वीवो में Trypanosoma cruzi गतिशीलता की जांच के लिए एक पशु मॉडल के रूप में लार्वा Zebrafish की स्थापना

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Developmental Biology
 

Summary

इस प्रोटोकॉल में, फ्लोरोसेंट लेबल cruzi पारदर्शी zebrafish लार्वा में इंजेक्शन थे, और परजीवी गतिशीलता प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग vivo में मनाया गया ।

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Akle, V., Agudelo-Dueñas, N., Molina-Rodriguez, M. A., Kartchner, L. B., Ruth, A. M., González, J. M., et al. Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo. J. Vis. Exp. (127), e56238, doi:10.3791/56238 (2017).

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Abstract

Chagas रोग एक परजीवी Trypanosoma cruzi, जिसका गतिशीलता न केवल स्थानीयकरण के लिए महत्वपूर्ण है की वजह से संक्रमण है, लेकिन यह भी सेलुलर बाध्यकारी और आक्रमण के लिए । cruzi के अध्ययन के लिए वर्तमान पशु मॉडल vivo में परजीवी के सीमित प्रेक्षण, मनुष्यों में संक्रमण के प्रारंभिक चरणों के दौरान परजीवी व्यवहार को समझने के लिए एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करने की अनुमति देते हैं । इस प्रोटोजोआ में वेक्टर और स्तनधारी दोनों होस्टेस में flagellar स्टेज है, लेकिन vivo मेंइसके गतिशीलता का वर्णन करने वाले कोई भी अध् ययन नहीं हैं । इस परियोजना का उद्देश्य संवहनीय प्रणाली में टी. cruzi गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक जीवित हड्डीवाला zebrafish मॉडल की स्थापना करना था. पारदर्शी zebrafish लार्वा फ्लोरोसेंट लेबल trypomastigotes के साथ इंजेक्शन थे और प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM), उच्च ऑप्टिकल संकल्प के साथ जीना जीवों कल्पना करने के लिए एक इनवेसिव विधि का उपयोग कर मनाया । परजीवी फोकल या epifluorescence माइक्रोस्कोपी की तुलना में धूप के इस तकनीक अपेक्षाकृत कम जोखिम के कारण समय की विस्तारित अवधि के लिए visualized किया जा सकता है । cruzi परजीवी रहते zebrafish के संचार प्रणाली में विभिंन आकार रक्त वाहिकाओं और जर्दी में यात्रा कर मनाया गया । वे भी जर्दी थैली दीवार से जुड़ी और मजबूत दिल संकुचन के साथ जुड़े बलों के बावजूद अलिंदनिलय वाल्व को देखा जा सकता है । LSFM ऑफ cruzi-inoculated zebrafish लार्वा एक मूल्यवान विधि है कि घूम परजीवी कल्पना और उनके tropism, प्रवास के पैटर्न का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और एक जीवित जानवर के हृदय प्रणाली के गतिशील वातावरण में गतिशीलता ।

Introduction

Chagas रोग प्रोटोजोआ परजीवी टी. cruzi के कारण होता है. दुनियाभर में लगभग ६ से ७,०००,००० लोग टी. cruziसे संक्रमित हैं. रोग मुख्य रूप से लैटिन अमेरिका में फैलता है, लेकिन संयुक्त राज्य, कनाडा में सूचित किया गया है, और कई यूरोपीय के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ पश्चिमी प्रशांत देशों, मुख्य रूप से संक्रमित व्यक्तियों के प्रवास के कारण1। Chagas मुख्यतः वेक्टर जनित है और Triatominae उपपरिवार में hematophagic कीड़ों के मल के साथ संपर्क द्वारा मनुष्यों को संचारित, सामांयतः "चुंबन कीड़े" के रूप में जाना जाता है । हालांकि, टी cruzi भी रक्त आधान के माध्यम से प्रेषित किया जा सकता है, मां से बच्चे को ऊर्ध्वाधर स्थानांतरण, या परजीवी के साथ प्रदूषित भोजन की घूस2। तीव्र चरण संक्रमण मुख्य रूप से स्पर्शोन्मुख या constitutively रोगसूचक है और 6 से 8 सप्ताह तक रहता है, जिसके बाद प्रतिरक्षा प्रणाली की सगाई परजीवी लोड नियंत्रण, लेकिन पूरी तरह से संक्रमण को खत्म नहीं करता है3. अधिकांश व्यक्तियों तो एक जीर्ण स्पर्शोन्मुख चरण में प्रवेश; हालांकि, रोगियों के लगभग 30% एक रोगसूचक जीर्ण चरण है, जिसमें हृदय प्रणाली और कम बार पाचन और तंत्रिका प्रणालियों के4समझौता कर रहे हैं विकसित. इस परिदृश्य रोग उपचार और नियंत्रण के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करता है के बाद से वहां कोई टीके उपलब्ध हैं, और वहां केवल दो Chagas के लिए प्रभावी दवाओं: benznidazole और nifurtimox हैं । दोनों उपचार लंबे समय तक प्रशासन की आवश्यकता होती है और गंभीर साइड इफेक्ट2हो सकता है ।

vivo में टी cruzi व्यवहार के व्यवहार की वृद्धि हुई समझ परजीवी प्रवास, सेलुलर लगाव, और मेजबान के भीतर आक्रमण का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है; vivo मॉडल में की कमी उपंयास चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास को सीमित करता है । टी cruzi संक्रमण के विट्रो में अध्ययन से पता चला है कि trypomastigotes के गतिशीलता सेल झिल्ली और बाद में सेलुलर आक्रमण5मेजबान के लिए बाध्यकारी के लिए महत्वपूर्ण है । एक अतिसंवेदनशील सेल लाइन के साथ सह-संस्कृति में trypomastigotes में ऊर्जा की कमी सेलुलर आक्रमण को कम करने के लिए दिखाया गया है6. दिलचस्प है, trypanosomatids में, flagellar आंदोलन भी परजीवी विशिष्ट एंटीबॉडी7के खिलाफ एक चोरी तंत्र के रूप में विशेषता किया गया है ।

Flagellar गतिशीलता बड़े पैमाने पर Trypanosoma brucei, एक निकट संबंधित परजीवी है कि अफ्रीकी Trypanosomiasis8कारणों में इन विट्रो में अध्ययन किया गया है । इन विट्रो में इन trypanosomes के गतिशीलता के अध्ययन से पता चला कि रक्त या शरीर के तरल पदार्थ की शर्तों का अनुकरण, चिपचिपापन सहित और रक्त कोशिकाओं के प्रतिनिधि बाधाओं की उपस्थिति, परजीवी आगे आंदोलन के लिए महत्वपूर्ण है9 . अभी तक यह संभव नहीं किया गया है कि vivo मेंखून में परजीवी के आंदोलन की कल्पना ।

Zebrafish लार्वा vivo मेंहोस्ट-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल हैं । वे छोटे, सस्ती, और अपेक्षाकृत आसान है जब Chagas रोग के लिए अंय स्थापित हड्डीवाला मॉडल के साथ तुलना में बढ़ा रहे हैं । Zebrafish सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली मनुष्यों के समान है, लेकिन उनके अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए 4 दिन में (dpf) निषेचन के बाद विकसित शुरू होता है और एक और कई हफ्तों के लिए परिपक्व नहीं है10। प्रारंभिक विकास के दौरान, जब केवल मैक्रोफेज मौजूद हैं, वहां तत्काल प्रतिरक्षा हस्तक्षेप के बिना परजीवी व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक बड़ी खिड़की है10। हालांकि, रोगज़नक़ व्यवहार के अध्ययन के लिए एक हड्डीवाला मॉडल के रूप में zebrafish लार्वा का उपयोग करने का सबसे बड़ा लाभ उनके ऑप्टिकल पारदर्शिता में निहित है, उंहें सूक्ष्म स्क्रीनिंग और इमेजिंग11के लिए उत्तरदायी बना । इसके अतिरिक्त, मछली आनुवंशिकी में हेरफेर करने के लिए कई उपकरण हैं । उदाहरण के लिए, कैस्पर तनाव कोई रंजकता के साथ zebrafish के एक उत्परिवर्ती लाइन है, जानवर पूरी तरह से पारदर्शी और व्यक्तिगत अंगों के दृश्य के लिए उपयोगी बनाने और इंजेक्शन कोशिकाओं के वास्तविक समय पर नज़र रखने के लिए12.

तेजी से रहने zebrafish में फोकल या epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए परजीवी के अनुदैर्ध्य अवलोकन की एक प्रमुख सीमा उच्च अधिग्रहण गति और अच्छी छवि गुणवत्ता और कम के साथ बड़ी पैठ गहराई पर इमेजिंग के असंभव में निहित है धूप का खतरा । लाइट शीट प्रतिदीप्ति micsroscopy (LSFM) एक उभरते इमेजिंग तकनीक है कि इन सीमाओं पर काबू पाने के लिए इन टिप्पणियों की अनुमति है । एक उद्देश्य का उपयोग करके प्रतिदीप्ति का पता लगाने और एक दूसरे ओर्थोगोनल रोशनी उद्देश्य है कि केवल पता लगाने के उद्देश्य के फोकल विमान रोशन, यह एक फोकल माइक्रोस्कोप के रूप में उच्च संकल्प ऑप्टिकल वर्गों को प्राप्त करने के लिए संभव है, लेकिन साथ काफी कम धूप, यहां तक कि epifluorescence माइक्रोस्कोपी के संबंध में13. यहां इस्तेमाल होने वाली LSFM तकनीक को सिंगल प्लेन दीप्ति माइक्रोस्कोपी (SPIM) कहा जाता है, जिसमें प्रकाश की एक पतली सी चादर zebrafish लार्वा के भीतर एक भी विमान को रोशन करती है ।

इस पद्धति का उद्देश्य vivo में cruzi गतिशीलता और संबंधित व्यवहार को समझने के लिए एक व्यवहार्य गैर-संक्रमण मॉडल के रूप में लार्वा zebrafish की स्थापना करना है । यह पूरा करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट लेबल trypomastigotes के साथ पारदर्शी zebrafish लार्वा इंजेक्शन, सेलुलर फार्म मनुष्यों के संक्रमण के लिए जिंमेदार है, और zebrafish के हृदय संचलन में टी cruzi के आंदोलन की पहचान की LSFM का उपयोग कर ।

Protocol

< p class = "jove_content" > निम्न प्रोटोकॉल्स को संस्थागत एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी ऑफ लॉस Andes यूनिवर्सिटी (CICUAL) द्वारा अनुमोदित किया गया । 2. सुरक्षा स्तर (बीएसएल-2) दिशा निर्देशों का कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए रोगज़नक़ के साथ संक्रमण को रोकने के लिए cruzi.

< p class = "jove_content" > ध्यान दें: पशु देखभाल और रखरखाव: कैस्पर zebrafish, zebrafish (ढाणियो rerio ) के एक आनुवंशिक रूप से संशोधित तनाव इस प्रोटोकॉल में उनके मूल्यवान ऑप्टिकल पारदर्शिता के कारण सभी विकासात्मक चरणों में प्रयोग किया जाता है । मछली प्रजातियों के लिए इष्टतम देखभाल शर्तों का उपयोग कर हेरफेर कर रहे है < सुप class = "xref" > 14 , एक 14 ज लाइट-10 ज अंधेरे चक्र में, 28 & #177; 1 & #176; C, में एक पीएच (7.0-7.4) नियंत्रित बहु-टैंक पुनर्संचारी पानी प्रणाली । पशु लाइव नमकीन चिंराट ( Artemia सलीना ) के साथ दो बार एक दिन में खिलाया और पालन भोजन के साथ समृद्ध कर रहे हैं । सभी प्रोटोकॉल Universidad de लॉस Andes (सी. फुआ _14-017) पर CICUAL द्वारा अनुमोदित किया गया ।

< p class = "jove_title" > 1. अंडे के पानी की तैयारी

  1. ०.६ जी/एल मछलीघर में नमक रिवर्स असमस (आरओ) या (डि) पानी के लिए तैयार है और जोड़ें ०.०१ mg/l methylene ब्लू समाधान करने के लिए.
    नोट: मापा चालकता 400-500 & #181; S/सेमी और पीएच स्तर पर 7.2-7.9 का होना चाहिए । पीएच को कम करने के लिए, कुछ घंटों के लिए अंडे का पानी aerate ।
< p class = "jove_title" > 2. Tricaine स्टॉक सॉल्यूशन की तैयारी

  1. ९७.९ मिलीलीटर आसुत जल (Tricaine ddH 2 O) में ४०० मिलीग्राम (MS-२२२) भंग करके ०.४% Tricaine शेयर समाधान तैयार करें । पाउडर पूरी तरह से भंग कर दिया है के बाद, २.१ एमएल 1m Tris (पीएच ९.०) का उपयोग कर ७.० के लिए पीएच समायोजित करें और समाधान प्रशीतित ।
< p class = "jove_title" > 3. १.०% कम पिघल बिंदु Agarose

  1. अंडे के पानी में कम पिघल बिंदु Agarose पाउडर १.०% की एक अंतिम एकाग्रता को भंग करने की तैयारी । एक माइक्रोवेव में मिश्रण गर्मी या लगातार सरगर्मी के साथ एक गर्म थाली पर जब तक agarose समाधान सजातीय प्रकट होता है ।
  2. Store को aliquots 4 & #176; C एक सप्ताह से अधिक समय तक नहीं ।
< p class = "jove_title" > 4. संभोग परख और भ्रूण संग्रह

  1. तीन दिन पहले इंजेक्शन के लिए प्रजनन टैंक में पुरुष और मादा मछली के स्वस्थ जोड़े का उपयोग कर संभोग की स्थापना की । कांच के पत्थर और कृत्रिम पौधों के साथ संवर्धन अंडे को बढ़ाता है । संभोग दोपहर के दौरान स्थापित किया जाना चाहिए और रात भर छोड़ दिया ।
  2. अगली सुबह
  3. , एक छलनी के माध्यम से टैंक draining और अंडे के पानी के साथ कपड़े धोने से पैदा अंडे इकट्ठा । छलनी और एक पेट्री डिश में छलनी के माध्यम से अंडा पानी डालने औंधा द्वारा सभी अंडे निकालें । भ्रूण को स्वस्थ रखने के लिए उनके पानी को किसी भी मलबे और मृत भ्रूण को निकालकर एक ट्रांसफर प्लास्टिक पिपेट के साथ साफ कर दें ।
  4. २८.५ के एक स्थिर तापमान पर एक मशीन के लिए भ्रूण हस्तांतरण & #176; ग zebrafish मचान मानकों के अनुसार भ्रूण के विकास की अनुमति के लिए < सुप वर्ग = "xref" > १५ . एक दिन में दो बार भ्रूण की जांच करें, और क्लच को स्वस्थ रखने के लिए अव्यावहारिक अंडे छोड़ें ।
< p class = "jove_title" > 5. भ्रूण Dechorionation

< p class = "jove_content" > नोट: इंजेक्शन के समय भ्रूण नहीं रचा है तो इस प्रक्रिया की आवश्यकता है । इस सामा य म, & #34; लार्वा & #34; उनके चोरियों से ४८ ज पद निषेचन (hpf) आगे से पशुओं रहे हैं ।

प्रयोग के दिन
  1. , एक विदारक stereoscope के अंतर्गत स्वस्थ भ्रूणों से युक्त पेट्री पकवान की जगह.
  2. दो तेज संदंश (Dumont #5) के साथ चोरियों का विरोध समाप्त होता है हड़पने के लिए, और धीरे आंसू और घर का काम खुला खींचो । के बारे में 5-6 लार्वा एक समय में इंजेक्ट कर रहे हैं, और आम तौर पर 3-4 imaged हैं ।
  3. एक अंतरण पिपेट का प्रयोग कर पानी से होने वाली चोरियों को दूर करे ।
< p class = "jove_title" > 6. इंजेक्शन सामग्री की तैयारी

  1. पतली दीवार कांच केशिकाओं और निंनलिखित सेटिंग्स के साथ एक micropipette खींचने डिवाइस का उपयोग १.० mm सुई तैयार: 2 लाइट वजन + 1 भारी वजन, 2 मिमी शीर्ष पुल + 5 मिमी नीचे खींचो, ७५.९ & #176; ग (Step 1) + ७८.२ & #176; ग ( चरण 2) । दुकान क्ले मॉडलिंग की एक पट्टी पर एक पेट्री डिश में सुई । आदर्श सुई एक संकीर्ण टिप होना चाहिए, के रूप में टी cruzi उपाय लगभग 20 x 1-3 & #181; m और आसानी से सुई के माध्यम से पारित होगा. टिप की लंबाई भिन्न हो सकते हैं: एक लंबी टिप गहरी संरचनाओं तक पहुँचने के लिए उपयोगी है, लेकिन एक छोटी टिप अधिक उपयोगकर्ता के लिए आसान इंजेक्शन बनाने कठोर हो जाएगा.
    नोट: सुई टिप आकार इस्तेमाल किया तापमान पर निर्भर करता है: एक उच्च तापमान एक लंबी और महीन टिप में चरण 2 परिणाम के लिए.
  2. ddH 2 O में १.५% agarose सॉल्यूशन तैयार करें और इसे 10 सेमी पेट्री डिश में डाल दें । कवर की गहराई लगभग १.० cm.
  3. जगह एक पूर्वनिर्मित microinjection मोल्ड agarose पर और यह जमना के लिए अनुमति देते हैं ।
  4. पूर्वनिर्मित microinjection मोल्ड बाहर उठा और 4 में भंडारण के लिए अंडे का पानी जोड़ने & #176; सी. यह agarose को सूखने से रोकता है ।
  5. tricaine स्टॉक समाधान करने के लिए अंडे का पानी जोड़ें १५० मिलीग्राम/L की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 4 & #176; C.
< p class = "jove_title" > 7. कोशिका संस्कृति परजीवी विकास के लिए

  1. परजीवी एक मानव तारिकाकोशिकार्बुद सेल लाइन (CRL-१७१८) में वर्गास द्वारा वर्णित विधि का उपयोग कर बनाए रखा जाता है-Zambrano एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > १६
  2. एक T25 संस्कृति कुप्पी में मानव कोशिकाओं की संस्कृति शुरू (सतह क्षेत्र = 25 सेमी 2 ) एक पर 2 एक्स के घनत्व 10 5 या 4 x 10 5 कोशिकाओं में RPMI के 4 मिलीलीटर-१६४० मध्यम के साथ 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), पूरक 2 मिमी एल-glutamine, ४.५ g/l ग्लूकोज, 10 मिमी HEPES, 1 मिमी पाइरूवेट, और 1% पेनिसिलिन-streptomycin (के रूप में संदर्भित & #34; पूरा मीडिया & #34;). तारिकाकोशिकार्बुद संस्कृतियों में ३७ & #176; C में एक 5% सह 2 वातावरण.
  3. एक बार एक monolayer धाराप्रवाह है, trypsin-EDTA के ०.२५% के 2 मिलीलीटर का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग करने के लिए उंहें ३७ पर 3 मिनट के लिए मशीन द्वारा & #176; सी. नेत्रहीन टुकड़ी के लिए कक्षों की जांच करें, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10% FCS के साथ RPMI-१६४० के 3 मिलीलीटर का उपयोग trypsin समाधान ब्लॉक ।
  4. १,३५० x g.
  5. पर 5 मिनट के लिए सेल के निलंबन केंद्रापसारक
  6. DMEM मध्यम में एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर गोली धोने और 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर १,३५० x g पर 22 & #176; C.
  7. एक Neubauer कक्ष में मैंयुअल रूप से कोशिकाओं गिनती और 40X आवर्धन पर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप में व्यवहार्यता के लिए जांच करें ।
  8. धीरे फिर से पूरा मीडिया के 4 मिलीलीटर में सेलुलर गोली निलंबित कर दिया और इसे इस्तेमाल के लिए नए सेल 2 x 10 T25 संस्कृति कुप्पी के अनुसार 5 कोशिकाओं का उपयोग कर संस्कृतियों बनाने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 8. t. cruzi संस्कृति और लेबलिंग

  1. परजीवी एक तनाव मूल रूप से एक संक्रमित मानव से प्राप्त कर रहे है और टी के रूप में विशेषता । cruzi da तनाव (MHOM/CO/01/डीए), जीनोटाइप असतत टंकण इकाई (DTU) TcI < सुप वर्ग = "xref" > 16 . संवर्धन के 3 या 4 दिनों के बाद, मानव तारिकाकोशिकार्बुद सेल संस्कृति supernatant से चलती परजीवी इकट्ठा और १,३५० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक मध्यम छोड़ें ।
    नोट: पूर्ण माध्यम में परजीवी T25 संस्कृति कुप्पी में तारिकाकोशिकार्बुद कोशिकाओं के साथ एक 1:1 अनुपात में पुनः संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. धीरे फिर से 10 मिलीलीटर बाँझ 1x फास्फेट बफर खारा में गोली निलंबित (पंजाब) ०.१% FCS के साथ और १,३५० x g.
  3. पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक
  4. supernatant को छोड़ दें और पंजाब के 1 मिलीलीटर में पुनः निलंबित कर दें । एक Neubauer चैंबर में नि: शुल्क तैराकी परजीवी गिनती के लिए 10 & #181; एल ले लो ।
  5. ले री-निलंबित परजीवी के आराम (९९० & #181; l) और जोड़ 1 & #181; l के Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl एस्टर (CFSE), अंतिम एकाग्रता ५.० & #181; M. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: 5 mM पर CFSE शेयर aliquoted होना चाहिए और उस पर बनाए रखा-20 & #176; C.
  6. गोली परजीवी (१,३५० x g, 5 मिनट) । एक बाद की स्पिन (१,३५० x g, 5 मिनट) के बाद 1x पंजाबियों-०.१% FCS के 10 मिलीलीटर में ट्यूब और धो झटका द्वारा परजीवी गोली का पुनर्गठन ।
  7. supernatant त्याग और धीरे फिर से उचित मात्रा के साथ 1x पंजाब में लेबल परजीवी गोली निलंबित के बारे में 10-20 परजीवी की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए/nL इंजेक्शन के लिए.
  8. एक छोटी मात्रा का उपयोग करें (& #8764; 10 & #181; L, लगभग 1 x 10 4 -2 x 10 4 परजीवी) की व्यवहार्यता और लेबलिंग का आकलन करने के लिए trypomastigotes. एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप परजीवी के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । संचारित प्रकाश मोड में, जांच करें कि परजीवी चाल । प्रतिदीप्ति मोड में, परजीवी लेबलिंग का आकलन करने के लिए Fluorescein Isothiocyanate (FITC) फ़िल्टर का उपयोग करें.
< p class = "jove_title" > 9. injection Zebrafish लार्वा

  1. परजीवी लदान
    1. ले 10 & #181; l से परजीवी का निलंबन (१०० & #181; l) और उन्हें एक 10 & #181 का उपयोग कर सील ग्लास सुई में लोड; l microloader पिपेट टीप.
    2. micromanipulator की सुई धारक में गिलास सुई डालें, एक चुंबकीय स्टैंड का उपयोग करें, और stereoscope के बगल में जगह.
    3. stereoscope के तहत ठीक संदंश का उपयोग कर, एक कुंद खुला अंत बनाने सुई काट और ड्रॉप आकार मापने के लिए 1 nL के एक इंजेक्शन की मात्रा प्राप्त करने के लिए (यह एक मनका व्यास के बराबर है 0.12-0.13 mm जब खनिज तेल में मापा < सुप वर्ग = "xref" > १७ ). एक लंबी टिप इतना पसंद है कि सुई ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना मछली के अंदर गहरी संरचनाओं तक पहुँच सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में, एक कुंद सुई का प्रयोग किया जाता है, लेकिन एक बेवल सुई के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. बढ़ते
    1. Anesthetize के ४८ hpf के लार्वा, १५० mg/L tricaine के साथ । जांच करें कि वे छूने का जवाब नहीं है, लेकिन यह सुनिश्चित करें कि दिल की धड़कन है ।
    2. microinjection agarose मोल्ड में लार्वा को पार्श्व स्थिति में रखें ।
    3. stereoscope के बगल में सुई धारक जगह और micromanipulator को समायोजित करें ताकि सुई की नोक देखने के क्षेत्र के केंद्र में है । कदम ६.२-के लिए ६.४ में तैयार पेट्री पकवान ले जाएं ताकि लार्वा की जर्दी सुई टिप के करीब है । लार्वा की स्थिति की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि दिल की धड़कन जारी है ।
    4. सेट microinjector मान निम्नानुसार: इंजेक्शन दबाव ९.६ पाउंड प्रति इंच (psi); दबाव पकड़ो: 20 psi; १०० ms श्रेणी की गेटिंग; अवधि मान १.९ (से मेल खाती है १०.९ ms) । इंजेक्शन की मात्रा 1-3 nL के बीच लगभग 10-20 परजीवी के साथ होना चाहिए/nL.
< p class = "jove_title" > 10. परजीवी

  1. के इंजेक्शन कुवियर के डक्ट में सुपीरियर-पूर्वकाल भाग की जर्दी में मछली इंजेक्षन । यह कदम इंजेक्शन के बाद पशु अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए अभ्यास किया जाना चाहिए । यह लगभग 10 मिनट लगते है 5-6 लार्वा सफलतापूर्वक सुई
  2. एक नियंत्रण के रूप में
  3. , एक ही वाहन की मात्रा (1x पंजाब) के साथ 1-2 लार्वा सुई ।
  4. ताजा अंडा पानी के लिए लार्वा स्थानांतरण तुरंत ।
< p class = "jove_title" > 11. इंजेक्शन लगाए लार्वा के बढ़ते LSFM

  1. स्थानांतरण लार्वा एक खाली पेट्री पकवान के लिए परजीवी के साथ इंजेक्शन और ध्यान से एक प्लास्टिक पिपेट और शोषक कागज के साथ आसपास के पानी को दूर । तुरंत जोड़ें १०० & #181; पहले से गरम १.०% कम पिघलने बिंदु agarose (चरण 3 के लिए agarose तैयारी के लिए देखें) लार्वा को कवर करने के लिए । यह सुनिश्चित agarose ४० से अधिक नहीं है & #176; ग.
  2. एक १.० मिमी ग्लास केशिका के अंदर एक सीधे तार डालने और एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में लार्वा चूसना करने के लिए एक सवार के रूप में उपयोग करें । लार्वा के ऊपर agarose की एक छोटी राशि छोड़ने के लिए सुनिश्चित करें । लार्वा को उजागर करने से पहले agarose जम जाने तक प्रतीक्षा करें (यह कुछ मिनट की आवश्यकता होगी). यदि आवश्यक हो, लार्वा नीचे अतिरिक्त agarose बाहर धक्का और इसे काट ।
  3. माइक्रोस्कोप नमूना धारक में केशिका जगह और लार्वा युक्त अंत बाहर धक्का जब तक यह केशिका से मुक्त लटका है । नमूना कक्ष tricaine समाधान से भरा जाना चाहिए (१५० mg/L) और तापमान पर निर्धारित 28 & #176; C.
  4. एक XYZ-micromanipulator प्रणाली का उपयोग कर पता लगाने के उद्देश्य की पुतली के सामने लार्वा स्थिति । घुमाव के लिए अनुलंब अक्ष के बारे में, घुमाव अवस्था का उपयोग करें । लार्वा की स्थिति स्पष्ट रूप से लार्वा संरचनाओं की पहचान करने के लिए संचारित प्रकाश मोड में किया जाना चाहिए ।
< p class = "jove_title" > 12. इंजेक्शन परजीवी के LSFM इमेजिंग

  1. प्रतिदीप्ति मोड में परिवर्तन और रोशनी तीव्रता को समायोजित करने के साथ ही जोखिम समय धूप कमी और समय संकल्प का अनुकूलन । इन विशेष प्रयोगों के लिए, हम नमूना के लिए 2.8-3.0 मेगावाट की एक शक्ति का इस्तेमाल किया और २०० एमएस के लिए प्रत्येक फ्रेम उजागर ६.४५ & #181 के साथ एक कैमरा का उपयोग कर; एम पिक्सल और ~ ७०% पता तरंग दैर्ध्य पर क्वांटम दक्षता । इन सेटिंग्स के बारे में 5 फ्रेम पर पर्याप्त रूप से उजागर छवियों में परिणाम चाहिए/सबसे अधिक संभव संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक उद्देश्य का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  2. ब्याज के क्षेत्र (रॉय) के एक वीडियो अधिग्रहण शुरू करते हैं । हमारे मामले में, परजीवी वाल्व के लिए संलग्न और स्वतंत्र रूप से हृदय क्षेत्र के चारों ओर बढ़ मनाया जाता है । यह समय के साथ एक एकल विमान का एक वीडियो लेने के लिए, या micromanipulator या पीजो-galvo प्रणाली का उपयोग करने के लिए अलग विमानों ध्यान जबकि परजीवी चाल की सिफारिश की है.
    नोट: इस प्रक्रिया को 2 एच के लिए कम अधिग्रहण समय के लिए उपयोगी है । दीर्घकालिक अधिग्रहण के लिए, लार्वा वैकल्पिक तरीकों का उपयोग कर माउंट किया जाना चाहिए < सुप क्लास = "xref" > 20 .
< p class = "jove_title" > 13. छवि प्रसंस्करण और अधिग्रहण डेटा का विश्लेषण

< p class = "jove_content" > नोट: इमेज प्रोसेसिंग एक पर्सनल कंप्यूटर पर २.९० GHz प्रोसेसर, ८.०० gb मेमोरी के साथ, और एक videocard १.०० gb मेमोरी के साथ किया गया था ।

  1. पसंद के इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में अधिग्रहित डेटासेट को खोलें । ओपन सॉफ्टवेयर फिजी LSFM डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए सिफारिश की है < सुप वर्ग = "xref" > २१ .
  2. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में
  3. , छवियों को बढ़ाने के लिए चमक और कंट्रास्ट स्तरों को समायोजित करें ।
    नोट: इस मामले में कोई निश्चित पैरामीटर्स का उपयोग नहीं किया जाता है, लेकिन & #34 का चयन करना; Auto & #34; विकल्प एक प्रारंभिक वृद्धि प्राप्त करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।
  4. रॉय का चयन करें.
    नोट: व्यक्तिगत परजीवी पर नज़र रखने के लिए, फिजी दोनों मैनुअल और स्वचालित ट्रैकिंग plugins उपलब्ध है ।
< p class = "jove_title" > 14. छवि वाले लार्वा ठीक कर रहा है

  1. ठीक संदंश और एक बाल पाश उपकरण का उपयोग agarose से लार्वा सावधानी से निकालें । मछली वापस ताजा अंडे के पानी के लिए स्थानांतरण और वसूली के लिए जांच के बाद 15 मिनट । लार्वा मशीन को 28 & #177 पर लौटाएं; ०.५ & #176; ग.
  2. वैकल्पिक रूप से, tricaine की ओवरडोज के साथ छवि वाले लार्वा euthanize करने के लिए आगे बढ़ें । फिर, परजीवी को मारने के लिए 5 मिनट के लिए सोडियम हाइपोक्लोराइट (६.१५% NaClO) के एक समाधान में लार्वा का परिचय । संस्था के अनुसार निपटाना & #39; s मानक प्रोटोकॉल.

Representative Results

इंजेक्शन के लिए इष्टतम स्थिति:

zebrafish लार्वा के समूह 24, ४८, ७२, ९६, और १२० hpf, विभिन्न संरचनात्मक स्थलों पर इंजेक्ट किए गए थे, और उनके अस्तित्व को हर दिन 5 दिनों के लिए जांच की गई थी । 5 दिनों के बाद इंजेक्शन, भ्रूण 24 hpf में इंजेक्शन ६.२५% (2/32) अस्तित्व था, जबकि ९५% (38/40) लार्वा के इंजेक्शन में ४८ hpf बच गया । एक नियंत्रण के रूप में, लार्वा 1x पंजाबियों के साथ एक वाहन के रूप में इंजेक्ट किया गया । वाहन के बीच अस्तित्व में कोई मतभेद नहीं थे इंजेक्शन और परजीवी इंजेक्शन लार्वा, मछली की उत्तरजीविता दर पर कोई परजीवी पर निर्भर प्रभाव का संकेत (पी = ०.०८). लार्वा 72-120 के बीच इंजेक्ट किया जाता है hpf लगातार इंजेक्शन मात्रा में ४८ hpf-इंजेक्शन लार्वा के लिए तुलना जीवित रहने की दर था । सभी प्रक्रियाओं के लिए यहां प्रस्तुत है, ४८ hpf लार्वा हेरफेर की उनकी आसानी और विकसित अंगों और आसानी से इंजेक्शन के बाद स्पष्ट क्षति के बिना penetrable त्वचा होने के कारण इस्तेमाल किया गया ।

लार्वा ४८ hpf में इंजेक्शन pericardial अंतरिक्ष, पूंछ मांसपेशी, hindbrain निलय, भड़काऊ पुटिका, notochord, और कुवियर की जर्दी थैली में डक्ट में थे । अलग संरचनात्मक साइटों पर इंजेक्शन लार्वा के अस्तित्व में कोई अंतर नहीं थे । हालांकि, सबसे तेज और आसान क्षेत्र इंजेक्षन करने के लिए कुवियर की जर्दी थैली के पूर्वकाल भाग में स्थित वाहिनी (चित्रा 1, फिल्म 1) था । उस साइट पर इंजेक्शन महत्वपूर्ण संरचनाओं के लिए चोट का एक कम जोखिम के साथ उच्च मात्रा की शुरूआत की अनुमति दी । इसके अतिरिक्त, 24-72 hpf के बीच, इस क्षेत्र को सीधे विकासशील vasculature और दिल11का उपयोग करने के लिए एक इष्टतम साइट है ।

LSFM का उपयोग कर परजीवी विज़ुअलाइज़ेशन:

कुवियर के डक्ट में टी cruzi के इंजेक्शन के बाद 8-10 मिनट के भीतर, परजीवी zebrafish उनके CFSE फ्लोरोसेंट संकेत और लार्वा की ऑप्टिकल पारदर्शिता के कारण LSFM का उपयोग कर लार्वा में पहचान की गई । टीका के बाद, परजीवी या तो संचार प्रणाली के आसपास की दीवारों का पालन या रक्त प्रवाह की दिशा में यात्रा (चित्रा 2, चित्रा 3) मनाया गया । जब एक परजीवी ऐसी अलिंदनिलय वाल्व के रूप में एक हृदय संरचना से जुड़ा रहता है, यह दिल के संकुचन के साथ झूलती है, यह दर्शाता है कि परजीवी के पालन के लिए आणविक तंत्र हमारे हड्डीवाला मॉडल में प्रभावी हो सकता है (फिल्म 2, फिल्म 3 , पूरक फिल्म 1). टी cruzi भी लार्वा जर्दी थैली ( चित्रा 2, फिल्म 2), एक संरचना है जो बाद में अवशोषित हो जाएगा और zebrafish आंत22का हिस्सा बनने की दीवारों का पालन किया । यह क्या संक्रमित मनुष्यों, जहां परजीवी cardiomyocytes में और पाचन तंत्रिका तंत्र23,24में पाए जाते है में जीर्ण रोग के दौर के दौरान होता है के समान हो सकता है । जब संलग्न नहीं है, परजीवी एरिथ्रोसाइट्स ( चित्रा 3, फिल्म 4) के रूप में एक ही दिशा में रक्त के प्रवाह के माध्यम से बहती है । परजीवी मछली के विभिंन आकार के जहाजों में देखा जा सकता है, लेकिन pericardial अंतरिक्ष में और अधिक प्रचुर मात्रा में थे और आसन्न जर्दी रक्त प्रवाह युक्त क्षेत्र में ( चित्रा 2, चित्रा 3, पूरक फिल्म 2) ।

10 मिनट के बाद इंजेक्शन में, यह अधिक vasculature के साथ उनके वितरण के कारण परजीवी के एकल रूपों हाजिर मुश्किल था, और एक असमर्थता जल्दी LSFM के दृश्य के एक सीमित क्षेत्र के कारण मछली के विभिंन संरचनात्मक साइटों को स्क्रीन करने के लिए (40X आवर्धन पर ). 24 एच पोस्ट इंजेक्शन (hpi) के बाद, CFSE संकेत विकासशील आंत (अनुपूरक चित्रा 1) के पास क्षेत्र में जमा करने के लिए शुरू होता है ।

Figure 1
चित्र 1: इष्टतम इंजेक्शन साइट. () लार्वा की छवि ४८ hpf कुवियर की वाहिनी में इष्टतम इंजेक्शन साइट दिखा (पीला तीर) एक नियमित stereoscope का उपयोग कर । () कुवियर की वाहिनी (पीला तीर) दिखाने में बॉक्स का बढ़ाया देखें । स्केल बार = २०० µm (A), ५० µm (B). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: एक ४८ hpf लार्वा में एक स्थिर परजीवी की छवियों LSFM. टी cruzi परजीवी (पीले तीर) जर्दी थैली की दीवारों का पालन रहता है, समय चूक अनुक्रम (७.२ एस, १७.२ एस, और २७.२ एस), के बारे में ~ 15 मिनट के बाद परजीवी इंजेक्शन के दौरान । परजीवी की स्थिति में कोई परिवर्तन नहीं, Atrium के एक अधिग्रहण अवधि के दौरान मनाया जाता है; व्ही, निलय. स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: LSFM का उपयोग कर pericardial अंतरिक्ष में यात्रा एक परजीवी के पथ । cruzi परजीवी pericardial अंतरिक्ष (पुनश्च) में बहती है, जबकि (लाल रंग में दिखाया ट्रैक) के बारे में ~ 15 मिनट के बाद परजीवी इंजेक्शन के बाद रक्त प्रवाह की दिशा के बाद, ट्रैक किया जा सकता है । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Movie 1
फिल्म 1: रक्त परिसंचरण घाटी की जर्दी में एक लार्वा ४८ hpf । एक लार्वा की फिल्म ४८ hpf एक नियमित stereoscope का उपयोग कर रक्त परिसंचरण घाटी या कुवियर की वाहिनी दिखा । विभिंन क्षेत्रों के लिए वीडियो के दौरान ध्यान केंद्रित कर रहे है लाल रक्त नलिका में परिचालित कोशिकाओं को दिखाने के । पीला तीर इष्टतम इंजेक्शन साइट से पता चलता है । फिल्म परजीवी इंजेक्शन के बाद के बारे में 10-15 मिनट दर्ज किया गया था । वीडियो डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Movie 2
मूवी 2: cruzi जर्दी थैली की दीवारों से जुड़ी परजीवी । LSFM एक लार्वा की मूवी ४८ दिखा रहा है कि cruzi परजीवी परजीवी इंजेक्शन के बाद के बारे में 10-15 मिनट की जर्दी थैली का पालन रह hpf । परजीवी की स्थिति में कोई परिवर्तन नहीं किया गया था एक अधिग्रहण अवधि के दौरान मनाया गया कम से 30 एस. ए., Atrium; व्ही, निलय. वीडियो डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Movie 3
मूवी 3: T. cruzi दिल की दीवारों से जुड़ी परजीवी । LSFM एक लार्वा की मूवी ४८ hpf दिखा रहा है कि cruzi परजीवी remain हृदय दीवार का पालन, मजबूत हृदय संकुचन के बावजूद के बारे में 10-15 मिनट परजीवी इंजेक्शन के बाद । एरिथ्रोसाइट्स काले गोल छाया के रूप में मनाया जा सकता है । वीडियो डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Movie 4
फिल्म 4: pericardial अंतरिक्ष में चलती परजीवी । एक लार्वा की LSFM मूवी ४८ hpf दिखा रहा है cruzi परजीवी pericardial अंतरिक्ष में बहती । दो परजीवी अलग समय अंक में पता लगाया जा सकता है (आईडी 1, लाल सर्कल में, और 2 आईडी पीले घेरे में), एक समान गति के बाद । फिल्म परजीवी इंजेक्शन के बाद के बारे में 10-15 मिनट दर्ज किया गया था । वीडियो डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: जर्दी में CFSE फ्लोरोसेंट संकेत का संचय । एक wildtype लार्वा के Stereoscope छवियों कुवियर की वाहिनी में ४८ hpf पर इंजेक्शन । CFSE फ्लोरोसेंट संकेत उत्तरोत्तर जर्दी में जमा, दो दिन पोस्ट इंजेक्शन (४८ hpi) के बाद । स्केल बार = ५०० µm. कृपया आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फिल्म 1: परजीवी दीवारों और संचार प्रणाली के वाल्व से जुड़ा. Stereoscope समय श्रृंखला एक जंगली प्रकार के लार्वा ४८ hpf में इंजेक्शन की छवियां । छवियों ०.२ एस पर कब्जा कर लिया है cruzi परजीवी अलिंदनिलय वाल्व पर हृदय की मांसपेशी संकुचन के साथ synchrony में बढ़ रहा है । फिल्म परजीवी इंजेक्शन के बाद के बारे में 30 मिनट दर्ज की गई । वीडियो डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरक फिल्म 2: चलती और periventricular अंतरिक्ष और जर्दी में परजीवी का पालन किया. LSFM एक लार्वा की मूवी ४८ hpf दिखा रहा है cruzi परजीवी बहती या pericardial अंतरिक्ष या जर्दी का पालन किया । पहली बार 5 एस के लिए एक संचारित प्रकाश दृश्य मनाया गया । प्रतिदीप्ति दृश्य 5.2-25.8 एस से मनाया गया । फिल्म परजीवी इंजेक्शन के बाद के बारे में 10-15 मिनट दर्ज किया गया था । वीडियो डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

यह अध्ययन vivo मेंरोगज़नक़ व्यवहार के अध्ययन के लिए एक पशु मॉडल के रूप में zebrafish के लाभों पर प्रकाश डाला गया । विशेष रूप से, इस अध्ययन के लिए एक विधि अपने प्राकृतिक वातावरण में रोगज़नक़ cruzi कल्पना: hematic संचलन का प्रस्ताव है । मछली में संचार microenvironment के पर्यावरण स्तनधारियों की तुलना में है, और trypanosomatids यात्रा के लिए तंत्र विकसित किया है, प्रतिरक्षा प्रणाली से बच रहा है, और उस वातावरण में संक्रमण के लिए कोशिकाओं को संलग्न25। इस प्रोटोकॉल एक मानव सेल लाइन और फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए flagellar रूपों के बाद अलगाव में cruzi की संस्कृति के लिए एक इष्टतम प्रक्रिया का वर्णन प्रदान करता है । यह तो बाद में बढ़ते और दृश्य LSFM का उपयोग करने के लिए पारदर्शी zebrafish में परजीवी के सफल इंजेक्शन के लिए उपयुक्त सेटिंग्स से पता चलता है । अंत में, इस प्रोटोकॉल LSFM का उपयोग संचलन में परजीवी स्थान और आंदोलन के vivo इमेजिंग में कुशल और प्रभावी के लिए सुझाव प्रदान करता है.

trypanosomes के flagellum अपने पीछे क्षेत्र से उभर, कोशिका शरीर से बह रही है, और जीव के पूर्वकाल भाग में मुक्त लटका26T. cruzi शरीर के आगे flagellum को लहराते हुए खुद को बढाती है, जो परजीवी के पूरे शरीर को लहरदार करती है । Flagellar आंदोलन परजीवी गतिशीलता के लिए केवल अपरिहार्य नहीं है, के रूप में टी brucei27 (अफ्रीकी trypanosomiasis के प्रेरणा का एजेंट) के मामले में, लेकिन यह भी सेलुलर संक्रमण के लिए प्रयोग किया जाता है, के रूप में टी cruziमें प्रदर्शन किया गया है5 ,28. हालांकि zebrafish टी cruziके लिए प्राकृतिक मेजबान नहीं हैं, परजीवी गतिशीलता एक विकासशील हृदय संचलन प्रणाली में अध्ययन किया जा सकता है यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर । इसके अतिरिक्त, trypanosomes प्रजातियां हैं जो cyprinids को संक्रमित कर रही हैं, zebrafish का वर्ग, जैसे कि टी. carassii और टी. borreli25. इन परजीवी प्रजातियों का वास्तविक समय में अध्ययन किया जा सकता है इन trypanosomatids के आंदोलनों और लगाव तंत्र; इस तरह के अध्ययन स्तनधारी सेल संक्रमण की प्रक्रिया में अंतर्दृष्टि उधार दे सकते हैं ।

इस अध्ययन में, इंजेक्शन gram cruzi परजीवी inoculated मछली के हृदय संचलन के माध्यम से यात्रा मनाया, अपारदर्शी एरिथ्रोसाइट्स के साथ घूम रहे थे, और हृदय प्रणाली की दीवारों में संरचनाओं का पालन । हम ०.२५ के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ प्रदीप्ति बांह के लिए एक 10x achromatic लंबे समय से काम कर दूरी हवा उद्देश्य (१७.६ mm) के साथ एक घर का निर्माण LSFM का इस्तेमाल किया । एक 40X apochromatic जल विसर्जन उद्देश्य ०.८ के एक संख्यात्मक एपर्चर और ३.५ mm की एक काम की दूरी के साथ पता लगाने के हाथ के लिए इस्तेमाल किया गया था । इसका पता लगाने के उद्देश्य से नमूना चैंबर में विसर्जित कर दिया गया, जबकि दीप्ति का मकसद चैंबर के बाहर था । कक्ष में एक coverslip और ऑप्टिकल गोंद रोशनी किरण के लिए अनुमति के लिए चैंबर में प्रवेश के साथ बंद चैंबर में एक बंदरगाह, के रूप में Lorenzo एट अल में दर्शाया गया है । 18 रोशनी के लिए, हम ४८८ एनएम जिसकी शक्ति एक Acousto ऑप्टिकल स्वरित्र फिल्टर द्वारा संग्राहक था पर एक ५० मेगावाट DPSS लेजर का इस्तेमाल किया । पता लगाने के रास्ते प्रयुक्त फिल्टर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या FITC के साथ संगत । एक हल्की चादर माइक्रोस्कोप एक केशिका नमूना धारक के साथ सुसज्जित (स्वचालित रोटेशन के साथ आदर्श) और नमूना चैंबर के तापमान नियंत्रण इस आवेदन के लिए उपयुक्त होना चाहिए. सूक्ष्मदर्शी को चाहिए कि यदि आवश्यक हो तो अधिग्रहण से पहले निर्माता के निर्देशों या उपयोगकर्ता के प्रयोगशाला मानक प्रोटोकॉल के अनुसार संरेखित और तुले हुए हों । इस प्रोटोकॉल में, हम SPIM सॉफ्टवेयर19का उपयोग कर माइक्रोस्कोप नियंत्रित.

यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि zebrafish के संचलन में, लार्वा परजीवी लगाव प्रभावी है । कार्डिनल नस में, परजीवी कई मिनट तक के लिए संलग्न रहे; दिल में, वे वाल्व और दीवारों पर आयोजित, दिल संकुचन के साथ दोलन । आगे की पढ़ाई के क्रम में स्पष्ट है कि क्या cruzi बहते एरिथ्रोसाइट्स के साथ इंटरैक्ट करता है जो रक्त प्रवाह की दिशा में बहती है. पिछले इन विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि ठोस संरचनाओं की उपस्थिति (यानी, रक्त कोशिकाओं), या तरल की वृद्धि हुई चिपचिपाहट इन विट्रो मेंरक्त की नकल करने के लिए, परजीवी के गतिशीलता और वेग पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है 9.

वहां phagocytic कोशिकाओं, शुरू में संक्रमित सेल प्रकार29से बचने के amastigotes के बाद मनुष्यों में टी. cruzi के संक्रमण के पाठ्यक्रम के बारे में कई सवाल हैं । उदाहरण के लिए, कैसे वे अपने लक्ष्य अंगों के लिए पहुंचते हैं? ऐसे कार्डियक, पाचन, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रूप में पसंदीदा अंगों के लिए tropism के लिए तंत्र क्या हैं? दिलचस्प है, इस अध्ययन में परजीवी शुरू में दिल में छवि थी, क्योंकि यह परजीवी के उच्चतम घनत्व का स्थल था । हालांकि, CFSE संकेत बाद में 7 दिनों के बाद इंजेक्शन द्वारा विकासशील आंत में संचित । हालांकि मछली और स्तनधारियों के एनाटॉमी अलग है, इस अध्ययन के परिणाम tropism के एक फार्म का प्रदर्शन, के रूप में यह देखा गया था कि परजीवी जीव मतभेदों के बावजूद ज्ञात पसंदीदा लक्ष्य अंगों की ओर tropism का प्रदर्शन किया । इस अध्ययन की एक महत्वपूर्ण सीमा के प्रयोगों में इस्तेमाल तापमान की चिंताओं । पूरी प्रक्रिया के दौरान Zebrafish लार्वा को लगभग 28 डिग्रीसेल्सियस के आसपास रखा जाना चाहिए । हालांकि इस तापमान वेक्टर मेजबान (Triatominae उपपरिवार के कीड़े) के समान हो सकता है, यह गर्म खून स्तनधारियों कि अंतिम मेजबान (लगभग ३७ डिग्री सेल्सियस) शामिल से काफी अलग है । T. cruzi flagellar दोनों मेजबानों में रहने वाले रूपों के लिए जाना जाता है; हालांकि, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि इस कारक vivo मेंजानवर के व्यवहार में एक प्रभाव हो सकता है.

हालांकि मछली ´ एस अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली है परिपक्व नहीं है जब तक 4 सप्ताह के बाद निषेचन, जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास में जल्दी सक्रिय है10। के रूप में जल्दी के रूप में ४८ या ९६ hpf, phagocytic कोशिकाओं को देखा गया trypanosomes लेबल घिरा (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस परजीवी के दृश्य के लिए समय की खिड़की सीमा । हालांकि, अगर एक अध्ययन के लिए मछली ´ एस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित किया गया था, बाद के चरणों में इंजेक्शन की सिफारिश की जा सकती है । इसके अलावा, लेबल मैक्रोफेज या प्रतिरक्षा प्रणाली के अन्य कोशिकाओं के साथ ट्रांसजेनिक मछली लाइनों में परजीवी के इंजेक्शन परजीवी लगाव और संभव endocytosis तंत्र का अध्ययन करने में उपयोगी हो सकता है । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि अगर परजीवी CFSE के साथ लेबल कर रहे हैं, ट्रांसजेनिक सेल लेबल GFP नहीं किया जाना चाहिए, और स्पेक्ट्रम के पीले या लाल अंत में एक मार्कर की आवश्यकता है ।

परजीवी आंदोलन की विस्तृत दिशा का आकलन करने के लिए, यह 3 आयामों (3 डी) में अपने पथ का पालन करने के लिए उपयोगी हो सकता है । 3 डी दृश्य और प्रक्रिया के पुनर्निर्माण के लिए, एक उच्च गति प्रणाली आवश्यक है । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया उपकरणों के साथ, यह केवल एक विमान में परजीवी कल्पना करने के लिए संभव है । इस मामले में, हम परजीवी आंदोलन के दौरान फोकल विमान स्थिरता को बनाए रखने प्राथमिकता है, और एक विमान में अपनी गति रिकॉर्डिंग ।

यहां प्रस्तावित पद्धति हृदय संचलन में परजीवी व्यवहार की जांच करने का मार्ग प्रशस्त करती है । सारांश में, zebrafish लार्वा के अंदर इमेजिंग लाइव फ्लोरोसेंट परजीवी के लिए आवश्यक कदम हैं:(i) जल्दी रची भ्रूण का उपयोग (24-48 hpf) या लार्वा, या कोई रंजकता के साथ 72-96 hpf के बीच जानवरों इतना है कि वे पारदर्शी और इंजेक्षन करने के लिए आसान कर रहे हैं; (ii) phagocytic कोशिकाओं द्वारा परजीवी निकासी से बचने के लिए इंजेक्शन के बाद जितनी जल्दी हो सके छवि लार्वा; और (iii) LSFM को ब् याज की साइट (उदा., pericardial क्षेत्र) पर फ़ोकस करें और ध् यान बनाए रखें । यह उपंयास प्रक्रिया एक अपने प्राकृतिक संक्रमण आला करने के लिए तुलनीय वातावरण में trypomastigotes के दृश्य की अनुमति देता है, पहली बार के लिए एक जीवित जीव में टी cruzi अध्ययन संभावना प्रदान करते हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

यह काम Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de लॉस Andes, और यूएसएड अनुसंधान और नवाचार फैलोशिप कार्यक्रम से Convocatoria Interfacultades द्वारा समर्थित किया गया । हम मछली के रखरखाव और सहायता के लिए जुआन राफेल Buitrago और Yeferzon Ardila धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5-10 μL Micropipette Fisherbrand 21-377-815
Agarose RA Amresco N605 Regular
Agarose SFR Amresco J234 Low Melting point
Aquarium salt Instant ocean SS15-10
Cell Count chamber Boeco Neubauer 
Cell culture flasks Corning 430639
Centrifuge Sorvall Legend RT
CFSE ThermoFisher C34554
Detection objective Nikon 40x 0.8NA  40x CFI APO NIR
DMEM medium Sigma-Aldrich D5648
Dumont #5 fine forceps World precision Instruments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Fetal calf serum (FCS) Eurobio CVFSVF00-01
Filter Chroma ET-525/50M
Glass capillaries for embryo mounting Vitrez Medical 160215
Glass capillaries for pulling needles World precision instruments TW100-4
Glucose Gibco A2494001
HEPES Gibco  156300-80
Incubator Thermo Corporation Revco
Larval microinjection mold Adaptive Science Tools I-34
Laser Crystalaser DL488-050
L-glutamine Gibco 250300-81
Methylene blue Albor Químicos 12223
Micromanipulator  Narishige MN-153
Micromanipulator system Sutter Instrument MP-200 For LSFM 
Micropipette puller device  Narishige PC-10
Microscope  Olympus CX31
Microscope (inverted) Olympus CKX41
Multipurpose microscope Nikon AZ100M
Neubauer counting chamber Boeco Germany
Penicillin-streptomycin Gibco  15140-163
Petri dish 94x16 Greiner bio-one 633181
Plastic pasteur pipette Fisherbrand 11577722
Rotation stage Newport CONEX-PR50CC
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R4130
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Stereoscope Nikon C-LEDS
Tricaine (MS-222) Sigma-Aldrich 886-86-2
TRIS Amresco M151
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco R-001-100
Tubes 15 ml Corning 05-527-90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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