Поддержание инфицированных комаров Aedes aegypti с Wolbachia

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Комары Aedes aegypti , инфицированных Wolbachia выпускаются в природных популяциях для подавления передачи арбовирусов. Мы описываем методы задней А.е. aegypti с Wolbachia инфекции в лаборатории для экспериментов и поля релиз, принимая меры предосторожности для сведения к минимуму Лаборатория адаптации и отбора.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Комары Aedes aegypti , экспериментально зараженных Wolbachia используются в программах по борьбе с распространением арбовирусов денге и чикунгунья Зика. Wolbachia-инфицированных комаров может быть выпущен в поле либо сокращения размеров населения через несовместимые вязки или преобразовать населения с комаров, которые являются тугоплавкие для передачи вируса. Для этих стратегий для достижения успеха комаров, выпущенный в поле из лаборатории должны быть конкурентоспособными с родной комаров. Однако ведение комаров в лабораторных условиях может привести к инбридинга, генетического дрейфа и лабораторных адаптации, который может уменьшить их пригодности в области и может посрамить результаты экспериментов. Для проверки пригодности различных инфекций Wolbachia для развертывания на местах, необходимо поддерживать комаров в контролируемой лабораторной среде через несколько поколений. Мы опишем простой протокол для поддержания А.е. aegypti комаров в лаборатории, которая подходит для обоих Wolbachia-дикого типа и инфицированных комаров. Методы минимизации Лаборатория адаптации и осуществлять ауткроссинга увеличить актуальность экспериментах поля комаров. Кроме того колонии поддерживаются при оптимальных условиях для максимизации их пригодности для открытого поля релизов.

Introduction

Комары Aedes aegypti несут ответственность за некоторые из наиболее важных арбовирусов в мире, включая денге и чикунгунья, Зика1передачи. Эти вирусы становятся растущей угрозой для глобального здравоохранения, как широкое распространение А.е. aegypti в тропиках продолжает расширяться2,3,4. Женщины А.е. aegypti преференциально питаются человеческой кровью5 и таким образом, как правило, живут в непосредственной близости от людей, особенно в городских районах, где население наиболее плотной. Через этой тесной связи с людьми они также адаптированы к породе в искусственной среде обитания, включая шины, горшки, желобов и водных резервуаров6,7. А.е. aegypti также легко адаптироваться к лабораторных сред, где они могут соблюдаться без каких-либо специальных требований после собираются непосредственно из поля, в отличие от некоторых других видов рода Aedes 8, 9,10. Их простота в обслуживании видел их широко изучены в лаборатории в широкий спектр областей, в конечном счете целью уничтожения комаров заболеваний могут передавать.

Традиционно арбовирусами управления сильно зависит от использования инсектицидов для сокращения популяций комаров. Однако существует растущий интерес к подходов, где выращены в лабораторных условиях и затем выпустили в природных популяциях измененных комаров. Выпущенные комаров может быть генетически модифицированных11,12,13, биологически14,15, через облучения16, химическая обработка17,18, или с совмещенной19 методы подавления популяций комаров или заменить их на комаров, которые являются тугоплавкие арбовирусами передачи20.

Wolbachia являются бактерии, которые в настоящее время используются в качестве биологического контроля агента для арбовирусов. Несколько штаммов Wolbachia были недавно внесены в А.е. aegypti экспериментально с использованием эмбриональных микроинъекции21,,2223,24. Эти штаммы снижают способность арбовирусов распространения и тиражирования в комаров, уменьшая их передачи потенциальных23,25,26,27,28 . Wolbachia инфекции передаются от матери к потомству, однако некоторых штаммов вызвать бесплодие при инфицированных мужчин спариваться с неинфицированных женщин22. Wolbachia-инфицированных мужчин, поэтому могут быть освобождены в больших количествах для подавления населения естественный комаров, как недавно продемонстрировано в других видов Aedes 15,29. Однако поскольку Wolbachia также препятствовать арбовирусами передачи в А.е. aegypti, комаров также может быть освобожден для замены коренного населения бедных векторов. А.е. aegypti экспериментально зараженных Wolbachia теперь выпускаются в поле в нескольких странах, используя этот последний подход14,30,31.

Wolbachia-основанные подходы для арбовирусами управления опираться на четкое понимание взаимодействия между Wolbachia, комаров и окружающей среды. Wolbachia происходят естественно в широком диапазоне насекомых, и штаммы, введены комаров разнообразны в их эффекты32. Как в А.е. aegypti24вводятся новые типы Wolbachia инфекции, необходимо охарактеризовать каждого штамма для их воздействия на комаров фитнес, размножение и арбовирусами вмешательства под ряда условий. Поэтому строгие эксперименты в лабораторных условиях требуется оценить потенциал для Wolbachia штаммов для достижения успеха в области.

