Dendrimer-आधारित असमान Nanopatterns को स्थानीय रूप से नियंत्रित करने के लिए सतह चिपकने वाला: एक विधि Chondrogenic भेदभाव प्रत्यक्ष करने के लिए

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

dendrimer प्राप्त करने के लिए एक विधि-आधारित असमान nanopatterns कि स्थानीय arginine के नेनो नियंत्रण की अनुमति-glycine-एसपारटिक एसिड (RGD) सतह घनत्व का वर्णन किया गया है और सेल आसंजन और chondrogenic भेदभाव के अध्ययन के लिए आवेदन किया ।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Casanellas, I., Lagunas, A., Tsintzou, I., Vida, Y., Collado, D., Pérez-Inestrosa, E., Rodríguez-Pereira, C., Magalhaes, J., Gorostiza, P., Andrades, J. A., Becerra, J., Samitier, J. Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation. J. Vis. Exp. (131), e56347, doi:10.3791/56347 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

सेलुलर आसंजन और भेदभाव extracellular मैट्रिक्स (ECM) घटकों के नेनो स्वभाव से वातानुकूलित है, स्थानीय सांद्रता एक प्रमुख प्रभाव होने के साथ । यहां हम arginine-glycine-एसपारटिक एसिड (RGD) के बड़े पैमाने पर असमान nanopatterns प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रस्तुत है कि स्थानीय dendrimers सतह घनत्व के नेनो नियंत्रण की अनुमति कार्यात्मक । Nanopatterns अलग प्रारंभिक सांद्रता पर समाधान से dendrimers की सतह सोखना द्वारा गठित कर रहे है और जल संपर्क कोण (सीए), एक्स-रे photoelectron स्पेक्ट्रोस्कोपी (XPS), और स्कैनिंग की जांच माइक्रोस्कोपी तकनीक की विशेषता के रूप में कर रहे है स्कैनिंग सुरंगिंग माइक्रोस्कोपी (STM) और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM). RGD के स्थानीय सतह घनत्व न्यूनतम कण दूरी की संभाव्यता समोच्च नक्शे के माध्यम से AFM छवियों का उपयोग कर मापा जाता है और फिर सेल आसंजन प्रतिक्रिया और भेदभाव के साथ संबंधित. nanopatterning विधि यहां प्रस्तुत एक सरल प्रक्रिया है कि बड़े सतह क्षेत्रों के लिए एक सीधा तरीके से बढ़ाया जा सकता है । यह इस प्रकार सेल संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ पूरी तरह से संगत है और अंय लाइगैंडों है कि कोशिकाओं पर एकाग्रता पर निर्भर प्रभाव डालती करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

यहां हम एक सरल और बहुमुखी dendrimer आधारित nanopatterning प्रक्रिया का वर्णन सेल संस्कृति प्राप्त करने के लिए सतहों कि नेनो में स्थानीय चिपचिपाहट के नियंत्रण की अनुमति है । ECM संगठन के नेनो विवरण में बताया गया है,1,2,3 और सेल आसंजन सतहों के nanopatterning4आसंजन से संबंधित सेलुलर आवश्यकताओं में गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है, 5. micellar लिथोग्राफी-आधारित nanopatterns के प्रयोग से RGD पेप्टाइड nanospacing के लिए लगभग ७० एनएम के दहलीज मूल्य का पता चला, सेल आसंजन काफी इस मूल्य के ऊपर देरी की जा रही है6,7,8 ,9. ये अध्ययन भी सेल आसंजन9,10,11पर वैश्विक ligand घनत्व की तुलना में स्थानीय के अधिक से अधिक प्रभाव पर प्रकाश डाला ।

morphogenesis के दौरान, आसपास के वातावरण के साथ सेल बातचीत पहले भेदभाव की घटनाओं को ट्रिगर, जो अंतिम जटिल ऊतक संरचनाओं का गठन किया गया है जब तक जारी है । इस ढांचे के भीतर, nanopatterned सतहों morphogenesis पर प्रारंभिक कोशिका सतह बातचीत के प्रभाव से निपटने के लिए इस्तेमाल किया गया है । लिथोग्राफी-आधारित RGD nanopatterns में ६८ एनएम के पार्श्व रिक्ति के साथ β-प्रकार Ti-40Nb मिश्र धातु गैर के विभेदित phenotype को बनाए रखने के लिए मदद स्टेम सेल12, जबकि RGD nanospacings के बीच ९५ और १५० एनएम के भेदभाव को बढ़ाने mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) की ओर adipogenic/osteogenic13,14,15 और chondrogenic फाटे16. इसके अलावा, स्व-कोडांतरण अणुओं संकेत घटकों के साथ संशोधित संकेतात्मक cues के नेनो वास्तु विनियमन17प्रदान करके सीधे सेल आसंजन और भेदभाव को दिखाया गया है । इस संबंध में, सेल के साथ dendrimers के जमाव-बातचीत moieties उनके बाहरी क्षेत्र में18,19,20 सतहों पर सेल आसंजन21,22अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, आकृति विज्ञान23,24, और माइग्रेशन ईवेंट्स25,26. फिर भी, इन अध्ययनों में सतह लक्षण वर्णन की कमी यह मुश्किल dendrimer सतह विंयास और सेल प्रतिक्रिया के बीच किसी भी संबंध स्थापित करने के लिए बनाता है ।

Dendrimer nanopatterns तरल की तरह आदेश और परिभाषित रिक्ति के साथ प्राप्त किया जा सकता है जब dendrimers कम ईओण ताकत के साथ समाधान से adsorb सतहों का आरोप लगाया । 27 इस गुण के आधार पर, यहां हम कम-चार्ज किए गए सतहों पर RGD-कार्यात्मक dendrimers के बड़े पैमाने पर असमान nanopatterns प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते है जो स्थानीय RGD सतह घनत्व के नेनो नियंत्रण की अनुमति देते हैं । जल संपर्क कोण (सीए), एक्स-रे photoelectron स्पेक्ट्रोस्कोपी (XPS) और स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी तकनीक (STM और AFM nanopatterns) बताते हैं कि स्थानीय ligand घनत्व समाधान में प्रारंभिक dendrimer एकाग्रता को संशोधित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । स्थानीय RGD सतह घनत्व AFM छवियों से ंयूनतम कण दूरी की संभावना समोच्च नक्शे से मात्रा है और फिर सेल प्रयोगों के साथ संबंधित । अंय nanopatterning तकनीक के साथ तुलना में4, dendrimer-आधारित nanopatterning सीधा है और आसानी से बड़े सतह क्षेत्रों के लिए बढ़ाया जा सकता है, इस प्रकार सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के साथ पूरी तरह से संगत जा रहा है । Nanopatterns सेल आसंजन28 पर स्थानीय RGD सतह घनत्व के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए और वयस्क मानव MSCs के chondrogenic प्रेरण पर29के रूप में इस्तेमाल किया जाता है । हमारे परिणाम बताते है कि RGD dendrimer-आधारित nanopatterns सेल विकास को बनाए रखने और सेल आसंजन उच्च स्थानीय RGD सतह घनत्व द्वारा प्रबलित है । विभेदक प्रयोगों में, कोशिकाओं के मध्यवर्ती चिपकने के लिए MSC संघनित्र और जल्दी chondrogenic भेदभाव इष्ट । कारण आसानी से जो dendrimer परिधीय समूहों संशोधित किया जा सकता है के लिए, विधि यहां वर्णित अंय ECM लाइगैंडों कि कोशिकाओं पर एकाग्रता पर निर्भर प्रभाव डालती करने के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सब्सट्रेट तैयारी

  1. एनीलिंग १.४ x १.१ cm Au (111) मीका सब्सट्रेट पर ।
    1. प्लेस Au (111) एक गिलास पर सब्सट्रेट-सिरेमिक hob और यह एक ब्यूटेन लौ के साथ एनएन 3 min. सब्सट्रेट एक आर्गन वातावरण के तहत शांत करने के लिए अनुमति दें । प्रत्येक Au (111) सब्सट्रेट के लिए इस कदम को दोहराएँ ।
      नोट: Au (111) सब्सट्रेट एनीलिंग के बाद तुरंत इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  2. पाली (एल लैक्टिक एसिड) (PLLA) की तैयारी-लेपित कांच सब्सट्रेटs ।
    1. कांच की स्लाइड्स को काटें और धो लें ।
      1. एक हीरे टिप कटर के साथ १.२५ cm x १.२५ cm के 18 स्लाइड में माइक्रोस्कोप स्लाइड में कटौती । प्रत्येक स्लाइड के निचले हिस्से पर एक छोटा इंडेंटेशन करें, ताकि ऊपरी और निचली भुजाओं को बाद में प्रतिष्ठित किया जा सके.
      2. ९६% इथेनॉल के बाद पानी के साथ अच्छी तरह से स्लाइड धो लें । उंहें हवा सूखी अनुमति देते हैं ।
    2. 2% PLLA समाधान तैयार करें ।
      1. जोड़ें २०० मिलीग्राम PLLA के लिए 10 मिलीलीटर 1, 4-dioxane एक दबाव ट्यूब में । एक हलचल बार जोड़ें और कसकर ट्यूब बंद ।
      2. दबाव ट्यूब एक गर्म थाली पर एक ग्लिसरीन स्नान में ६० ° c पर 24 घंटे के लिए कोमल सरगर्मी के तहत प्लेस, और फिर एक 15 मिलीलीटर कांच की शीशी के लिए समाधान स्थानांतरण ।
    3. PLLA समाधान के साथ कांच स्लाइड कोटिंग ।
      1. ग्लास स्लाइड्स और शीशी को PLLA सॉल्यूशन के साथ एक साफ गरम प्लेट पर ६० डिग्री सेल्सियस पर रखें । ऊपर की ओर का सामना करना पड़ स्लाइड जगह सुनिश्चित करें और उन्हें आवश्यक तापमान तक पहुँचने के लिए न्यूनतम 10 मिनट के लिए रहने के लिए अनुमति देते हैं ।
      2. स्पिन कोट तैयार करें और तालिका 1में निर्दिष्ट प्रोग्राम सेट करें ।
      3. स्लाइड में से एक प्लेस स्पिन कोट पर चेहरा, एक वैक्यूम प्रणाली का उपयोग कर । एक पाश्चर पिपेट के साथ, स्लाइड करने के लिए PLLA समाधान की ०.२५ मिलीलीटर लागू करें, सुनिश्चित करें कि पूरी सतह को कवर किया जाता है । कोटिंग प्रोग्राम चलाएँ । प्रत्येक स्लाइड के लिए इस चरण को दोहराएं ।

2. Dendrimer Nanopatterning

  1. RGD-कार्यात्मक Dendrimer की तैयारी (RGD-Cys-D1) 28 समाधान ।
    1. भंग 5 dendrimer के ६.४९४ मिलीलीटर में पानी की मिलीग्राम । यह है समाधान A.
      नोट: तैयारी के 6 महीने के भीतर dendrimer शेयर समाधान का उपयोग करें ।
    2. Sonicate समाधान के लिए एक 10 मिनट और तैयार समाधान बी और सी के बाद तालिका 2
    3. 10 मिनट के लिए Sonicate समाधान C और समाधान तैयार करें D, E और F निंन तालिका 2
    4. स्टोर समाधान बी, सी, डी, ई और एफ 4 में उपयोग तक ° c । समाधान A को बाद में उपयोग के लिए-20 ° c पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. Nanopatterning RGD-Cys-D1 Dendrimers के सब्सट्रेट्स पर
    1. एक ऊतक संस्कृति हुड में, उंहें 13 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ radiating द्वारा सब्सट्रेट बंध्याकरण ।
      नोट: यह कदम केवल आवश्यक है जब nanopatterned सब्सट्रेट सेल संस्कृति सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए जा रहे हैं. इस मामले में, निंनलिखित चरणों के लिए बाँझ शर्तों (ऊतक संस्कृति हूड, बाँझ सामग्री, समाधान और तकनीक) को बनाए रखने ।
    2. प्रत्येक सब्सट्रेट एक थाली के कुओं में चेहरा, उन्हें चिमटी से ध्यान से निपटने प्लेस.
    3. Sonicate समाधान बी, सी, डी, ई और एफ के लिए 10 मिनट ।
    4. पास RGD-Cys-D1 dendrimer समाधान एक ०.२२-µm व्यास के माध्यम से फिल्टर एक सिरिंज का उपयोग कर कुओं में सीधे शामिल सब्सट्रेट (2 mL/ प्रति dendrimer एकाग्रता से कम तीन प्रतिकृतियां अनुशंसित हैं । बंद करो और प्लेट सील और यह कमरे के तापमान पर छोड़ (आरटी) 16 के लिए एच ।
    5. समाधान निकालें और छोड़ें । बाँझ पानी और सूखे के साथ सब्सट्रेट धो लें । 4 डिग्री सेल्सियस पर सब्सट्रेट्स स्टोर.
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।

3. नियंत्रण सब्सट्रेट की तैयारी

नोट: सभी कदम एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में प्रदर्शन किया गया, और केवल बाँझ सामग्री, समाधान और तकनीक का इस्तेमाल किया गया. न्यूनतम, छह नियंत्रण सब्सट्रेट का उपयोग किया गया (तीन प्रतिकृतियों सकारात्मक नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण की तीन प्रतिकृतियों).

  1. एक ऊतक संस्कृति हुड में, उंहें 13 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ radiating द्वारा सब्सट्रेट बंध्याकरण ।
  2. Fibroblast आसंजन प्रयोग के लिए नियंत्रण सब्सट्रेट ।
    1. लौ-annealed Au का प्रयोग करें (111) के रूप में नकारात्मक नियंत्रण सब्सट्रेट । सोने की एक प्रसिद्ध प्रोटीन विकार प्रभाव है कि विरोधी कोशिका चिपकने वाला गुण28प्रदान किया है । Sonicate सभी समाधान और फ़िल्टर सब्सट्रेट मशीन के लिए पहले ।
    2. धनात्मक नियंत्रणों के लिए, ज्वाला विसर्जित-annealed Au (111) RGD के एक समाधान में सब्सट्रेट-संशोधित खूंटी thiol, एसी-Gly-Arg-Gly-एएसपी-Ser-एएसपी-एनएच-ईथीलीन ग्लाइकोल मोनो-11-mercaptoundecanamide (RGD-खूंटी-एसएच)30 और triethylene ग्लाइकोल मोनो-11-mercaptoundecyl ईथर (खूंटी-एसएच) पर ९६% इथेनॉल में 16 ज के लिए आरटी में 1:100 दाढ़ अनुपात
    3. इथेनॉल में अच्छी तरह से सब्सट्रेट धोने और उन्हें आर्गन के साथ सूखी. 4 डिग्री सेल्सियस पर सब्सट्रेट्स स्टोर.
  3. Chondrogenesis के लिए नियंत्रण सब्सट्रेट ।
    1. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्राचीन PLLA सब्सट्रेट का उपयोग करें । किसी भी सतह के इलाज के बिना, PLLA जीवित कोशिकाओं के साथ गरीब सामना करना पड़ता है । 31
    2. सकारात्मक नियंत्रण के लिए, फॉस्फेट में ०.१ मिलीग्राम/एमएल fibronectin की 5 मिलीलीटर तैयार खारा (पंजाब) और 1 एच में आरटी के लिए fibronectin समाधान के १.६ मिलीलीटर के साथ प्रत्येक PLLA सब्सट्रेट मशीन ।
    3. fibronectin समाधान निकालें और छोड़ें, और पंजाबियों के साथ सब्सट्रेट धो लें । 4 डिग्री सेल्सियस पर सब्सट्रेट्स स्टोर.

4. भूतल लक्षण वर्णन

  1. AFM इमेजिंग
    1. एक किसी न किसी विश्लेषण के लिए PLLA सब्सट्रेट के AFM इमेजिंग प्रदर्शन. चूंकि dendrimers 4-5 एनएम का व्यास है, 1 एनएम के किसी न किसी मूल्यों nanopatterns के उचित दृश्य के लिए प्राप्त किया जाना चाहिए । इसके अलावा, nanopatterns के AFM इमेजिंग प्रदर्शन । दोनों ही मामलों में, हवा में दोहन मोड में AFM प्रदर्शन करते हैं ।
    2. एक स्प्रिंग स्थिरांक k = ४० N/m और एक गुंजयमान आवृत्ति ν = ३०० kHz के साथ एक सिलिकॉन ब्रैकट का चयन करें और यह AFM उपकरण पर माउंट ।
    3. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोप के मंच पर नमूना माउंट । सेट-अप उपकरण, ट्यूनिंग और इमेजिंग विनिर्देशों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । निर्माता की पुस्तिका से परामर्श करें ।
    4. संपर्क जब तक माइक्रोस्कोप की नोक के साथ नमूना दृष्टिकोण ।
    5. किसी न किसी विश्लेषण के लिए छवि PLLA करने के लिए, तीन स्वतंत्र सब्सट्रेट से सब्सट्रेट प्रति 20x20 µm के कम से कम चार प्रतिनिधि क्षेत्रों का चयन करें. छवि dendrimer nanopatterns करने के लिए, 5 × 5 µm प्रति तीन स्वतंत्र सब्सट्रेट से हालत (समाधान में प्रारंभिक dendrimer एकाग्रता) से कम तीन प्रतिनिधि छवियों का चयन करें । इमेजिंग करते समय dendrimer लेयर को क्षति से बचाने के लिए, कम से कम बल रखने के लिए सेट पॉइंट को समायोजित करें ।
      नोट: इमेजिंग क्षेत्र का चुनाव भी piezoelectric स्कैनर की कार्यशील सीमा पर निर्भर करता है । इस संबंध में यंत्र मैनुअल से परामर्श करें ।
    6. AFM तंत्र के निर्माता के मालिकाना सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बहुपद leveling कार्यों के लिए प्रत्येक स्कैन लाइन फिटिंग द्वारा AFM ऊंचाई छवियों प्रक्रिया, और सतह किसी न किसी की गणना करने के लिए PLLA से उन का विश्लेषण. रूट-माध्य वर्ग (RMS) विश्लेषण एक उपयुक्त विकल्प प्रदान कर सकता है ।
  2. स्थानीय RGD सतह घनत्व माप ।
    1. सतह पर dendrimers का चयन करने के लिए संसाधित AFM ऊँचाई छवियों की छवि थ्रेशोल्ड प्राप्त करें ।
    2. कण एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पदों का निर्धारण और उंहें का उपयोग करने के लिए ंयूनतम कण दूरी (डीमिन) प्राप्त करते हैं ।
    3. dminके लिए संभाव्यता समोच्च मानचित्र प्राप्त करने के लिए dmin मान को संबंधित कण पदों के लिए z में प्लॉट करें । उच्चतम स्थानीय RGD सतह घनत्व (dंयूनतम < ७० एनएम) के क्षेत्रों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए प्लॉट का रंग स्केल समायोजित करें ।
    4. एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उच्चतम स्थानीय RGD सतह घनत्व के साथ क्षेत्रों के क्षेत्र को बढ़ाता है । गणना में dendrimer समुच्चय के क्षेत्रों को शामिल करें ।
  3. STM इमेजिंग ।
    नोट: STM इमेजिंग केवल प्रवाहकीय Au (111) सब्सट्रेट्स पर nanopatterns के लिए किया जा सकता है । माप हवा में किया जाता है ।
    1. STM उपकरण के नमूने धारक में nanopatterned सब्सट्रेट रखें । एक परीक्षक के साथ नमूना और धारक के बीच विद्युत कनेक्शन की जांच करें ।
    2. चयनित जांच सामग्री (यानीकी एक टिप खोदना Pt ०.८: Ir ०.२) एक व्यास है कि STM उपकरण के सिर पर उचित फिटिंग सुनिश्चित करता है के साथ । नक़्क़ाशी या तो मैनुअल काटने या विद्युत नक़्क़ाशी द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है । ३२
      नोट: विद्युत नक़्क़ाशी प्रदान करता है और अधिक सममित युक्तियां ।
    3. STM उपकरण के सिर में टिप माउंट और नमूना कनेक्ट ।
    4. प्रतिक्रिया चैनल में "वर्तमान" सेट (माप के इस प्रकार में, वर्तमान प्रतिक्रिया ट्यूनिंग द्वारा स्थिर हो जाएगा). पूर्वाग्रह वोल्टेज और वर्तमान सेट बिंदु समायोजित करें और एक अच्छी तरह से हल छवि प्राप्त करने के लिए स्कैन आकार एक बार टिप लगे हुए है ।
      नोट: इमेजिंग क्षेत्र का चुनाव भी piezoelectric स्कैनर की कार्यशील सीमा पर निर्भर करता है । इस संबंध में यंत्र मैनुअल से परामर्श करें ।
    5. STM तंत्र के निर्माता के स्वामित्व सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बहुपद leveling कार्यों के लिए प्रत्येक स्कैन लाइन फिटिंग द्वारा STM स्थलाकृतिक छवियों की प्रक्रिया ।
  4. CA माप ।
    1. nanopatterned सब्सट्रेटs पर डंठल-ड्रॉप विधि द्वारा तीन अलग स्थिति (समाधान में प्रारंभिक dendrimer एकाग्रता) एक ऑप्टिकल CA प्रणाली के साथ हालत प्रति तीन स्वतंत्र सब्सट्रेट पर के लिए उपाय सीए ।
    2. microsyringe पानी के साथ भरें और सीए सॉफ्टवेयर में पैरामीटर सेट के लिए 1 µ एल की बूंदों का उत्पादन
    3. नमूना मंच पर रखें ताकि नमूने की सतह इमेजिंग के लिए कंप्यूटर पर स्पष्ट रूप से दिखाई देता है ।
    4. micromanipulator के साथ सिरिंज हटो जब तक यह सतह के करीब हो जाता है और सतह पर छोड़ तिरस्कृत । तुरंत छोटी बूंद स्थिरीकरण के बाद छवि रिकॉर्ड ।
      नोट: CA माप में, यह बहुत महत्वपूर्ण है नमी को नियंत्रित करने के क्रम में प्रतिलिपि परिणाम प्राप्त करने के लिए ।
    5. सीए तंत्र के निर्माता के मालिकाना सॉफ्टवेयर के साथ मापा कैस का विश्लेषण करें । फिटिंग विधि उपयोगकर्ता आवश्यकताओं के लिए समायोजित किया जा सकता है । एलिप्टिक फिटिंग विधि एक विकल्प हो सकता है ।

5. सेल संस्कृति

नोट: सभी कदम एक ऊतक संस्कृति हुड में प्रदर्शन किया, और केवल बाँझ सामग्री, समाधान और तकनीक का इस्तेमाल किया गया ।

  1. Fibroblast आसंजन प्रयोग ।
    1. संस्कृति NIH 3T3 माउस भ्रूण fibroblasts प्रारंभिक मार्ग से (< 10) पर ३७ ° c और ४.६% सह2 उच्च ग्लूकोज के साथ पूरक के साथ बेसल मध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% L-glutamine, 1% पेनिसिलिन-streptomycin और 1% सोडियम पाइरूवेट (विकास माध्यम). एक कुल ५००,००० कोशिकाओं की कुप्पी प्रति 10 मिलीलीटर में वृद्धि मध्यम के लिए T75 कुप्पी की सिफारिश कर रहे हैं ।
    2. एक 10 मिलीलीटर पिपेट के साथ पुराने मध्यम निकालें हर 2 दिन और हौसले से तैयार विकास मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित ।
    3. संस्कृति कोशिकाओं के विकास के माध्यम में जब तक वे लगभग ८०% संगम तक पहुँचने, तो मध्यम निकालें और कुप्पी प्रति trypsin की 5 मिलीलीटर जोड़ें । कुप्पी के नीचे से उचित कोशिका टुकड़ी सुनिश्चित करने के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ संपर्क में trypsin समाधान बनाए रखें ।
    4. कुप्पी प्रति विकास मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक केंद्रापसारक ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा । 5 मिनट के लिए ४७० x g पर कक्षों को supernatant निकालें और वृद्धि मध्यम के 10 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड । एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की एकाग्रता का निर्धारण ।
    5. अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति (गैर अनुयाई) के लिए इलाज नहीं प्लेटों के लिए सब्सट्रेट स्थानांतरण ।
    6. बीज वृद्धि मध्यम में ४,००० कोशिकाओं/cm2 के घनत्व पर सब्सट्रेट्स पर कोशिकाओं को ३७ डिग्री सेल्सियस और 10% सह2 वातावरण में ४.५ एच के लिए उन्हें मशीन ।
  2. Chondrogenic प्रेरणे MSCs ।
    1. प्रारंभिक मार्ग से संस्कृति मानव MSCs (< 5) ३७ डिग्री सेल्सियस पर और एमएससी विकास माध्यम में ४.६% कं2 वायुमंडल । एक कुल ५००,००० कोशिकाओं की कुप्पी प्रति 10 मिलीलीटर में वृद्धि मध्यम के लिए T75 कुप्पी की सिफारिश कर रहे हैं ।
    2. हर 3 दिन में मध् यम बदलें (जैसा कि 5.1.2 में बताया गया है).
    3. Trypsinize कोशिकाओं से पहले ८०% संगम तक पहुंच गया है, और केंद्रापसारक और उंहें एमएससी विकास के माध्यम में reसस्पैंड (जैसा कि 5.1.3 में वर्णित है) । एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की एकाग्रता का निर्धारण ।
    4. कोशिकाओं को फिर से केंद्रापसारक और उंहें chondrogenesis-उत्प्रेरण मध्यम के 10 मिलीलीटर में reसस्पेंड ।
    5. प्लेटों से नए अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति (गैर अनुयाई) के लिए इलाज नहीं प्लेटों के लिए सब्सट्रेट स्थानांतरण । बीज ३,००० कोशिकाओं के घनत्व पर सब्सट्रेट्स पर कोशिकाओं/
    6. chondrogenic मीडियम को हर 3 दिन में बदलें (जैसा कि 5.1.2 में बताया गया है).

6. कक्ष निर्धारण और Immunostaining

नोट: निम्न चरणों का पालन गैर-बाँझ स्थितियों में किया जा सकता है ।

  1. मीडिया निकालें और पंजाबियों के साथ धीरे से कोशिकाओं को धो लें । RT पर 20 मिनट के लिए एक 10% formalin समाधान जोड़कर उन्हें ठीक करें ।
  2. formalin को हटा दें और पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  3. पंजाब में अमोनियम क्लोराइड (NH4Cl) का ५० mM सॉल्यूशन जोड़कर फ्री एल्डिहाइड ग्रुप्स को ब्लॉक कर दीजिये । आरटी में 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को छोड़ दें NH4Cl समाधान निकालें और पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में नमूनों की दुकान ।
  4. पंजाबियों को हटाएं और permeabilize में saponin का ०.१% समाधान जोड़कर कोशिकाओं को हटाने (पंजाब में 1% एल्ब्युमिन) पर 10 मिनट के लिए RT. पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें और नमूनों को एक नए चहेतों की थाली में ट्रांसफर करें ।
  5. आर टी पर 1 एच के लिए अवरुद्ध समाधान (तालिका 3) में प्राथमिक एंटीबॉडी का एक समाधान के साथ कोशिकाओं को मशीन. फिर, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  6. अवरुद्ध समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी (तालिका 3) के लिए 1 ज पर आरटी के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: प्रकाश जोखिम से बचें ।
  7. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान निकालें और पंजाबियों और सूखे के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । पंजाब में नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर ।
  8. माइक्रोस्कोप अवलोकन के लिए बढ़ते नमूना: एक हीरे टिप कटर का उपयोग कर, १.२५ सेमी x १.२५ सेमी में coverslips कटौती । नमूनों पर सूक्ष्म बढ़ते माध्यम के ५० µ एल लागू करें और उन्हें धीरे से काट coverslips के साथ कवर.
  9. एक सुविधाजनक प्राप्तकर्ता के लिए नमूने स्थानांतरण, यह एल्यूमीनियम पंनी और दुकान के साथ अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर अवलोकन तक कवर ।

7. सेल इमेजिंग और डेटा विश्लेषण

नोट: अपारदर्शी Au (111) और मोटी microslide-आधारित सब्सट्रेट के लिए, एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

  1. Fibroblast आसंजन प्रयोग ।
    1. एक epifluorescence एक डिजिटल कैमरा और कम (यानी 10x) और उच्च (यानी 40X) आवर्धन उद्देश्यों से सुसज्जित माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें । हवा में माप प्रदर्शन ।
    2. एक पराबैंगनी उत्तेजना, longpass उत्सर्जन फिल्टर Hoechst/DAPI दाग कल्पना का उपयोग कर 10x उद्देश्य के साथ मंच और छवि सेल नाभिक पर नमूना प्लेस ।
    3. 40X उद्देश्य के साथ छवि सेल cytoskeleton और फोकल आसंजन (फास), इसी एंटीबॉडी fluorochrome विनिर्देशों से मेल खाता है कि माइक्रोस्कोप फिल्टर का चयन.
    4. एफए ठहराव के लिए, एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए छवियों 8 बिट फ़ाइलों को परिवर्तित । एक थ्रेशोल्ड सेट करके पृष्ठभूमि को निकालें और बाइनरी में छवियों को परिवर्तित करें । प्रति नमूना कम से कम 30 छवियों की गणना और गणना के लिए 1 µm2 से फास पर विचार करें ।
  2. Chondrogenic प्रेरणे MSCs ।
    1. छवि सेल chondrogenic प्रेरण (< 5 दिन) के आरंभिक चरणों में एक डिजिटल कैमरा और एक कम (यानी 10x) आवर्धन उद्देश्य से सुसज्जित एक ईमानदार epifluorescence माइक्रोस्कोप के साथ condensates । Hoechst/DAPI दाग की कल्पना करने के लिए पराबैंगनी उत्तेजना और longpass उत्सर्जन फिल्टर का प्रयोग करें ।
    2. घनीभूत क्षेत्र को मापने के लिए, एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग, 8-bit फ़ाइलों के लिए छवियों को बदलने, पृष्ठभूमि को हटाने और कुल समोच्च पर प्रकाश डाला गया है कि एक सीमा का चयन करें । कणों के क्षेत्र की गणना ।
    3. छवि immunostained के लिए नमूने, cytoskeleton actin फाइबर, और उपास्थि विशिष्ट कोलेजन प्रकार द्वितीय अल्फा 1 (COL2A1) उच्च आवर्धन पर एक ईमानदार फोकल माइक्रोस्कोप के साथ (यानी 40-60X). एक प्रतिनिधि अंतराल (यानी 0.5-1 µm) पर वर्गों लीजिए ।
    4. स्टैक को संसाधित करने के लिए, एक छवि संसाधन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । छवियों को 8-बिट फ़ाइलों में कनवर्ट करें, पृष्ठभूमि निकालें, और थ्रेशोल्ड सेट करके उंहें बाइनरी बनाएं । तीन स्वतंत्र नमूनों की शर्त प्रति तीन सेल condensates की एक ंयूनतम समझो ।
    5. सेल condensates के बेसल क्षेत्र से एफए प्रोटीन दाग क्षेत्रों को बढ़ाता है और उन्हें छवि में सेल नाभिक की संख्या से विभाजित क्षेत्र के इसी प्रतिशत के रूप में व्यक्त करते हैं ।
    6. COL2A1 धुंधला, फोकल z-अनुमानों का उपयोग करें और अनुमानित क्षेत्र (नमूना प्रति अधिकतम COL2A1 क्षेत्र) की राशि को मापने के लिए । संगत घनीभूत के क्षेत्र के विरुद्ध प्राप्त क्षेत्र मान को सामान्य करना.

8. मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT-पीसीआर) विश्लेषण

नोट: RNase संदूषण को रोकने के लिए, डिस्पोजेबल का उपयोग करें, बाँझ प्लास्टिक के बर्तन और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनते हैं, जबकि रिएजेंट और आरएनए हैंडलिंग. हमेशा उचित सूक्ष्मजीवविज्ञानी रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करें और काम सतहों और गैर डिस्पोजेबल आइटम जैसे केंद्रापसारक और पिपेट से RNase संदूषण को दूर करने के लिए एक उचित प्रदूषित समाधान का उपयोग करें ।

  1. कुल शाही सेना को अलग और एक आरएनए विघटनकारी में यह चूर । DNase के साथ आरएनए नमूनों का इलाज और उन्हें एक सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग कर सीडीएनए में परिवर्तित.
  2. आचरण qRT-पीसीआर प्रतिलेखन कारक के लिए प्राइमरों का उपयोग कर SOX9। बीटा-2-microglobulin (B2M) और राइबोसोमल प्रोटीन L13a (RPL13a) गृह व्यवस्था जीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. अभिव्यक्ति के स्तर की गणना और उन्हें नकारात्मक नियंत्रण (PLLA) के खिलाफ सामान्य.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम सतह चिपचिपाहट नेनो (चित्रा 1) पर संबोधित किया जा करने की अनुमति देता है कि एक nanopatterning विधि प्रस्तुत करते हैं । RGD-Cys-D1 की रासायनिक संरचना को चित्र 1aमें दिखाया गया है । Dendrimers विद्युत प्रवाहकीय Au (111) उच्च संकल्प STM लक्षण वर्णन के लिए सतहों पर नमूनों थे । समाधान में कम dendrimer सांद्रता (10-5% w/w) व्यास में 4-5 एनएम के पृथक dendrimers प्रदान की (आंकड़ा 1b), जबकि उच्च dendrimer समुच्चय (चित्रा 1C) अधिक सांद्रता पर गठित । AFM सतह लक्षण वर्णन (चित्र 1 डी-जी, ऊपरी पंक्ति) से पता चला कि RGD की सतह वितरण-Cys-D1 dendrimers समाधान में प्रारंभिक dendrimer एकाग्रता का एक समारोह के रूप में समायोजित किया जा सकता है । dminके लिए प्रायिकता समोच्च मानचित्र पर, इस परिणाम में विभिन्न स्थानीय RGD नेनो घनत्व सतह पर (आंकड़े 1 d-G, निचली पंक्ति).

कोशिका संस्कृति प्रयोगों में, कोशिका-झिल्ली रिसेप्टर integrins व्यास में लगभग 10 एनएम के dendrimers परिधि पर RGD अनुक्रम को मांयता दी । हालांकि इस अनुक्रम की आठ प्रतियां प्रति dendrimer प्रदान की गई, केवल एक dendrimer इसके आकार के कारण integrin प्रति बातचीत की (4-5 एनएम STM द्वारा मापा; चित्र 1b) । यही है, प्रत्येक dendrimer integrin बंधन के लिए एक साइट प्रदान की है, जिससे dendrimer वितरण से एक सीधा संबंध की अनुमति (के रूप में AFM छवियों में देखा) और RGD सेल आसंजन के लिए उपलब्ध वितरण । इसके अलावा, कोई महत्वपूर्ण बदलाव CA अलग nanopattern विंयास कि सेल आसंजन29प्रभावित हो सकता है के लिए प्राप्त मूल्यों में पाया गया । इन विशेषताओं के माध्यम से जो मॉडुलन और अध्ययन सेल व्यवहार उपयुक्त सब्सट्रेट सतहों पर dendrimer nanopatterns बनाते हैं ।

nanopatterned Au के लिए सेल आसंजन (111) संस्कृति के पहले 24 एच के भीतर fibroblasts के साथ परीक्षण किया गया था (चित्रा 2a) और nanopatterned PLLA पर MSCs के साथ (चित्रा बी) । दोनों ही मामलों में, एफए प्रोटीन paxillin (शांति) के लिए दाग क्षेत्र का प्रतिशत dendrimer एकाग्रता के साथ उत्तरोत्तर वृद्धि हुई, के रूप में स्थानीय RGD सतह घनत्व किया था (nanopatterned क्षेत्र के प्रतिशत के साथ ७०-एनएम दहलीज नीचे डीमिनट कुशल सेल आसंजन के लिए; तालिका 4) । 10-2% w/w और धनात्मक नियंत्रणों के प्रारंभिक dendrimer एकाग्रता के लिए, प्रति कक्ष पैक्स के लिए दाग वाले क्षेत्र का प्रतिशत कम हुआ और dmin < ७० एनएम के साथ nanopatterned क्षेत्र के प्रतिशत के साथ सहसंबंध खो गया ।

dंयूनतम < 70 एनएम (चित्रा 1डी-जी निचली पंक्ति और तालिका 4) द्वारा कब्जाित सतह क्षेत्र का प्रतिशत nanopatterns के लिए स्थानीय RGD सतह घनत्व का एक अच्छा संकेत है जो 10-5% डब्ल्यू/ प्रारंभिक dendrimer dendrimer एकत्रीकरण के कारण 10-2% w/wतक उन लोगों की एकाग्रता नहीं । एकत्रीकरण ligand वितरण के मामले में अत्यधिक विषम नमूनों का उत्पादन किया, ७०-एनएम दहलीज के नीचे डीन्यूनतम मूल्यों के साथ सतह का केवल एक छोटा सा प्रतिशत के साथ (चित्रा 3 डी निचली पंक्ति और तालिका 4). XPS परिणाम से पता चला है कि इन सतहों एक वैश्विक RGD घनत्व वर्तमान 10-5% डब्ल्यू/nanopatterns28व्युत्पंन के लिए तुलनीय । इस अवलोकन से यह संकेत मिलता है कि dendrimer समुच्चय वाले क्षेत्रों में अधिकतम RGD घनत्व प्राप्त किया गया था और यह कि dmin < 70 एनएम द्वारा कब्जाित सतह क्षेत्र का प्रतिशत स्थानीय RGD सतह घनत्व का प्रतिनिधि नहीं है यह मामला ।

अवलोकन है कि सकारात्मक नियंत्रण (सजातीय कोटिंग्स) अधिकतम स्थानीय RGD सतह घनत्व के साथ सेल आसंजन में अपेक्षित वृद्धि नहीं दिखा था एक steric बाधा प्रभाव के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि, इसी सजातीय की तुलना में आमतौर पर सेल संस्कृति में प्रयुक्त सतहों, RGD nanopatterns सेल आसंजन को बनाए रखने और अधिक कुशलता से । यह खोज इस प्रकार स्थानीय ligand घनत्व की प्रासंगिकता पर प्रकाश डाला गया ।

morphogenesis में आसपास के वातावरण के साथ बातचीत पहले सेल भेदभाव की घटनाओं को ट्रिगर और उंहें अंतिम जटिल ऊतक संरचनाओं की स्थापना तक प्रचार । सेल आसंजन और भेदभाव पर dendrimer nanopatterns के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हम एक मॉडल के रूप में MSCs के chondrogenic प्रेरण इस्तेमाल किया । chondrogenesis के दौरान, वहाँ सक्रिय मैट्रिक्स remodeling है, जो उपास्थि गठन के विभिन्न चरणों के माध्यम से कोशिकाओं के निर्देशन में एक शिक्षाप्रद भूमिका निभाता है.

nanopatterns (चित्रा 3) पर MSCs chondrogenesis । Chondrogenic भेदभाव एक सेल संघनित्र कदम है, जो घने condensates, सेल के लिए सेल संचार की स्थापना, और कक्ष आकृति विज्ञान३३में सहवर्ती परिवर्तन के रूप में सेल भर्ती शामिल है के साथ शुरू होता है । चित्रा 3 ए पता चलता है कि कोशिका संघनित्र सभी सब्सट्रेट में हुई और कि condensates dendrimer सांद्रता बढ़ाने के साथ क्षेत्र में वृद्धि हुई २.५ x 10-8% डब्ल्यू/ घनीभूत क्षेत्र तो एक dendrimer के लिए फिर से कमी आई एकाग्रता 10-2% डब्ल्यू/डब्ल्यू और सकारात्मक नियंत्रण के लिए । chondrogenesis में सेल संघनित्र कदम सक्रिय सेल आंदोलन के माध्यम से होता है बजाय सेल प्रसार३४में वृद्धि के माध्यम से । इस सेल आंदोलन सब्सट्रेट के साथ लचीला आसंजन द्वारा इष्ट है: स्थिर आसंजन कोशिका शरीर को स्थानांतरित करने के लिए कर्षण बलों की अनुमति के लिए गठित किया जाना चाहिए, और एक ही समय में, इन आसंजन के दौरान सब्सट्रेट से सेल रिलीज की अनुमति देने के लिए पर्याप्त कमजोर होना चाहिए आंदोलन. सेल संघनित्र 2.5 x10 करने के लिए स्थानीय RGD सतह घनत्व में वृद्धि से इष्ट है-8% w/-व्युत्पंन nanopatterns, सेल आसंजन और सेल आंदोलन के बीच एक अच्छा संतुलन के साथ । 10-2 और सकारात्मक नियंत्रण के लिए, स्थानीय RDG सतह घनत्व बहुत अधिक था, जिससे संघनित्र घटना बिगड़ रही है ।

Chondrogenic prechondrogenic condensates से अंतर आय: condensates में कोशिकाओं को और अधिक गोल हो जाते हैं और इस तरह के ECM प्रोटीन COL2A1 और प्रतिलेखन कारक SOX9३३के रूप में उपास्थि विशिष्ट मार्कर के संश्लेषण शुरू, ३४ , ३५. तदनुसार, एक मध्यवर्ती चिपचिपाहट के साथ सब्सट्रेट, सेल condensates के गठन के पक्ष में, उच्च COL2A1 धुंधला (चित्र3) और SOX9 mRNA अभिव्यक्ति के उच्च स्तर दिखाया (चित्रासी सी) ।

हमारे परिणाम chondrogenic भेदभाव के प्रारंभिक दौर के दौरान सेल सेल मैट्रिक्स बातचीत के प्रभाव पर प्रकाश डाला । इस तरह की बातचीत आसानी से dendrimer आधारित nanopatterns के माध्यम से संबोधित किया जा सकता है ।

कदम समय (ओं) गति (rpm) त्वरण (rpm/
1 5 ५०० ३००
2 30 ३,००० १,५००

तालिका 1: स्पिनर कार्यक्रम कदम तैयार PLLA समाधान के साथ कांच स्लाइड कोट करने के लिए इस्तेमाल किया । एक पहली homogenization कदम ३०० rpm के एक त्वरण के साथ ५०० rpm पर इस्तेमाल किया गया था/एस के लिए ३,००० rpm पर एक अंतिम चरण के बाद १,५०० rpm/एस के एक त्वरण के साथ 30 एस के लिए ।

समाधान RGD-Cys-D1 (mg/एमएल) RGD-Cys-D1 (mg) MQ पानी (µ l)
एक ०.७७ 5 ६,४९४
RGD-Cys-D1 (% w/ समाधान A (µ l)
बी 10-2 ७७९ ५,२२०
सी 10-5 ०.७८ ६,०००
हल ग (µ l)
डी 2, 5 x 10-8 १५.० ५,९८५
10-8 ६.० ५,९९४
4 x 10-9 २.४ ५,९९८

तालिका 2: RGD-Cys-D1 समाधान उपयोग की तैयारी का विवरण । RGD-Cys-D1 dendrimers के एक शेयर समाधान ०.७७ मिलीग्राम/एमएल (समाधान ए), जिसमें से समाधान बी और सी पर 10-2 और 10-5% डब्ल्यू/ सांद्रता में तैयार किया गया था की एक अंतिम एकाग्रता पर तैयार किया गया था । एक 10 के साथ समाधान सी-5% w/ RGD की एकाग्रता-Cys-D1 dendrimer समाधान डी तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, २.५ x 10-8, 10-8 और 4 x 10-9% w/w के अंतिम सांद्रता पर E और F, क्रमशः ।

नाम मात्रा (µ एल) बफ़र ब्लॉक कर रहा है (एमएल)
प्राथमिक मिश्रण खरगोश मॉब को शांति ६५ १२.८७०
माउस मॉब को COL2A1 ३२.५
माध्यमिक मिश्रण Alexa Fluor ४८८ बकरी विरोधी माउस 13 १२.९६१
Alexa Fluor ५६८ बकरी विरोधी खरगोश 13
Hoechst समाधान 13

तालिका 3: एंटीबॉडी समाधान तैयारी. प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के खिलाफ एंटीबॉडी में उत्पादित मोनोक्लोनल COL2A1 के साथ अवरुद्ध समाधान में 1:200 पतला खरगोश में उत्पादित शांति के खिलाफ निहित अवरुद्ध समाधान में 1:400 पतला । माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण कोशिका नाभिक दाग Hoechst और माध्यमिक क्रमशः माउस और खरगोश के खिलाफ बकरी में उत्पादित एंटीबॉडी (Alexa Fluor ४८८ और ५६८ fluorophores, क्रमशः के साथ लेबल) निहित ।

Figure 1
चित्र 1 : RGD-Cys-D1 dendrimer nanopatterning स्थानीय नेनो सतह घनत्व के RGD नियंत्रण के लिए । (क) RGD-Cys-D1 dendrimer संरचना कोशिका चिपकने वाला RGD पेप्टाइड की आठ प्रतियों से युक्त. प्रतिनिधि STM छवियां (पूर्वाग्रह = २०० एमवी, सेट बिंदु = ०.५ nA) की RGD-Cys-D1 nanopatterns पर Au (111) के एक प्रारंभिक जलीय समाधान से 10-8% डब्ल्यू/ (स्केल बार = 3 एनएम, बी) और इसी ऊंचाई-दूरी पर प्राप्त प्रोफ़ाइल धराशायी क्षेत्र में संकेत दिया गया (B), और (C) 10-2% w/w का dendrimer एग्रीगेट (स्केल बार = 20 एनएम) दिखा रहा है । (D-G) प्रतिनिधि AFM RGD की छवियां-Cys-D1 nanopatterns पर PLLA के इसी dendrimer जलीय समाधान से प्राप्त 10-2%, २.५ x 10-8%, 10-8% और 4 x 10-9% डब्ल्यू/, क्रमशः (स्केल बार = 1 µm) । इसी न्यूनतम कण दूरी (dmin) संभाव्यता समोच्च नक्शा प्रत्येक AFM छवि के नीचे दिखाया गया है, उच्च घनत्व RGD क्षेत्रों के साथ डार्क रेड (डीन्यूनतम < 70 एनएम) में दिखाया गया है । Dendrimers और dendrimer समुच्चय काले में स्पष्टता के लिए चित्रित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : RGD-Cys-D1 nanopatterns पर सेल आसंजन । क्षेत्र के प्रतिशत की साजिश सब्सट्रेट के साथ संपर्क में कोशिकाओं के लिए एफए प्रोटीन पैक्स प्रति के लिए दाग (बाएं अक्ष) प्रारंभिक dendrimer एकाग्रता के साथ । मान के साथ तुलना कर रहे हैं स्थानीय RGD सतह घनत्व (nanopatterns में सतह क्षेत्र का प्रतिशत ७० एनएम थ्रेशोल्ड नीचे ंयूनतम मान) (दाएँ अक्ष) के साथ १०० और 0 धनात्मक (+ नियंत्रण) और ऋणात्मक को असाइन किया गया प्रतिशत (- नियंत्रण) क्रमशः नियंत्रण । (क) संस्कृति के ४.५ ज के बाद Au (१११) पर dendrimer nanopatterns पर Fibroblast आसंजन. (ख) PLLA पर dendrimer nanopatterns पर एमएससी आसंजन chondrogenic प्रेरण के दिन 1 में मूल्यांकन किया । मानक विचलन के साथ माध्य के रूप में मान दिए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

RGD-Cys-D1 (% w/ क्षेत्र (< dmin = ७० एनएम) (%) on Au (111) क्षेत्र (< dmin = ७० एनएम) (%) on PLLA
10-2 5 ± 1 2 ± 2
10-5 ९७ ± 2
2, 5x10-8 ६५ ± 11 ९० ± 2
10-8 25 ± 16 ४५ ± 7
4x10-9 18 ± 11

तालिका 4: क्षेत्र के साथ प्रतिशत d मिन ७० एनएम RGD-Cys-D1 dendrimer के लिए प्राप्त नीचे मान Au (111) पर और PLLA सतहों पर प्रारंभिक dendrimer सांद्रता का एक समारोह के रूप में इस्तेमाल किया ।

Figure 3
चित्र 3 : RGD-Cys-D1 nanopatterns पर MSCs का Chondrogenic विभेद । PLLA प्रेरण के 5 दिनों के बाद chondrogenic पर RGD-Cys-D1 nanopatterns पर MSCs culture का (क) संघनित्र । प्रतिनिधि epifluorescence की छवियां सना हुआ सेल नाभिक (Hoechst; स्केल बार = ३०० µm; ऊपरी पंक्ति) और सेल condensates (निचली पंक्ति) के क्षेत्र की साजिश RGD-Cys-D1 nanopatterns पर विभिंन प्रारंभिक dendrimer सांद्रता से प्राप्त की । विशिष्ट chondrogenic मार्करों की अभिव्यक्ति के साथ सेल संघनित्र कदम से भेदभाव आय: (ख) COL2A1 के क्षेत्र का प्रतिशत इसी फोकल जेड से सेल घनीभूत के क्षेत्र के साथ सामान्यीकृत दाग-अनुमानों से chondrogenic प्रेरण के 5 दिनों के बाद प्राप्त की । (ग) सापेक्ष SOX9 mRNA अभिव्यक्ति (नकारात्मक नियंत्रण के विरुद्ध) chondrogenic प्रेरण के ३ दिन बाद. मान को (B) और (C)में मानक विचलन के साथ माध्य के रूप में दिया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल के विकास के दौरान कई अहम कदमों पर विचार किया जाना चाहिए । पहले जांच माइक्रोस्कोप तकनीक स्कैनिंग के साथ nanopattern लक्षण वर्णन करने के लिए संदर्भित करता है । nanopatterns कल्पना करने के लिए, सतह जहां पैटर्न का उत्पादन किया जाता है dendrimers का मतलब व्यास, जो 4 के आसपास है के नीचे किसी न किसी मूल्य होना चाहिए-5 एनएम के रूप में STM द्वारा मापा (चित्र 1b) । इसके अलावा, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि उच्च संकल्प STM इमेजिंग प्रवाहकीय सब्सट्रेट करने के लिए प्रतिबंधित है, इस मामले Au (111) में । स्लाइड के कोनों से बहुलक के किसी भी उठाने के बाद स्पिन-कोटिंग सुधारा जा सकता है के साथ संगत गोंद का उपयोग कर ।

Dendrimer nanopatterning एक प्रक्रिया है जिसके माध्यम से नेनो पर नियंत्रित स्थानीय कोशिका चिपकने प्राप्त करने के लिए । आत्म सोखना द्वारा सतह पर dendrimers की विधानसभा के आधार पर, इस तकनीक किसी भी जटिल nanopatterning उपकरण की आवश्यकता नहीं है, इस प्रकार पहले वर्णित लिथोग्राफी के साथ विषम-आधारित तरीकों३६,३७, ३८. Dendrimer nanopatterning आसानी से बड़े सतह क्षेत्रों तक पहुंचा जा सकता है और पूरी तरह से सेल संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ संगत है ।

dendrimer nanopatterning विधि यहां वर्णित अपक्षयी दवा में भविष्य अनुप्रयोगों पा सकते हैं । कोशिका चिपकने पर dendrimer nanopatterning द्वारा लागू नियंत्रण इस तकनीक को आरोपण से पहले, इस तरह की मेजबानी के ऊतकों में उनके एकीकरण की सुविधा की कंडीशनिंग के लिए उपयुक्त बनाता है । इसके अलावा, आसानी के साथ जो dendrimer परिधीय moieties संशोधित किया जा सकता है dendrimer nanopatterning अंय लाइगैंडों कि कोशिकाओं पर एकाग्रता पर निर्भर गतिविधि लागू करने के लिए उपयुक्त बनाता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

लेखक ओरिओल फ़ॉंट-बाख और अल्बर्ट जी Castaño डीमिन ठहराव में उनकी मदद के लिए स्वीकार करते हैं । उंहोंने यह भी (आईआरबी बार्सिलोना) में अनुसंधान के लिए संस्थान में उंनत डिजिटल माइक्रोस्कोपी इकाई स्वीकार करते है लेखक अपने परिसर में वीडियो रिकॉर्ड है । यह काम नेटवर्किंग जैव चिकित्सा अनुसंधान केंद्र (CIBER), स्पेन द्वारा समर्थित किया गया था । CIBER एक छठी राष्ट्रीय आर एंड डी और मैं योजना 2008-2011, Iniciativa Ingenio २०१०, ठोस कार्यक्रम, CIBER कार्रवाई, और Instituto de सैलड कार्लोस III, यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि के समर्थन के साथ द्वारा वित्त पोषित पहल है । यह काम विश्वविद्यालयों और नवाचार, विश्वविद्यालयों के विभाग के अनुसंधान के लिए आयोग द्वारा समर्थित किया गया है, और Generalitat de Catalunya (२०१४ SGR १४४२) के उद्यम । यह भी परियोजनाओं OLIGOCODES द्वारा वित्त पोषित किया गया था (सं. MAT2012-38573-C02) और CTQ2013-41339-P, स्पेनी अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा के मंत्रालय द्वारा संमानित किया, INTERREG वी के अलावा एक स्पेन-पुर्तगाल 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E) । C.R.P. अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धात्मकता अनुदान के स्पेनी मंत्रालय से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है (सं । IFI15/00151) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm  Spi Supplies 466PS-AB
Glass micro slides, plain Corning 2947-75x25
Deionized water Millipore 18MΩ cm
Ethanol 96% PanReac 131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymer Corbion 95/05 molar ratio
1,4 - dioxane Sigma-Aldrich 296309-1L
Silicone oil, high temperature Acros Organics 174665000
Spinner Laurell WS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hood Telstar Bio II Advance Class II biological safety cabinet
Filter unit Millex-GP SLGP033RB 0.22 µm
Syringe 10 mL Discardit 309110
Atomic Force microscope Veeco Instruments Dimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probes Budget Sensors Tap300AI-G Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscope Molecular Imaging PicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wire Advent PT671012 Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 software Nanotec electronica
Optical contact angle (CA) system Dataphysics
SCA20 software Dataphysics
X-ray photoelectron spectrometer Physical Electronics Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141-1MG 1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Gibco 21600-10 Powder
Mouse embryo fibroblasts ATCC ATCC CRL-1658 NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose Gibco 11960044 liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044 500 mL
L-Glutamine Invitrogen 25030 200 mM (100X)
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360039 100 mL
T75 culture flasks Nunclon 156499
Trypsin Life Technologies 25200072 0,25% EDTA
Centrifuge Hermle Labortechnik Z 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 well Falcon 351143 Non-adherent
Adipose-derived hMSCs ATCC ATCC PCS-500-011 Cell vial 1 mL
MSC basal medium ATCC ATCC PCS-500-030
MSC growth kit ATCC ATCC PCS-500-040 Low serum
Chondrocyte differentiation tool ATCC ATCC PCS-500-051
Formalin solution Sigma-Aldrich HT5011-15ML neutral buffered, 10%
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434-500G for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody Abcam ab32084 Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain  Acris Antibodies AM00212PU-N Diluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A10667 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11036 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10ML 10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mm Deltalab D102424
Fluoromount Sigma-Aldrich F4680-25ML
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse E1000 upright microscope with a CCD camera
Confocal Microscope Leica Microsystems Leica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freeware http://imgej.nih.gov/ij
MATLAB software The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software  OriginLab Coorporation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148, (3), 268-278 (2004).
  2. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5, (10), 2243-2254 (2007).
  3. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27, (5), 451-461 (2008).
  4. Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
  5. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27, (16), 3044-3063 (2006).
  6. Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5, (3), 383-388 (2004).
  7. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85, (3-4), 219-224 (2006).
  8. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92, (8), 2964-2974 (2007).
  9. Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5, (1), 72-77 (2009).
  10. Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10, (2), 686-694 (2010).
  11. Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11, (4), 1469-1476 (2011).
  12. Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
  13. Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34, (12), 2865-2874 (2013).
  14. Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9, (4), 280-286 (2013).
  15. Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15, (3), 1457-1467 (2015).
  16. Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, (12), 5197-5209 (2015).
  17. Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15, (1), 603-609 (2015).
  18. Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
  19. Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20, (4), 693-701 (2009).
  20. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23, (5), 1059-1068 (2012).
  21. Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24, (4), 938-944 (2008).
  22. Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115, (1), 96 (2013).
  23. Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107, (2), 196-205 (2009).
  24. Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73, (3), 499-507 (2013).
  25. Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113, (Pt 10), 1677-1686 (2000).
  26. Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104, (5), 428-431 (2007).
  27. Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
  28. Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7, (3), 399-409 (2014).
  29. Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. (2017).
  30. Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013, (7), 1233-1239 (2013).
  31. Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10, (1-2), 53-61 (2004).
  32. Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76, (17), 5218-5222 (2004).
  33. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87, (4), 351-371 (2009).
  34. De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8, (5), 309-334 (2000).
  35. Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102, (4), 1151-1156 (1986).
  36. Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112, (1-2), 97-107 (2004).
  37. Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
  38. Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8, (4), 541-545 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics