에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템

Bioengineering

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Summary

셀 무료 녹음 방송 번역 플랫폼의 새로운 세대 생화학 시스템에 생체 외에서 유전자 회로 실행을 통해 구성 설계 되었습니다. 이 문서에서는, 우리는 모든 대장균 세포 무료 TXTL 시스템을 사용 하 여 그들의 게놈에서 살 균 소 MS2, ΦΧ174, T7, 등는 합성 하는 방법을 설명 합니다.

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Rustad, M., Eastlund, A., Marshall, R., Jardine, P., Noireaux, V. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (126), e56144, doi:10.3791/56144 (2017).

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Abstract

셀 무료 전사-번역 (TXTL) 시스템, 더 큰 다양성 및 모듈화, 테스트 튜브 반응에서 기초 및 응용 과학을 수행 하기 위해 새로운 기능을 제공 하기 위해 설계 된의 새로운 세대. 지난 10 년간, TXTL 셀 무료 소설 종합 연구 분야 관련된 양적 및 합성 생물학의 광범위 한 범위에 대 한 강력한 기술 되고있다. 새로운 TXTL 플랫폼은 생성 하 고 합성 또는 자연 유전자 회로 실행을 통해 생화학 시스템 심문 특히 유용 합니다. 생체 외에서 TXTL 입증 정리로 빠르게 프로토 타입 규제 요소와 뿐만 아니라 생물 네트워크에 편리한 메커니즘 생활 시스템에서 발견 하는 자기 조립 분자. 이 문서에서 설명 하는 어떻게 전염 성 살 균 소, 등 MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), 그리고 T7 (dsDNA), 전적으로 모든 대장균, 셀 프리 TXTL 시스템을 사용 하 여 한 냄비 반응에 그들의 게놈에서 합성 됩니다. 3 coliphages의 합성 상 패 분석 결과 사용 하 여 정량 이다. 우리는 합성된 살 균 소의 수확량 반응의 생 화 확 적인 설정에 따라 결정 하는 방법을 보여줍니다. 던지다 8000의 제어 집중을 통해 에뮬레이션 분자 크롤 링, magnitudes의 명령에 의해 합성된 페이지의 금액에 영향을 줍니다. 우리는 또한는 페이지를 증폭 하는 방법 및 그들의 게놈을 정화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 및이 작품에서 제시 하는 결과 집합이 셀 무료 합성 생물학 및 생명 공학에 종합 연구 참여에 대 한 관심의 이어야 한다.

Introduction

지난 10 년간, 셀 무료 식 기술 긴급 종합 연구 분야 관련 합성 및 양적 생물학에서 주소 새로운 응용 프로그램을 설계 되었습니다. 원래 독립적인 생명체의 단백질을 표현 하는 데 사용, 새로운 셀 무료 TXTL 시스템 모두 기초 및 응용 과학1,2, 상당히이 기술의 범위 확대에 대 한 개발 되었습니다. TXTL 플랫폼의 새로운 세대는 사용자 친화적인, 수 있도록 설계 되었습니다 더 효율적 (도달 배치 모드3에서 단백질 합성의 2 mg/mL), 더 전사4의 수준에서 다양 하 고 게로 이렇게 모듈형 쉽게 통합 자연 소설 또는 기존 생물 학적 시스템5,6의 기능을 확장 하는 합성 함수. 특히, TXTL 시스템 셀 무료 되 규제 요소 등 작은 유전자 회로7,,89, 유전 프로그램의 신속한 프로토 타입에 대 한 편리한 디자인-빌드-테스트를 줄여 몇 일을 주기. 놀랍게도, 새로운 TXTL 시스템은 또한 큰 DNA coliphages10,11, 강한 활성 게놈의 재구성을 지원 하기 위해 충분 한 성과 보여주는 완벽 한 종합 프로그램을 처리할 수 DNA는 생활 엔티티 인코딩됩니다.

TXTL 시스템 전통적인 생체 외에서 건설적인 생 화 확 적인 분석 실험에 비해 많은 기술적인 장점을 제시. 셀-무료 TXTL 살아있는 세포의 복잡 한 세포질 반대로 감소 하 고 오픈 환경에서 최종 제품에 유전자 발현의 과정을 연결합니다. TXTL DNA를 사용 하 여, 현대 DNA 조립 기술,는 저렴 하 고 빠른 까다로운 단백질 정화 단계를 요구 하지 않는 뿐만 아니라 생화학 시스템에 생체 외에서재구성. 셀-무료 식 대부분의 생 화 확 적인 반응, 따라서12분자 상호 작용 깊은 해 부를 수 있도록 구성 요소에 대 한 직접 액세스를 제공 합니다. TXTL 반응에서 거의 불가능 한 살아있는 세포에 자유로이 생화학 및 생물 설정을 변경할 수 하나. 이러한 장점과 최근 개선을 감안할 때, TXTL 기술 합성 및 양적 생물학에 대 한 대체 플랫폼으로 더 많은 인기 되고있다. TXTL를 사용 하 여 연구 커뮤니티는 빠르게 성장 하는 동안 TXTL 바이오에 표준 기술 되 고, 그것은 TXTL 반응의와 실행에 관련 된 적절 한 전략을 개발할 수 있도록 같은 플랫폼을 사용 하는 방법을 이해 필수적입니다는 결과의 해석입니다.

이 문서에서는, 우리 모든 대장균 TXTL 시스템을 사용 하 여 그들의 게놈11, MS2 같은 살 균 소를 한 냄비 반응에서 합성 하는 방법을 설명 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), 및 T7 (dsDNA, 40 kb). 우리는 페이지의 금액 반응 (마그네슘과 칼륨 농도)의 생 화 확 적인 설정의 일부에 관하여 변화를 합성 하는 방법을 보여줍니다. 말뚝의 범위 8000 농도 통해 에뮬레이션 분자 크롤 링, 여러 자릿수로 이상 살 균 소 합성에 극적인 효과가. 동시에 전사, 번역의 과정을 정리 하 고 자기 조립, 생물학 및 물리학에 관련 된 기본적인 질문을 해결 하기 위한 흥미롭습니다 단일 테스트 튜브 반응에서 이러한 큰 생화학 시스템의 실현 10 (유전자 규칙, 자기 조립), 뿐만 아니라 새로운 nanostructures13구축 페이지 기능을 재사용 하는 등 응용 프로그램 개발에. TXTL에는 실용적, 뿐만 아니라 우리 패 분석 실험에 의해 살 균 소 증폭, 게놈 추출 및 정화, 살 균 소 정량화 방법 제공합니다. 이 원고에 표시 메서드에 대장균 추출 기반 셀 자유로운 시스템을 사용 하 고 살 균 소에 관심이 연구원에 적합 합니다.

이 작품에서 제시 하는 프로토콜은 다음과 같이 요약 될 수 있다: 1) 살 균 소 확대 (주 1: 접종 준비 세포, 주 2: 플 라크, 여러 살 균 소 성장, 고 농도, 및 3 일: 살 균 소의 정화), 2) 더블-좌초 게놈 DNA 추출 (페 놀/클로 프롬 추출), 3) 셀 무료 살 균 소 반응과 titer 실험 (주 1: 호스트 셀 접시 고 한 천 배지, 주 2: 셀 무료 반응 하 고 호스트 세포 사전 문화, 그리고 하루 3: 호스트 셀 문화 및 살 균 소 titer).

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Protocol

참고: 다음 증폭 단계와 추출 방법은 크게 받아들이기는 많은 이중 가닥 DNA 살 균 소, 예를 들어, 살 균 소 T7, enterobacteria 살 균 소 T4, 또는 enterobacteria 살 균 소 λ (L). 그들은 주로 그 게놈은 쉽게 상업적인 근원에서 구입할 수 있는 살 균 소 사용 됩니다.

1. 살 균 소 증폭

참고: 단일 플 라크, 멀티 사이클 (SPMC) 살 균 소 생산 기술은 잘 첸, 그 외에 T4 파지에 대 한 설명 14 다음 페이지 확대 및 DNA 추출 방법은 대장균 이중 가닥 DNA 페이지, 예를 들면, T7, T4, 또는 L와 함께 사용 하기 위해 일반화 프로토콜의 궁극적인 성공을 심하게 선택한 호스트 세포 변형에 따라 달라 집니다 ' superinfection 조건을 견딜 수 s. 경우 호스트 셀 superinfection, 아래 안정 또는 superinfection 결코 도달 하 고, 세포는이 중요 한 단계에 도달 하지, confluent 세포의 용 해 프로토콜 진행 최상 이다. 고속 원심 분리 및 살 균 소 ultracentrifugation 속도에서 산을 통해 세포질 파편을 분리 포함 됩니다. 다음 모든 조건 및 매개 변수는 일반적인 시작 지점으로는 위한 것입니다. 로컬 호스트 셀 라인에 대 한 최적의 조건을 수 있습니다; 확인 하 고 적절 한 조건 준수.

  1. 준비 접종 셀
    1. 대장균 호스트 셀, 15 mL 문화 관에 Luria Bertani (파운드) 미디어 10 mL를 접종 예를 들어, B 또는 K12.
    2. 250rpm, 37로 설정 통에 위치 ° C. 두고 하룻밤 채도 성장.
  2. 단일 플 라크, 멀티 사이클 살 균 소 성장 및 농도
    1. 유능한 살 균 소 패의 접시를 준비 하려면 따뜻한 1 h, 37 ° C에서 몇 파운드-한 천 배지 또는 하룻밤.
    2. 파운드 미디어, ~ 10-10 2 3 살 균 소/mL에 대 한 목표에서 알려진된 농도의 살 균 소 주식 (예를 들어, T7, T4, 또는 L)의 여러 희석 준비.
    3. 하룻밤 성장의 각 접시에 집중된 호스트 셀의 추가 100 µ L.
    4. 는 준비의 선택 볼륨 살 균 소 희석 10-100 페이지/접시에서 범위에 해당. 각 접시에 살 균 소 희석의 필요한 볼륨을 추가 (예를 들면, ml/10 3 페이지; 100 µ L이 ~ 100 플 라크 생성 한다). 37 ° C에서 번호판을 품 어 고 카운트 업 타이머 (+ 0 h)를 시작 합니다. 4-5 헤에 대 한 품 어
    5. 250 mL 플라스 크에 250 rpm을 37 설정 회전 통에서 49 mL 파운드 미디어 준비 ° c.
    6. 에서 + 2.5 h, 희석 49 mL 파운드 매체를 포함 하는 미리 데워 진된 플라스 크에 하룻밤 성장에서 포화 세포 배양의 1 mL을 추가 하 여 50 x 세포. 600에서 흡 광도 측정 하는 셀 로그 증가 (+ 4-5 h)에 도달, nm (OD 600). 1.0 = 8 x 10의 변환 OD 600을 사용 하 여 셀의 농도 결정 8 셀/mL.
    7. Dilute 2 x 10에 7 셀/mL 추가 파운드 성장 매체를 사용 하 여. 인큐베이터에서 살 균 소 패를 포함 하는 한 천 배지를 제거 합니다. 즉시 코어 단일 플 라크를 제거 하는 살 균 파스퇴르 피 펫의 끝을 사용 합니다. 희석된 셀에 플 라크를 불어와 추가 2 h (+ 6-7 h) 37 ° C에서 품 어.
    8. 1.5 mL 튜브, 추가 10 µ L 클로 프롬 (CHCL 3), 및 바로 고속 vortexing 500 µ L의 샘플을 취 함으로써 전체 감염에 대 한 테스트. 관찰 솔루션 명확히 했다. 일단 세포는 감염 완벽 하 게, 또 다른 2 시간 (+ 8-9 h) 품 어.
      참고: 셀은 완전히 감염 경우, 그들은 것입니다 빠르게 lyse (< 2 분) 솔루션을 명확히. 다른 결과 아래의 토론 섹션에서 간주 됩니다. 셀 superinfected 될 것입니다 하지만이 시점 lyse 하지 것 이다. 세포 시작, 원심 분리에 의해 수확 DNase 추가 페이지 저하를 방지 하기 위해 즉시 시작 해야 합니다.
    9. 추가 DNase 5 µ g/mL를 원심 분리기에 펠 렛을 4 ° C에서 8000 x g 세포. 폐기는 상쾌한. Resuspend 1 x TRIS 염화 마그네슘 (TM) (50 mM pH 7.8, 10 m m MgCl 2에서 트리 스) 10 mL에 펠 릿 5 µ g/mL DNase 버퍼. 세포를 lyse를 빠른 속도로 CHCL 3 및 소용돌이의 500 µ L를 추가 합니다. 4에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심 분리에 의해 명확히 ° C. Decant 15 mL 원뿔 튜브와 4에 게 상쾌한 ° c.

2. 살 균 소의 정화

참고: 자당 정화 크게 페이지의 크기에 따라 달라 집니다. 격리 살 균 소의 질량에 대 한 고려 사항을 만들 수 있고 그라데이션 조건에 조정 수행. 10 13 살 균 소/mL의 최종 바이러스 titers는이 방법으로 쉽게 달성.

  1. TM 버퍼 x 1에서 5%와 45 %w / v 자당의 12 mL 준비.
  2. Pipetting 2.5 mL 4 ultracentrifuge 튜브 45% 자당의 의해 준비 4 x 5-45% 자당 기온 변화도. 와 최고 ~ 5% 자당, 액체 튜브의 가장자리에서 2mm에 도달 하면 중지의 2.6 mL.
    참고: 자당 솔루션의 표면 접촉 피 펫 팁 놓고 아주 천천히 액체 분배 합니다. 라이터 자당 솔루션은 부동의 위에 무거운, 뚜렷한 경계를 형성. 배경 조명에 대 한 개최 하는 경우 제대로 계층된 솔루션 ~ 1 mm 인터페이스를 해야 합니다.
  3. 43 악기를 형성 그라디언트를 사용 하 여 기울기 튜브 회전 하 여 그래디언트를 섞어 23 rpm에서 86 ° s. 즉시 필요한 경우, 파라핀 영화와 함께 커버 하 고 저장 4 ° c.
  4. 각 위에서 제거 500 µ L 준비 1 mL pipettor와 ± 0.002 g. 내 균형 자당 그라데이션
  5. 수영장 살 균 소 정지 모든 튜브 (1.2.9 단계)에서. 1 mL 피 펫을 사용 하 여, 액체 표면 접촉 팁을 가져오고 매우 느리게 빠른 pipetting 통해 혼합 하지 않도록 주의 되 고 자당 기온 변화도의 상단에 볼륨을 분배 하 여 현 탁 액의 500 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 20 분 동안 70000 x g에서 원심 분리기
    참고: 균형 ± 0.002 g. 작은 페이지 내에 준비 된 그라디언트 걸릴 수 있습니다 최대 1 h.
  6. 멸 균 주사기와 무딘 정을 사용 하 여 살 균 소 밴드 제거.
    참고: 측면에서 볼 때 살 균 소 밴드 두께 하얀 주변, 높이 약 5 m m에 비해 되며 원심 분리기 튜브 아래로 절반 방법 위치. 끝까지 솔루션으로
    1. Submerge 무딘 정 살 균 소 밴드의 매우 위쪽 가장자리에 중심 이다. 살 균 소 밴드의 대부분 제거 되었습니다 때까지 주사기 플런저에 그려서 밴드 제거.
  7. 중단된 페이지와 자당 볼륨 3-4 ultracentrifuge 관을 추가. 더 이상 1.5 mL/튜브를 추가 합니다. 3-4 mm 감기 1 튜브의 상단에서에서 채우기 TM x. 파라핀 영화와 함께 표지 및 혼합 반전. 장소는 ultracentrifuge 및 4 ° C에서 1 h 145000 x g에서 스핀에 다시 펠 렛. 작은 페이지 2 h. 최대 걸릴 수 있습니다
  8. 는 신속 하 게 부는 상쾌한 어 및 일회용 물티슈에 거꾸로 드레인. 초과 상쾌한 제거를 멸 균 면봉으로 튜브의 내부를 닦아.
  9. 분할 200-400 µ L 찬 1 x 모든 TM 펠 릿 및 4 ° C에서 하룻밤 resuspend; 아무 떨고 하는 것이 필요.
    참고: 펠 릿 깨끗 하지 않으면 예를 들어, 힘 줄 비트 막의 DNA, , 수영장 및 17000 x g.에서 microcentrifuge에 추가 원심 분리를 수행
  10. Titers, 하기 전에 하루 10 mL 파운드 성장 매체에 대장균 호스트 세포의 문화를 준비 하 고 하룻밤 250rpm, 37 ° C로 설정 떨고 인큐베이터에서 두고. 살 균 소의 titers를 하기 전에 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 배양 배지의 적절 한 금액을 품 어.
    참고: 품 어에 번호판의 번호 도금을 살 균 소의 희석 수에 따라 달라 집니다: 살 균 소의 각 고유 희석 두 문화 접시 필요 합니다 (예를 들어, 살 균 소의 4 개의 다른 희석 필요 8 문화 접시).
  11. 100 mL 병에 2.5 g 파운드와 0.6 g bacto-agar를 추가 하 여 최고 한의 100 mL를 준비 합니다. 이온된 물 100 mL 및 오토 클레이 브의 볼륨에 있는 고체를 용 해. 압력솥, 후 천천히 반전 병 6-8 시간 균질 솔루션에 걸쳐 천 하. 45 ° C 물 목욕 온도 . equilibrate 15-20 분에 병을 배치
  12. 직렬 희석 살 균 소 주식 파운드 솔루션의 준비. 100 희석에 대 한
    1. 추가 990 µ L 파운드 10 µ L 살 균 소 주식. 균질에 소용돌이입니다. 10 배 희석, 900 µ L를 100 µ L 살 균 소 주식의 추가 균질을 파운드 소용돌이.
    2. 위의 희석 시리즈 패 (10-100 패)의 수 수를 얻는 데 필요한 횟수 만큼 반복.
      참고:이 위해 희석 살 균 소 주식 2-3 배나 살 균 소/mL 반응 측면에서 예상된 살 균 소 수확량 보다는 더 적은. 예를 들어 특정 페이지 사진 11 전염 성 살 균 소/10ml 들어 접시 살 균 소 주식 10에 8-배 또는 10 9-희석 배.
  13. 14 mL 문화 관 (문화 관의 수 = 도금을 살 균 소 재고 희석 수)를 조립 하 여 살 균 소 titers에 대 한 영역을 준비. 얼음에 단계 2.12에서에서 희석된 살 균 소 재고 샘플 단계 2.10에서에서 호스트 세균성 세포를 배치
  14. 준비 마스터 믹스 pipetting 5.25 mL 최고 천 (단계 2.11), 여 220 µ L 희석 살 균 소 샘플 (2.12 단계), 및 50 µ L 호스트 세균성 세포 (단계 2.10) 14 mL 문화 관. 문화 관 및 높은 속도 소용돌이 모자.
    1. 4에서 나머지 페이지 솔루션을 저장 ° c.
  15. 두 문화 접시 (단계 2.10) 37 ° C 배양 기에서 검색. (거품) 없이 첫 번째 접시의 중앙에 천천히 마스터 믹스의 2.5 mL를 추가 합니다. 부드럽게 있도록 그것은 전체 문화 접시에 걸쳐 마스터 믹스를 균등을 손으로 접시를 회전 합니다. 두 번째 접시와 함께 반복 합니다. 최고 한의 응고 되도록 20 분 기다립니다. 4-7 h. 위해 37 ° C에서 번호판을 품 어
  16. 는 플 라크를 계산 하 고 각 반응 샘플에 대 한 살 균 소 농도 결정.
    참고: 패 호스트 세포의 불투명 한 카펫에 1-2 m m 분명 원으로 표시 됩니다. 대표 결과 그림 1을 참조 하십시오. 성공적인 살 균 소 생산 10 12-10 13 살 균 소/mL의 최종 농도에서 발생 합니다.

3. 더블-좌초 게놈 DNA 추출

참고: 희석, 떨고, 원심 분리 단계 페 놀 및 수성 단계 사이 경계층 두께, 단단한 단백질 개발을 최적화 해야 합니다. 이 단백질 오염 물질이 면제 되 가장 높은 순도 게놈 생성 합니다. 초기 희석 최종 페이지 titer에 따라 달라 집니다. 매우 높은 titer 살 균 소 주식 (≥ 10 13 살 균 소/mL) 낮은 titer 주식 (10 ~ 10-10 11 살 균 소/mL)만 할 수 있습니다 하는 동안 추출, 전에 10 20 배 희석 할 수 있습니다는 2-fold 또는 없음. 이후 단계에서 단단한 단백질 층을 형성 하기가 수성 현 탁 액은 너무 끈 적 높은 DNA 농도 때문에 실행할 수 있을 경우 계속 추출 하기 전에 살 균 소 주식의 높은 희석을 고려 하십시오. 게놈-처리 단계 때 어떤 pipetting 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하는 것이 중요 하다 수성 단계. 많은 살 균 소 게놈은 매우 크고 쉽게 피 펫 전단 통해 조각난. 또한, 어떤 vortexing 피해 야 한다 명시적이 심각 하 게 게놈을 기울일 것입니다.

  1. 신선한 1.5 mL 튜브에 TM 버퍼 x 1 단계 400 2.9 µ L에서 살 균 소의 일부 희석.
  2. 희석에 Tris:Phenol:Chloroform의 동일한 볼륨을 추가합니다. 5 분 원심 결과 유제 5-10 분 위한 벤치탑 원심 분리기에 17000 x g에 대 한 실험실 로커에 부드럽게 또는 손으로, 혼합물을 흔들어
    참고: 기본 페 놀 위상의 표면에 뚜렷한, 흰색 단백질 층은 존재.
  3. Interphase 경계를 방해 하지 않도록 주의 복용 새로운 튜브를 위 수성 단계 제거.
  4. 3 페 놀 추출의 총 단계 3.2 3.3 추가 2 회 반복 한다. 신선한 튜브에 수성 단계를 전송 하 고 CHCl 3의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 쉐이크 하 고 원심 (3.2 단계)입니다. 깨끗 한 관을 수성 DNA 샘플을 전송.
  5. 순화 된 DNA의 볼륨 견적. 3 M 나트륨 아세테이트 (채널 3 COONa)의 0.4 볼륨 및 95% 에탄올 (EtOH)의 3 볼륨을 추가 합니다. 1 박 강 수-20 ° C 냉장고에 넣습니다. 10-15 분 위해 벤치탑 원심 분리기에 17000 x g에서 원심 분리기
    참고: DNA 즉시 탈수 되며 튜브에 정지에서 질량으로 표시 됩니다. 적절 한 결과 펠 릿은 흰색과 잘 튜브의 하단에 대 한 포장.
  6. 제거 하 고 상쾌한 decanting 또는 pipetting 삭제. 추가 500 µ L 70 %EtOH 펠 릿 수레 무료 튜브의 바닥에서 때까지 부드럽게 튜브를 흔들어. 5 분 제거에 대 한 17000 x g에서 원심 및 삭제는 펠 렛을 방해 하지를 돌보는 EtOH.
  7. 반복 단계 3.6입니다. 공기 건조 30-60 분 추가 50 µ L ddH 2 O는 펠 릿을 위해 벤치탑에 펠 릿 RT에 1 시간에 대 한 품 어 또는 resuspend에 4 ° C에서 하룻밤. 280에서 흡수 측정을 사용 하 여 DNA 농도 결정 nm.
    참고: 예상된 농도 0.5-5 µ g / µ L이이 기술을 사용 하 여. 총 게놈 분자 무게 마지막 게놈 농도 결정 하 여 분할.

4. 셀-무료 살 균 소 반응 및 살 균 소 Titer 실험

  1. 25 g 파운드 매체와 15 g bacto-한 천 고체를 준비 하 고, 1 L 병에 부 어 하 고 이온된 수 1 L. 압력솥 추가.
  2. 살 균 후 병 거품의 형성 되지 않도록 천천히 6-8 회 복용 주의 반전. 병 반전 1 L 솔루션에 걸쳐 한 천 고체를 균질 것입니다. 전에 문화 접시에 분배 병 20 분 58 ° C 물 욕조에 배치.
  3. 파운드-한 천 해결책의 온도 equilibrated 일단 오픈 문화 접시 근처 환경 소독 문화 접시 옆 화 염을 준비 합니다. 1 리터 병은 aliquots을 만드는 동안 한 천의 응고를 피하기 위해 물 목욕 하십시오. 100 m m x 15 m m 문화 접시에 25 mL를 추가 합니다. 1 L 40 배양 배지를 생산할 예정 이다.
  4. 하나 문화 접시를 마련해 고 RT에서 적어도 1 시간에 대 한 응고;이 접시 호스트 셀을 도금 하는 데 사용 됩니다. 다른 39 문화 접시 실시간 매장에서 4 ° C에서 2 일 동안 응고 또는 즉시 titers를 만들기를 위해 사용 하자.
  5. 질주 적절 한 박테리아 스트레인 (예를 들어, 호스트에서 호스트 셀 접시 B t 7에 대 한)를 파운드-한 천 문화 접시에-80 ° C에 저장 된. 환경 오염을 방지 하는 화로 옆 행진. 37 ° c.에서 밤새 품 어 호스트 세포는 항 생 저항 그래서 무 균 환경에서 작업 하는 것은 필수적 이다.
  6. 셀 무료 반응
    참고: 셀 무료 TXTL 반응 원유 대장균 반응 버퍼 및 살 균 소 게놈의 구성 다른 67% (8.9-9.9 mg/mL 단백질)을 추출 하는 33%의 구성 됩니다. 원유 추출 기술된 15 , 16 이전으로 준비 된다. 최종 반응 조건: (원유 추출)에서 8.9-9.9 mg/mL 단백질, 각 아미노산, 앞에서 설명한 17, 그리고 설명 하는 에너지 믹스 솔루션 준비의 3-6 m m Mg-조미료, 40-100 m m K-조미료, 2-4% 말뚝 8000, 3-4 m m 15, 0.33 3.33의 구성 하는 이전 m m DTT, 50 mM HEPES, 1.5 m m ATP와 GTP, 0.9 m m CTP 및 UTP, 0.2 mg/mL tRNA, 0.26 m m CoA, 0.33 m 나드 m, 0.75 m m 캠프, 0.068 mM folinic 산, 1 m m spermidine, 및 30 m m 3-PGA. 그리고 DNA 형 페이지 필요 게놈 농도 0.5-10 nM의 RNA 형 페이지 50-150 nM의 범위를 필요로 합니다. 최종 반응 농도 합성 특정 페이지에 고유 하 고 위에서 설명한 범위에 속하는 것 이다. 반응의 최적의 산소, 최종 반응 볼륨 µ L 10-20 사이 여야 합니다. 게놈 분자의 형태에 따라 반응 프로토콜에서 작은 변이가 있다. 예를 들어 선형 게놈 분자 recBCD 효소 원유 추출에 의해 선형 DNA 조각의 소화를 억제 하기 위해 반응에 추가 구성 요소가 필요 합니다.
    1. 완료는 " 반응 정보 " 반응의 총 수와 반응의 최종 볼륨을 입력 하 여 표 1 (PhageTXTL_JOVE) 섹션.
    2. 일정 구성 요소와 반응의 가변 구성 요소를 결정 하 여 실험을 디자인 합니다. 최종 반응 볼륨 및 샘플 수의 제품에 지속적인 반응 구성 요소의 총 볼륨의 비율은 마스터 믹스의 소수 볼륨 비율을 입력 합니다. 주식에서 반응 시 약의 최종 농도 입력은 " 마스터 혼합 반응 레시피 " PhageTXTL_JOVE에 섹션. 재고 및 테스트할 변수 reagent(s)의 최종 농도 입력.
      참고: 구성 요소 반응의 볼륨 자동으로 계산 됩니다 마스터 믹스 볼륨 및 각 개별 반응의 최종 볼륨에 따라.
    3. 튜브의 필요한 금액을 제거 (표시는 " 해 동 관 " PhageTXTL_JOVE.xlsx의 섹션) 원유 세포 추출 물, 에너지 버퍼 믹스, 아미노산 믹스-20 ° C 또는-80 ° C와 얼음에 녹여
      참고: 한 번 해 동, 결합 하 여 구성 요소와 같은 여러 aliquots의 (필요한 경우).
    4. 약 원유의 표시 된 볼륨 수 추출, 최종 반응 볼륨의 33%에 microcentrifuge 튜브.
    5. 표 1에 의하여 마스터 믹스를 준비합니다. 모든 구성 요소에서 균질 " 마스터 혼합 반응 제조 법 " vortexing에 의해. 각 구성 요소의 적절 한 볼륨을 원유 추출 추가.
    6. 선형 DNA 게놈 (예를 들어, T7)로 살 균 소를 사용 하는 경우 반응 11 살 균 소 lambda의 gam 단백질의 1 개의 µ M를 추가 합니다. 5 분 동안 얼음에 반응을 균질 솔루션, 소용돌이. 이 원유 추출에서 생은 복잡 한, recBCD에 의해 선형 DNA 조각의 소화 억제.
    7. 표 1에 따라 마지막 구성 요소를 추가한 후 균질 반응 vortexing에 의해. N microcentrifuge 튜브로 마스터 믹스 분할.
      참고: 각 분할의 볼륨은 소수 마스터 믹스 볼륨 비율 제품과 반응의 최종 볼륨. 예를 들어 90%의 소수 마스터 믹스 볼륨 비율 및 12 µ L의 최종 반응 볼륨, 각 분할의 볼륨은 10.8 µ L.
    8. 마스터 혼합 배열 가변 구성 요소의 표시 된 볼륨을 추가 (표 1 참조). 원하는 최종 반응 볼륨에 연결할 각 반응 물을 추가 합니다. Vortexing에 의해 각 반응 균질. 적어도 8 h 또는 하룻밤에 29 ° C에서 microcentrifuge 튜브를 품 어.
  7. 호스트 셀 사전 문화
    참고: 하룻밤 사전 문화는 되도록 titer 실험에 사용 되는 호스트 세포 감염 효율성을 증가 하는 중앙 로그 단계에 희석된 50: 1. 중간 로그 셀 다음 다시 10 배 하 여 집중 하 고 얼음에 저장.
    1. 5 mL 파운드 3-5 건강 셀 식민지와의 문화 관을 예방 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여. 오염을 방지 하는 화로 옆 일.
    2. 16 h 또는 하룻밤에 대 한 37 ° C, 250 rpm에서 떨고 인큐베이터에 문화 관을 품 어. 셀 다음 날에 의해 채도 단계를 도달할 수 있다.
  8. 셀 문화와 샘플 준비 페이지 titer 호스트
    1. 50ml 파운드 500 mL 삼각 플라스 크와 커버에 알루미늄 호 일을 분배. 20 분 동안 37 ° C에 플라스 크를 따뜻한
    2. 는 호스트 셀 하룻밤 사전 문화는 미리 데워 파운드 품 어 37 ° C에서 3-4 h 및 250 rpm에서 진동으로 aliquot 1 mL.
    3. 분리기 50 mL 호스트 세포 배양 5000 x g.에서 10 분에 대 한 삭제는 파운드
    4. 감기 (4 ° C) 5 mL 파운드와 펠 릿을 resuspend 하 고 얼음에 계속
    5. Titer 실험을 시작 하기 전에 1 시간 37에서 배양 배지를 품 어 ° c.
      참고: 각 고유 살 균 소 반응 (및 해당 희석 요인) 두 접시를 활용 합니다. 또한, 실험 컨트롤 (대표 양수 및 음수 컨트롤 그림 1 참조)에 대 한 4 접시를 품 어.
    6. 가기 천 (단계 2.11) 100 mL를 준비.
  9. 2.12 섹션에 설명 된 대로 파운드 솔루션 셀 무료 반응의 직렬 희석 준비.
  10. 살 균 소 titer
    참고: 문화 요리는 적어도 1 시간에 대 한 인 큐베이 팅 하 고 최고 agar는 압력솥에서 제거 후 15-20 분 동안 45 ° C 물 욕조에는 접시를 시작 합니다.
    1. Titer 마지막 셀 무료 반응 파운드 솔루션 2에 설명 된 대로 단계 2.14-2.16.

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Representative Results

우리는 4 개의 대표적인 결과 보여줍니다. 그림 1에서는 셀 무료 TXTL 시스템 및 살 균 소 DNA 주식 생활 오염 되지 되도록 부정적인 컨트롤 집합 소개 대장균 세포. 우리 셀 무료 TXTL 시스템은 그대로 대장균 의 무료 확인 모두 비 인 큐베이 팅 및 incubated 반응 솔루션 genomic DNA (그림 1A그림 1B)의 무효를 도금 하 여 오염 셀. 경우 셀 무료 TXTL 시스템 대장균 세포 오염 되었다, 성장 접시에 관찰 될 것 이다. 또한, 우리 확인 셀 무료 반응 그리고 그러므로 어떤 가능한 오염 물질 셀, 살 균 소의 합성에 대 한 책임 도금 살 균 소 게놈 (그림 1C와 비 인 큐베이 팅 및 incubated 반응 하 여 그림 1D). 플레이트 비 incubated 반응 (그림 1C) 표시 제로 플 라크 incubated 반응 (그림 1D) 플레이트 표시 셀 무료 TXTL 시스템은 살 균 소에 대 한 책임을 나타내는 패 합성입니다.

그림 2에서 우리는 균질 휘도가 패 분석 결과 대 비교합니다. 그림 2 B 그림 2A에서 접시의 균질 플 라크 밀도 비해 최적의 문화 접시에 걸쳐 패 밀도의 그라데이션을 보여 줍니다. 이 소스 관찰 결과 최고 천, 샘플 및 호스트 세균성 세포의 실험의 살 균 소 titer 부분 문화 접시에 적절 하 게 때 마스터 믹스의 급속 한 냉각에서. 살 균 소 패의 휘도가 확산을 피하기 위해, 배양 배지는 살 균 소 titer 실험을 시작 하기 전에 37 ° C에 equilibrated 확인 합니다.

플레이트 (그림 3) 당 50 그리고 200 패 사이 충분히 살 균 소 솔루션을 희석을 제대로 페이지를 계산 하는 중요 한 단계가입니다. 이 범위 아래의 어려운 사실 통계를 확인 하 고 이상이 범위는 플 라크 중복, 정확한 조사를 방지. 페이지 TXTL에 합성 수는 소금 (칼륨과 마그네슘), 분자 되어의 그리고 게놈의 농도 같은 생 화 확 적인 설정에 따라 다릅니다. 그림 4에서 우리는 T7, ΦΧ174 페이지에 대 한 테스트의 몇 가지 예를 보여줍니다. T7, 등의 DNA를 복제 하는 살 균 소에 대 한 우리 셀 무료 반응에서 살 균 소 종합의 높은 효율을 관찰: 반응에서 게놈 분자 당 3 개의 전염 성 페이지 합성 됩니다. 하나는 ΦΧ174 등의 DNA를 복제 하지 않는 페이지에 대 한 반응의 낮은 효율을 기대할 수 있습니다: 합성된 전염 성 살 균 소 게놈 분자의 비율은 1:5.

Figure 1
그림 1: 패 분석 결과 컨트롤 및 셀 무료 반응 (CFR) 시스템을 사용 하 여 성공적인 전염 성 살 균 소 생산. (A) 아무 게놈 추가 되었습니다 하 고 CFR의 아무 보육 (보육 시간 0 분) 수행 되었다. 반응 다음 호스트 대장균없이 도금 했다. 결과 CFR의 셀 오염 없음 가능한 호스트를 보여줍니다. (B) 아무 게놈 추가 되었고 CFR 29 ° C에 12 h incubated 호스트 대장균없이 도금. 결과 셀 오염 CFR, 부 화 후에 아무 가능한 호스트를 보여줍니다. (C) 1 nM 게놈 CFR (보육 시간 0 분)의 아무 인큐베이션에 포함 된 및 호스트 대장균으로 도금. 결과 게놈 솔루션의 살 균 소 오염을 없이 보여줍니다. (D) 1 nM 게놈 포함 및 CFR incubated 29 ° c.에 12 h 그리고 호스트 대장균도금. 결과 CFR에 성공적인 전염 성 살 균 소 복제를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 균질 titer 실험 기간 동안 살 균 소 반응의 휘도가 확산 대. 37 ° C의 온도에 equilibrated 하지 문화 접시에 살 균 소 titer를 수행의 효과 가능한 문화 접시에 걸쳐 살 균 소 반응의 휘도가 확산 이다. 살 균 소 반응의 균질 확산을 표시 하는 좋은 결과 (A)에 표시 되는 플 라크는 격판덮개의 표면에 걸쳐 고르게 배포 됩니다. 최적의 결과 (B)에 표시 되는 플 라크 문화 접시의 왼쪽 아래 부분에 집중 된다. 이 상단-한 천, 살 균 소 반응, 그리고 호스트 셀 마스터 믹스는 37 ° c.의 온도 문화 접시에 적절 하 고 발생할 수 있습니다. 믹스 마스터의 대부분 왼쪽 지역에서 굳은 그리고 균질 확산은 불가능 하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 셀 무료 살 균 소 반응의 titers에 대 한 적절 한 희석 요소가 설정. (A)이이 판 플 라크의 합리적으로 셀 수 있는 숫자를 표시 합니다. 실험의 titer 부분에 사용 되는 희석 요소 희석 접시에 plaques의 수 수를 두고 충분히 살 균 소 반응의 수확량. 반대로 (B) 희석 요소 합성된 살 균 소의 수확량에 관하여 너무 낮은 그리고 조정 될 필요가 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 페이지의 셀 무료 합성의 특성 ΦΧ174 및 t 7. (A) 합성된 ΦΧ174 T7 페이지의 번호 (PFU/mL: plaque 밀리 리터 당 형성 단위)의 함수 던지다 셀 무료 반응에서 8000 농도 측정 후 16 h 29 ° c.에 외피의 셀 무료 반응에서 마그네슘 조미료 농도의 기능으로 합성된 ΦΧ174 T7 페이지의 (B) 수 16 h 29 ° c.에 외피의 후 측정 ΦΧ174 셀 무료 반응에서 DNA 게놈 농도의 기능으로 합성된 ΦΧ174 살 균 소의 (C) 수 16 h 29 ° c.에 외피의 후 측정 (D) 수 셀 무료 반응에서 T7 DNA 게놈 농도의 기능으로 합성된 T7 페이지의 29 ° c.에 외피의 16 h 후 측정 모든 오차 막대 표시는 3 개의 반복된 실험의 표준 편차입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Table 1
표 1: 반응 구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

첸, 그 외 에 기술에 따라 SPMC에 대 한 14 , superinfection 적절 한 조건을 결정할 때 중요 한 단계에 도달입니다. 가장 가깝게 superinfection 견딜 호스트 스트레인의 능력을 제어 하는 매개 변수 자주 감염 살 균 소의 초기 농도 이다. 호스트 세포는 살 균 소의 아주 작은 금액을 초기 감염 전에 대 수 성장 단계에 있어야 합니다. 결국, 페이지 또한 로그 성장을 도달 하 고 목표 살 균 소 숫자 빠르게 셀 카운트, 각 호스트 셀에 페이지의 여러 복사본에 대 한 허용을 능가 하는. 이렇게 하면 어디 그것은 세포의 용 해를 받게 될 것 이다 준 안정 상태로 셀. 이 상태에 도달 하지 경우 셀 연계, confluent 세포를 받아야 하 고 그들의 바이러스 부하를 풀어 것입니다. Superinfection 위의 초기 바이러스 농도 사용 하 여 연결할 수 없습니다, 후속 시도 하기 전에 10의 요인에 의해 감염의 초기 다양성을 낮은. 수확을 하기 전에 호스트 셀 lyse 할 superinfection에 도달 하지 경우에, 즉시 별도 정화 절차 진행. DNase를 추가 나 5 µ g/mL를 500 µ L CHCl3 모든 세포 세포의 용 해를 마무리 하. 계속 해 서 추가 5 분 소용돌이 다음 세포 파편을 제거 하려면 10000 x g에서 원심. 가만히 따르다와 작은 페이지를 하룻밤 4 ° C에서 1 mL 전체 1 x TM 버퍼에 동요 하지 않고 resuspend 1-2 h에 대 한 75000 x g에서 상쾌한 원심. Superinfection 셀의 작은 볼륨을 사용 하 여에 대 한 테스트, 얼마나 가까운 세포에 의해 얼마나 빨리 그들은 때를 lyse 세포에 노출 되는 추가 된 클로 프롬을 측정 가능 하다. 세포를 lyse 해결책 거의 즉시 명확히 하는 경우에, 세포 벽은 매우 불안정 하 고 셀 대규모 캐스케이드 세포의 용 해를 방지 하기 위해 즉시 수확 해야 한다. 테스트 1-3 분 이내 lyses, 큰 볼륨 사용에 대장균 의 로컬 변형에 따라 최대 2 h에 대 한 superinfect을 계속 수 있습니다. 셀 5 분 이내 lyse 하지 않습니다, 경우 살 균 소 성장 하지 잡 았 있다 E. 콜라이 성장 하 고 기본 보육 계속 해야 합니다. 30-60 분에 테스트를 다시 수행 합니다.

준비 된 자당 기온 변화도에 살 균 소 정화, 페이지 1/3와 튜브 아래 방법의 2/3 사이 매우 두꺼운, 진주빛 밴드로 표시 됩니다. 비교적 성공적인 세포 및 세포 잔해 정화 단계 가정, 거기 그러나 비슷한 밀도 또는 크기의 아무도 다른, 밴드 있을 수 있습니다. 큰, 불투명 밴드 페이지를 포함 하 고 멸 균 주사기와 무딘 정 솔루션에서 제거 하는 것입니다.

프로토콜, 셀 무료 반응 및 살 균 소 titer의 세 번째 섹션을 시작 하는 때 (3.5 단계)에서 호스트 박테리아 플레이트 및 배양 배지 (3.21 단계)에서 titer 분석에 사용 신선한 배양 배지 (미만 1 주 이전)를 사용 하 여 최상 이다. 이 호스트 박테리아 세포 및 살 균 소 titer에 대 한 더 높은 감염 효율의 강한 성장을 촉진 합니다. 살 균 소 배양 배지 살 균 소 titer 부분의 프로토콜을 시작 하기 전에 1 h의 최소 37 ° C에서 미리 incubated 해야 합니다. 살 균 소 문화 접시의 사전 인큐베이션 없이 가기-agar 솔루션 (합성된 살 균 소 및 호스트 세포 배양 포함) 균질 문화 접시의 표면에 걸쳐 배포 하지 것 이다. 대신, 상단 한 솔루션 것입니다 (그림 2b) 표면에 공고히 균질. 이 셀 무료 반응에서 살 균 소의 과소 평가 일으킬 수 있는 여러 페이지에 같은 자리, 지역화의 확률을 증가 시킵니다.

각 패 1 합성된 살 균 소 주인 세포 내에서 복제 하 고 호스트 세포를 lysing 주인 세포를 감염의 이벤트를 나타냅니다. 플 라크는 자손 살 균 소 감염 이웃 호스트 세포에서 초기 감염 이벤트에서 잠복기 동안 크기에서 성장 한다. 아무 플 라크, 관찰 하는 경우 프로토콜 섹션 4.6에서 희석 요인이 너무 높은 어떤 합성된 살 균 소 주인 세포를 감염 하는 낮은 확률의 결과 가능 하다. 이 문제를 해결 하려면 3-4 배나 (또는 필요에 따라) 희석 비율을 감소 하 고 titer 실험을 반복 합니다. 반대로, 희석 비율 너무 높은 패 문화 접시의 전체 표면에 걸쳐, 살 균 소 수율 계산 불가능에 결과 수 있습니다. 이 경우에, 3-4 배나 (또는 필요에 따라) 희석 비율을 증가. 특징이 잘 페이지에 대 한 셀 무료 반응의 수확량은 알려질 것 이다 하 고 반응 포인트 당 하나만 희석 요소 titer 실험에 필요한 됩니다. 새로운 살 균 소 특성화 때 반응 포인트, 하나는 희석 수 패를 얻을 것입니다 보장 당 2-3 다른 희석 요소를 포함 하도록 최상 이다 (참조 그림 3 패의 수 및 셀 번호 간의 차이 대 한 플레이트)입니다.

아니 패 살 균 소 titer의 희석 비율을 수정한 후 관찰 되는 경우이 셀 무료 반응 되지 않았음을 성공적인 유전자 발현 발생 하지 않은 나타낼 수 있습니다. 이 대 한 가능한 설명 시 약/살 균 소 DNA 때문에 vortexing에 의해 셀 무료 반응의 균질의 구조적 손상 될 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 반응을 반복 하 고 부드럽게 반응 관 5 ~ 7 배를 손가락으로 두 드려서 또는 천천히 5 ~ 7 배는 피 펫과 함께 반응 혼합 하 여 균질.

셀 무료 반응 시스템 대장균 에서 유래 하 고 endogenously 모두 대장균 RNA 중 합 효소 및 포함 기본 시그마 요인, 시그마 70, 주요 발기인 합의 인식 하는 데 필요한 holoenzyme를 결합 하는 대장균 유전자의 시퀀스입니다. 또한, 셀 무료 반응 시스템 것 시그마 70의 발기인 합의 순서에서 다른 6 개의 대장균 시그마 요인 유전자를 제공 하 여 전체 시그마 요인 녹음 방송 체계를 정리 수 있습니다. 이 모든 살 균 소의 유전자는 대장균의 전사/번역 기계와 호환을 합성 하는 기능을 수 있습니다. 이 공부 하거나 셀 무료 반응 시스템 활용 여기와 합성 수 없는 살 균 소의 하위 집합에 밖으로 나뭇잎.

셀 무료 전사/번역 플랫폼 제어의 인상적인 수준과 vivo에서 학문의 방법에 비해 반응 조건의 유연성에 대 한 수 있습니다. 우리 살 균 소 반응의 많은 생화학 및 유전 구성 요소를 정밀 하 게 조정 하 고 분자 크롤 링에 대 한 그림 4 와 같이 24 시간 미만에 효과 직접 관찰할 수 있습니다. 말뚝에 같은 분자 되어 효과 자기 조립 고분자 복합물의 되어 이론적으로 설명 하 고 검증 된 시험관에18,,1920. 분자 크롤 링 하는 것은 큰 바이오 구조 협회 상수를 증가 시키는 메커니즘을 구동 하는 엔트로피 이다. 셀-무료 접근 연구원을 살 균 소, vivo에서 작품의 본질적인 제한 없이 같은 모델 시스템으로 자기 조립의 물리학 같은 복잡 한 생물 학적 과정을 수 있습니다.

이 플랫폼은 또한 적용된 분야에 페이지의 유틸리티의 조사에 대 한 수 있습니다. 살 균 소 게놈의 구성 요소 다른 용도로 고 소설 nanostructures 결과 통합의 목표와 셀 무료 반응 시스템에 신속 하 게 테스트 될 수 있습니다. 살 균 소는 호스트 세포 감염, 항생제 내성 박테리아에 대 한 대 안으로 살 균 소 치료의 유틸리티를 홍보 것의 선택도 증가 시키기 위해 수정할 수 있습니다.

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Disclosures

저자 선언 다음 경쟁 금융 interest(s): Noireaux 실험실 MYcroarray, MYtxtl 셀 무료 단백질 식 키트의 대리점에서에서 연구 자금을 받습니다.

Acknowledgements

이 자료는 해군 연구 사무실 보너스 번호 N00014-13-1-0074 (V.N.)를 지 원하는 작업을 기반으로, 인간 프론티어 과학 프로그램 부여 번호 RGP0037/2015 (V.N.), 그리고 한국군 과학 재단 부여 2014400 (V.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifugation tubes Beckman Coulter 344057
Conical tubes Falcon 352070
Gradient maker BioComp Gradient Master see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula Monoject 8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips Fischerbrand 02-707-134
Plaque counter New Brunswik Scientific Colony Counter Model C-110
Culture tubes Fischerbrand 14-961-33
Cell-free system Mycroarray Inc Mytxtl
BioComp Gradient Master BioComp Instruments Model 105ME
LB agar plate recipe 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

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References

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