로컬 컨트롤 표면 점착을 고르지 Nanopatterns Dendrimer 기반: Chondrogenic 차별화 하는 방법
Summary
받는 dendrimer 기반 고르지 nanopatterns 로컬 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD) 표면 밀도의 나노 제어를 허용 하는 방법은 설명 하 고 세포 접착 및 chondrogenic 분화의 연구에 대 한 적용.
Abstract
세포 접착 및 차별화는 주요 효과가 지역 농도와 세포 외 기질 (ECM) 성분의 나노 처리에 의해 조절 된다. 여기에 우리가 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD)의 대규모 고르지 nanopatterns를 얻을 하는 방법을 제시-기능성된 dendrimers 로컬 RGD의 나노 제어를 허용 하는 표면 밀도. Nanopatterns dendrimers 다른 초기 농도에 솔루션에서의 표면 흡착에 의해 형성 된다 물 접촉 각 (CA), 엑스레이 광전자 분광학 (XPS), 특징 및 현미경 기법 같은 프로브 검색 주사 터널링 현미경 (STM)와 원자 힘 현미경 (AFM). 최소 interparticle 거리의 확률 컨투어 지도 의하여 AFM 이미지를 사용 하 고 세포 접착 반응 및 차별화와 그 때 상관 RGD의 로컬 표면 밀도 측정 됩니다. 여기에 제시 된 nanopatterning 메서드는 큰 표면 영역을 간단한 방식으로 확장 될 수 있는 간단한 절차입니다. 따라서 세포 배양 프로토콜을 완벽 하 게 호환 이며 셀에 농도 의존 효과 발휘 하는 다른 ligands에 적용할 수 있습니다.
Introduction
여기 우리는 간단 하 고 다재 다능 한 dendrimer 기반 nanopatterning 프로시저는 nanoscale에 로컬 점착의 제어를 허용 하는 세포 문화 서피스를 설명 합니다. ECM의 나노 세부 보도 되 고,1,2,3 , nanopatterning의 세포 접착 표면 접착4에 관련 된 세포 요구 사항에 대 한 깊은 통찰력을 제공 하고있다 5. 실험 micellar 리소 그래피 기반 nanopatterns를 사용 하 여 약 70의 임계값 공개 RGD 펩타이드 nanospacing, 세포 접착이 값6,,78 위에 상당히 지연 되 고에 대 한 nm 9. 이 연구는 또한 세포 접착9,,1011에 글로벌 ligand 밀도 보다 로컬의 큰 영향을 강조 했다.
Morphogenesis, 동안 주변 환경과 상호 작용 세포 최종 복잡 한 조직 구조를 형성 될 때까지 계속 첫 번째 차별화 이벤트를 트리거합니다. 이 프레임 워크 내에서 nanopatterned 표면 morphogenesis에 초기 세포 표면 상호 작용의 영향을 해결 하기 위해 사용 되었습니다. 68의 측면 간격으로 RGD nanopatterns 리소 그래피 기반에서 β 형 Ti-40Nb nm 합금 95 및 150 nm 사이 RGD nanospacings의 차별화를 강화 하는 동안 저지른 비 줄기 세포12, 미 분화 형을 유지 하는 데 도움이 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) adipogenic/osteogenic13,,1415 와 chondrogenic 운명을16쪽으로. 또한, 신호 구성 요소를 사용 하 여 수정 자가 조립 고분자 나노 신호 신호17의 건축 규제를 제공 하 여 세포 접착 및 차별화를 직접 표시 되었습니다. 이와 관련, 그들의 외부 구체18,,1920 표면에 세포 상호 작용 moieties와 dendrimers의 증 착 세포 접착21,22, 공부 하는 데 사용 되었습니다. 형태학23,24, 그리고 마이그레이션 이벤트25,26. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 연구에서 표면 특성의 부족 어렵게 dendrimer 표면 구성 및 세포 반응 사이 어떤 상관 관계를 설정 합니다.
액체와 같은 순서 및 정의 된 간격 Dendrimer nanopatterns dendrimers 낮은 이온 힘을 가진 솔루션에서 낮은 충전 표면에 흡착 될 때 얻어질 수 있다. 27 이 속성을 기준으로 하 여 여기 선물이 메서드를 로컬 RGD 표면 밀도의 나노 제어를 허용 하는 낮은 충전 표면에 RGD 기능성된 dendrimers의 대규모 고르지 nanopatterns. 물 접촉 각 (CA), 엑스레이 광전자 분광학 (XPS) 및 스캐닝 조사 현미경 검사 법 기술 (STM 및 AFM nanopatterns) 표시 로컬 ligand 밀도 수정 솔루션에서 초기 dendrimer 농도 조정 될 수 있다. 로컬 RGD 표면 밀도 최소 interparticle 거리의 확률 컨투어 지도 의해 AFM 이미지에서 계량 하 고 세포 실험과 상관. 다른 nanopatterning 기법4와 비교 하면, dendrimer 기반 nanopatterning은 간단 하 고 따라서 셀 문화 응용 프로그램에 완벽 하 게 호환 되 고 큰 표면 영역을 쉽게 확장 될 수 있습니다. Nanopatterns는 생리 기판으로 성인 인간의 MSCs29의 chondrogenic 유도 및 세포 접착28 에 로컬 RGD 표면 밀도의 효과 평가 하는 데 사용 됩니다. 우리의 결과 보여준다 RGD dendrimer 기반 nanopatterns 세포의 성장을 유지 하 고 세포 접착은 높은 로컬 RGD 표면 밀도 의해 강화 된다. 차별화 실험에는 기판에 세포의 중간 접착 력 MSC 결로 및 초기 chondrogenic 차별화를 선호. 쉽게는 dendrimer 주변 그룹 수정할 수 있습니다 인해 여기 설명 하는 방법은 더 셀에 농도 의존 효과 발휘 하는 다른 ECM ligands를 확장할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명된 프로토콜의 개발 하는 동안 몇 가지 중요 한 단계를 고려해 야 합니다. 첫 번째 검사 조사 현미경 검사 법 기술을 가진 nanopattern 특성을 말합니다. nanopatterns를 시각화 하려면 모방 생산은 표면 거칠기 값 주위 dendrimers의 평균 직경 아래 있어야 STM (그림 1B)에 의해 측정 된 4-5 nm. 또한, 그것은 높은 해상도 STM 이미징이 경우 Au(111) 전도성 기판에 제한 된 계정으로 취해야 한다. 어떤…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자에에서 대 한 그들의 도움 d분 정량화 악천후로 글꼴-바흐와 앨버트 G. Castaño 인정합니다. 그들은 또한 고급 디지털 현미경 단위 의학 작가 그들의 전제에 동영상을 기록 하도록 (IRB 바르셀로나)에서 연구를 위한 연구소에서 인정 합니다. 이 작품으로는 네트워킹 생물 의학 연구 센터 (CIBER), 스페인을 지원 했다. CIBER 유럽 지역 개발 기금의 지원으로 건배 카를로스 III, VI 국가 R & D & 계획 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider 프로그램, CIBER 작업 및 Instituto de에 의해 자금 이니셔티브 이다. 이 작품 대학과 학과의 혁신, 대학 및 기업 Generalitat 드 Catalunya의의 연구에 대 한 위원회에 의해 지원 되었습니다 (2014 SGR 1442). 그것은 또한 OLIGOCODES (제 프로젝트에 의해 투자 되었다 MAT2012-38573-C02)와 CTQ2013-41339-P, INTERREG V-A 스페인-포르투갈 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E)에 또한 스페인 경제와 경쟁력에 의해 수 여. C.R.P. 스페인 경제와 경쟁력 부여 (제 로부터 재정 지원을 인정합니다 IFI15/00151).
Materials
| Gold (111) on mica. 1.4×1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75×25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 – dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24×24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
- Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
- Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
- Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
- Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
- Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
- Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
- Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
- Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
- Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
- Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
- Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
- Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
- Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
- Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
- Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
- Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
- Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
- Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
- Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
- Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
- Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
- Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
- Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
- Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
- Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
- Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
- Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).
