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로컬 컨트롤 표면 점착을 고르지 Nanopatterns Dendrimer 기반: Chondrogenic 차별화 하는 방법

Bioengineering

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Summary

받는 dendrimer 기반 고르지 nanopatterns 로컬 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD) 표면 밀도의 나노 제어를 허용 하는 방법은 설명 하 고 세포 접착 및 chondrogenic 분화의 연구에 대 한 적용.

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Casanellas, I., Lagunas, A., Tsintzou, I., Vida, Y., Collado, D., Pérez-Inestrosa, E., Rodríguez-Pereira, C., Magalhaes, J., Gorostiza, P., Andrades, J. A., Becerra, J., Samitier, J. Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation. J. Vis. Exp. (131), e56347, doi:10.3791/56347 (2018).

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Abstract

세포 접착 및 차별화는 주요 효과가 지역 농도와 세포 외 기질 (ECM) 성분의 나노 처리에 의해 조절 된다. 여기에 우리가 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD)의 대규모 고르지 nanopatterns를 얻을 하는 방법을 제시-기능성된 dendrimers 로컬 RGD의 나노 제어를 허용 하는 표면 밀도. Nanopatterns dendrimers 다른 초기 농도에 솔루션에서의 표면 흡착에 의해 형성 된다 물 접촉 각 (CA), 엑스레이 광전자 분광학 (XPS), 특징 및 현미경 기법 같은 프로브 검색 주사 터널링 현미경 (STM)와 원자 힘 현미경 (AFM). 최소 interparticle 거리의 확률 컨투어 지도 의하여 AFM 이미지를 사용 하 고 세포 접착 반응 및 차별화와 그 때 상관 RGD의 로컬 표면 밀도 측정 됩니다. 여기에 제시 된 nanopatterning 메서드는 큰 표면 영역을 간단한 방식으로 확장 될 수 있는 간단한 절차입니다. 따라서 세포 배양 프로토콜을 완벽 하 게 호환 이며 셀에 농도 의존 효과 발휘 하는 다른 ligands에 적용할 수 있습니다.

Introduction

여기 우리는 간단 하 고 다재 다능 한 dendrimer 기반 nanopatterning 프로시저는 nanoscale에 로컬 점착의 제어를 허용 하는 세포 문화 서피스를 설명 합니다. ECM의 나노 세부 보도 되 고,1,2,3 , nanopatterning의 세포 접착 표면 접착4에 관련 된 세포 요구 사항에 대 한 깊은 통찰력을 제공 하고있다 5. 실험 micellar 리소 그래피 기반 nanopatterns를 사용 하 여 약 70의 임계값 공개 RGD 펩타이드 nanospacing, 세포 접착이 값6,,78 위에 상당히 지연 되 고에 대 한 nm 9. 이 연구는 또한 세포 접착9,,1011에 글로벌 ligand 밀도 보다 로컬의 큰 영향을 강조 했다.

Morphogenesis, 동안 주변 환경과 상호 작용 세포 최종 복잡 한 조직 구조를 형성 될 때까지 계속 첫 번째 차별화 이벤트를 트리거합니다. 이 프레임 워크 내에서 nanopatterned 표면 morphogenesis에 초기 세포 표면 상호 작용의 영향을 해결 하기 위해 사용 되었습니다. 68의 측면 간격으로 RGD nanopatterns 리소 그래피 기반에서 β 형 Ti-40Nb nm 합금 95 및 150 nm 사이 RGD nanospacings의 차별화를 강화 하는 동안 저지른 비 줄기 세포12, 미 분화 형을 유지 하는 데 도움이 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) adipogenic/osteogenic13,,1415 와 chondrogenic 운명을16쪽으로. 또한, 신호 구성 요소를 사용 하 여 수정 자가 조립 고분자 나노 신호 신호17의 건축 규제를 제공 하 여 세포 접착 및 차별화를 직접 표시 되었습니다. 이와 관련, 그들의 외부 구체18,,1920 표면에 세포 상호 작용 moieties와 dendrimers의 증 착 세포 접착21,22, 공부 하는 데 사용 되었습니다. 형태학23,24, 그리고 마이그레이션 이벤트25,26. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 연구에서 표면 특성의 부족 어렵게 dendrimer 표면 구성 및 세포 반응 사이 어떤 상관 관계를 설정 합니다.

액체와 같은 순서 및 정의 된 간격 Dendrimer nanopatterns dendrimers 낮은 이온 힘을 가진 솔루션에서 낮은 충전 표면에 흡착 될 때 얻어질 수 있다. 27 이 속성을 기준으로 하 여 여기 선물이 메서드를 로컬 RGD 표면 밀도의 나노 제어를 허용 하는 낮은 충전 표면에 RGD 기능성된 dendrimers의 대규모 고르지 nanopatterns. 물 접촉 각 (CA), 엑스레이 광전자 분광학 (XPS) 및 스캐닝 조사 현미경 검사 법 기술 (STM 및 AFM nanopatterns) 표시 로컬 ligand 밀도 수정 솔루션에서 초기 dendrimer 농도 조정 될 수 있다. 로컬 RGD 표면 밀도 최소 interparticle 거리의 확률 컨투어 지도 의해 AFM 이미지에서 계량 하 고 세포 실험과 상관. 다른 nanopatterning 기법4와 비교 하면, dendrimer 기반 nanopatterning은 간단 하 고 따라서 셀 문화 응용 프로그램에 완벽 하 게 호환 되 고 큰 표면 영역을 쉽게 확장 될 수 있습니다. Nanopatterns는 생리 기판으로 성인 인간의 MSCs29의 chondrogenic 유도 및 세포 접착28 에 로컬 RGD 표면 밀도의 효과 평가 하는 데 사용 됩니다. 우리의 결과 보여준다 RGD dendrimer 기반 nanopatterns 세포의 성장을 유지 하 고 세포 접착은 높은 로컬 RGD 표면 밀도 의해 강화 된다. 차별화 실험에는 기판에 세포의 중간 접착 력 MSC 결로 및 초기 chondrogenic 차별화를 선호. 쉽게는 dendrimer 주변 그룹 수정할 수 있습니다 인해 여기 설명 하는 방법은 더 셀에 농도 의존 효과 발휘 하는 다른 ECM ligands를 확장할 수 있습니다.

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Protocol

1. 기판 준비

  1. 1.4 x 1.1 cm Au(111) 운 모 기판에 단련
    1. Au(111) 기판 유리-세라믹 호 브에 배치 하 고 아르곤 분위기 아래 시원한 기판 3 분 허용에 대 한 부탄 불꽃 anneal. 각 Au(111) 기판에 대해이 단계를 반복 합니다.
      참고: Au(111) 기판 열 처리 후 즉시 사용 해야 합니다.
  2. 폴 리 (L 젖 산)의 준비 (PLLA)-유리 기판 코팅.
    1. 절단 하 고 유리 슬라이드를 씻어.
      1. 1.25 cm x 1.25 cm 다이아몬드 팁 커터의 18 슬라이드를 현미경 슬라이드를 잘라. 상하 면 나중에 구별 될 수 있다 그래야 각 슬라이드의 하단 측면에 작은 들여쓰기를 확인 합니다.
      2. 96% 에탄올 뒤 이온된 수와 슬라이드를 철저히 씻으십시오. 그들이 건조 수 있습니다.
    2. 2 %PLLA 솔루션을 준비 합니다.
      1. 200mg PLLA의 압력 튜브에 1, 4-dioxane의 10 mL를 추가 합니다. 저 막대를 추가 하 고 튜브를 단단히 닫습니다.
      2. 24 h에 대 한 부드러운 교에서 60 ° C에서 뜨거운 접시에 글 리세 린 목욕으로 압력 튜브를 놓고 솔루션 15 mL 유리 유리병에 전송 합니다.
    3. PLLA 솔루션 유리 슬라이드 코팅.
      1. 유리 슬라이드와 PLLA 솔루션 유리병 60 ° c.에 깨끗 한 뜨거운 접시에 배치 위 슬라이드를 확인 하 고 필요한 온도 도달 하려면 적어도 10 분 동안 남아 있을 수 있도록.
      2. Spin coater를 준비 하 고 표 1에 지정 된 프로그램을 설정 합니다.
      3. 장소 슬라이드 얼굴 중 하나를 진공 시스템을 사용 하 여 spin coater에서. 파스퇴르 피 펫으로 0.25 mL PLLA 솔루션의 전체 표면 커버 확인 하 고 슬라이드에 적용 됩니다. 코팅 프로그램을 실행 합니다. 각 슬라이드에 대해이 단계를 반복 합니다.

2. Dendrimer Nanopatterning

  1. RGD 기능성된 Dendrimer (RGD Cys D1) 28 솔루션의 준비.
    1. 5 mg 이온된 수의 6.494 ml에서 dendrimer의 분해. 이것은 솔루션 1입니다.
      참고: dendrimer 재고 솔루션을 사용 하 여 준비의 6 개월 이내.
    2. 10 분에 대 한 솔루션을 sonicate 고 B 및 C는 표 2에 따라 솔루션을 준비 합니다.
    3. C 10 분에 대 한 솔루션을 sonicate 고 D, E 및 F 표 2다음 솔루션을 준비 합니다.
    4. 사용 될 때까지 4 ° C에서 B, C, D, E 및 F 솔루션을 저장 합니다. 솔루션은 나중에 사용-20 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. 기판에 RGD Cys D1 Dendrimers의 Nanopatterning
    1. 조직 문화 후드에서 13 분 자외선과 해 여는 기판 소독.
      참고:이 단계는 nanopatterned 기판 셀 문화 기판으로 사용 하려고 하는 경우에 필요. 이 경우 다음 단계에 대 한 살 균 조건 (조직 문화 후드, 살 균 자료, 솔루션 및 기술)을 유지 합니다.
    2. 핀셋으로 신중 하 게 그들을 처리 하는 접시의 우물에 각 기판 얼굴을 배치 합니다.
    3. 10 분에 대 한 솔루션 B, C, D, E 및 F sonicate
    4. 기판 (2 mL/음)을 포함 하는 우물에서 직접 주사기를 사용 하 여 0.22 μ m 지름 필터를 통해 RGD Cys D1 dendrimer 솔루션을 전달 합니다. Dendrimer 농도 당 적어도 3 개의 복제본 권장 됩니다. 및 접시 인감 닫고 실 온 (RT) 16 시간에서 그것을 두고.
    5. 제거 하 고 솔루션을 삭제. 살 균 이온된 수와 건조 기판 세척. 4 ° c.에 게 기판
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

3입니다. 제어 기판의 준비

참고: 메 마른 조직 문화 후드, 그리고 메 마른 재료만 솔루션에서 모든 단계를 수행 했다 고 기술 사용 되었다. 적어도 6 제어 기판 사용된 (긍정적인 통제의 3 개의 복제본) 및 부정적인 컨트롤의 3 개의 복제본을 했다.

  1. 조직 문화 후드에서 13 분 자외선과 해 여는 기판 소독.
  2. 섬유 아 세포 접착 실험의 제어 기판
    1. Au(111) 기판 불꽃 단련 부정적인 컨트롤로 사용 합니다. 골드 안티 셀 접착제 속성28수 여 하는 잘 알려진 단백질 변성 효과가 있다. 모든 솔루션을 sonicate 고 기판 부 화 하기 전에 필터링 합니다.
    2. 긍정적인 컨트롤에 대 한 몰두 RGD 수정 못 thiol Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene 글리콜 모노-11-mercaptoundecanamide (RGD-말뚝-SH)30 , triethylene 글리콜의 해결책에 Au(111) 기판 불꽃 단련 모노-11-mercaptoundecyl 에테르 (못-SH) 실시간에 16 h에 대 한 96% 에탄올에 어 금 니 비율 1: 100
    3. 에탄올에 기판을 철저 하 게 세척 하 고 아르곤과 그들을 건조. 4 ° c.에 게 기판
  3. Chondrogenesis의 제어 기판
    1. 깨끗 한 PLLA 기판 부정적인 컨트롤로 사용 합니다. 어떤 표면 처리 없이 PLLA는 살아있는 세포와 가난한 인터페이스를 보여줍니다. 31
    2. 긍정적인 컨트롤에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 0.1 mg/mL fibronectin의 5 mL을 준비 하 고 품 어 실시간에서 1 h fibronectin 솔루션의 1.6 mL와 함께 각 PLLA 기판
    3. 제거 및 fibronectin 솔루션을 삭제 하 고 PBS와 기판 세척. 4 ° c.에 게 기판

4. 표면 특성

  1. AFM 화상 진 찰
    1. 거칠기 분석 PLLA 기판의 AFM 이미지를 수행 합니다. 이후 dendrimers 거칠기 값 1의 4-5 nm의 직경을가지고 nm는 nanopatterns의 적절 한 시각화를 위한 얻을 수 있어야. 또한,는 nanopatterns의 AFM 이미지를 수행 합니다. 두 경우에서 모드 공기에 도청에서 AFM을 수행 합니다.
    2. 실리콘 캔틸레버를 선택 스프링 상수 k = 40 N/m 및 공 진 주파수 ν = 300 kHz 및 AFM 장비에 탑재.
    3. 원자 힘 현미경의 스테이지에는 샘플을 탑재 합니다. 장치 설정에 따라 튜닝 및 이미징 규격은 달라질 수 있습니다. 제조 업체의 수첩을 참조 하십시오.
    4. 연락처까지 현미경의 팁과 샘플을 접근 한다.
    5. PLLA 거칠기 분석에 대 한 이미지, 3 개의 독립적인 기판에서 기판 당 20 x 20 µ m의 적어도 4 개의 대표적인 영역을 선택 합니다. Dendrimer nanopatterns 이미지를 조건 (솔루션에서 초기 dendrimer 농도) 당 3 개의 독립적인 기판에서 기판 당 5 × 5 µ m의 적어도 3 개의 대표 이미지를 선택. 이미징 동안 dendrimer 층의 손상을 방지 하려면 최소한 힘을 유지 하는 세트 포인트를 조정 합니다.
      참고: 이미지 영역의 선택은 또한 압 전 스캐너의 작업 범위에 따라 다릅니다. 이 점에서 악기 매뉴얼을 참조 하십시오.
    6. AFM 높이 피팅 하 여 이미지 프로세스 각 다항식 평준화 AFM 장치 제조업체의 독점 소프트웨어를 사용 하 여 기능을 검사 하 고 PLLA 표면 거칠기 계산 하에서 그 분석. 루트-평균 제곱 (RMS) 분석은 적절 한 옵션을 제공할 수 있습니다.
  2. 로컬 RGD 표면 밀도 측정입니다.
    1. 표면에 dendrimers 선택 처리 AFM 높이 이미지의 이미지 임계값을 가져옵니다.
    2. 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 입자 위치를 확인 하 고 최소 interparticle 거리 (dmin)를 그들을 사용 하 여.
    3. D확률 등고선 지도를 해당 입자 위치 z dmin 값을 플롯 합니다. 높은 로컬 RGD 표면 밀도 (d < 70 nm)의 영역을 시각화 하기 위한 음모의 색조를 조정 합니다.
    4. 최고의 로컬 RGD 표면 밀도 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 영역의 영역을 계량. 계산에 dendrimer의 영역을 포함 합니다.
  3. STM 이미지입니다.
    참고: STM 이미지 전도성 Au(111) 기판에 nanopatterns에 대해서만 수행할 수 있습니다. 측정은 공기에서 수행 됩니다.
    1. 장소에 STM 장비의 샘플 홀더 nanopatterned 기판. 테스터와 샘플 홀더 사이 전기 연결을 확인 합니다.
    2. 팁 선택한 조사 자료 (엣지. Pt 0.8: Ir 0.2) STM 장비의 머리에 적절 한 피팅을 보장 하는 직경. 에칭 수동 절단 또는 전기 화학 에칭에 의해 수행할 수 있습니다. 32
      참고: 전기 화학 에칭 더 많은 대칭 팁 렌더링합니다.
    3. STM 장비의 머리에 팁을 탑재 하 고 샘플을 연결.
    4. "현재" 피드백 채널 설정 (이 유형의 측정, 전류 피드백 조정 일정 될 것입니다). 바이어스 전압 및 전류 설정 포인트 팁 종사 일단 잘 해결된 이미지를 스캔 크기를 조정 합니다.
      참고: 이미지 영역의 선택은 또한 압 전 스캐너의 작업 범위에 따라 다릅니다. 이 점에서 악기 매뉴얼을 참조 하십시오.
    5. 각 스캐닝선 다항식 평준화를 피팅 하 여 STM 지형 이미지 기능 STM 장치 제조업체의 독점 소프트웨어를 사용 하 여 처리 합니다.
  4. CA 측량입니다.
    1. 측정 조건 (솔루션에서 초기 dendrimer 농도)는 광학 CA 시스템 당 3 개의 독립적인 기판에 세 가지 다른 위치에서 무 드롭 방법으로 nanopatterned 기판에 CA입니다.
    2. 이온된 수로는 microsyringe와 1 µ L의 상품을 생산 하기 위해 CA 소프트웨어에서 매개 변수를 설정.
    3. 샘플의 표면 영상에 대 한 컴퓨터에 명확 하 게 표시 되도록 스테이지의 샘플을 놓습니다.
    4. 그것은 표면에 가까운 때까지 micromanipulator와 주사기를 이동 하 고 표면에 드롭 분배. 드롭릿 안정화 후 즉시 이미지를 기록 합니다.
      참고: CA 측정에서는 매우 재현 가능한 결과 달성 하기 위해 습도 제어 하는 것이 중요입니다.
    5. Ca의 CA 기구 제조업체의 독점 소프트웨어와 측정을 분석 합니다. 사용자 요구 사항에 맞는 메서드를 조정할 수 있습니다. 타원 피팅 방법 옵션 될 수 있습니다.

5. 세포 배양

참고: 조직 문화 후드, 그리고 메 마른 재료만 솔루션에서 모든 단계를 수행 했다 고 기술 사용 되었다.

  1. 섬유 아 세포 점착 실험입니다.
    1. NIH 3T3 마우스 미 발달 섬유 아 세포 초기 구절 (< 10) 37 ° C와 기저 매체에 4.6% CO2 분위기에서에서 높은 포도 당 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 문화 1 %L-글루타민, 1% 페니실린-스와 1% 나트륨 pyruvate (성장 매체)입니다. 성장 매체의 10 mL 플라스 크 당 500000 셀의 총 시드의 T75 플라스 크는 것이 좋습니다.
    2. 2 일 마다 10 mL 피 펫과 오래 된 매체를 제거 하 고 갓된 성장 매체의 10 mL를 바꿉니다.
    3. 그들은 80% 합류, 다음 제거 매체 주위에 도달 될 때까지 플라스 크 당 trypsin의 5 mL을 추가 성장 매체에 문화 세포. 플라스 크의 아래쪽에서 적절 한 셀 분리를 보장 하기 위해, 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀 접촉 trypsin 솔루션 유지
    4. 플라스 크 당 성장 매체의 5 mL을 추가 하 고 원심 분리기 튜브에 세포를 수집 합니다. 원심 470 x g 5 분 제거에서 세포는 상쾌한 고 성장 매체의 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀의 농도 결정 합니다.
    5. 번호판 없는 조직 문화 (비 점착)에 대 한 치료를 잘 기판 전송.
    6. 성장 매체에서 4000 셀/c m2 의 조밀도에 기판에 셀 씨 하 고 37 ° C와 10%의 CO2 분위기에서 4.5 h에 대 한 그들을 품 어.
  2. MSCs의 Chondrogenic 감 응 작용입니다.
    1. 초기 구절에서 인간의 MSCs 문화 (< 5) MSC 성장 매체에서 37 ° C와 4.6% CO2 분위기에. 성장 매체의 10 mL 플라스 크 당 500000 셀의 총 시드의 T75 플라스 크는 것이 좋습니다.
    2. (5.1.2에서 설명한) 대로 모든 3 일 매체를 변경 합니다.
    3. Trypsinize 셀 전에 80% 합류에 도달 하면, 그리고 원심 (5.1.3에서와 같이) MSC 성장 매체에서 그들을 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀의 농도 결정 합니다.
    4. 셀을 다시 원심 하 고 유도 하는 chondrogenesis 매체의 10 ml에서 그들을 resuspend.
    5. 새로운 잘 번호판 없는 조직 문화 (비 점착)에 대 한 치료는 기판 격판덮개에서 전송. 3, 000 셀/c m2의 조밀도에 기판에 셀 씨
    6. 변경 chondrogenic 매체 3 일 마다 (5.1.2에서 설명).

6. 세포 고정 및 Immunostaining

참고: 다음 단계는 비 살 균 조건에서 수행할 수 있습니다.

  1. 미디어를 제거 하 고 부드럽게 PBS로 세포 세척. 실시간에서 20 분 동안 10% 포 르 말린 솔루션을 추가 하 여 수정
  2. 포 르 말린을 제거 하 고 PBS로 세포 세척.
  3. PBS에서 염화 암모늄 (NH4Cl)의 50mm 솔루션을 추가 하 여 무료로 알데하이드 그룹을 차단 합니다. 실시간 제거 NH4Cl 솔루션에서 20 분에 대 한 셀을 두고 PBS로 세포 세척.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 4 ° c.에 PBS에 샘플을 저장
  4. PBS를 제거 하 고 추가 하 여 사포닌의 0.1% 솔루션 차단 솔루션 (PBS에 1% 민) 10 분에에서 실시간 세척에 PBS 가진 세포 세포를 permeabilize 새로운 잘 플레이트에 샘플을 전송.
  5. 실시간에서 1 h 차단 솔루션 (표 3)에 1 차 항 체의 솔루션 셀을 품 어 그런 다음 기본 항 체 솔루션을 제거 하 고 PBS로 세포 세척.
  6. 실시간에서 1 시간에 대 한 차단 솔루션 (표 3)에서 2 차 항 체와 세포를 품 어
    참고: 방지 빛 노출.
  7. 이차 항 체 솔루션을 제거 하 고 세포를 PBS와 건조를 씻어.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 어둠 속에서 4 ° C에서 PBS에 샘플을 저장 합니다.
  8. 현미경 관찰에 대 한 샘플 장착: 다이아몬드 팁 커터를 사용 하 여 coverslips 샘플에 매체를 장착 하는 현미경의 1.25 cm x 1.25 cm. 적용 50 µ L로 자르고 부드럽게 컷된 coverslips와 함께 그들을 커버.
  9. 편리한 받는 사람에 게 샘플을 전송, 관찰까지 알루미늄 호 일 및 4 ° C에서 어둠 속에서 그것을 커버.

7. 세포 이미징 및 데이터 분석

참고: 불투명 한 Au(111) 및 두꺼운 microslide 기반 기판, 직 립 현미경 사용 해야 합니다.

  1. 섬유 아 세포 점착 실험입니다.
    1. 사용 epifluorescence 현미경 장비는 디지털 카메라 및 낮은 (즉, 10 배)와 높은 (즉 40 X) 확대 목표. 공기에서 측정을 수행 합니다.
    2. 10 X 목표는 자외선 여기, Hoechst/DAPI 얼룩 시각화 longpass 방출 필터를 사용 하 여 무대와 이미지 세포 핵에 샘플을 놓습니다.
    3. 이미지 셀 골격 및 해당 항 체 형광 색소 명세와 일치 하는 현미경 필터를 선택 하면 40 X 목표 초점 유착 (FAs).
    4. FA 정량화에 대 한 8 비트 파일에 이미지를 변환 하는 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 합니다. 임계값을 설정 하 여 이진 변환 및 배경 이미지를 제거 합니다. 샘플 당 적어도 30 이미지를 계산 하 고 1 µ m2 계산에서 FAs를 고려 하십시오.
  2. MSCs의 Chondrogenic 감 응 작용입니다.
    1. 똑바로 epifluorescence 현미경 디지털 카메라 및 낮은 (즉, 10 배)으로 셀 condensates chondrogenic 유도 (< 5 일)의 초기 단계에서 이미지 확대 목표. 자외선 여기 및 longpass 방출 필터를 사용 하 여 시각화 Hoechst/DAPI 얼룩.
    2. 응축 영역을 측정 하기 위한 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 하 이미지를 8 비트 파일 변환 배경 제거 하 고 집계 윤곽선을 강조 하는 임계값을 선택 합니다. 입자의 위치를 계산 합니다.
    3. FAs, 골격 말라 섬유, 및 높은 확대율 (즉, 40-60 X)에서 직 립 confocal 현미경으로 특정 연골 콜라겐 유형 II 알파 1 (COL2A1)에 대 한 이미지 immunostained 샘플. (즉, 0.5-1 µ m) 대표 간격 섹션을 수집 합니다.
    4. 스택 처리, 이미지 처리 소프트웨어를 사용 합니다. 8 비트 파일에 이미지를 변환, 배경, 제거 그리고 이진 임계값을 설정 합니다. 최소 3 개의 독립적인 샘플의 조건 당 3 셀 condensates 취급.
    5. 스테인드 지역의 condensates 셀의 기초 영역에서 FA 단백질을 계량 하 고 해당 지역 이미지에 세포 핵의 수로 나눈 비율으로 그들을 표현.
    6. COL2A1 얼룩 측정, confocal z-계획을 사용 하 고 예상된 지역 (샘플 당 최대 COL2A1 영역)의 합 계량. 해당 응축의 지역에 대 한 가져온 지역 값을 정상화.

8. 양적 역 전사-중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석

참고: 오염을 방지 하기 위해 RNase, 일회용, 살 균 플라스틱 도자기를 사용 하 고 시 약 및 RNA를 처리 하는 동안 일회용 장갑을 착용. 항상 적절 한 미생물 무 균 기술을 사용 하 고 적절 한 오염 제거 솔루션을 사용 하 여 작업 및 원심 분리기, 펫 등 비 일회용 항목에서 RNase 오염 제거.

  1. 총 RNA를 분리 하 고 RNA disrupter에 그것을 격파. RNA 샘플 DNase 처리 하 고 cDNA cDNA 합성 키트를 사용 하 여 그들을 변환.
  2. QRT-PCR 수행 녹음 방송 요인 SOX9에 대 한 프라이 머를 사용 하 여. 베타-2-microglobulin (B2M) 및 ribosomal 단백질 L13a (RPL13a)는 내부 관리 유전자로 사용할 수 있습니다.
  3. 식 수준을 계산 하 고 부정적인 제어 (PLLA)에 대 한 그들을 정상화.

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Representative Results

표면 접착 력 나노 (그림 1)에서 해결할 수 있도록 nanopatterning 메서드는 선물이. RGD Cys D1의 화학 구조는 그림 1A에 표시 됩니다. Dendrimers는 고해상도 STM 특성화를 위한 전기 전도성 Au(111) 표면에 모방 했다. 솔루션 (최대 10-5% w/w)에서 낮은 dendrimer 농도 높은 포장된 dendrimer 집계 높은 농도 (그림 1C) 형성 하는 동안 (그림 1B), 직경에서 4-5 nm의 격리 dendrimers 렌더링. AFM 표면 특성 (그림 1의 D-G, 위 행) 밝혔다 RGD Cys D1 dendrimers의 표면 배포 솔루션에서 초기 dendrimer 농도의 기능으로 조정 될 수 있다. D확률 등고선 지도에서 표면 (그림 1의 D-G, 낮은 행)에 서로 다른 로컬 RGD nanoscale 밀도 결과.

세포 배양 실험, 약 10의 세포 막 수용 체 integrins에에서 nm 직경에서 인식 dendrimers 주변에 RGD 시퀀스. 이 시퀀스의 8 복사본 dendrimer 당 제공 했다, 비록 하나의 dendrimer STM;에 의해 측정 (4-5 nm 크기로 인해 integrin 당 작용 그림 1B)입니다. 즉, 각 dendrimer 제공 단일 사이트 integrin 바인딩, 그로 인하여 dendrimer 배급에서 직접적인 상관 관계 (로 AFM 이미지에서 본) 및 세포 접착에 사용할 수 있는 RGD 배포. 또한, 아니 중요 한 변화는 세포 접착29에 영향을 미칠 수 있는 다른 nanopattern 구성에 대 한 가져온 CA 값에서 발견 됐다. 이러한 특성을 통해 생체 표면 적당 한 기판 변조 및 셀 동작을 연구에 dendrimer nanopatterns를 확인 합니다.

Nanopatterned Au(111)에 세포 접착 nanopatterned PLLA (그림 2B)에 문화 (그림 2A)의 첫 24 시간 내 섬유 아 세포와 MSCs를 테스트 했습니다. 두 경우 모두, 영역의 백분율 스테인드 dendrimer 농도로, 점차적으로 증가 FA 단백질 paxillin (pax)에 대 한 로컬 RGD 표면 밀도 ( d 70 nm 임계값 아래 nanopatterned의 비율 않았다 효율적인 세포 접착; 표 4)입니다. 10-2%의 초기 dendrimer 농도 w/w 및 긍정적인 컨트롤의 영역 비율 감소 셀 당 인원에 대 한 스테인드 및 d < 70 nm nanopatterned의 비율로 상관 관계 손실 되었습니다.

D 점유 면적의 비율 < 70 nm (그림 1D-G 낮은 행 및 표 4)은 10-5%w / w 초기 dendrimer 최대 nanopatterns에 대 한 로컬 RGD 표면 밀도의 좋은 표시 이다 집중 하지만 그 10-2% w/w, dendrimer 집계 때문. 집계는 ligand 유통, dmin 값 70 nm 임계값 (그림 1D 낮은 행 및 표 4)와 표면의 단지 작은 비율의 측면에서 매우 이질적인 샘플 제작. XPS 결과 이러한 표면 글로벌 RGD 밀도 10-5% w/w에 비해 제시 했다-파생 된 nanopatterns28. 이 관측 최대 RGD 밀도 dendrimer 집계를 포함 하는 지역에서 달성 했다 나타내고 표면적의 비율 d 점령 < 70 nm에서 로컬 RGD 표면 밀도의 것은 아닙니다 이 경우.

최대 로컬 RGD 표면 밀도와 긍정적인 컨트롤 (균질 코팅) 세포 접착에 예상 된 증가 보여 주지 않았다 관찰 입체 방해 효과를 지정할 수 있습니다. 이 결과 나타냅니다, 일반적으로 세포 배양에 사용 하는 해당 균질 표면에 비해, RGD nanopatterns 세포 접착 유지 보다 효율적으로. 이 발견은 따라서 로컬 ligand 밀도의 관련성을 강조 표시합니다.

Morphogenesis에서 주변 환경과 상호 작용 첫 번째 셀 차별화 이벤트가 발생 하 고 최종 복잡 한 조직 구조의 설립까지 전파. 세포 접착 및 차별화 dendrimer nanopatterns의 효과 평가 하려면 우리는 모델 MSCs의 chondrogenic 유도 사용. Chondrogenesis, 동안 있다, 개장 하는 액티브 매트릭스는 연골 형성의 다른 단계를 통해 셀 지시에 교육적 역할을 한다.

MSCs는 (그림 3) nanopatterns에 chondrogenesis를 받았다. Chondrogenic 감 별 법 세포 형태학33밀도 condensates, 셀 통신 및 부수적인 변경의 설립 형태 셀 채용을 포함 하는 셀 응축 단계로 시작 합니다. 그림 3A 쇼 모든 기판에 그 condensates 셀 결로 발생 증가 dendrimer 농도와 지역에 최대 2.5 x 10-8% w/w 응축 영역은 dendrimer에 대 한 다음 다시 감소 증가 농도 10-2% w/w 및 긍정적인 통제에 대 한. Chondrogenesis에서 셀 응축 단계 현재 셀 운동을 통해 보다 셀 확산34증가 통해 발생합니다. 이 셀 이동은 기판으로 유연한 접착에 의해 선호: 안정적인 유착 세포 체를 이동 하는 견인 세력을 허용 하도록 형성 한다 하 고, 동시에 이러한 유착 충분히 약한 동안 기판에서 셀 출시를 허용 해야 운동입니다. 2.5x10-8% w/w까지 로컬 RGD 표면 밀도 증가 의해 선호 셀 응축-nanopatterns, 세포 접착 및 셀 운동 사이의 적절 한 균형으로 파생. 10-2 , 긍정적인 통제에 대 한 로컬 RDG 표면 밀도 너무 높은, 그로 인하여 응축 이벤트를 방해 했다.

Chondrogenic 차별화 prechondrogenic condensates에서 진행: condensates 셀 더 반올림 되 고 ECM 단백질 COL2A1와는 녹음 방송 요인 SOX933, 와 같은 특정 마커 연골의 합성을 시작 34 , 35. 따라, 셀 condensates의 형성을 선호 하는 중간 접착 력으로 기판 높은 COL2A1 얼룩 (그림 3B)와 SOX9 mRNA 식 (그림 3C)의 높은 수준을 보였다.

우리의 결과 chondrogenic 분화의 초기 단계 동안 세포-세포 모 체 상호 작용의 영향을 강조 표시합니다. 이러한 상호 작용은 dendrimer 기반 nanopatterns 통해 쉽게 해결할 수 있습니다.

단계 시간 (s) 속도 (rpm) 가속 (rpm/s)
1 5 500 300
2 30 3000 1500

표 1: 준비 된 PLLA 솔루션 유리 슬라이드 코트 하 회전자 프로그램 단계. 균질 첫걸음은 5 300 rpm/s의 가속도와 500 rpm에서 사용 되었다 s. 30 1500 rpm/s의 가속도와 3000 rpm에서 마지막 단계 뒤에 s.

솔루션 RGD-Cys-D1 (mg/mL) RGD-Cys-D1 (mg) MQ 물 (µ L)
A 0.77 5 6,494
RGD-Cys-D1 (%w / w) 솔루션 (µ L)
B 10-2 779 5,220
C 10-5 0.78 6000
솔루션 C (µ L)
D 2, 5 x 10-8 15.0 5985
E 10-8 6.0 5,994
F 4 x 10-9 2.4 5,998

표 2: 사용 RGD Cys D1 솔루션의 준비의 세부 사항. RGD Cys D1 dendrimers의 재고 솔루션에서 솔루션 B와 C는 10-2 , 10-5%w / w 농도에 준비 했다 (솔루션), 0.77 mg/mL의 최종 농도에 준비 되었다. RGD Cys D1 dendrimer의 10-5%w / w 농도 C 솔루션 솔루션 D, E 및 F 2.5 x 10-8, 10-8 및 4 x 10-9%w / w의 최종 농도 각각 준비 하 사용 되었다.

이름 볼륨 (µ L) 블로킹 버퍼 (mL)
주 믹스 Pax에 토끼 mAb 65 12.870
COL2A1에 마우스 mAb 32.5
2 차 믹스 알 렉 사 Fluor 488 염소 안티 마우스 13 12.961
알 렉 사 Fluor 568 염소 반 토끼 13
Hoechst 솔루션 13

표 3: 항 체 솔루션 준비. 토끼에서 생산 하는 인원에 대 한 1 차적인 항 체 혼합물 포함 된 단일 클론 항 체 희석 COL2A1 차단 솔루션에서 마우스 희석 1:400에서 생산에 대 한 단일 클론 항 체로 차단 솔루션에서 1: 200. 이차 항 체 혼합물 포함 세포 핵 얼룩 Hoechst 및 이차 항 체 각각 마우스와 토끼에 대 한 염소에서 생산 (알 렉 사 Fluor 488와 568 fluorophores, 각각 표시).

Figure 1
그림 1 : RGD-Cys-D1 dendrimer nanopatterning 로컬 RGD 표면 밀도의 나노 제어에 대 한. (A) RGD Cys D1 dendrimer 구조 셀 접착제 RGD 펩타이드의 최대 8 개의 복사본을 포함 하. 대표 STM 이미지 (바이어스 = 200 mV, 세트 포인트 = 0.5 나) 10-8% w/w 의 초기 용액에서 Au(111)에 RGD Cys D1 nanopatterns의 (눈금 막대 = 3 nm, B)와 해당 높이 거리 프로 파일에는 파선 (B)(C) 10-2% w/w dendrimer 집계 표시에 표시 된 지역 (눈금 막대 = 20 nm). (D-G) PLLA에 RGD Cys D1 nanopatterns의 대표 AFM 이미지 각각 10-2%, 2.5 x 10-8%, 10-8%및 4 x 10-9% w/w, 해당 dendrimer 수성 해결책에서 얻은 (눈금 막대 = 1 µ m). 해당 최소 interparticle 거리 (dmin) 확률 등고선 지도 아래 각 AFM 이미지, 높은 밀도와 RGD 영역은 어두운 빨간색으로 표시 (d < 70 nm). Dendrimers와 dendrimer 집계 선명도 대 한 블랙에 묘사 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : RGD-Cys-D1 nanopatterns에 접착 세포. 초기 dendrimer 농도와 기판 (왼쪽된 축) 접촉 셀에 대 한 셀 당 FA 단백질 pax에 대 한 스테인드 영역 비율의 플롯. 값을 로컬 RGD 표면 밀도 ( dmin 값 70 nm 임계값을 포함 하는 nanopatterns에서 표면적의 비율)와 비교 (오른쪽 축) 100, 0 비율로 긍정적인 (+ 컨트롤)에 할당 된 및 네거티브 (- 각각 제어) 제어합니다. (A) 구와 접착 dendrimer nanopatterns Au(111)에 문화의 4.5 h 후에. (B) MSC 접착 PLLA chondrogenic 유도의 1 일에 평가에 dendrimer nanopatterns에. 값은 표준 편차와 함께 평균으로 주어 집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

RGD-Cys-D1 (%w / w) 지역 (< d= 70 nm) (%) Au(111)에 지역 (< d= 70 nm) (%)에 PLLA
10-2 5 ± 1 2 ± 2
10-5 97 ± 2
2, 10-8 x 5 65 ± 11 90 ± 2
10-8 25 ± 16 45 ± 7
4 x 10-9 18 ± 11

표 4: 비율의 d 70 아래 값 nm 얻은 RGD Cys D1 dendrimer 증 착 PLLA와 Au(111)에 사용 하는 초기 dendrimer 농도의 기능으로 표면에.

Figure 3
그림 3 : RGD-Cys-D1 nanopatterns에 MSCs의 Chondrogenic 차별화. (A) chondrogenic 유도의 5 일 후 PLLA에 RGD Cys D1 nanopatterns에 경작 하는 MSCs의 응축. 얼룩진된 세포 핵 (Hoechst;의 대표 epifluorescence 이미지 눈금 막대 = 300 µ m; 위쪽 행)와 다른 초기 dendrimer 농도에서 RGD Cys D1 nanopatterns에 얻은 지역의 condensates 셀 (아래쪽 행)의 음모. 차별화 특정 chondrogenic 마커의 식 셀 응축 단계에서 진행:의 COL2A1 해당 confocal z-계획에서 셀 응축의 지역으로 정규화 된 얼룩의 영역 (B) 비율 chondrogenic 유도의 5 일 후에 얻은. Chondrogenic 유도의 3 일 후 (에 대 한 부정적인 제어) (C) 상대 SOX9 mRNA 식입니다. 값 (B)(C)표준 편차와 함께 평균으로 주어 집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

설명된 프로토콜의 개발 하는 동안 몇 가지 중요 한 단계를 고려해 야 합니다. 첫 번째 검사 조사 현미경 검사 법 기술을 가진 nanopattern 특성을 말합니다. nanopatterns를 시각화 하려면 모방 생산은 표면 거칠기 값 주위 dendrimers의 평균 직경 아래 있어야 STM (그림 1B)에 의해 측정 된 4-5 nm. 또한, 그것은 높은 해상도 STM 이미징이 경우 Au(111) 전도성 기판에 제한 된 계정으로 취해야 한다. 어떤 스핀 코팅 후 슬라이드의 모서리에서 폴리머의 리프팅은 생체 접착제를 사용 하 여 조정 될 수 있습니다.

Dendrimer nanopatterning 달성 하는 프로세스 제어는 nanoscale에 로컬 셀 접착 력 이다. 에 따라는 자기 조립 dendrimers 흡착에 의해 표면에,의이 기술은 장비가 필요 하지 않습니다 모든 복잡 한 nanopatterning, 이전와 따라서 대조 설명 리소 그래피 기반 방법36,37, 38. Dendrimer nanopatterning 큰 표면 영역을 쉽게 확장 될 수 있습니다 및 세포 배양 프로토콜을 완벽 하 게 호환 됩니다.

여기 설명 하는 dendrimer nanopatterning 방법을 재생 의학에서 미래의 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다. Dendrimer nanopatterning 세포 점착에 의해 발휘 하는 컨트롤은이 기술을 주입, 호스트 조직에 그들의 통합을 촉진 함으로써 이전 바이오의 컨디셔닝에 적합 합니다. 또한,는 dendrimer 주변 moieties 수정할 수 있습니다 용이성은 dendrimer nanopatterning 셀에 농도 의존 활동을 발휘 하는 다른 ligands에 적합 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

저자에에서 대 한 그들의 도움 d 정량화 악천후로 글꼴-바흐와 앨버트 G. Castaño 인정합니다. 그들은 또한 고급 디지털 현미경 단위 의학 작가 그들의 전제에 동영상을 기록 하도록 (IRB 바르셀로나)에서 연구를 위한 연구소에서 인정 합니다. 이 작품으로는 네트워킹 생물 의학 연구 센터 (CIBER), 스페인을 지원 했다. CIBER 유럽 지역 개발 기금의 지원으로 건배 카를로스 III, VI 국가 R & D & 계획 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider 프로그램, CIBER 작업 및 Instituto de에 의해 자금 이니셔티브 이다. 이 작품 대학과 학과의 혁신, 대학 및 기업 Generalitat 드 Catalunya의의 연구에 대 한 위원회에 의해 지원 되었습니다 (2014 SGR 1442). 그것은 또한 OLIGOCODES (제 프로젝트에 의해 투자 되었다 MAT2012-38573-C02)와 CTQ2013-41339-P, INTERREG V-A 스페인-포르투갈 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E)에 또한 스페인 경제와 경쟁력에 의해 수 여. C.R.P. 스페인 경제와 경쟁력 부여 (제 로부터 재정 지원을 인정합니다 IFI15/00151).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm  Spi Supplies 466PS-AB
Glass micro slides, plain Corning 2947-75x25
Deionized water Millipore 18MΩ cm
Ethanol 96% PanReac 131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymer Corbion 95/05 molar ratio
1,4 - dioxane Sigma-Aldrich 296309-1L
Silicone oil, high temperature Acros Organics 174665000
Spinner Laurell WS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hood Telstar Bio II Advance Class II biological safety cabinet
Filter unit Millex-GP SLGP033RB 0.22 µm
Syringe 10 mL Discardit 309110
Atomic Force microscope Veeco Instruments Dimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probes Budget Sensors Tap300AI-G Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscope Molecular Imaging PicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wire Advent PT671012 Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 software Nanotec electronica
Optical contact angle (CA) system Dataphysics
SCA20 software Dataphysics
X-ray photoelectron spectrometer Physical Electronics Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141-1MG 1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Gibco 21600-10 Powder
Mouse embryo fibroblasts ATCC ATCC CRL-1658 NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose Gibco 11960044 liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044 500 mL
L-Glutamine Invitrogen 25030 200 mM (100X)
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360039 100 mL
T75 culture flasks Nunclon 156499
Trypsin Life Technologies 25200072 0,25% EDTA
Centrifuge Hermle Labortechnik Z 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 well Falcon 351143 Non-adherent
Adipose-derived hMSCs ATCC ATCC PCS-500-011 Cell vial 1 mL
MSC basal medium ATCC ATCC PCS-500-030
MSC growth kit ATCC ATCC PCS-500-040 Low serum
Chondrocyte differentiation tool ATCC ATCC PCS-500-051
Formalin solution Sigma-Aldrich HT5011-15ML neutral buffered, 10%
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434-500G for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody Abcam ab32084 Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain  Acris Antibodies AM00212PU-N Diluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A10667 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11036 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10ML 10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mm Deltalab D102424
Fluoromount Sigma-Aldrich F4680-25ML
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse E1000 upright microscope with a CCD camera
Confocal Microscope Leica Microsystems Leica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freeware http://imgej.nih.gov/ij
MATLAB software The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software  OriginLab Coorporation

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