Открытое поле релизы А.е. aegypti с Wolbachia инфекций может часто требуют тысячи, десятки тысяч комаров за релиз зоны, чтобы быть выращены каждую неделю14,30,31. Успех первоначального релизы могут быть улучшены путем выпускать комаров большого размера для максимизации их плодовитость33 и34,спаривания успех35. Комаров, также должны быть адаптированы к условиям, которые они будут испытывать в этой области, однако долгосрочные Лаборатория воспитания могут вызвать изменения в поведении и физиологии, которые могут повлиять на поле производительности36,37, 38.

Мы опишем простой протокол для выращивания А.е. aegypti в лаборатории с использованием основного оборудования. Этот протокол предназначен для обеих одичал типа и Wolbachia-инфицированных комаров, последний из которых могут потребовать особого внимания как некоторые штаммы Wolbachia имеют существенные последствия для комаров истории жизни черты39, 40. воспитание условия избежать переполненности и конкуренция за питание производить комаров постоянный размер, который имеет решающее значение для векторных компетентности и фитнес экспериментов и гарантирует, что комары являются здоровыми для поля релиз41 . Мы также принимаем меры предосторожности для сведения к минимуму Лаборатория адаптации и инбридинга путем уменьшения селективного давления, и обеспечения того, чтобы следующее поколение выборку из случайных большой бассейн. Однако лабораторных сред, заметно отличаются от полевых условиях, и долгосрочное обслуживание льготных условиях может уменьшить фитнес комаров после освобождения в поле37,42,43 . Мы поэтому Крест женщин из лаборатории линий на поле собранные мужчины периодически, приводит в колониях, которые генетически аналогичны для экспериментальных сравнения и что адаптированы к целевой области населения39. Методы не требуют какого-либо специализированного оборудования и может масштабироваться задней десятки тысяч людей в неделю для поля релизов. Протокол также устанавливает приоритеты фитнес комаров внутри и между поколениями, важным фактором для насекомых, предназначенных для создания в природных популяциях. Протокол подходит для большинства лабораторий, которые требуют обслуживания А.е. aegypti, особенно для экспериментальных сравнений, где важны стабильное качество комаров и relatability в поле.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Крови кормление комаров на человеке был одобрен в университете Мельбурна человеческой этики Комитета (утверждение #: 0723847). Все добровольцы условии сообщил письменного согласия.

1. личиночной воспитания

Примечание: Комаров проводятся в 26 ± 0,5 ° C и 50-70% относительной влажности, с 12:12 h (свет: темный) фотопериода для обслуживания протокол этой колонии. Эти условия похожи на среднем климатических условий в Кэрнс, Австралия и в пределах оптимального теплового диапазона А.е. aegypti выживания и развития44,45,46. Высокая температура может привести к потере Wolbachia инфекции от комаров колоний и следует избегать47. Мы поддерживаем по меньшей мере 500 человек на населения к минимуму инбридинга; поддержание колоний меньшего размера может иметь последствия фитнес [Росс et al. неопубликованных]. В этих условиях и при условии адекватного питания среднее поколение время составляет 28 дней (см. таблицу 1).

  1. Погружать яйца на подложке в лотки (рис. 1A), содержащий 3 Л воды (воды обратного осмоса или возрасте водопроводной воды, порожденных оставляя водопроводной воды в лотки за 24 часа до использования), ~ 300 мг корма для рыб (один щебень планшет, смотрите Таблицу материалы) и несколько зерен активных сухих дрожжей, чтобы побудить штриховкой48.
  2. Один день после вылупления, используйте Пипетки стеклянные для передачи примерно 500 личинок лотков, содержащих 4 Л воды (рис. 1B), граф, используя счетчик кликер. Добавьте две таблетки питания дробленого рыбы в каждый лоток. При необходимости, использовать контейнеры различных размеров для выращивания личинки (рис. 1а), но держать личиночной плотностью ниже 0,5 личинки/мл во избежание переполненности.
  3. Проверьте лотки ежедневно, что личинки имеют достаточного количества продовольствия; Добавьте примерно две таблетки питание лотков каждые два дня. Обеспечивать питание ad libitum , но убедитесь, что соответствует 0,5 мг/сутки личинка доступен в течение этого периода для обеспечения развития является синхронным и тела размер, в противном случае результаты экспериментов может быть confounded (см. Результаты представитель).
  4. Позаботьтесь, чтобы избежать перекормить личинок, особенно в небольших воспитания контейнеры с менее воды площадь поверхности и объем. Если вода выглядит облачно или если существует значительный личиночной смертности, замените его с пресной водой; смертности, должны быть несущественными, если личинки питаются оптимально.

2. Взрослый появление

Примечание: Личинки начнут окукливаются от пяти дней после вылупления, если хорошо кормили и большинство должно окукливаются в семь дней после вылупления. Взрослые будут начинаться появляются примерно через два дня после Окукливание если оптимально на 26 ° C (см. Результаты представитель). Развития личинок обычно затрагиваются Wolbachia инфекций, когда достаточное питание обеспечивается23,39,49.

  1. Через семь дней после вылупления вылить содержимое лотка через тонкой сеткой (порами размером 0,4 мм). Держите фильтрованная вода личинок для последующего использования в ovicups (см. раздел «Кровь кормления и откладки яиц»). Инвертировать сетки и окунуть его в пластиковый контейнер с 200 мл воды для передачи куколок. Обеспечивают дополнительное продовольствие, если любой личинки остаются.
  2. Подготовьте взрослых появление клеток (рис. 1 c), предоставляя две чашки 10% раствора сахарозы (Рисунок 1F) и две чашки влажной ваты для предотвращения высыхания (Рисунок 1E).
  3. Если куколки не обязательно должны быть отсортированы по признаку пола, место крышкой контейнеры куколки в клетку и оставьте крышку слегка приоткрыта, чтобы позволить взрослых выйти в клетку. Кроме того место Перевернутый воронку над контейнера, чтобы свести к минимуму утопления. Убедитесь, что все взрослые появились перед снятием контейнера из клетки для предотвращения выбора против медленного разработчиков.

3. куколки Sexing для ауткроссинга

  1. Если куколки должны быть отсортированы по полу (например, для ауткроссинга), Пипетка куколок из личинок лотков и разделения полов (рис. 2) пластиковые контейнеры (рис. 1A) с 200 мл воды каждые 24 ч до желаемое количество каждого пола было достигнуто. Место крышки на контейнерах и оставить их закрытия.
  2. Взрослые будут возникать в контейнеры; Подтвердите их пола перед выпуском в клетки (рис. 2 c). Удалите любые взрослых, сексуальны неправильно с аспиратором в течение 24 ч возникновение, прежде чем они достигают половой зрелости. После того, как были подтверждены полов, отпустите взрослых в клетки каждые 24 ч.
  3. Для получения Wolbachia-подмес инфицированные колонии аналогичные генетический фон для естественного движения населения, путем добавления Wolbachia-инфицированных женщин из лаборатории колоний клеток неинфицированных мужчин, производные от яйца, собранные ovitraps в на поле39, поддержание предписанной плотности 500 человек на населения.
    1. Повторите ауткроссинга для по крайней мере три последовательных поколений производить колонии, которые по крайней мере 87,5% генетически аналогичны населения поле39. Критической: Убедитесь в правильности полов на данном этапе (см. шаг 3.1).
  4. Женщины А.е. aegypti обычно тугоплавких для дальнейшего осеменения в течение часов спаривания50. Когда ауткроссинга колоний, позволяют женщин и мужчин, Зрелые в отдельных клетках в течение двух дней и затем аспирационная самок в мужской клетку обеспечить равные возможности для всех мужчин.

4. кровь кормления и откладки яиц

  1. Подождите, по крайней мере через три дня после последнего самка возникла до крови, кормления, чтобы предоставить достаточно времени созреть. Крови кормить самок в течение двух недель эмерджентности для предотвращения чрезмерной смертности, особенно для комаров с Wolbachia инфекций, которые отрицательно влияют на долговечность22,24,49. Удаление чашки сахара за день до кормления для улучшения питания ставок.
    1. Попросите добровольцев для вставки их предплечья в клетке, чтобы позволить женского комаров кормить. Большинство женщин должны кормить повторилась в течение 5 мин, но уменьшить выбор против медленных кормушки, оставить предплечья в клетке за 15 мин, или до тех пор, пока все женщины заметно engorged; латексные перчатки для защиты рук от укусов необязательно, но рекомендуется.
    2. Через два дня после кормления крови, место два пластиковых стаканчиков, содержащих личиночной воспитания воду и облицованная с полоской наждачной бумагой (рис. 1 g) (или фильтровальная бумага (рис. 1 H)) в клетке для самки откладывают яйца. Частично погрузиться полосе наждачной бумаги в воду, чтобы держать его влажным. Удалите другие источники воды для предотвращения самки откладывают свои яйца вне Кубка откладки яиц.
      Примечание: водопроводной воды могут быть использованы в чашках, но личинок воспитания воды поощряет откладки яиц51,52 и самки откладывают яйца более синхронно.

5. яичные сбора и кондиционирования

  1. Женщины будут откладывают яйца на наждачной бумаги чуть выше линии воды; собирать и заменить полос наждачную бумагу ежедневно до тех пор, пока не больше яиц. Обратите внимание, что oviposition могут продолжаться до одной недели.
  2. Частично сухой полосы наждачной бумаги, аккуратно промокательной их на бумажное полотенце для 30 сек, стараясь не выбить яйца. Затем оберните полоски в лист сухой салфеткой и поместите его в закрывающемся полиэтиленовый пакет (Рисунок 1I).
  3. Проверьте состояние яйца под микроскопом рассечения (рис. 3). Если полосы наждачной бумаги являются слишком мокрая, может высиживают яйца до погружения в воду (рис. 3B), но если сушеные слишком жестко, яйца может обрушиться (рис. 3 c).
  4. Яйца могут быть вылупившихся в любое время за три дня после сбора; Люк все яйца от каждой колонии, собранных во все дни, в том же контейнере воды, чтобы обеспечить, что следующее поколение выборку из пула большой, случайных людей.
  5. Для длительного хранения Держите яйца в запечатанном контейнере при высокой (> 80%) влажности при температуре около 20 ° C. В этих условиях яйца без Wolbachia могут храниться несколько месяцев при сохранении высокой Люк ставки53,54.
  6. Как некоторые Wolbachia инфекции значительно уменьшить жизнеспособность яиц с возраст49,55, высиживают яйца от Wolbachia-инфицированных линии в течение одной недели коллекции для предотвращения чрезмерной смертности для соответствующих штаммы. Крови кормить самок снова после одной недели, если необходимо больше яиц.
День Шаг
0 Люк яйца
1 Количество личинок в лотки
7 Личинки и куколки передавать колонии клеток
17 Крови кормить взрослых женщин
21 Начать сбор яиц
25 Закончить сбор яиц
28 Люк яйца

Таблица 1: Обзор расписания обслуживания колонии А.е. aegypti в 26 ° с. Гибкие сроки женской крови кормления и инкубационных яиц, но следует избегать длительного времени на этих этапах, особенно для комаров, инфицированных Wolbachia, с тем чтобы свести к минимуму смертности. После этого графика минимизирует выбор против комаров, которые быстро или медленно развивать или Зрелые на всех этапах жизни, при том условии, что личинки питаются оптимально.

Figure 1
Рисунок 1: Оборудование, используемое для выращивания А.е. aegypti в лаборатории. (A) пластиковые контейнеры, используемые для инкубационных яиц и выращивания личинки с объемами 500, 750 и 5000 мл (слева направо). (B) лотки, используется для выращивания личинок на контролируемых плотности, обычно 500 личинок в 4 Л воды. (C) 19,7 L и (D) 3 Л клеток для взрослых жилищного строительства. Плотность 25 взрослых или меньше за литр следует сохранить для обеспечения достаточного пространства. (E) 35 мл чашка с влажной ватой, предоставляемых как источник воды для взрослых. (F) 35 мл чашка раствором сахарозы, предоставляемых через шнур или стоматологические фитиль как источник сахара. (HG) Чашки с личинками воспитания водой и выстроились с Субстрат откладки яиц наждачная бумага или Бумага фильтровальная (G и H, соответственно). (я) Zip-lock мешок для хранения полос наждачную бумагу или фильтровальной бумаги. Черные пятна на наждачной бумаги являются комаров яйца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Боковые (A) и спинной (B) виды куколок и взрослых А.е. aegypti (C) демонстрируют их половой диморфизм. Самцы расположены на левой и самок справа в каждой панели. Когда оптимально кормить, мужские и женские куколки отличаются по размеру; самки крупнее самцов (A) и имеют сравнительно луковичных головогрудь, по сравнению с мужчинами, которые имеют плоские стороны (B). Взрослые мужчины легко отличить от самки при всех условиях выращивания, прежде всего путем их перистые усики и длинные щупальцы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
На рисунке 3. Четыре дня старый А.е. aegypti яйца в различных условиях. (A) неповрежденными яйца на наждачную бумагу полосками, поддерживается при влажности воздуха высокой (> 80%), но без каких-либо видимых влаги. Люк ставки должны быть выше 90% для одичал тип А.е. aegypti , если правильно. (B) яйца, которые вылупляются до погружения в воду (скороспелый штриховкой) отличаются отдельностоящий яйцо шапку и видимые личинки. Это означает, что наждачная бумага газа содержался слишком влажным. (C) яйца, которые сушатся слишком жестко может рухнуть и хорошо видны их вогнутый вид. Если наждачной бумагой становится жесткой, это также указывает, что яйца могут быть слишком сухой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 4 демонстрирует эффекты субоптимальные питания на развитие А.е. aegypti личинок. Когда контейнеры предоставляются с 0,25 мг продовольствия на личинки в день или меньше, время разработки увеличивает для мужчин и женщин, и менее синхронного чем в контейнерах предоставляется с 0,5 мг пищи. Если достаточное питание не предоставляется во время развития личинок, это может иметь негативное влияние на расписание обслуживания. Медленно развивающихся лица подвергаются риску быть выбранным против, крови кормление может быть отложено, и есть более высокий риск смертности взрослого населения, прежде чем происходит размножение.

Рисунок 5 показывает длину крыла (оценку размера тела) А.е. aegypti взрослых, выращенные под различных режимов питания. Длина крыла самцов и самок значительно уменьшить и стать более переменных, когда питание является оптимальным. Форма тела размеров имеют важное значение для экспериментальных сравнения размер тела положительно связаны с плодовитости, а большие комаров, как ожидается, демонстрируют более фитнес в полевых условиях33,,3435 .

Эффекты Wolbachia инфекций на выше черты описаны в других исследованиях, но обычно нет практически никакого эффекта23,39,49.

Figure 4
Рисунок 4: Совокупное соотношение Ae.aegypti (A) женщин и (B) мужчин, развивающихся в зрелом возрасте при различных режимах на 26 ° C. 100 личинок воспитывались в контейнерах по 500 мл воды (личинок плотность личинок 0,2 мл), с различными уровнями продовольствия (см. таблица материалов) и забил за время их разработки. Только личинки, которые дожили до зрелого возраста были включены. Планки погрешностей являются стандартные ошибки, с n = 4 реплицирует за лечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Длина крыла Ae.aegypti (A) женщин и (B) мужчин, развивающихся при различных режимах на 26 ° C. 100 личинки были выращены в контейнерах по 500 мл воды (личинок плотность личинок 0,2 мл) и с различными уровнями пищи. Подмножество взрослых был затем измеряется для их длина крыла, используя ранее описанные методы56. Планки погрешностей, стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

После протокола, представленные здесь для поддержания Wolbachia-инфицированных А.е. aegypti следует обеспечить здоровые комаров неизменного качества производятся для экспериментов и открыть поле релизов. В отличие от других протоколов, которые приоритеты производства массовых количествах комаров (см. ссылку57) методы ориентированы на максимизации их пригодности, как внутри поколений путем реализации расслабленной условий выращивания и через поколений путем минимизации инбридинга, отбора и лабораторных адаптации. Этот протокол также разработан специально для А.е. aegypti с Wolbachia инфекции, но должны быть подходящими для любого типа А.е. aegypti. Однако это не подходит для выращивания массовых количествах (порядка миллионов в неделю), которые могут быть необходимы для стерильной или несовместимые насекомых релизов, которые требуют высоких номеров для достижения подавления населения57,58.

Есть некоторые важные шаги, которые следует использовать осторожно. Важно, чтобы оптимально кормить личинок и избежать переполненности в течение их развития. Это будет гарантировать, что комаров развиваться синхронно и имеют одинаковый размер. Особое внимание следует также при кондиционирования яйца; Личинки очень легко может слишком рано штриховки или яйца могут забираются если откладки яиц субстратов слишком мокрой или сухой, соответственно. На всех этапах в протоколе мы рекомендуем, позволяет достаточно времени для как много людей в колонии как можно для завершения каждого этапа. Выбор против отдельных лиц, которые медленно развиваться, Зрелые, кровь корма, разведению или Люк скорее всего приведет к потере генетических вариаций.

Мы отмечаем некоторые дополнительные соображения для поддержания Wolbachia-инфицированных комаров, которые не описаны в протоколе выше. Это возможно для Wolbachia инфекций быть утрачены из лаборатории колоний, и поэтому мы рекомендуем, что колонии регулярно контролироваться для их Wolbachia ВИЧ-статуса. Мы используем количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР)49,59 для тестирования по меньшей мере 30 человек из каждой Wolbachia-инфицированных линии каждое поколение. Если любых лиц, тест отрицательный для соответствующего Wolbachia инфекции, колонии может быть очищен путем изоляции как многие женщины как можно дальше от пострадавших колонии и затем с помощью потомства от инфицированных матерей только, чтобы найти следующее поколение. Причины потери некоторых штаммов Wolbachia из лаборатории колоний практически неизвестна, но можно объяснить тем, что контроль температуры, как высоких температур может привести к потере Wolbachia инфекции47, 60.

Колонии и эксперименты также быть загрязнены с лицами из разных линий, если уход не принимается при воспитании. Загрязнение может быть результатом небрежной закупорить личинок, смешивая партий яиц, неправильной клетки или неправильно sexing куколки в кресты. Поэтому особое внимание следует при обработке колоний с различными типами Wolbachia инфекции. Тщательно очистить любой чашки откладки яиц, воспитание лотков и клетки перед повторным использованием их, очистки пипетки перед обработкой каждый новый лоток личинок и очистить сетку каждый раз при передаче личинки и куколки в другие контейнеры. Кроме того проверьте пальцы для яиц, когда обработка наждачной бумаги полос и использовать свежие бумажные полотенца, когда сушки каждой полосы, обеспечивают правильный секс взрослых перед выпуском их в клетки и быстро справиться с любой беглецов. Принимая эти меры предосторожности следует избегать наиболее загрязнения, но колоний следует по-прежнему регулярно контролироваться с использованием диагностических анализов59.

Женщины А.е. aegypti требуют еды крови для того, чтобы откладывать яйца, и лабораторий по всему миру предоставляют им в различных способов, от мембраны кормления систем57, сдержанная животных61 и, в меньшей степени, искусственной крови62 . Однако комаров с экспериментальной Wolbachia инфекции часто плохо работают на кровь человека и могут exhibit снижение плодовитости и Люк ставки и неполной передачи Wolbachia их потомство63, 64 , 65. поддержание восприимчивости женщин человека запахи также имеет важное значение для комаров будет выпущен в поле, и кормить их через мембраны или других животных может привести к нарушению этой способности37. Мы поэтому предпочитают использовать предплечья человека добровольцев для обслуживания протокол этой колонии, хотя при некоторых обстоятельствах требуются другие методы. Кровь должна поставляться через другие средства при работе непосредственно с арбовирусов, и следует позаботиться при колониях происходят от населения области с высокой вирусной нагрузкой как transovarial передача арбовирусов может произойти66. Добровольцах следует также не крови корма, если они недавно посетили арбовирусами эндемичных стран, как может быть риск передачи инфекции.

Наше обслуживание протокола стремится свести к минимуму Лаборатория адаптации и селективного давления, но есть место для совершенствования. Leftwich и др. 42 предоставляют дополнительные рекомендации для поддержания фитнес комаров для открытого поля релизов, включая использование более разнообразной и естественной личиночной диеты, снижение плотности взрослых в клетках и сложных условий. Эти соображения могут повысить фитнес А.е. aegypti до более высокого уровня, хотя в настоящее время нет никаких доказательств изменения фитнес благодаря адаптации Лаборатория протоколом содержание описано здесь [Росс et al. неопубликованных]. Некоторые дополнительные меры не может быть возможным для лабораторий с ограниченным пространством и ресурсов, но, тем не менее, стоит изучить. Сохранение размеров большого населения, избегая крупных селективного давления через воспитание протоколы и реализации периодических ауткроссинга поле комаров должны помочь в обеспечении высокой приспособленности А.е. aegypti открытое поле релизов. Принципы, используемые в подходе может применяться для выращивания других видов векторных болезней для выпуска манипулировать или подавить природных популяций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgements

Мы признаем Хенг Lin Yeap, Крис Патон, Petrina Джонсон и Клэр Дойг за их вклад в развитие наших методов поддержания колонии и три анонимные отзывы за их предложения, которые помогли улучшить рукопись. Наши исследования поддерживается программы грантов и стипендий для ААА от национального здравоохранения и Совет медицинских исследований и перевод грант от Уэллком траст. PAR является получателем Австралийской правительство исследований подготовки программы стипендий.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, S. V., Tesh, R. B., Vasilakis, N. The emergence of arthropod-borne viral diseases: A global prospective on dengue, chikungunya and zika fevers. Acta Trop. 166, 155-163 (2017).
  2. Campbell, L. P., et al. Climate change influences on global distributions of dengue and chikungunya virus vectors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370, (1665), (2015).
  3. Kraemer, M. U., et al. The global distribution of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus. eLife. 4, (2015).
  4. Carvalho, B. M., Rangel, E. F., Vale, M. M. Evaluation of the impacts of climate change on disease vectors through ecological niche modelling. Bull Entomol Res. 1-12 (2016).
  5. Scott, T. W., et al. Longitudinal studies of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Thailand and Puerto Rico: population dynamics. J Med Ent. 37, (1), 77-88 (2000).
  6. Cheong, W. Preferred Aedes aegypti larval habitats in urban areas. Bull World Health Organ. 36, (4), 586-589 (1967).
  7. Barker-Hudson, P., Jones, R., Kay, B. H. Categorization of domestic breeding habitats of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Northern Queensland, Australia. J Med Ent. 25, (3), 178-182 (1988).
  8. Watson, T. M., Marshall, K., Kay, B. H. Colonization and laboratory biology of Aedes notoscriptus from Brisbane, Australia. J Am Mosq Control Assoc. 16, (2), 138-142 (2000).
  9. Williges, E., et al. Laboratory colonization of Aedes japonicus japonicus. J Am Mosq Control Assoc. 24, (4), 591-593 (2008).
  10. Munstermann, L. E. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Springer. 13-20 (1997).
  11. McDonald, P., Hausermann, W., Lorimer, N. Sterility introduced by release of genetically altered males to a domestic population of Aedes aegypti at the Kenya coast. Am J Trop Med Hyg. 26, (3), 553-561 (1977).
  12. Rai, K., Grover, K., Suguna, S. Genetic manipulation of Aedes aegypti: incorporation and maintenance of a genetic marker and a chromosomal translocation in natural populations. Bull World Health Organ. 48, (1), 49-56 (1973).
  13. Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnol. 29, (11), 1034-1037 (2011).
  14. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476, (7361), 454-457 (2011).
  15. O'Connor, L., et al. Open release of male mosquitoes infected with a Wolbachia biopesticide: field performance and infection containment. PLoS Negl Trop Dis. 6, (11), e1797 (2012).
  16. Morlan, H. B. Field tests with sexually sterile males for control of Aedes aegypti. Mosquito news. 22, (3), 295-300 (1962).
  17. Grover, K. K., et al. Field experiments on the competitiveness of males carrying genetic control systems for Aedes aegypti. Entomol Exp Appl. 20, (1), 8-18 (1976).
  18. Seawright, J., Kaiser, P., Dame, D. Mating competitiveness of chemosterilized hybrid males of Aedes aegypti (L.) in field tests. Mosq News. 37, (4), 615-619 (1977).
  19. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II- a safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10, (8), e0135194 (2015).
  20. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. Nature Rev Microbiol. 11, (3), 181-193 (2013).
  21. Xi, Z., Khoo, C. C., Dobson, S. L. Wolbachia establishment and invasion in an Aedes aegypti laboratory population. Science. 310, (5746), 326-328 (2005).
  22. McMeniman, C. J., et al. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegypti. Science. 323, (5910), 141-144 (2009).
  23. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476, (7361), 450-453 (2011).
  24. Joubert, D. A., et al. Establishment of a Wolbachia superinfection in Aedes aegypti mosquitoes as a ppotential approach for future resistance management. PLoS Pathog. 12, (2), e1005434 (2016).
  25. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Sci Transl Med. 7, (279), 279ra237 (2015).
  26. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia Reduces Transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Sci Rep. 6, 28792 (2016).
  27. van den Hurk, A. F., et al. Impact of Wolbachia on infection with chikungunya and yellow fever viruses in the mosquito vector Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 6, (11), e1892 (2012).
  28. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139, (7), 1268-1278 (2009).
  29. Mains, J. W., Brelsfoard, C. L., Rose, R. I., Dobson, S. L. Female Adult Aedes albopictus Suppression by Wolbachia-Infected Male Mosquitoes. Sci Rep. 6, 33846 (2016).
  30. Nguyen, T. H., et al. Field evaluation of the establishment potential of wmelpop Wolbachia in Australia and Vietnam for dengue control. Parasit Vectors. 8, 563 (2015).
  31. Garcia Gde, A., Dos Santos, L. M., Villela, D. A., Maciel-de-Freitas, R. Using Wolbachia releases to estimate Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) population size and survival. PloS One. 11, (8), e0160196 (2016).
  32. Hoffmann, A. A., Ross, P. A., Rašić, G. Wolbachia strains for disease control: ecological and evolutionary considerations. Evol Appl. 8, (8), 751-768 (2015).
  33. Briegel, H. Metabolic relationship between female body size, reserves, and fecundity of Aedes aegypti. J Insect Physiol. 36, (3), 165-172 (1990).
  34. Ponlawat, A., Harrington, L. C. Factors associated with male mating success of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 80, (3), 395-400 (2009).
  35. Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 8, (12), e3294 (2014).
  36. Imam, H., Zarnigar,, Sofi, G., Seikh, A. The basic rules and methods of mosquito rearing (Aedes aegypti). Trop Parasitol. 4, (1), 53-55 (2014).
  37. Spitzen, J., Takken, W. Malaria mosquito rearing-maintaining quality and quantity of laboratory-reared insects. Proc Neth Entomol Soc Meet. 16, 95-100 (2005).
  38. Lorenz, L., Beaty, B. J., Aitken, T. H. G., Wallis, G. P., Tabachnick, W. J. The effect of colonization upon Aedes aegypti susceptibility to oral infection with Yellow Fever virus. Am J Trop Med Hyg. 33, (4), 690-694 (1984).
  39. Yeap, H. L., et al. Dynamics of the "popcorn" Wolbachia infection in outbred Aedes aegypti informs prospects for mosquito vector control. Genetics. 187, (2), 583-595 (2011).
  40. Turley, A. P., Moreira, L. A., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Wolbachia infection reduces blood-feeding success in the dengue fever mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 3, (9), e516 (2009).
  41. Yeap, H. L., Endersby, N. M., Johnson, P. H., Ritchie, S. A., Hoffmann, A. A. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. Am J Trop Med Hyg. 89, (1), 78-92 (2013).
  42. Leftwich, P. T., Bolton, M., Chapman, T. Evolutionary biology and genetic techniques for insect control. Evol Appl. 9, (16), 212-230 (2016).
  43. Calkins, C., Parker, A. Sterile Insect Technique. Springer. 269-296 (2005).
  44. Tun-Lin, W., Burkot, T., Kay, B. Effects of temperature and larval diet on development rates and survival of the dengue vector Aedes aegypti in north Queensland, Australia. Med Vet Entomol. 14, (1), 31-37 (2000).
  45. Richardson, K., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S., Kearney, M. R. Thermal sensitivity of Aedes aegypti from Australia: empirical data and prediction of effects on distribution. J Med Ent. 48, (4), 914-923 (2011).
  46. Richardson, K. M., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S. R., Kearney, M. R. A replicated comparison of breeding-container suitability for the dengue vector Aedes aegypti in tropical and temperate Australia. Austral Ecol. 38, (2), 219-229 (2013).
  47. Ross, P. A., et al. Wolbachia infections in Aedes aegypti differ markedly in their response to cyclical heat stress. PLoS Pathog. 13, (1), e1006006 (2017).
  48. Gjullin, C., Hegarty, C., Bollen, W. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of Aedes mosquito eggs. J Cell Physiol. 17, (2), 193-202 (1941).
  49. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. Am J Trop Med Hyg. 94, (3), 507-516 (2016).
  50. Degner, E. C., Harrington, L. C. Polyandry depends on postmating time interval in the dengue vector Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 94, (4), 780-785 (2016).
  51. Bentley, M. D., Day, J. F. Chemical ecology and behavioral aspects of mosquito oviposition. Ann Rev Entomol. 34, (1), 401-421 (1989).
  52. Wong, J., Stoddard, S. T., Astete, H., Morrison, A. C., Scott, T. W. Oviposition site selection by the dengue vector Aedes aegypti and its implications for dengue control. PLoS Negl Trop Dis. 5, (4), e1015 (2011).
  53. Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Ann Entomol Soc Am. 57, (4), 468-472 (1964).
  54. Faull, K. J., Williams, C. R. Intraspecific variation in desiccation survival time of Aedes aegypti (L.) mosquito eggs of Australian origin. J Vector Ecol. 40, (2), 292-300 (2015).
  55. McMeniman, C. J., O'Neill, S. L. A virulent Wolbachia infection decreases the viability of the dengue vector Aedes aegypti during periods of embryonic quiescence. PLoS Negl Trop Dis. 4, (7), e748 (2010).
  56. Ross, P. A., Endersby, N. M., Hoffmann, A. A. Costs of three Wolbachia infections on the survival of Aedes aegypti larvae under starvation conditions. PLoS Negl Trop Dis. 10, (1), e0004320 (2016).
  57. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. J Vis Exp. (83), e3579 (2014).
  58. Benedict, M. The first releases of transgenic mosquitoes: an argument for the sterile insect technique. Trends Parasitol. 19, (8), 349-355 (2003).
  59. Lee, S. F., White, V. L., Weeks, A. R., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M. High-throughput PCR assays to monitor Wolbachia infection in the dengue mosquito (Aedes aegypti) and Drosophila simulans. Appl Environ Microbiol. 78, (13), 4740-4743 (2012).
  60. Corbin, C., Heyworth, E. R., Ferrari, J., Hurst, G. D. Heritable symbionts in a world of varying temperature. Heredity. 118, (1), 10-20 (2017).
  61. Day, J. F., Edman, J. D. Mosquito engorgement on normally defensive hosts depends on host activity patterns. J Med Ent. 21, (6), 732-740 (1984).
  62. Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial diets for mosquitoes. Int J Environ Res Public Health. 13, (12), (2016).
  63. McMeniman, C. J., Hughes, G. L., O'Neill, S. L. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti disrupts mosquito egg development to a greater extent when mosquitoes feed on nonhuman versus human blood. J Med Ent. 48, (1), 76-84 (2011).
  64. Caragata, E. P., Rances, E., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Competition for amino acids between Wolbachia and the mosquito host, Aedes aegypti. Microb Ecol. 67, (1), 205-218 (2014).
  65. Suh, E., Fu, Y., Mercer, D. R., Dobson, S. L. Interaction of Wolbachia and bloodmeal type in artificially infected Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. (2016).
  66. Thangamani, S., Huang, J., Hart, C. E., Guzman, H., Tesh, R. B. Vertical transmission of Zika virus in Aedes aegypti mosquitoes. Am J Trop Med Hyg. 95, (5), 1169-1173 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics