Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

* These authors contributed equally
Genetics
 

Summary

Onlangs ontdekte geoxideerde vormen van 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) kan verschillende DNA wijzigingen met unieke functionele rollen. Hier wordt een semi-kwantitatieve workflow voor visualisatie van oxi-mCs ruimtelijke verdeling, signaal intensiteit profilering en colocalization omschreven.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ramsawhook, A. H., Lewis, L. C., Eleftheriou, M., Abakir, A., Durczak, P., Markus, R., Rajani, S., Hannan, N. R., Coyle, B., Ruzov, A. Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images. J. Vis. Exp. (127), e56318, doi:10.3791/56318 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Voor decennia, is 5-methylcytosine (5mC) als de enige wijziging van het DNA met een functionele betekenis in metazoans gedacht. De ontdekking van enzymatische oxidatie van 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) alsmede opsporing van N6-methyladenine (6mA) in het DNA van meercellige organismen verstrekt extra graden van complexiteit aan de epigenetische onderzoek. Volgens een groeiend lichaam van experimenteel bewijs, kunnen deze nieuwe DNA-wijzigingen specifieke rollen spelen in verschillende cellulaire en ontwikkelingsbiologie processen. Nog belangrijker is, zoals sommige van deze merken (e. g. 5hmC, 5fC en 5caC) tentoonstelling weefsel- en ontwikkelings fase-specifieke voorval in gewervelde dieren, vertegenwoordigt Immunochemie een belangrijk instrument waardoor beoordeling van ruimtelijke verdeling van DNA wijzigingen in verschillende biologische contexten. De methoden voor computationele analyse van DNA wijzigingen gevisualiseerd door immunokleuring gevolgd door confocale microscopie worden hier beschreven. In het bijzonder de generatie van 2,5 dimensie (2.5 D) signaal intensiteit percelen, signaal intensiteit profielen, kwantificering van de kleuring van de intensiteit in meerdere cellen en bepaling van signaal colocalization coëfficiënten worden weergegeven. Deze technieken mogelijk collectief, operationele bij de beoordeling van de niveaus en de lokalisatie van deze DNA-wijzigingen in de kern, die bijdragen tot het ophelderen van hun biologische rol in metazoans.

Introduction

Methylation van DNA, een goed gedocumenteerde mechanisme geassocieerd met een transcriptionele verordening leidt tot wijziging van cytosine residuen in een 5'-cytosine-fosfaat-guanine-3' (CpG) dinucleotide verband via de toevoeging van een methylgroep (-CH3) aan op de 5 - koolstofatoom van de cytosine pyrimidine ring te vormen 5-methylcytosine (5mC)1. Bij zoogdieren, zijn ongeveer 70% van de CpGs die slechts 1% van hun genoom vormt, aangezien zij zijn uitgeput van deze palindromische sequentie als gevolg van 5mC mutagene neiging om spontaan deaminate aan thymine2gemethyleerd. Aanwezigheid van de methylgroepen op gensequenties promotor weergeven sterke correlatie met transcriptionele repressie in gewervelde dieren3,4,5. Toevoeging van deze methylgroepen wordt gekatalyseerd door zeer geconserveerde DNA methyltransferase (DNMT) enzymen DNMT3a 3b en 3 L en DNMT1 die respectievelijk wijzigen van apr cytosines in DOVO en onderhoud methylering contexten6. DNMT3A/B expressie is verhoogd tijdens de ontwikkeling in embryonale stamcellen en epiblast; echter zijn verminderde expressie wordt waargenomen na pluripotente cel lineage inzet voor somatische lot tijdens differentiatie8. Terwijl het delen van functionele redundantie, display DNMT3a en 3b weefsel-specifieke expressiepatronen, met 3a gedetecteerd gelijkmatig in muis embryo's maar 3b voornamelijk gelokaliseerd op neuroectoderm en chorionic ectoderm weefsels8.

Methylation handtekeningen kunnen worden overgenomen tijdens de mitose en meiose10. Methylation van onderhoud omvat DNMT1 vergemakkelijkt wijziging van CpG cytosine residuen bestaande in hemi-gemethyleerd Palindromen op double-stranded DNA11. DNMT1 bindt DNA replicatie vorken11 en bijgevolg genomic methylering piek tijdens de S-fase van de celcyclus12niveaus. DNMT1 methyleert ongewijzigde cytosines daardoor onderscheiden van nieuw gesynthetiseerd DNA-strengen, bevordering van x-chromosoom inactivering en onderhouden van transcriptionele repressie profielen13. Door middel van erkenning van de hemi-gemethyleerd opeenvolgingen van DNA CpG houdt DNMT1 gevestigde patronen van methylering afgebakend door DOVO methylering bv onderdrukking van lange afgewisseld nucleaire Element 1 (lijn1) de initiatiefnemers van het retrotransposon voor de remming van haar potentieel kankerverwekkend propagatie14. Hoewel bezitten hemi-gemethyleerd DNA preferentiële bindende affiniteit, kunt DNMT1 unmethylated CpG eiland (CGI) sequenties in DNMT3a/b - / - mutantcellen, methylate vervullen een noodsituatie DOVO methylering rol15 . Dus als gevolg van de semi-conservatieve aard van DNA replicatie16, kan onderhoud methylering getrouw recapituleren methylering handtekeningen van bovenliggende dochtercel17.

Echter voor gen moet expressie als dynamisch gemoduleerde, repressieve methylering wijziging worden gewist, die kan worden bereikt door passieve en actieve demethylatie mechanismen18. De tien-elf Translocase (TET) eiwitten die behoren tot een geconserveerde familie van dioxygenase eiwitten zijn geschikt voor iteratieve oxidatie van methylgroepen op apr residuen19. Deze Tet eiwitten, homoloog aan J-Base bindende proteïnen (JBP) ontdekt in de bruceii van de trypanosoom, erkennen en binden van gemodificeerd DNA onderstellen van bijvoorbeeld 5mC en deze residuen 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) 5-formylcytosine (5 fC) en 5 - zuurstof carboxylcytosine (5caC)20. Tet eiwitten vergemakkelijkt oxidatie van 5mC leidt tot verandering van de stapsgewijze conformatie van methyl naar hydroxyl-, carbonyl- en carboxylaat-configuraties, maar 5fC en 5caC wijzigingen kunnen gesynthetiseerd worden rechtstreeks vanuit 5mC oxidatie21, 22 , 23 , 24.

Informatieve indicatie van TET eiwitten activiteit inzicht in hun verordening bestudeert de distributie en de overvloed van oxi-methyl-cytosine merken. Belangrijke 5mC aanwezigheid op apr arme initiatiefnemers is aantoonbaar in tegenstelling tot de unmethylated apr rijke regio's, de laatste is kenmerkend voor apr25eilanden. Over weefsels, hoogste weefsel specifieke methylering wordt waargenomen in de hersenen, testis en bloed terwijl mondelinge mucosa vertonen grootste hypomethylation, geeft een patroon van de differentiële methylering plaatsvinden op weefsel specifieke initiatiefnemers26.

Door gebruik te maken van gevoelige anti-5mC en anti-5hmC antilichamen in selectieve methyl/hydroxymethyl DNA immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP), en de daaropvolgende hoge doorvoer sequencing, Ficz et al. aangetoond hoog 5hmC bezetting op initiatiefnemers, exons en lijn-1 retrotransposon sequenties die gecorreleerd met verminderde 5mC niveaus op deze locaties in muis embryonale stengelgroenten cellen27. Omgekeerd, werd grootste 5mC verrijking waargenomen op repetitieve satelliet sequenties waar 5hmC aanwezigheid was beperkt28. Studies uitgevoerd op menselijke frontale kwab hersenweefsel onthullen veelbetekenend 5hmC verrijking, vier keer hoger dan in muis embryonale stamcellen28. In overeenstemming met eerdere opmerkingen, hoge doorvoer sequentiebepaling van frontale kwab weefsel geïllustreerd meerderheid 55-59% van 5hmC signaal gelokaliseerd op lage dichtheid CpG promotor regio's, 35-38% binnen gene organen en ongeveer 6% bezetting op intergenic regio's. Daarentegen 5mC werd verrijkt bij intergenic regio's (25-26%) en hoger in gen organen (52-55%) maar minder (22-24%) bij promotor29sequenties. Deze studies tonen aan dat overvloed van 5hmC in embryonale stamcellen en somatische weefsel, vooral de hersenen, maar onderzoeken op 5fC en 5caC distributies beperkt zijn.

Interessant is dat onlangs ontdekt in eukaryoten, methylering van adenine residuen op de positie 6 stikstof (N-6) (6mA) display een genomic overvloed profile inverse aan die van 5mC30. Observaties van de Spectrometrie van de massa van de tandem vloeistofchromatografie gekoppeld onthullen 6mA absolute niveaus bestaan in overmaat in zebravis en varkens vroege embryo's in vergelijking met sperma met haar niveaus (0.003% van genomische adenines) gestaag op bevruchting, piek stadium de morula ontwikkelingsstoornissen (33 vouw hoger dan sperma) en het bereiken van de somatische niveaus steady-state 0.004% van genomische adenines31. Immunoprecipitation van DNA-sequenties 6mA verrijkt heeft aangetoond overheersende bezetting (ongeveer 80% verrijking) van dit merk op repetitieve element Regio'sen transcriptionele start sites32. Deze observaties contextualiseren en valideren van de ontdekking van 6mA demethylase-null ede cellen van de stam mbryonic exposeren geaccumuleerde 6mA gemedieerde lijn-1 retrotransposon tot zwijgen brengen t.o.v. transcriptionally actieve elementen in wildtype cellen. Deze gegevens stellen voor een transcriptionele regelgevingstaak voor 6mA33.

Terwijl geconjugeerd biochemische labels gekoppeld aan latere DIP testen geven aan- of afwezigheid van geoxideerde methylcytosine derivaten (oxi-mCs), kunnen niet zij geven ruimtelijke verdeling of kwantificeerbare informatie van deze merken34, 35. een protocol voor gevoelige immunochemical detectie van 5hmC en 5caC was onlangs ontwikkelde36. Deze methode van geconjugeerd fluorophore secundair antilichaam gebaseerde immunokleuring gekoppeld met behulp van scanning laser confocal microscopie bezit het unieke voordeel dat visuele lokalisatie van deze DNA-wijzigingen binnen de cellen, dus nadruk op individuele positief dan wel negatief gekleurd cellen die overeenkomt met de heterogene aanwezigheid van deze merken. De 5hmC en 5caC absolute signaal intensiteit zoals versterkt door de geconjugeerde antilichamen in staat stellen semi-kwantitatieve interpretaties worden voorgesteld over de omvang en de standpunten van deze merken binnen de kern bijvoorbeeld hétérochromatique en euchromatique regio 's 37 , 38. hier een techniek voor de computationele analyse van beelden van de confocal microscopie wordt beschreven. De generatie van 2.5D ruimtelijke verdeling percelen voor het weergeven van verschillende 5hmC en 5caC signaal pieken per pixel en hun locaties binnen kernen wordt gedemonstreerd. Histogram percelen van 5hmC en 5caC signaal intensiteit profielen kunnen illustreren trends in overvloed van deze merken als de toppen en troggen zijn uitgezet als afzonderlijke niet-overlappende kanalen. Tot slot, door de uitvoering van de colocalization-functie, de mate van de nabijheid van een signaal naar de andere kan worden bepaald en als gevolg hiervan, hun respectieve genomic coördinaten kunnen worden geïdentificeerd.

Protocol

1. generatie van Confocal beelden

  1. In de voorbereiding voor de analyse van gemodificeerde vorm van cytosine, uitgevoerd door immunohistochemische kleuring zoals beschreven door Abakir et al. 34.
  2. uit beeldvorming van dia's uit te voeren met behulp van een microscoop en bestanden opslaan in een indeling van LSM.
    Opmerking: Wanneer het vergelijken van intensiteit profielen tussen monsters de waarden gebruikt voor laser macht en gewin voor elk kanaal moet worden gehouden over de hele afbeelding procedure te voorzien in rechtstreekse vergelijking in het stadium van de analyse beeld nemen.

2. Generatie 2.5D intensiteit percelen

  1. de software (zoals Zen zwart) Open en selecteer ' Image Processing '.
  2. Ga naar het menu bestand en selecteer openen. Selecteer de afbeelding die verwerking vereist.
  3. Klik op ' Toon alle ' onder de afbeelding alle grafische besturingselementen om zichtbaar te maken. In de onderste helft van het scherm zijn er drie tabbladen; ' Afmetingen ', ' Display ' en ' Graphics ', selecteert u de ' Graphics ' tab.
    1. Kies de ' rechthoek ' hulpmiddel om te Selecteer kernen/interessegebied.
    2. Selecteer ' gesneden regio ' bijsnijden van de afbeelding. Hierdoor genereert u een nieuwe afbeelding voor de bijgesneden regio in een afzonderlijke tab.
    3. Ga naar het menu bestand en selecteer Save As. Geef het bestand een naam en sla het op als een bestand LSM of CZI.
  4. Open software (bijvoorbeeld blauwe Zen) en selecteer de ' Zen Desk '.
  5. Verzenden de bijgesneden afbeelding van Zen zwart blauwe Zen door het bestand te selecteren en te klikken op het menu bestand en selecteer Verzend naar Zen 2012-blauw editie. De bijgesneden afbeelding wordt geopend in het desbetreffende programma.
    Opmerking: Het afbeeldingsbestand wordt overgebracht omdat de 2.5D intensiteit perceel functie in Zen zwart 2012 meerdere afbeeldingen van het kanaal niet gelijktijdig toont.
  6. Aan de linker kant van de afbeelding Kies het tabblad geëtiketteerd ' 2.5D ', hierdoor visualisatie van de afbeelding in 2.5 D. Klik op ' alles weergeven ' zichtbaar te maken alle grafische besturingselementen.
  7. Alter visualisatie instellingen met behulp van vier grijze bars gelegen links en onder de afbeelding
  8. .
    Opmerking: linkerhand bar, de top van het scherm = zoom. Linkerhand bar, onderin het scherm = beurt afbeelding op as. Onderkant van scherm, linkerhand bar = rotatie van beeld. Onderkant van scherm, goede hand bar = uitbreiden en contract schaal bars.
  9. Zorgen dat rendermodus geselecteerd is oppervlak als dit de beste visualisatie van de individuele pieken geeft.
  10. Raster afstand veranderen door het veranderen van het percentage, hoe lager het percentage gedefinieerd hoe meer elke individuele piek.
  11. Om op te slaan van het 2.5D beeld, eerst de bestandenlijst op de rechterkant en de grafische hulpmiddelen onder de afbeelding verbergen door te klikken op de grijze pijl onder het perceel 2.5D (naast ' Toon alle '), dit zal het verbergen van de grafische tabbladen, waardoor het beeld uit te breiden om te vullen de scree n. om op te slaan de 2.5D plot, druk op de ' PrtSc ' toets op het toetsenbord. Dit zal een schermafbeelding van het scherm. Plak de afbeelding in Microsoft Paint en bijsnijden van de afbeelding voordat u opslaat.

3. Intensiteit Profiling

  1. Open van de software (zoals Zen zwart) en selecteer Image Processing.
  2. Ga naar het menu bestand en selecteer openen. Selecteer de afbeelding die verwerking vereist.
  3. Zoals de afbeelding wordt weergegeven op het scherm, aan de linker kant van de afbeelding selecteert u het tabblad geëtiketteerd ' profiel '.
  4. In de onderste helft van het scherm Selecteer (tik) de ' alles weergeven ' tabblad. Hierdoor kan de toegang tot alle opmaakopties.
  5. In de onderste helft van het scherm zijn er drie tabbladen; ' afmetingen ', ' Display ' en ' ProfileƆ Selecteer ' profiel ' en selecteer (tik) de ' tabel ' vak. Selecteer de ' pijl ' knop.
  6. Op de afbeelding met de muis te selecteren een beginpunt en sleep de muis over een continu aantal cellen. Laat de muisknop los om het produceren van een complot van de intensiteit van de cellen langs de lijn; Bovendien zal de tabel worden bevolkt door intensiteit meetgegevens voor de pixels langs de lijn voor elke golflengte.
    Opmerking: De tabel geeft de afstand (µm) op welke pixel intensiteit wordt gelezen voor de rode, groene en blauwe fluorescentie.
  7. Dit om gegevens te exporteren, klik met de rechtermuisknop op de tabel, selecteer ' opslaan tabel … ' en opslaan naar een juiste locatie als een txt-bestand.
  8. Om op te slaan van de geselecteerde intensiteit profielafbeelding selecteert u het menu bestand en selecteer ' exporteren … '. Kies in het pop-upvenster ' Tagged Image File (formaat) ' en ' inhoud van afbeeldingsvenster - één venster (Data) ' gevolgd door te klikken op ' Selecteer de bestandsnaam van het en sla … ' Kies een geschikte locatie en klik op ' opslaan '.
  9. Het proces herhalen voor elke individuele intensiteit profiel afhankelijk van het aantal profielen te analyseren en gezichtsvelden.
  10. Import intensiteit gegevens opgeslagen (zie 3.7) profielen en analyseren in een werkblad gevolgd door statistische analyse.

4. Co lokalisatie analyse

  1. Open de software en selecteer ' beeldverwerking '.
  2. Ga naar het menu bestand en selecteer openen. Selecteer de afbeelding die verwerking vereist.
  3. Zoals de afbeelding wordt weergegeven op het scherm, aan de linker kant van de afbeelding selecteert u het tabblad geëtiketteerd ' Coloc '.
  4. In de onderste helft van het scherm Selecteer (tik) de ' alles weergeven ' tabblad. Hierdoor kan de toegang tot alle opmaakopties.
  5. In de onderste helft van het scherm er zijn vier tabbladen; ' afmetingen ', ' Display ', ' grafische ' en ' ColocalizationƆ Selecteer ' Colocalization ' en vink het vakje voor ' tabel ' en ' Image '.
  6. Selecteer het derde pictogram langs aan de bovenkant van deze tab (nauwe Bezier tekst wordt weergegeven wanneer de muis zich boven het hulpmiddel) gebruik dan dit hulpmiddel te omsingelen van een enkele kernen, waarden voor deze kernen zal dan verschijnen in de tabel
      .
      Opmerking: Voor elke omringde kernen een scatterplot wordt geproduceerd voor rood versus groene fluorescentie die wordt weergegeven in het deelvenster van de linkerhand op het scherm. De as wordt vervolgens verplaatst om de poort uit cellen afhankelijk van de drempel. Zoals de kernen van belang zijn handmatig geselecteerd in de beelden, is de gating drempels boven het nulpunt aanpassen niet vereist. Alle pixelwaarden intensiteit waargenomen binnen de nucleaire grenzen worden beschouwd als positief signaal.
  7. Herhaal dit proces door het derde pictogram te selecteren in het tabblad en latere kernen rondom totdat de dataset is voltooid.
  8. Dit om gegevens te exporteren, klik met de rechtermuisknop op de tabel, selecteer Opslaan tabel en sla op een passende locatie.
  9. Om op te slaan van het colocalization beeld, selecteer het menu bestand en selecteer ' exporteren … ' Kies vervolgens; Tagged Image File (Format) en ' inhoud van het venster van de afbeelding – enkel vliegtuig (Data) ' gevolgd door te klikken op ' Selecteer de bestandsnaam van het en sla … ', kies een geschikte locatie en klik op ' opslaan '.
  10. Colocalization gegevens in een werkblad gevolgd door statistische analyse uitzetten.

Representative Results

Om te bepalen van de ruimtelijke verdeling van 5hmC en 5caC in het onderscheiden van hepatische progenitoren immunostained dia's voor deze DNA-wijzigingen werden beeld met behulp van een microscoop.

Eerste analyse van de ruimtelijke spreiding van deze oxi-mCs werd uitgevoerd door middel van de generatie van 2.5D intensiteit percelen (figuur 1A, 1B). De rode en groene pieken bleek goed gedefinieerd met de beperkte aanwezigheid van Oranje pieken die slechts een kleine overlapping van de signalen van de 5caC en de 5hmC aangeeft. In overleg met deze resultaten samenvallen de profielen voor 5hmC en 5caC intensiteiten in de corresponderende cel niet sterk met elkaar (Figuur 1 c). Dit illustreert dat 5caC en 5hmC verschillende patronen van nucleaire distributie in hepatische progenitoren suggereren dat Tet-afhankelijke oxidatie van 5mC leidt tot generatie van verschillende geoxideerd derivaten van deze DNA-wijziging in specifieke chromatine vertonen regio's.

Om te vergelijken de niveaus van 5caC en 5hmC in Daoy medulloblastoom en BXD-1425EPN Ependymoom cellen, werd immunokleuring voor deze oxi-mCs uitgevoerd op beide monsters onder dezelfde proefomstandigheden. Intensiteiten van 5caC en 5hmC signalen werden vervolgens vergeleken in 20 profielen gegenereerd over 3-5 cellen opgenomen voor elke regel van de cel (figuur 2A-2D). De kwantificering van de resultaten bleek dat BXD-1425EPN cellen aanzienlijk lagere niveaus van zowel 5hmC als 5caC immunokleuring ten opzichte van Daoy cellen (figuur 2D vertonen).

Gezien de twee kanalen rood (5hmC) en groen (5caC) die kan worden aangeduid als de R- en G respectievelijk van de Pearson correlatiecoëfficiënt (PCC) beschrijft de mate van overlapping van de ruimtelijke en co segregatie van R & G uitgaande van beide merken bestaan in een lineaire relatie met elkaar, aangeduid door R statistiek34. Kwadratuur van de PCC-waarde, aangeduid door R2 maakt het meten van groene signaal intensiteit variatie die wordt beïnvloed door rood signaal intensiteit34. Dit is overbodig voor onze 5caC vs 5hmC co lokalisatie analyse.

Om te onderzoeken de ruimtelijke verdeling van 5caC en 5hmC in ongedifferentieerde (Undiff) hiPSCs en hepatische endoderm 24 uur (HE24) na inductie, werd colocalization analyse van deze DNA-wijzigingen uitgevoerd op dezelfde confocal afbeeldingen, met R-waarden voor 20 kernen geanalyseerd voor elke regel van de cel (figuur 3A-3 C).

De kwantificering van deze resultaten aangetoond dat de mate van colocalization beduidend hoger is (P < 0.05) in HE24 in vergelijking met Undiff (Figuur 3 c). Dit is te wijten aan de beperkte omvang van 5caC aanwezigheid en dus zijn beperkte signaalsterkte in Undiff cellen.

Figure 1
Figuur 1: immunohistochemische kleuring van hepatische endoderm voorlopercellen tijdens 72 uur post inductie van differentiatie. (A) is mede van kleuring van 5hmC (rood), 5caC (groen) en DAPI nucleaire teller vlek (blauw). De witte onderbroken pijl 'B' duidt de richting van de profilering bemonsterd door de kern, geïllustreerd in 1 C. Schaal staaf vertegenwoordigt 5 µm. rode kanaal: 800 krijgen, laser van 1%. Groene kanaal: 750 krijgen, laser 2,4%. DAPI kanaal: 750 krijgen, laser van 2,6%. (B) 2.5 D intensiteit plot van 5hmC, 5caC en DAPI signalen. Individuele pieken vertegenwoordigen absolute signaal intensiteiten voor elke pixel. Samengevoegde weergaven en afzonderlijke kanalen worden weergegeven. (C) de profielen van de intensiteit van de 5hmC, de 5caC en de DAPI signalen in hepatische progenitoren tijdens 72 uur post inductie van differentiatie. Piek intensiteit werden geregistreerd langs de afmetingen van de witte onderbroken pijl 'B' en langs de x-as van intensiteit profiel worden aangeduid met een zwarte onderbroken pijl. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: analyse van 5hmC en 5caC signaal intensiteit in Daoy medulloblastoom en BXD-1425EPN Ependymoom cellijnen. (A) immunefluorescentie kleuring van 5hmC (rood) en 5caC (groen) in Daoy en BXD-1425EPN cellen. Beelden werden gemaakt met 63 x olie-immersie objectief, zowel op dezelfde instellingen. Samengevoegde weergaven en afzonderlijke kanalen worden weergegeven. Schaal staven 10 µm. rode kanaal: 746 krijgen, laser van 1%. Groene kanaal: 750 krijgen, laser 2,4%. Individuele Daoy (B) en (C) BXD-1425EPN cellen zijn in aangrenzende cijfers uitgebreid. Schaal bars voor (B) en (C) vertegenwoordigen 5 µm. (D) gemiddelde fluorescentie intensiteit van 5hmC vs 5caC signalen in Daoy en BXD-1425EPN cellen (n = 20, SD). Betekenis werd beoordeeld met behulp van een F-toets en Two-sample t-test sterretjes duiden statistisch significant p-waarden van ** als p < 0.01 en *** als p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: analyse van de Colocalization van 5hmC en 5caC absolute signalen in ongedifferentieerde hiPSCs (Undiff) ten opzichte van hepatische endoderm 24 uur na gedifferentieerde voorlopercellen (HE24). Confocale microscopie beelden van (A) gedifferentieerdeproductie hiPSCs en (B) HE24 cellen gekleurd voor 5hmC (rood), 5caC (groen) en DAPI (blauw). Cellen werden beeld met 63 X olie onderdompeling lens op identieke instellingen. 20 omringde kernen illustreren de cellen bemonsterd voor analyse van de colocalization. Schaal staven 20 µm. rode kanaal: 800 krijgen, laser van 1%. Groene kanaal: 750 krijgen, laser 2,4%. DAPI kanaal: 750 krijgen, laser van 2,6%. (C) Colocalization analyse van de aanwezigheid van 5caC signaal binnen het bereik van de nabijheid van de 5hmC in undiff en HE24 (n = 20, SD). Betekenis werd beoordeeld met behulp van een F-toets en Two-sample t-test sterretjes duiden statistisch significant p-waarden van * p < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Dit protocol beschrijft de stapsgewijze proces van het genereren van visuele representaties van DNA wijzigingen binnen kernen. Hoewel gevoelige en impactful, beschikken deze technieken een aantal beperkingen.

Het is noodzakelijk om te benadrukken dat de gegevens die zijn gegenereerd op basis van 2.5D percelen, signaal intensiteit profielen en colocalization analyse zijn semi-kwantitatieve in de natuur. Als gevolg van de punt voor punt verlichting van het monster tijdens Beeldacquisitie op de laser confocal microscoop scannen, worden absolute signaal intensiteit van elk kanaal geregistreerd. Echter, dit zijn geen absolute grootheden van 5hmC en 5caC wordt gedetecteerd en enige vertegenwoordigen aanwijzingen voor de aanwezigheid, afwezigheid of de omvang van deze epigenetische merken.

Het repetitieve karakter van signaal amplifications verwarren beperkingen consistent met de omvang van machines toegepast ter verbetering van het signaal onvermijdelijk benaderingen waar fysieke genomic exploitatievorm van deze merken34. De ware genomic lokalisatie van deze merken kan worden verborgen door deze omvangrijke eiwitten, die fysiek gebieden unresolvable zelfs bij optimale resolutie van de confocal grenzen van 200-300 nm34 bezetten. Bovendien, de intensiteit van het signaal van de afzonderlijke kanalen voor elk merk niet te vergelijken met elkaar als gevolg van verschillen in de gevoeligheid van het antilichaam en fluorophore vervoeging34. Echter werpt de informatie verkregen met beeldvorming licht op de organisatie van de ruimtelijke en temporele van de genomic merken.

Voor nauwkeurige kwantificatie van 5hmC en 5caC signalen, zijn kernen gemarkeerd en omringd tegen de DAPI counterstain, duidelijk afbakening van de regio te worden geanalyseerd. Deze procedure opleidingscyclus met de eis voor het kalibreren van gating drempels zoals achtergrondgeluiden wordt genegeerd door het handmatige proces van het selecteren van de kernen1. Een automatisering van dit proces kan worden bereikt in de meest recente software die het mogelijk voor nucleaire segmentatie maakt moet worden uitgevoerd. Terwijl gratis alternatieve softwarepakketten zoals FIJI zijn beschikbaar voor de analyse van de colocalization, nadelen zoals de eis om afbeeldingen te converteren naar binaire 8 bit formaten, afbeeldingen maskeren en invoeren van uitsluiting groottegegevens Schakel regio's van belang limiet de gebruiker-toegankelijkheid van dit programma. Bovendien, introduceert gezien dat de algemene niveaus van 5hmC en 5caC in het genoom in combinatie met hun overheersende locatie op euchromatique gebieden en uitputting van genomic CpG sequenties in het algemeen beperkt, handmatige rondom van kernen gebruiker-bias. Daarom de markering van de kernen automatisch wordt ervan uitgegaan dat alle gebeurtenissen binnen het afgebakende gebied als positief en negeert elke achtergrondpixels die aanwezig kunnen zijn. Dus, analyseren van afbeeldingen op basis van de pixel intensiteit mogelijk meer betekenis. Deze factoren zijn belangrijk bij het overwegen van het gebruik van Mander van colocalization coëfficiënt te analyseren van de mate van ruimtelijke overlapping tussen twee signalen, ongeacht hun signaal intensiteit als zich te verzetten tegen de Pearson-correlatiecoëfficiënt die wordt verondersteld een lineaire relatie tussen signalen.

Over het geheel genomen dragen de hier beschreven technieken het thema van de visuele representatie van biologische gegevens in een intuïtieve indeling. Terwijl de semi-kwantitatieve beeldanalyse krachtige technieken zoals Spectrometrie van de massa in termen van gevoeligheid of enkele basis resolutie genoom kan niet vervangen breed sequencing, biedt aanvullende gegevens waardoor gevolgtrekkingen en hypothesen te zijn uit analyse van beelden met precisie bedacht.

Disclosures

Geen potentiële belangenconflicten werden bekendgemaakt.

Acknowledgments

Het werk werd gesteund door de biotechnologie en biologische Sciences Research Council [BB/N005759/1 tot en met A.R.]. NRFH werd gefinancierd door The Rosetrees Trust en The Stoneygate Trust [A1130 / M546]. De Zeiss Elyra PS.1-Microscoop, de verwerking computers en software werden gefinancierd door BB/L013827/1 van de BBSRC (multidisciplinair Super resolutie microscopie Facility op de Universiteit van Nottingham subsidie)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head Zeiss NA
Zeiss Zen Black 2012 Zeiss NA
Zen Blue 2012 Zeiss NA
Microsoft Excel Microsoft NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern. J Mol Biol. 118, (1), 49-60 (1978).
  2. Youssoufian, H., et al. Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature. 324, (6095), 380-382 (1985).
  3. Holliday, R., Pugh, J. E. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).
  4. Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells. European J Biochem. 81, (1), 53-61 (1977).
  5. Bird, A. P., Southern, E. M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol. 118, (1), 27-47 (1978).
  6. Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBO J. 21, (15), 4183-4195 (2002).
  7. Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. Dissecting de novo methylation. Nature genetics. 23, (4), 380-382 (1999).
  8. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99, (3), 247-257 (1999).
  9. Eckhardt, F., et al. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet. 38, (12), 1378-1385 (2006).
  10. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321, (1), 238-250 (2008).
  11. Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 71, (5), 865-873 (1992).
  12. Jones, P. A., Taylor, S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell. 20, (1), 85-93 (1980).
  13. DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. Jähner, D., Jaenisch, R. Springer. 189-219 (1984).
  14. Chalitchagorn, K., et al. Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis. Oncogene. 23, (54), 8841-8846 (2004).
  15. Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur J Biochem. 269, (20), 4981-4984 (2002).
  16. Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase. Nature. 295, (5850), 620-622 (1982).
  17. Dean, W., Santos, F., Reik, W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer. Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14, (1), 93-100 (2003).
  18. Wu, S. C., Zhang, Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (9), 607-620 (2010).
  19. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, (6047), 1300-1303 (2011).
  20. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, (5929), 930-935 (2009).
  21. Bachman, M., et al. 5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals. Nat Chem Biol. 11, (8), 555-557 (2015).
  22. Bachman, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification. Nat Chem. 6, (12), 1049-1055 (2014).
  23. Lurlaro, M., et al. In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine. Genome Biol. 17, (1), 141 (2016).
  24. Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. J Am Chem Soc. 138, (30), 9345-9348 (2016).
  25. He, Y. -F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, (6047), 1303-1307 (2011).
  26. Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci. 93, (18), 9821-9826 (1996).
  27. Nagae, G., et al. Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation. Hum Mol Genet. 20, (14), 2710-2721 (2011).
  28. Ficz, G., et al. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature. 473, (7347), 398-402 (2011).
  29. Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain. Nucleic Acids Res. 39, (12), 5015-5024 (2011).
  30. Liu, J., et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig. Nat Commun. 7, (2016).
  31. Wu, T. P., et al. DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells. Nature. 532, (7599), 329-333 (2016).
  32. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, (5929), 929-930 (2009).
  33. Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 5, (12), e15367 (2010).
  34. Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. Springer. 125-137 (2016).
  35. Alioui, A., et al. 5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary. Nucleus. 3, (6), 565-569 (2012).
  36. Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. Diversity of two forms of DNA methylation in the brain. Front Genet. 5, 46 (2014).
  37. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  38. Lachmanovich, E., et al. Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies. J Microsc. 212, (Pt 2), 122-131 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics