Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

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Summary

L'obiettivo del protocollo è di presentare una procedura ottimizzata per la creazione di un modello in vitro barriera ematomeningea (BBB) basato sulle cellule endoteliali cerebrali primari porcina (pBECs). Il modello mostra un'elevata riproducibilità, alta tenuta ed è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare nella scoperta della droga.

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Nielsen, S. S., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

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Abstract

L'obiettivo di questo protocollo presenta una procedura ottimizzata per la purificazione e la coltivazione di pBECs e di stabilire in vitro barriera ematomeningea (BBB) modelli basati su pBECs in mono-cultura (MC), MC con medium condizionato di astrociti (ACM), e senza contatto co-coltura (NCC) con i astrocytes di suino o ratto origine. pBECs è stato isolato e coltivato da frammenti di vasi capillari dalle cortecce cerebrali di suini domestici 5-6 mesi di età. Questi frammenti sono stati purificati dal rimozione accurata di meningi, isolamento e omogeneizzazione della materia grigia, filtrazione, digestione enzimatica e centrifugazione. Per ridurre ulteriormente le cellule contaminanti, i frammenti capillari sono stati coltivati con contenenti con puromicina medio. Quando 60-95% confluenti, pBECs crescente dai frammenti capillari sono state attraversate per filtro a membrana permeabile inserisce e stabilita nei modelli. Per aumentare la tenuta di barriera e il fenotipo caratteristico BBB di pBECs, le cellule sono state trattate con i seguenti fattori di differenziazione: membrana permeante 8-CPT-cAMP (cAMP qui abbreviato), idrocortisone e un inibitore della fosfodiesterasi, RO-20-1724 (RO). La procedura è stata effettuata in un periodo di 9-11 giorni, e quando si stabilisce il modello di NCC, gli astrociti sono stati coltivati 2-8 settimane in anticipo. L'aderenza alle procedure descritte nel protocollo ha permesso la creazione di strati endoteliali con permeabilità paracellulare molto limitato, con il servizio NCC Mostra una resistenza elettrica media transendoteliale (TEER) 1249 ± 80 Ω cm di modello 2e permeabilità paracellulare (Papp) per Lucifero giallo di 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sec-1 (media ± SEM, n = 55). Ulteriore valutazione di questo fenotipo pBEC ha mostrato buona espressione della stretta proteine giunzionali claudin 5, ZO-1, occludina e adherens giunzione proteina p120 catenina. Il modello presentato può essere utilizzato per una serie di studi della BBB nella salute e nella malattia e, con la permeabilità paracellulare altamente restrittive, questo modello è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare.

Introduction

Struttura cellulare e la funzione della barriera sangue - cervello

All'interfaccia del sistema nervoso centrale e circolatorio (CNS), la BBB agisce come un sito di regolamentazione chiave per controllo omeostatico del microambiente CNS, che è essenziale per la funzione adeguata e la protezione del sistema nervoso. Il sito della BBB è le cellule endoteliali che allineano il lume del vaso sanguigno. Nei capillari del cervello, le cellule endoteliali formano complesse giunzioni intercellulari strette e modelli di espressione fortemente polarizzata di particolare afflusso e deflusso trasportatori garantiscono un trasporto molecolare altamente specifico tra il sangue e il cervello 1. I componenti strutturali dei complessi stretta della giunzione includono le proteine dalla famiglia occludin e claudin, zonula occludens (ZO) proteine, cingulin e associati di molecole di adesione giunzionale (marmellate). 5 Claudin è particolarmente importante nella restrizione giunzionale paracellulare. Induzione e il mantenimento di questo caratteristico fenotipo endoteliale BBB coinvolgono interazioni dinamiche con le cellule circostanti, compreso i periciti, astrociti, neuroni e le membrane dello scantinato, che insieme con cervello endothelial cellule forma il neurovascular unità (NVU)2,3. I meccanismi coinvolti in queste interazioni non sono ancora completamente chiari, ma includono scambio di segnali chimici fra le cellule, che consente la modulazione della permeabilità BBB a breve termine e induce a lungo termine BBB caratteristiche4. Astrociti soprattutto sono conosciuti per contribuire al fenotipo endoteliale delle cellule del cervello e sono una fonte di fattori regolatori quali neurotrophic glial-derivato fattore (che interessano cAMP intracellulare)5, fattore di crescita di base del fibroblasto6, idrocortisone7e per la β (TGF-β) di fattore di crescita trasformante8. L'effetto di TGF-β, tuttavia, è stato dibattuto9.

Da In Vivo In Vitro BBB

In vivo gli studi continuano a fornire preziose informazioni sulla biologia BBB. Tuttavia, modelli di coltura cellulare possono fornire ulteriori approfondimenti e costituiscono strumenti utili per comprendere gli aspetti molecolari e funzionali dettagliati della BBB in salute e malattia. Anche se le complesse interazioni tra i tipi di cella e costituenti della BBB sono difficili da raggiungere completamente in modelli in vitro , c'è stato, dal prima purificazione delle cellule endoteliali cerebrali e l'applicazione di questi in mono-culture 10 , 11 , 12, ampio sviluppo delle procedure di purificazione e le condizioni di crescita della BBB cellulari modelli di cultura, con conseguente maggiore somiglianza con la barriera in vivo . I modelli BBB comunemente usate in vitro sono basati su cellule primarie di origine roditore, suina e bovina e su linee cellulari immortalizzate. Ogni modello presenta diversi vantaggi e svantaggi. Per la scelta di modello e confronto, marcatori di convalida come espressione di enzimi BBB, trasportatori, recettori e proteine strutturali vengono utilizzati per creare panoramiche del corrente affermati modelli1.

Obiettivo del protocollo

Una caratteristica importante della BBB è barriera strettezza e alto TEER, ancora un gran numero di modelli disponibili non riflettono bene i livelli in vivo . Integrando il contributo di sviluppo e ottimizzazione da parecchi laboratori, l'obiettivo di questo protocollo è di presente un metodo per stabilire un alto TEER in vitro BBB modello basato su pBECs primario in MC con o senza ACM o in NCC con primario astrociti di ratto o di origine suina. Le procedure applicate e istituzione del modello includono gli sforzi per eliminare le cellule contaminanti e per migliorare la differenziazione delle pBECs in un fenotipo BBB. Questo lavoro ha provocato l'istituzione di modelli TEER ad elevate affidabilità, con permeabilità paracellulare basso e buona espressione funzionale di proteine giunzionali stretti chiave, trasportatori e recettori. Tuttavia, come gli astrociti sono un fattore che contribuisce al fenotipo endoteliale delle cellule del cervello, le tre diverse condizioni di cultura rappresentano tre diversi fenotipi delle cellule endoteliali cerebrali. Il modello di NCC è utile soprattutto per gli studi di alcuni meccanismi specializzati coinvolti nella scoperta della droga, gli studi sui trasporti e traffico intracellulare, oltre che per studio delle interazioni cellula-cellula, dove si trova la massima espressione delle caratteristiche BBB vantaggioso.

Origine e storia del protocollo

Il modello pBEC qui descritto si basa sul modello porcino sviluppato presso i laboratori di Eisai (Londra) da Dr. Louise Morgan e colleghi, che è basato su un successo precedenti cervello bovino delle cellule endoteliali modello13. Il metodo originale di preparazione delle cellule è una filtrazione di due fasi utilizzando nylon mesh per catturare i microvasi, seguiti da una fase subculturing per migliorare la purezza. Nello sviluppo del metodo precedente, tenuta ottimale del fenotipo e barriera BBB sono stati raggiunti dalla crescita in mezzo completato, tra cui ACM. Ulteriori modifiche al metodo sono state fatte da R. Skinner nel laboratorio del Prof N. Rothwell in Manchester Regno Unito14,15. Il metodo fu adottato dal laboratorio Abbott, KCL London, dove Patabendige reso significativamente più semplice preparare evitando l'uso di astrociti o ACM ed eliminando le cellule contaminanti quali periciti con con puromicina. Dai primi documenti ha confermato che il modello MC conservato diverse caratteristiche importanti in vivo BBB, tra cui efficace giunzioni strette, sistemi di trasporto di membrana e recettore transcitosi16,17 , 18 , 19 , 20. più tardi S. Yusof nuovamente testato co-coltura del astrocyte e trovato esso migliorato significativamente TEER, quindi questa è la variante preferita attualmente utilizzata nel laboratorio Abbott21. Il modello è stato correttamente trasferiti la Nielsen M. laboratorio a Aarhus, dove ulteriori modifiche sono state introdotte (questo protocollo), tra cui semplificando grigio importa estrazione, utilizzando solo una maglia filtrazione passaggio e un passaggio di rivestimento singolo filtro combinazione di collagene e fibronectina. La procedura applicata per l'isolamento dei astrocytes porcino (questo protocollo) era basata su protocolli sviluppati dal laboratorio T. Moos a Aalborg, descritto da Thomsen et al.22. Il TEER e altre proprietà del modello generato a Londra e Aarhus sono simili, che presta fiducia alla nozione che il modello viene prontamente trasferito tra i laboratori e risponde bene a un'attenta osservazione e la razionalizzazione dei passaggi del metodo. Infatti, S. Yusof ora ha stabilito il modello MC in un paese tropicale (Malesia)23, che ha coinvolto ulteriore adeguamento per le condizioni locali e fonti di tessuto.

Vantaggi rispetto ai metodi alternativi e attualmente stabilito modelli

Rispetto alle cellule endoteliali cerebrali di origine bovina e del roditore, pBECs forniscono il vantaggio di avere un tasso più basso di perdita del fenotipo in vivo BBB dopo isolamento24. Inoltre, sono in grado di formare barriere endoteliali relativamente strette, anche quando coltivate in MC (800 Ω cm2)16 rispetto ai livelli comunemente segnalati per monostrati di linee cellulari quali bEND.5 e bEND.3 (50 Ω cm2) pBECs 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30e cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32e cerebrali primari cellule endoteliali del mouse (100-300 Ω cm2)SS = "xrif" > 33,34,35,36 e ratto (100-300 Ω cm2)37,38. Tuttavia, il TEER ha mostrato dipendenza sulle procedure di purificazione e di cultura. Nella maggior parte dei casi, l'aggiunta di ACM o di co-coltura con i astrocytes Mostra effetti differenziazione le cellule endoteliali e un aumento nella strettezza del endoteliale strati1. Tuttavia, con gli sforzi per ottimizzare le condizioni di coltura, solo i modelli basati su bovini hanno mostrato valori TEER paragonabili ai modelli basati su porcina (medie di 800 Ω cm2 in MC, fino a 2500 Ω cm2 in co-coltura Astrocita)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Come i modelli basati su primario cervello bovino cellule endoteliali hanno dimostrato grandi variazioni, sia tra e all'interno di laboratori14,45,46,47,48, riproducibilità potrebbe essere un problema. Nel modello pBEC segnalato qui, i laboratori che contribuisce hanno raggiunto TEER molto simile e valori di permeabilità paracellulare con bassa variabilità sia tra i laboratori che in. Quindi, dovrebbe essere possibile per altri laboratori di stabilire un modello affidabile con bassa variabilità utilizzando il metodo presentato qui. Oltre a formare strati endoteliali stretti, modelli con pBECs precedentemente sono stati convalidati dall'espressione di proteine di giunzione stretta, funzionale BBB trasportatori, recettori ed enzimi e comprovata idoneità per una gamma di studi15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Inoltre, inediti transcriptome dati sulle co-culture di pBECs mostrano un profilo previsto dei trasportatori BBB e recettori (risultati non pubblicati, Nielsen et al.).

Il modello BBB porcina basato presenta un ulteriore vantaggio come il genoma, anatomia, fisiologia, e progressione di malattia del maiale riflettono la biologia umana ad un grado più elevato rispetto ad altri modelli stabiliti dispone di60, che sono favorevoli per il industria farmaceutica. Come suini cervelli sono un comune sottoprodotto dell'industria della carne, essi costituiscono una fonte facilmente accessibile del cervello cellule endoteliali, riducendo al minimo il numero di animali necessari per gli esperimenti e fornendo una resa alta purificazione da un cervello porcino. Sebbene la purificazione e la coltivazione di cellule primarie è un po' laborioso e richiede competenze di normalizzazione nella creazione del modello, cellule primarie generare i modelli BBB più affidabili. Linee cellulari immortalizzate non possono essere un sostituto, come proprietà importanti come tenuta di barriera, profili di espressione del trasportatore e regolamento microambiente non riflettono i risultati sperimentali in vivo61, 62. in vitro modelli offrono il vantaggio di vivere-cella delle immagini con risoluzione superiore, rendendo possibile la visualizzazione di processi intracellulari consentendo un approccio di vicinanza alle cellule campionate o osservati, utilizzando obiettivi con ingrandimento maggiore e migliore qualità ottica63. Questo non è il caso per l'uso di microscopia del due-fotone in animali vivi. Inoltre, in vitro modelli offrono la possibilità a transfect cellule, permettendo la visualizzazione di proteine e di indagine dei loro traffici.

Applicazioni del modello

La funzione della BBB non è fisso e può essere modulata in modo dinamico in fisiologia e la patologia. In molte malattie neurologiche, compreso neurodegenerative, infiammatorie e infettive, rottura e aumento della permeabilità della BBB è osservato64,65,66,67 . Al fine di ridurre e prevenire la progressione della malattia e conseguenti danni, identificazione e caratterizzazione dei meccanismi molecolari che sono alla base della modulazione della BBB sono di grande importanza. In questo contesto, affidabile in vitro modelli sono molto richiesti dall'industria farmaceutica e inoltre svolgono i ruoli importanti nel predire la permeabilità BBB di droghe al sistema nervoso centrale. Qualsiasi modello in vitro che serve come uno schermo di permeabilità dovrebbe visualizzare una via paracellulare restrittive, una cellula fisiologicamente realistica architettura ed espressione funzionale del trasportatore meccanismi68. Dimostrato in precedenti studi16,17,57e di permeabilità paracellulare ed espressione delle proteine TJ e AJ qui, il modello presentato soddisfa tutti questi criteri ed è adatto per una gamma di BBB studi in entrambi normale fisiologia e nella patologia. I punti di forza del metodo di purificazione e coltivazione presentato includono una combinazione di semplicità e riproducibilità e la capacità di includere astrocytic influenza con un robusto e affidabile alto TEER in vitro BBB modello risultante. Per questo scopo, gli astrociti di porcino e ratto origine hanno dimostrato di aumentare il fenotipo BBB di pBECs in un modo simile22.

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Protocol

suini cervelli sono stati ottenuti come sottoprodotti dell'industria alimentare danese. Macelli danesi sono sotto stretta sorveglianza e l'osservazione dal Ministero danese dell'ambiente e cibo.

ratti utilizzati per l'isolamento degli astrociti sono stati allevati e stabulati in gruppo nella struttura animale locale ad una temperatura ambiente di 22 ° C - 23 ° C e su un ciclo di buio/luce 12/12 h sotto controllo del veterinario e secondo danese regolamenti per gli animali da laboratorio. I ratti sono stati eutanasizzati prima sono stati sacrificati conformemente alle linee guida internazionali sull'uso etico degli animali (direttiva del Consiglio delle Comunità europee del 24 novembre 1986; 86/609/CEE) e linee guida danese. Senza esperimenti in vivo su animali o materiale umano sono stati utilizzati in questi esperimenti.

Nota: segue il protocollo principale pBEC che descrive la purificazione (passaggio 1), coltivazione (passaggio 2) e (passaggio 3) TEER misurazioni. Per l'installazione di un NCC con gli astrociti, viene presentato un protcol alternativo (passaggio 4) che descrive la purificazione e la coltivazione di ratto e astrociti porcini.

1. purificazione di capillari cerebrali suina

  1. raccogliere cervelli di 8-10 da 5-6-month-old suini domestici (ad es. da un macello nelle vicinanze) e trasportarli sul ghiaccio al laboratorio. Si consiglia di iniziare la procedura di purificazione seguente all'interno di 2-3 h di terminazione dell'animale.
  2. Posizionare i cervelli in un flussometro sterile e lavarli delicatamente con 1 L di PBS in un becher immesso sul ghiaccio.
  3. Attentamente rimuovere meningi da un cervello alla volta usando il forcipe ammenda-punta e trasferire i cervelli di meningi-libera un altro becher da 1 litro con PBS posizionato su ghiaccio. Estendere il tempo impiegato può complicare la rimozione. Il tempo approssimativo per ogni cervello dovrebbe essere 10-15 min.
  4. Usando un bisturi, raschiare la materia grigia da un cervello alla volta e trasferire il materiale isolato di Petri (8,8 cm 2) contenente 20 mL di miscela di nutrienti DMEM F-12 (DMEM/F-12) posizionato su ghiaccio. Isolare come materia molto grigia come possibile senza ritirare materiale di materia bianca. Per frammentazione iniziale, eseguita il materiale di materia grigia attraverso una siringa da 50 mL senza ago. Continuare per tutti i cervelli e la piscina il materiale raccolto materia grigia. Estendere il tempo impiegato può complicare la rimozione. Il tempo approssimativo per ogni cervello dovrebbe essere 10-15 min.
  5. Trasferire il materiale isolato di materia grigia nella provetta di smerigliatrice di un omogeneizzatore del tessuto mano in un rapporto di 50/50 con DMEM/F-12 media. Omogeneizzare il materiale facendo 8 su e giù colpi con un pestello sciolto, seguito da 8 su e giù colpi con un pestello stretto. Continuare fino a quando tutti isolato materiale ha stato omogeneizzato, quindi trasferire l'omogeneizzato per una bottiglia da 500 mL e diluire con DMEM/F-12 al volume totale di circa 450 mL.
  6. Filtrare l'omogeneizzato utilizzando una bottiglia da 500 mL blu-tappo con portafiltro e 140 µm-maglia del filtro e isolare i capillari eseguendo il tessuto attraverso il filtro. Utilizzare un filtro per 50 mL di omogenato e lavare dopo ogni filtro con DMEM/F-12.
  7. Posto il capillare contenente filtri in capsule di Petri con una soluzione di digestione della tripsina/EDTA (2,5% tripsina, 0,1 nM EDTA in PBS), collagenasi CLS2 (2.000 U/mL) e dnasi 1 (3.400 U/mL) in DMEM/F-12. Utilizzare 1 capsula di Petri (8,8 cm 2, 20 mL di soluzione) per ogni 3 filtro meshes.
  8. Inserire le piastre di Petri a 37 ° C per 1 h su agitatore orbitale a 180 giri/min o mescolate delicatamente ogni 10 min. Dopo 1 h, lavare i capillari dai filtri con sospensione da di Petri utilizzando una pipetta da 1 mL.
  9. Dividere la sospensione da 3 piatti in 2 tubi da 50 mL e fermare la digestione aggiungendo 10ml DMEM/F-12 ad ogni provetta da 50 mL.
  10. Centrifuga le sospensioni di cellule a 250 x g, 4 ° C per 5 min, aspirare i sovranatante e risospendere ogni pellet in 10 mL di DMEM/F-12. Aggiungere altri 20 mL di DMEM/F12 in ogni provetta. Ripetere due volte questa centrifuga.
  11. Let i tubi raffreddare in ghiaccio per 5 minuti e trasferire le soluzioni a 2 nuove provette da 50 mL.
  12. Centrifugare le sospensioni di cellule a 250 x g, 4 ° C per 5 minuti e Risospendere ciascun pellet in 8-10 mL (circa 1 mL/cervello utilizzato) di congelamento soluzione composta da 10% DMSO in FBS.
  13. Trasferire la sospensione cellulare cryovials, usando 1 mL / cryovial. In media, una purificazione provoca 1 fiala al cervello utilizzato, fornendo in media le cellule endoteliali per 12-16 inserti. Posizionare le fiale in una casella di congelamento a-80 ° C per almeno 4 ore fino a notte. In seguito, memorizzare le cryovials in un cryotank con azoto liquido.
    Attenzione: Azoto liquido ha temperature estremamente basse. Si prega di indossare una protezione appropriata.

2. Coltivazione di pBECs primaria (8-10 giorni)

  1. Cultura iniziale (3-5 giorni)
    giorno 1
    1. per ottimizzare le condizioni per l'applicazione di pBECs, eseguire il rivestimento di un pallone da T75 aggiungendo una soluzione con finale concentrazioni di collagene IV (150 µ g/mL) e fibronectina (50 µ g/mL) in ddH 2 O al pallone, assicurandosi che la soluzione copre tutta la superficie. Utilizzare 10 mL per ciascuna beuta T75. Incubare a 37 ° C per 2 h.
      Nota: Il rivestimento può essere eseguito appena prima dell'uso, o fino a una settimana prima e conservato con PBS a 4 ° C. Il rivestimento non deve seccare, o non si forma una superficie adatta di attaccamento e la crescita.
    2. Preparare 16 mL di pBEC crescita medio composto da DMEM/F-12 completati con 10% siero plasma-derivato (PDS), penicillina (100 U/mL), streptomicina (100 µ g/mL) e l'eparina (15 U/mL). Supplemento mezzo con con puromicina (4 µ g/mL) per selezionare per le cellule endoteliali. Essere consapevoli del fatto che il trattamento con puromicina. può essere utilizzato solo per un massimo di 5 giorni.
    3. Aliquota il mezzo preparato in volumi di 6 mL e 10 mL in due provette da 15 mL.
    4. Portare un flaconcino con capillari da azoto liquido (punto 1.13) e scongelare i capillari, mediante l'utilizzo di un bagno di acqua di 37 ° C o aggiungendo 750 µ l del mezzo preparato da parte aliquota di 6 mL. Se lo scongelamento aggiungendo mezzo, Pipettare attentamente su e giù per scongelare e omogeneizzare la sospensione. Quando scongelati, trasferire la sospensione cellulare al medium 6 mL aliquotare.
    5. Per rimuovere il mezzo di congelamento, girare i capillari giù a 250 x g, 4 ° C per 7 min.
    6. Attentamente aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 1-2 mL dell'aliquota 10mL. Quando ri-sospeso, trasferire la soluzione in mezzo 10mL aliquota.
    7. Trasferire la sospensione capillare al pallone T75 rivestito e inclinare delicatamente il pallone per garantire un'equa distribuzione su tutta la superficie. Collocare la beuta T75 a 37 ° C, 5% CO 2.
      Giorno 2
    8. Dopo incubazione overnight, preparare 10ml pBEC crescita supplementato con con puromicina (4 µ g/mL) per una boccetta di T75 ed eseguire un cambiamento medio. Essere consapevoli del fatto che tutte le soluzioni a medio applicate alle celle dovrebbero essere pre-riscaldate a 37 ° C prima dell'uso.
      Nota: In alternativa, un cambiamento medio può essere effettuato 4-6 h post-placcatura quando capillari dovrebbero avere allegata alla superficie. Incubare le cellule fino alla confluenza del 60-95% è raggiunto, solitamente 3-5 giorni dallo scongelamento. Fare non allocellule w per raggiungere la confluenza di 100% per evitare l'inibizione del contatto che può arrestare ulteriormente la crescita delle cellule.
      Giorno 4-6
    9. Quando il confluency di desiderato è raggiunto, passaggio le cellule endoteliali per inserti di membrana permeabile (Vedi sezione 2.2). Se il confluency di desiderata non viene raggiunta il giorno 4, cambiamento di mezzo viene eseguita. Al più tardi il giorno 6, cellule dovrebbero essere attraversate verso gli inserti di membrana permeabile. Se il confluency di richiesta non è raggiunto da giorno 6, le cellule non sono adatte per uso sperimentale.
      Nota: preparazione degli astrociti per NCC: quando si configura il modello di co-coltura, 2 - 8 settimana-vecchio astrociti in coltura (Vedi sezione 4) dovrebbero essere preparati per il modello di co-coltura eseguendo un cambiamento medio del giorno precedente passaggio le cellule endoteliali a inserti. Per ogni Astrocita preparare bene, 1500 µ l di astrociti crescita terreno costituito da DMEM basso glucosio completato con 10% FBS, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 µ g/mL) e quindi eseguire il cambiamento medio.
  2. Crescita di pBECs sulla permeabile membrana (5 giorni) consente di inserire
    giorno 4-6
    1. membrana permeabile Prepare inserti (12-pozzetti con inserti di 2 della superficie di 1,12 cm, 0,4 µm pori) per semina di pBEC da rivestimento con collagene IV (500 µ g/mL) e fibronectina (100 µ g/mL) in ddH 2 O. uso circa 300 µ l per ogni inserire e assicurarsi che la soluzione copre l'intera superficie crescente. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per un minimo di 2 h.
    2. Preparare 30 mL di mezzo di sviluppo pBEC (per composizione media, fare riferimento alla sezione 2.1.2) senza con puromicina.
    3. Aspirare delicatamente lavare due volte con 5 mL di PBS sterile a temperatura ambiente e medium da pBEC cultura nel matraccio T75.
    4. Tripsinizzano le cellule con l'aggiunta di 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA (2,5% tripsina, 0,1 nM EDTA in PBS) per il T75 e posizionare il pallone a 37 ° C, 5% CO 2 per 5-7 min.
    5. Per staccare le cellule endoteliali cerebrali, picchiettare delicatamente il lato della muffola T75 con i polpastrelli, lasciando alla fine i periciti superstiti e più forte-fissaggio sulla superficie del pallone. Individuare visivamente distaccamento sotto un microscopio. Quando si osserva un distacco di 80%, fermare trypsinization aggiungendo 5 mL di terreno.
    6. Trasferire la soluzione di cella in una provetta da 15 mL utilizzando una pipetta da 10 mL e spin giù le cellule endoteliali cerebrali mediante centrifugazione a 250 x g, 4 ° C per 7 minuti.
    7. Attentamente rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1mL di terreno. Quando sospesa, aggiungere altri 2 mL di medium per portare il volume totale a 3 mL
    8. contare il numero di celle manualmente mediante uso di una cella conteggio camera o una cella automatica sistema di conteggio. Preparare una soluzione di cella di 2,2 x 10 medio di cellule/mL 5, risultante in una densità di semina finale di 1.1 x 10 5 cellule/inserto.
    9. Rimuovere la soluzione di rivestimento dagli inserti membrana permeabile e trasferire 500 µ l di sospensione cellulare ogni inserto. Su uno degli inserti, aggiungere mezzo unico e utilizzare questo inserto come un ' solo filtro ' controllo per le misure di TEER.
    10. Stabilire le cellule endoteliali in MC, MC con ACM, o in NCC con i astrocytes nel modo seguente:
      1. per MC: aggiungere 1500 µ l di pBEC crescita medio/ACM per pozzetto della piastra 12-pozzetti sotto gli inserti di membrana permeabile. Mettere gli inserti di membrana permeabile a 37 ° C, 5% CO 2 e incubare per 2 giorni.
      2. Per NCC: trasferimento inserisce nei pozzetti con i astrocytes rinfrescato con mezzo di crescita Astrocita il giorno prima. Mettere gli inserti di membrana permeabile a 37 ° C, 5% CO 2 e incubare per 2 giorni.
        Nota: Essere consapevoli dell'uso dei diversi tipi di media nei pozzetti fondo dei tre modelli.
        Giorno 6-8
    11. Il giorno 2, cambiare il supporto sugli inserti membrana permeabile con pBECs. Preparare 500 µ l di terreno di coltura per inserto pBEC ed eseguire attentamente il cambiamento per ridurre al minimo la rottura dello strato delle cellule. Incubare le cellule per due giorni. Essere consapevoli del fatto che il cambiamento di media viene eseguito sugli inserti solo e non sul fondo.
  3. Stimolazione con fattori di differenziazione (1-2 giorni)
    giorno 8-10
    1. per ciascuno dei diversi modelli, mezzi di stimolazione devono essere preparato come segue:
      1. per MC: per ogni inserire e preparare bene, 500 µ l di terreno di crescita pBEC contenenti cAMP (250 µM), idrocortisone (550 nM) e RO (17,5 µM).
        MC: Preparare inoltre 1500 µ l di terreno di crescita pBEC contenente cAMP (250 µM), idrocortisone (550 nM) e RO (17,5 µM).
        MC con ACM: scongelare 1500 µ l di ACM e integrarla con cAMP (250 µM), idrocortisone (550 nM) e RO (17,5 µM).
      2. Per NCC: per ogni inserimento, preparare 500 µ l di terreno di crescita pBEC contenenti cAMP (250 µM), idrocortisone (550 nM) e RO (17,5 µM). Per ogni bene di astrociti, preparare 1500 µ l di DMEM/F-12 completati con penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 µ g/mL), eparina (15 U/mL), accampamento (250 µM), idrocortisone (550 nM) e RO (17,5 µM).
    2. Per ciascuno dei diversi modelli, esecuzione media exchange come segue:
      1. per MC: attentamente aspirare medio da pozzi e inserti e aggiungere il supporto di differenziazione per entrambi i comparti, con 500 µ l per ogni inserto e 1500 µ l per pozzetto. Essere consapevoli del fatto che rottura su entrambi i lati dell'inserto possa influenzare e alterare lo strato delle cellule.
      2. Per NCC: attentamente aspirare medio da pozzi e aggiungere mezzo di differenziazione 750 µ l per pozzetto. Attentamente aspirare medio da inserti e aggiungere 500 µ l di terreno di differenziazione per inserto. Quindi aggiungere il rimanente mezzo di differenziazione di 750 µ l per ogni Astrocita ben.
    3. Per tutti i modelli: mettere le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 e incubare con mezzo di differenziazione fino al giorno successivo.
      Nota: Tenere presente che per il servizio NCC con gli astrociti, gli astrociti sono da questo punto tenuto in medium senza siero.

3. TEER misure

  1. il giorno dopo stimolando le cellule con mezzo di differenziazione, preparare il sistema di alloggiamento di misurazione del tessuto resistenza per misurazioni TEER risciacquando la camera due volte con ddH 2 O, una volta con 70% EtOH per 5 min e 2 volte di più con ddH 2 O.
  2. Aggiungere 4 mL di DMEM/F-12 per camera di misura della resistenza del tessuto, collegarlo al sistema e calibrare per circa 30 min secondo le seguenti impostazioni: R = 0, Test R = 1000, modalità = R.
  3. Eseguire le misurazioni TEER posizionando accuratamente gli inserti nella camera di misurazione della resistenza del tessuto. Per ogni inserimento, effettuare misurazioni in triplice copia e calcolare la media Ω cm 2.
    Nota: Per il modello di co-coltura, valori TEER si prevedono di raggiungere > 500 Ω cm 2. Se il livello appropriato di TEER non viene raggiunto il primo giorno di misurazione TEER, aggiungere nuovi fattori di differenziazione (cAMP (250 µM), idrocortisone (550 nM) e RO (17,5 µM)) e misurare TEER nuovamente il giorno seguente. Quando vengono raggiunti livelli appropriati, il modello dovrebbe essere pronto per l'esperimento pianificato. Essere consapevoli del fatto che le cellule devono riposare per almeno 3 ore prima di eseguire l'esperimento per recuperare dopo le misure TEER. Dopo stimolazione, TEER valori in generale rimangono accettabili per 24-48 h dopo stimolazione.
    Nota: Un metodo alternativo e più veloce utilizzando la coppia di elettrodi STX - 100C rigida anche record alta TEER in questo modello 81. Il ele STX2 flessibilectrode coppia dà meno affidabile letture.

4. PREPARAZIONE di astrociti per co-coltura NON-CONTACT: Metodo alternativo

  1. Purificazione di astrociti
    1. per ogni ratto cervello utilizzato, cappotto 2 T75 boccette con l'aggiunta di 10 mL di poli-L-lisina (5 µ g/mL) in ddH 2 O a ciascuno T75 boccetta. Incubare le beute a 37 ° C per 30 min.
    2. Isolamento dei astrocytes può essere eseguita come segue:
      1. astrociti di ratto:
        1. decapitare 2 1 - 2 giorno vecchi ratti con un metodo approvato.
        2. Tagliare la pelle di dosso il cranio a partire dal collo verso il naso e tagliare l'osso con un'incisione sagittale.
        3. Apre il cranio con il forcipe curvo, prendere il cervello e metterlo in una provetta da 15 mL (filmato 1) con 11 mL di glucosio basso DMEM completato con 10% FBS e gentamicina solfato (125 µ g/mL).
        4. Attentamente rimuovere meningi usando il forcipe ammenda-punta e sospendere il materiale cerebrale utilizzando una pipetta da 1 mL.
      2. Suini astrociti:
        1. ottenere 1 cervello da un maiale domestico di 5-6-month-old.
        2. Attentamente rimuovere meningi dal cervello utilizzando forcipe ammenda-punta e/o mani.
        3. Raccogliere 4 g di grigio importa dal cervello e disporre i pezzi in glucosio basso di 1-2 mL DMEM completato con 10% FBS e gentamicina solfato (125 µ g/mL) in una capsula di Petri. Se i pezzi sono grandi, tritare con bisturi o forcipe.
        4. Sospendere il materiale isolato mediante una pipetta da 1 mL, spostarlo in un 15 mL tubo (tubo 1) e riempire con glucosio basso DMEM completato con 10% FBS e gentamicina solfato (125 µ g/mL) per un volume totale di 11 mL.
        5. Continuare omogeneizzazione del materiale isolato con un lungo ago collegato a una siringa da 10 mL e sospendere su e giù per 3 volte. Attendere che i pezzi grossi hanno depositato sul fondo del tubo, quindi raccogliere 7ml di mezzo dalla parte superiore del tubo (tubo 1).
        6. Filtrare la sospensione cellulare 7-mL attraverso un filtro di nylon di 40 µm in una nuova provetta 50 mL (filmato 2).
        7. Medio-
        8. aggiungere 7 mL provetta 1 con il cervello. Continuare l'omogeneizzazione e la filtrazione da passaggi 4.1.2.2.5-6 fino a quando il volume della sospensione cellulare filtrata in tubo 2 è di circa 35 mL.
    3. Rimuovere la soluzione di rivestimento dai palloni T75 [passo 4.1.1]. Un rapido lavaggio con 5 mL di PBS dopo incubazione con poli-L-lisina può essere utilizzato per assicurare che le cellule non sono danneggiate da eventuali effetti tossici della soluzione rivestimento.
    4. Dividere e la soluzione di astrociti isolato equamente tra le beute T75 di seme. Incubare le beute a 37 ° C, 5% CO 2 per 3-5 giorni.
  2. Coltura astrociti e preparazione NCC con le cellule endoteliali (3 settimane)
    1. Iniziale cultura
      1. dopo 3-5 giorni di incubazione, è necessario eseguire un cambiamento medio accuratamente aspirando medio e aggiungendo 10 mL di glucosio basso DMEM completato con 10% FBS e gentamicina solfato (125 µ g/mL).
        Nota: Dopo il primo cambiamento medio, medio dovrebbe essere cambiato ogni 5 giorni. Durante le prime 2 settimane, scuotere le beute e lavare le cellule accuratamente con PBS quando si cambia il mezzo. Questo aiuti nella rimozione di contaminanti microglia.
      2. Dopo 3 settimane di coltivazione, tripsinizzano le cellule con l'aggiunta di 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA al fondo di ciascuna beuta T75 e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 5-7 min.
      3. Smettere di trypsinization aggiungendo 5 mL di terreno, trasferire la soluzione di cella a un tubo da 15 mL e centrifugare gli astrociti a x 250 g, 4 ° C per 7 min.
      4. Attentamente rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in congelamento soluzione composta da 10% DMSO in FBS.
      5. Contare il numero di cellule e preparare una soluzione di cella di 4.0 x 10 6 cellule/mL. Congelare le cellule in cryovials aggiungendo 1 mL per flaconcino.
    2. Crescita in permeabile membrana inserire sistema fondo Wells (2-12 settimane)
      1. preparare 12-pozzetti per la crescita dei astrocytes aggiungendo 1 mL di poli-L-lisina (5 µ g/mL) in ddH 2 O in ciascun pozzetto. Posizionare le piastre a 37 ° C per 2 h.
      2. Per ogni piastra 12-pozzetti, preparare 25 mL di terreno di coltura del astrocyte (glucosio basso di DMEM completato con 10% FBS e penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 µ g/mL)).
      3. Portare il flaconcino di astrociti da azoto liquido e scongelare le cellule con l'aggiunta di 750 medio di glucosio basso DMEM µ l. Pipettare attentamente su e giù per scongelare e omogeneizzare la sospensione. Quando scongelati, trasferire la sospensione cellulare in una provetta 15 mL e aggiungere il terreno per un volume totale di 7 mL.
        Attenzione: L'azoto liquido è estremamente bassa temperatura, così indossare protezione personale come guanti.
      4. Per rimuovere il mezzo di congelamento, girare i capillari giù a 250 x g, 4 ° C per 7 min.
      5. Attentamente aspirare il supernatante e risospendere le cellule in medium.
      6. Rimuovere il rivestimento dai pozzetti delle piastre bene 12 e trasferire la sospensione cellulare pozzetti utilizzando 1ml per pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2.
      7. Aggiornare il mezzo ogni terzo giorno e cultura le cellule per un minimo di 2 settimane prima di utilizzare le cellule per la co-cultura con cellule endoteliali. Le cellule possono essere utilizzate per la co-cultura per fino a 12 settimane dopo lo scongelamento, con l'età ottima essendo 2-8 settimane.

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Representative Results

Stabilimento di BBB In Vitro modelli

Nel metodo presentato, ottimizzato, la coltivazione di pBECs e l'istituzione del sistema di inserimento membrana permeabile con MC o senza ACM o NCC con i astrocytes (Figura 1) è stati effettuati per un periodo di 9-11 giorni (Figura 2). Per la selezione delle cellule endoteliali, una cultura iniziale di frammenti capillare purificati è stata combinata con un trattamento con puromicina per un massimo di 5 giorni, che ha eliminato la maggior parte delle cellule contaminante e promosso la crescita delle cellule endoteliali fusiformi dalla frammenti di capillare (Figura 3A-C). Al giorno 4-6, pBECs aveva proliferato a una confluenza del 60-95%, in crescita come non sovrapposte, cellule di contatto-inibito, allineate longitudinalmente. Quando le cellule avevano raggiunto la confluenza desiderato, pBECs erano placcato il collagene IV e fibronectina rivestito membrana permeabile inserto filtro membrane (1,12 cm2 superficie, 0,4 µm pori) ad una densità di 1.1 x 105 cellule/insert, alle quali essi normalmente si formano monostrati confluenti dopo 4 giorni (giorno 8-10 post isolamento). Quando co-coltura pBECs, astrociti di ratto o di origine suina sono stati placcati su pozzi di fondo rivestito di poli-L-lisina per un minimo di 2 settimane prima di iniziare il servizio di NCC (Figura 3D). Quando si stabilisce il NCC, l'esperienza ha dimostrato che gli astrociti in coltura per 2-8 settimane forniscono il miglior supporto per promuovere il fenotipo BBB in pBECs; entro questo tempo, gli astrociti formano culture confluenti con cellule disposte in una struttura a nido d'ape-(Figura 3E-F). Il giorno 4 del modello di sistema di inserto membrana permeabile (isolazione post per 8-10 giorni), le cellule sono state stimolate con cAMP, idrocortisone e RO per aumentare la tenuta della barriera e la BBB caratteristico pattern di espressione proteine giunzionali stretti, trasportatori, e ricevitori.

Caratterizzazione del fenotipo pBEC e permeabilità paracellulare

Ispezione visiva delle cellule con misurazioni TEER ordinariamente sono i modi più affidabili per valutare la confluenza e la tenuta dello strato endoteliale delle cellule crescenti sugli inserti membrana permeabile prima di esperimenti. La figura 4 Mostra i risultati di due serie di esperimenti per valutare la permeabilità di droga di piccola molecola attraverso la BBB, i parametri di controllo di TEER (riflettendo permeabilità ionica) combinati con permeabilità apparente21 (Papp, cm s-1) di radiomarcato saccarosio o il giallo di Lucifero tracciante colorante (LY), riflettendo la permeabilità paracellulare di molecole di farmaco piccolo tipico (~ 200-600 Da). Un composto di interesse con un Papp maggiore di Papp di saccarosio o LY (secondo il peso molecolare del farmaco) potrebbe suggerire transcellular permeabilità e/o trasporto attraverso le cellule. Illustrato nella figura 4 che in membrana permeabile inserisce con pBECs coltivate sopra astrocytes del ratto, buone lotti di pBEC (ad es. qui impostare il LY) genererà TEERs in fascia 500-2000 Ω cm2, con qualche maggiore o minore. Alcune partite, soprattutto durante le prime fasi di apprendimento del protocollo, potrebbero essere inferiore TEERs intorno 100-900 Ω cm2 (ad es. qui impostata il saccarosio). Misura TEER consente la selezione dei filtri, ad esempio con avviamento TEER > 500 Ω cm2, e sopra la gamma di TEER mostrato, Papp è relativamente indipendente TEER, indicativo di uno strato di sbarramento sufficientemente stretto per questi esperimenti. Il protocollo per misurare la permeabilità dipende dal tipo di soluto/costrutto. Per una descrizione della procedura per misurare la permeabilità delle piccole molecole in NCC, un protocollo è descritto in Yusof, SR, et. al21. Valutazione dell'espressione delle proteine di giunzione stretta in pBECs in NCC con astrocytes del ratto hanno mostrato la localizzazione di claudin 5, occludin e ZO-1 lungo le giunzioni della cellula-cellula, come mostrato dall'immunofluorescenza (Figura 5A-C). Inoltre, il adherens giunzione proteina p120 catenina ha mostrato ben definita distribuzione lungo le giunzioni della cellula-cellula (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: rappresentazione schematica dei modelli applicati in vitro BBB. Rappresentazione schematica della membrana permeabile inserire modelli di sistema di pBECs di MC (A), MC con ACM (B)e NCC con i astrocytes (C). Il MC, pBEC crescita medio o ACM sono state applicate nei pozzetti fondo, considerando che in NCC, inserti con pBECs sono stati collocati in pozzi con 2-8-week-old astrociti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: diagramma di flusso delle principali operazioni durante la coltivazione di pBEC e la creazione di modelli presentati. Per una panoramica e la timeline per il metodo, questa presentazione schematica riassume i passaggi principali nella procedura coltura di pBECs e creazione di modelli presentati, cioè MC con o senza ACM e NCC con gli astrociti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: corso di tempo rappresentativo delle culture iniziale degli astrociti di ratto e pBECs. Contrasto di fase microscopia immagini delle culture di pBECs (A-C) e astrociti (D-F) visualizzate oltre i 5 giorni. Purificato capillare frammenti il primo giorno della cultura iniziale ha mostrato la presenza di capillari e cellule contaminanti (A, giorno 1), quale cambiamento medio dopo il giorno 2 e un altro giorno di crescita, ha mostrato la selezione per pBECs, a partire di loro crescita dai frammenti capillari (B, giorno 3). Monostrati confluenti di pBECs solitamente sono stati raggiunti il giorno 4-6, momento in cui pBECs ha mostrato la morfologia fusiforme e sono stati stati allineati longitudinalmente (C). Gli astrociti di ratto seminati in fondo pozzi normalmente hanno proliferato a strati confluenti entro 5 giorni (D-F)e sono stati utilizzati per i modelli di NCC dopo 2 settimane di crescita. Barra della scala per tutte le immagini: 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: integrità stretta della giunzione di pBECs. Apparente permeabilità (Papp) di pBECs ai marcatori paracellulare saccarosio (MW 342.5 14C-etichettati, 14,8-25,9 GBq/mmol) e Lucifero giallo (MW 521.57, 10 µ g mL-1), complottarono contro TEER. pBECs sono state coltivate su filtri di 1,12 cm2 membrana permeabile inserto sopra astrocytes del ratto nella base del pozzo e i marcatori aggiunti alla sezione apicale. Dopo 1 ora a 37 & #730; C, aspetto del marcatore nella camera basale era misurato e apicale--basale Papp (x 10-6 cm sec-1) calcolato. TEER è stata misurata > 3h prima Papp, utilizzando elettrodi EVOM STX100C, corretto per l'inserimento del filtro vuoto membrana permeabile con resistenza 150 Ω. TEER medio per il set di dati giallo Lucifero era 1249 ± 80 Ω cm2 (media ± SEM, n = 55). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: caratterizzazione Immunocytochemical di pBECs. Per pBECs coltivate su 1,12 cm2 membrana permeabile inserto filtro inserisce sopra astrocytes del ratto nel pozzo base, analisi di microscopia di immunofluorescenza delle componenti stretta della giunzione (A) Claudin 5 (B) Occludin (C) ZO-1, e dei adherens giunzione proteina (D) p120 catenina ha mostrato ben definita localizzazione alle giunzioni della cellula-cellula e ha rivelato strati delle cellule endoteliali confluenti del cervello con le cellule fusiformi, non sovrapposte. Barra della scala per tutte le immagini: 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Purificazione e la proliferazione di pBEC

Durante la procedura di purificazione, fasi critiche includono la rimozione rapida ed efficace dei meninges e separazione della sostanza bianca e grigia, che è importante per la resa di purificazione e la purezza e per la corretta creazione del modello. Per il presentato in vitro BBB modello utilizzando pBECs, abbiamo migliorato e semplificato di una procedura di purificazione basata su meccanica omogeneizzazione della materia grigia isolato, filtro per l'isolamento dei microvasi, digestione con collagenasi dimensionale selettivo , DNasi e la tripsina, con una cultura iniziale di frammenti del microvessel. In generale, una delle principali sfide durante la purificazione e la coltivazione di cellule primarie è l'eliminazione delle cellule contaminanti. Esperienza con purificazione delle cellule endoteliali cerebrali primari ha indicato che rimozione accurata di meningi e di risultati di materia bianca in migliorato la purezza e la resa dei capillari, nonché aumento della crescita delle cellule endoteliali ed espressione di BBB caratteristiche. Per questo motivo, un'attenta rimozione dei meninges (anche all'interno di sulci) nel protocollo presentato è stato progettato per garantire la rimozione di cellule leptomeningeal (che hanno proprietà di fibroblasto-come), così come delle cellule di muscolo liscio arterioso ed arteriolare, che crescono più rapidamente delle cellule endoteliali in coltura. Allo stesso modo, minimizzazione del materiale della materia bianca ha provocato più puri colture di cellule endoteliali, con meno cellule contaminanti crescente dai frammenti capillari isolati. Tuttavia, questo ha semplificato e rapido metodo applicato per l'isolamento riduce il rendimento dei capillari isolati e ottimizzazione dell'isolamento di materia grigia potrebbe migliorare significativamente la resa di ogni cervello. Un gradiente di densità, che è incluso in un protocollo di purificazione alternativi69, può essere utilizzato per isolare le cellule endoteliali gratis e migliorare la purezza delle cellule endoteliali, ma richiede tempo e può inoltre abbassare il rendimento. Entrambi questi metodi di purificazione sono stati ampiamente utilizzati e caratterizzati e condividere le caratteristiche della generazione di alta TEER pBEC modelli MC sia Astrocita co-coltura (normalmente 500-1500 Ω cm2)7,16, 21,22,49,57,70,71.

Al fine di stabilire gli strati monomolecolari con alta paracellulare restrittività, l'esperienza ha dimostrato che i periciti devono essere eliminati dalla culture endoteliale16. Cervello porcino periciti generalmente crescono sotto gli strati di pBEC e non causano fori negli strati endoteliali, come osservato per le culture di ratto cervello cellule endoteliali72,73. Periciti in pBEC culture fare, tuttavia, tendono a influenzare la morfologia delle cellule endoteliali, che appaiono più ampie e con cellule irregolari pensionanti16. Perché cervello le cellule endoteliali esprimono livelli più elevati di trasportatori di efflusso (ad esempio P-glicoproteina) rispetto ad altri tipi di cella nei microvasi, il numero delle cellule contaminanti può essere ridotto con trattamento con puromicina.74. Inoltre, l'uso dei derivati dal plasma del siero (PDS) piuttosto che vitello fetale o neonatale derivato del siero favorisce la crescita delle cellule endoteliali, come il PDS ha una minore concentrazione di fattori di crescita quali il fattore di crescita derivato dalle piastrine e crescita endoteliale vascolare fattore, che sono indicati per aumentare la permeabilità BBB e stimolano l'angiogenesi14,75,,del7677. Introducendo una cultura iniziale di frammenti isolati capillare e combinando questo con un trattamento con puromicina (4 µ g/mL) e l'uso di PDS, siamo riusciti a ridurre notevolmente il numero di contaminanti cellule residue dopo la purificazione, così che da allora in poi abbiamo potuto stabilire stretto endoteliale monolayers su inserti di membrana permeabile. Al fine di garantire il collegamento migliore delle cellule endoteliali su entrambi i piatti di cultura e superfici inserto membrana permeabile, è stato osservato che una miscela di rivestimento di collagene di tipo IV (da placenta umana) e fibronectina aumenta notevolmente la proliferazione rendimenti e la miscela combinata era pertanto favorito sopra il metodo tradizionale utilizzando solo il collagene di tipo I78.

Differenziazione delle cellule e l'istituzione di un alto TEER In Vitro BBB modello

La pBECs in MC generalmente conservano molte caratteristiche chiave BBB dopo isolamento, in modo che co-coltura con i astrocytes non è essenziale per l'induzione funzionale giunzioni strette ed ottenere alto TEER valori16,57. Gli sforzi per ottimizzare le condizioni per la differenziazione delle cellule endoteliali in fenotipo BBB includono l'uso di siero contenenti supplementato con 8-CPT-cAMP, idrocortisone7 (aumentando il livello cAMP intracellulare13) e RO 20-1724 (mantenendo il livello di cAMP intracellulare), che secondo la precedente Risultati74,79 insieme con successo migliorato la tenuta della barriera e aumentato TEER e può anche aver contribuito a ripristinare un più in vivo come espressione genica profilo80. Tuttavia, l'uso di idrocortisone per il serraggio dello strato endoteliale può modificare la risposta delle cellule endoteliali a determinati stimoli e al fine di utilizzare il modello per indagine responses to chemo - e citochine durante l'infiammazione, il uso di idrocortisone può devono essere evitati.

Da studi comparativi con MC, MC con ACM e astrociti co-culture in entrambi i laboratori partecipanti e altrove, è stato dimostrato che astrocytic contributo è in grado di migliorare la funzionalità endoteliale di BBB e aumentando la tenuta di barriera 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. al fine di raggiungere tale alta espressione del fenotipo BBB in pBECs, abbiamo stabilito un NCC con i astrocytes e trovato che entrambi porcina e astrociti di ratto erano favorevoli, come anche osservato in altri laboratori22. Durante l'istituzione del astrocyte CNC, l'esperienza ha dimostrato che la purezza e l'età delle culture Astrocita influenzare la tenuta di barriera endoteliale risultante, with l'età ottimale dei astrocytes essendo 2-8 settimane, che correla con un cambiamento osservato nella morfologia del astrocyte nel corso del tempo. Il giorno prima di stabilire il NCC, un cambiamento medio per gli astrociti è destinato per rimuovere i metaboliti nocivi e consentire tempo sufficiente per gli astrociti rilasciare la stimolazione e segnalazione fattori che influenzano lo sviluppo della barriera. Quando co-coltura le cellule endoteliali e astrociti del sistema di inserimento membrana permeabile, è importante prestare particolare attenzione alla gestione del modello di barriera. Durante il cambiamento medio, aspirazione e aggiunta del mezzo ed i movimenti degli inserti deve essere fatto con attenzione al fine di minimizzare le interruzioni della barriera endoteliale.

Affidabilità e riproducibilità

È una grande sfida quando si utilizzano celle primarie per la creazione di modelli in vitro per ottenere un'elevata riproducibilità tra culture. Tale normalizzazione può essere soddisfatte dalla scelta di metodo, uso di strumenti di alta qualità e reagenti e l'esperienza in microdissection. L'elevata riproducibilità con basso-lotto variazione per il metodo presentato pertanto è fortemente dipendente dalle rigoroso di procedure descritte.

Per ottenere una buona riproducibilità tra lotti e fiale durante TEER misurazioni, una camera di misura di resistenza del tessuto o voltmetri epiteliali con elettrodi rigidi in miniatura, piuttosto che il bastoncino flessibile elettrodi possono essere utilizzati, riducendo la variabilità dei valori osservati TEER. Oltre a raggiungere alti valori TEER (Figura 4), l'affidabilità del modello presentato è confermato dalla permeabilità soluta piccola bassa corrispondente (Figura 4) e dalla caratterizzazione immunocytochemical di pBECs (Figura 5 ).

Limiti del metodo applicato e modello

L'uso di maiali transgenici e miniatura è aumentato negli ultimi decenni, ma la quantità di dati in vivo è ancora limitata rispetto ai dati disponibili per i modelli del roditore e pertanto può proporre una sfida per confrontare i dati in vitro porcina con risultati in vivo . Tuttavia, come la biologia del maiale riflette maggiormente rispetto a molti animali stabilite dal laboratorio biologia umana, e maiale transgenico modelli per studiare malattie neurologiche come il morbo di Alzheimer sono stati stabiliti84, la disponibilità di dati in vivo sono destinati a diventare meno problematico con il tempo.

Una limitazione degli attuali modelli di sistema di inserimento membrana permeabile della BBB è l'incapacità di imitare il flusso di sangue nei microvessels. In vivo, shear stress ha dimostrato di influire su molti aspetti della fisiologia delle cellule endoteliali come divisione, differenziazione, migrazione e apoptosi85,86e di influenzare come caratteristiche importanti di BBB l'espressione di proteine giunzionali, induzione e polarizzazione di trasportatori61,85,87. Per introdurre tali condizioni, sistemi microfluidici recente sviluppato possono essere considerati88,89,90.

Un metodo utile per correggere l'effetto del livello di acqua unstirred (strato di contorno acquosa) dai dati di permeabilità in vitro consiste nel derivare il predetto 'permeabilità intrinseca' in vivo, utilizzando l' approccio basato su software21. Questo software può essere utilizzato anche per permeabilità dettagliati dati analisi21.

Future applicazioni e indicazioni per il metodo

Come i componenti dell'unità neurovascolare hanno dimostrati di svolgere un ruolo importante nell'induzione e mantenimento delle caratteristiche BBB, e nessun modello corrente in vitro è stato ancora in grado di mimare completamente le condizioni in vivo , costituenti importanti e interazioni possono ancora essere mancante. Attuali sforzi nello sviluppo del modello presentato comprendono la determinazione di modelli triple-cultura con gli astrociti e periciti ed esperimenti combinando cellule di specie diverse. Incorporazione dei pericytes finora ha non è stato osservato per aumentare significativamente i livelli TEER della barriera. Tuttavia, syngeneic modelli suine sono stati osservati per essere paragonabile a tripla culture utilizzando cellule endoteliali porcine cervello, astrocytes del ratto e topo periciti rispetto alla barriera strettezza ed espressione di hallmark proteine caratteristica del cervello endotelio22. Al fine di sviluppare un modello basato su cellule umane, gli sviluppi futuri in vitro di modelli BBB per consegna e scoperta della droga di invocare la derivazione di cellule staminali pluripotenti umane e staminali adulte e/o di cellule progenitrici21.

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Disclosures

Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere, Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen e Niels M. Kristiansen per assistenza tecnica, e la Fondazione di Lundbeck concedere numero R155-2013-14113.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

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