JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Screening af bioaktive nanopartikler i phagocytiske immunceller til inhibitorer af Toll-lignende Receptor Signalering

Published: July 26, 2017
doi:
10.3791/56075
, , , ,
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai First People’s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Pediatrics,BC Children’s Hospital and University of British Columbia

Summary

Toll-lignende receptor (TLR) signalering spiller en vigtig rolle i patofysiologien af ​​mange humane inflammatoriske sygdomme, og regulering af TLR-responser af bioaktive nanopartikler forventes at være gavnlig under mange inflammatoriske tilstande. THP-1-cellebaserede reporterceller tilvejebringer en alsidig og robust screeningsplatform til identifikation af nye inhibitorer af TLR-signalering.

Abstract

Farmakologisk regulering af Toll-lignende receptor (TLR) reaktioner har stort løfte i behandlingen af ​​mange inflammatoriske sygdomme. Der har imidlertid været begrænsede forbindelser hidtil til at dæmpe TLR-signalering, og der har ikke været klinisk godkendte TLR-hæmmere (undtagen det anti-malariale lægemiddelhydroxychloroquin) i klinisk anvendelse. I lyset af de hurtige fremskridt inden for nanoteknologi kan manipulation af immunrespons ved hjælp af nanoapparater give en ny strategi til behandling af disse sygdomme. Her præsenterer vi en high-throughput screeningsmetode til hurtigt at identificere nye bioaktive nanopartikler, der hæmmer TLR-signalering i fagocytiske immunceller. Denne screeningsplatform er bygget på THP-1-cellebaserede reporterceller med kolorimetriske og luciferaseanalyser. Reportercellerne er konstrueret fra den humane THP-1 monocytiske cellelinie ved stabil integration af to inducerbare reporterkonstruktioner. Den ene udtrykker et udskilt embryonalt alkalisk phosphatase (SEAP) genUnder kontrol af en promotor inducerbar af transkriptionsfaktorerne NF-KB og AP-1, og den anden udtrykker et udskilt luciferase-reportergen under styring af promotorer inducerbare af interferonregulatoriske faktorer (IRF'er). På grund af TLR-stimulering aktiverer reportercellerne Transkriptionsfaktorer og producerer efterfølgende SEAP og / eller luciferase, som kan detekteres under anvendelse af deres tilsvarende substratreagenser. Ved anvendelse af et bibliotek af hybrider af peptid-guld nanopartikel (GNP), der blev etableret i vores tidligere undersøgelser som eksempel, identificerede vi en peptid-GNP-hybrid, som effektivt kunne hæmme de to arme af TLR4-signaleringskaskade udløst af dets prototypiske ligand, lipopolysaccharid (LPS). Resultaterne blev valideret ved standard biokemiske teknikker, herunder immunoblotting. Yderligere analyse fastslog, at denne bly hybrid havde et bredt inhibitorisk spektrum, der virker på flere TLR-veje, herunder TLR2, 3, 4 og 5. Denne eksperimentelle tilgang gør det muligt hurtigt at vurdere hvemRa nanopartikel (eller andre terapeutiske forbindelser) kan modulere specifik TLR-signalering i fagocytiske immunceller.

Introduction

Toll-lignende receptorer (TLR'er) er et af hovedelementerne i det medfødte immunsystem, der bidrager til den første forsvarslinje mod infektioner. TLR'er er ansvarlige for at registrere invaderende patogener ved at genkende et repertoire af patogenassocierede molekylære mønstre (eller PAMP'er) og montering af forsvarsreaktioner gennem en kaskade af signaltransduktion 1 , 2 . Der er identificeret 10 menneskelige TLR'er; Bortset fra TLR10, for hvilken liganden (e) forbliver uklare, kan hver TLR genkende en særskilt konserveret gruppe af PAMP'er. For eksempel kan TLR2 og TLR4, primært placeret på celleoverfladen, detektere lipoproteiner og glycolipider fra henholdsvis Gram-positiv og Gram-negativ bakterier; Mens TLR3, TLR7 / 8 og TLR9, der hovedsagelig er til stede i endosomale rum, kan mærke RNA og DNA-produkter fra virus og bakterier 3 . Når stimuleret af PAMP'er udløser TLR'er væsentlige immunresponser ved at frigive pro-infLammatoriske mediatorer, rekrutterings- og aktiverende effektorimmunceller og koordinering af efterfølgende adaptive immunhændelser 4 .

TLR-signaltransduktionen kan simpelthen kategoriseres i to hovedveje 5 , 6 . Den ene er afhængig af adapter-myeloid differentieringsfaktor 88 (MyD88) – den MyD88-afhængige vej. Alle TLR'er undtagen TLR3 anvender denne vej til aktivering af kaktakaktiver kappa-lette kædeforstærkere af aktiverede B-celler (NF-KB) og mitogenassocierede proteinkinaser (MAPK'er), hvilket fører til ekspression af proinflammatoriske mediatorer, såsom TNF- A, IL-6 og IL-8. Den anden vej benytter TIR-domæne-indeholdende adapter-inducerende interferon-β (TRIF) – den TRIF-afhængige eller MyD88-uafhængige vej – for at aktivere interferon (IFN) regulatoriske faktorer (IRF'er) og NF-KB, hvilket resulterer i produktion af Type I IFN'er. Intact TLR signaleringEr afgørende for vores daglige beskyttelse mod mikrobielle og virale infektioner; Defekter i TLR signalveje kan føre til immunsvigt og er ofte skadelige for menneskers sundhed. 7

TLR-signalering er imidlertid et "dobbeltkantet sværd" og overdreven, ukontrolleret TLR-aktivering er skadelig. Overaktive TLR-reaktioner bidrager til patogenesen i mange akutte og kroniske humane inflammatoriske sygdomme 8 , 9 . F.eks. Skyldes sepsis, som er karakteriseret ved systemisk inflammation og multiorganskader, primært akutte, overvældende immunresponser mod infektioner, idet TLR2 og TLR4 spiller en afgørende rolle i sepsispatofysiologien 10 , 11 , 12 . Derudover har TLR5 vist sig at bidrage til kronisk lungebetændelse hos patienter med cystisk fibrose 13, 14 . Desuden er dysreguleret endosomal TLR-signalering (f.eks. TLR7 og TLR9) stærkt forbundet med udvikling og progression af flere autoimmune sygdomme, herunder systemisk lupus erythematosus (SLE) og reumatoid arthritis (RA) 15 , 16 . Disse konvergerende bevislinier identificerer TLR-signalering som et potentielt terapeutisk mål for mange inflammatoriske sygdomme 17 .

Selv om farmakologisk regulering af TLR-responser forventes at være gavnlig under mange inflammatoriske tilstande, er der desværre i øjeblikket meget få forbindelser klinisk tilgængelige til at hæmme TLR-signalering 9 , 17 , 18 . Dette skyldes dels kompleksiteten og redundansen af ​​TLR-veje involveret i immune homeostasen og sygdomspatologien. Derfor søger efter roman, potenTerapeutiske midler til målretning af flere TLR-signalveje kunne bygge bro over et grundlæggende hul og overvinde udfordringen ved at fremme TLR-hæmmere ind i klinikken.

I lyset af de hurtige fremskridt inden for nanovidenskab og nanoteknologi fremkommer nanodevices som næste generation TLR modulatorer på grund af deres unikke egenskaber 19 , 20 , 23 . Nanoskala-størrelsen gør det muligt for disse nano-terapeutiske stoffer at få en bedre biofordeling og vedvarende omsætning 24 , 25 , 26 . De kan yderligere funktionaliseres for at opfylde de ønskede farmakodynamiske og farmakokinetiske profiler 27 , 28 , 29 . Mere spændende opstår biaktiviteten af ​​disse nye nanodevices fra deres egenskaber, som kan skræddersyes tilSpecifikke medicinske anvendelser, snarere end blot at virke som et leveringsmiddel til et terapeutisk middel. For eksempel blev et HDD-lignende nanopartikel med høj densitet designet til at hæmme TLR4-signalering ved fjernelse af TLR4-liganden LPS 23 . Derudover har vi udviklet et peptid-guld nanopartikel hybrid system, hvor de dekorerede peptider kan ændre overfladeegenskaberne af guld nanopartikler, og tillade dem at have forskellige bioaktiviteter 30 , 31 , 32 , 33 . Dette gør dem til en speciel klasse af stof (eller "nanoteknologi") som næste generations nano-terapeutik.

I denne protokol præsenterer vi en tilgang til at identificere en ny klasse af peptid-guld nanopartikler (peptid-GNP) hybrider, der potentielt kan inhibere flere TLR signalveje i fagocytiske immunceller 32 , </suP> 33 . Tilgangen er baseret på kommercielt tilgængelige THP-1 reportercellelinier. Reportercellerne består af to stabile, inducerbare reporterkonstruktioner: den ene bærer et sekretiseret embryonalt alkalisk phosphatase- (SEAP) -gen under kontrol af en promotor inducerbar af transkriptionsfaktorerne NF-KB og aktivatorprotein 1 (AP-1); Den anden indeholder et secerneret luciferase reportergen under kontrol af promotorer inducerbare af interferon regulatoriske faktorer (IRF'er). Ved TLR-stimulering fører signaltransduktionen til aktiveringen af ​​NF-KB / AP-1 og / eller IRF'er, som tænder reportergenene til hemmeligt SEAP og / eller luciferase; Sådanne hændelser kan let registreres ved anvendelse af deres tilsvarende substratreagenser med et spektrofotometer eller luminometer. Ved hjælp af denne fremgangsmåde til screening af vores tidligere etablerede bibliotek af peptid-GNP-hybrider, identificerede vi blykandidater, som potentielt kan hæmme TLR4-signalveje. Den inhibitoriske aktivitet af blypeptid-BNP-hybrider blev derefter valideret ved anvendelse af en anden biokemisk tilgang til immunoblotting og evalueret på andre TLR-veje. Denne fremgangsmåde muliggør hurtig og effektiv screening af nye agenter, der retter sig mod TLR-signalveje.

Protocol

1. Fremstilling af cellekulturmedier og reagenser Forbered det fuldstændige cellekulturmedium R10 ved at tilsætte supplementerne af 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat i RPMI-1640-mediumet. Forbered udvælgelseskulturmediet R10-Z ved at tilsætte antibiotika Zeocin (200 μg / ml) til R10 for at opretholde ekspressionen af ​​SEAP under kontrol af NF-KB / AP-1-aktivering. For at udvælge celler, der udtrykker både SEAP- og luciferase-reporterge…

Representative Results

Den samlede eksperimentelle tilgang er illustreret i figur 1 . De to THP-1-reportercellelinier, THP-1-XBlue og THP-1-Dual, anvendes til hurtig screening af TLR-responserne ved at undersøge aktiveringen af ​​henholdsvis NF-KB / AP-1 og IRF'er. Aktiveringen af ​​NF-KB / AP-1 kan påvises ved hjælp af SEAP-kolorimetrisk analyse, mens IRF-aktivering overvåges ved luciferase luminescens. De monocytiske THP-1-celler kan let afledes i makrofager for …

Discussion

Da TLR er involveret i patogenesen af ​​mange inflammatoriske sygdomme, er de fremkommet som terapeutiske mål for moduleringen af ​​immunresponser og inflammatoriske tilstande. Den kliniske udvikling af terapeutiske midler til at inhibere TLR-signalveje har imidlertid haft begrænset succes til dato. Det antimalariale lægemiddel hydroxychloroquin, der hæmmer TLR7 og TLR9, er i klinisk anvendelse 35 , 36 . Tilsvarende har kun et begrænset antal forbin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne anerkende støtten fra programmet for professor i Special Appointment (Eastern Scholar) ved Shanghai Higher Learning (HY), startfonden fra Shanghai First People's Hospital (HY), Gaofeng Clinical Medicine Grant-støtte fra Shanghai Jiaotong University School of Medicine (HY), og finansieringen fra Crohns og Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET og HY).

Materials

THP-1-XBlue reporter cell InvivoGen thpx-sp keep cell culture passage under 20
THP-1-Dual repoter cell InvivoGen thpd-nfis keep cell culture passage under 20
RPMI-1640 (no L-glutamine) GE Health Care SH30096.02 Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10
Fetal bovine serum (qualified) Thermo Fisher Scientific 12484028 Heat inactivated; 10% in RPMI-1640
L-glutamine Thermo Fisher Scientific SH30034.02 2 mM in the complete medium R10
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM in the complete medium R10
Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium GE Health Care SH30028.02 Use for cell washing and reagent preparation
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1 SEAP substrate
QUANTI-Luc InvivoGen rep-qlc2 Luciferase substrate
Zeocin InvivoGen ant-zn-1 Selection antibiotics for reporter cells
Blasticidin InvivoGen anti-bl-1 Selection antibiotics for reporter cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology Sigmal-Aldrich D8418-100ML Use for reagent preparation
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology Sigmal-Aldrich P1585-1MG Use for cell differentiation
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 InvivoGen tlrl-eklps TLR4 ligand
Pam3CSK4 InvivoGen tlrl-pms TLR2/1 ligand
Poly (I:C) HMW InvivoGen tlrl-pic TLR3 ligand
Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure InvivoGen tlrl-epstfla TLR5 ligand
SpectraMax Plus 384 microplate reader Molecular Devices N/A Read colorimetric assay
Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors Tecan N/A Read luminiscience
Microfuge 22R centrifuge Beckman Coulter N/A Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)
Allegra X-15R centrifuge Beckman Coulter N/A Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)
Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated Corning Costar 3903 Used for luminiscence assay
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
  4. Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
  5. Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
  6. Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
  7. Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
  8. Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
  9. O’Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
  10. Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
  11. Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
  12. Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
  13. Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
  14. Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
  15. Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
  16. Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
  17. Hennessy, E. J., Parker, A. E., O’Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
  18. Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
  19. Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
  20. Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
  21. Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
  22. Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
  23. Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
  24. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  25. Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
  26. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  27. Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374 (2011).
  28. Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
  29. Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
  30. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
  31. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
  32. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
  33. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  34. Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
  35. Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
  36. Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
  37. Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
  38. Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
  39. Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
  40. Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
  41. Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
  42. Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
  43. Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).

Tags

Bioactive NanoparticlesToll-like Receptor SignalingInnate Immune CellsInflammatory DiseasesPhagocytic Immune CellsReporter Cell SystemsNanoinhibitorsScreening ProcedureLuciferase SubstrateSEAP SubstrateCell CulturePMA

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yang, H., Fung, S. Y., Bao, A., Li, Q., Turvey, S. E. Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling. J. Vis. Exp. (125), e56075, doi:10.3791/56075 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image