Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C

Biochemistry

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Summary

Descrevemos em detalhes dois protocolos de base química para cultivo de células-tronco embrionárias do mouse. Esse novo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidação mediada por Tet (vitamina C) e reprimindo a síntese de novo de 5-metilcitosina (por PD0325901) para manter o DNA hypomethylation e pluripotência das células-tronco embrionárias do mouse.

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Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

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Abstract

Células-tronco embrionárias (ES) têm o potencial de se diferenciar em qualquer uma das três camadas germinativas (ectoderma, mesoderma ou endoderme) e podem gerar muitas linhagens para medicina regenerativa. ES célula cultura em vitro tem sido objecto de preocupação generalizada. Classicamente, pilhas do rato ES são mantidas no fator inibitório de soro e leucemia (LIF)-contendo meio. No entanto, sob condições de soro/LIF, células mostram heterogeneidade na morfologia e o perfil de expressão de genes relacionados ao pluripotência e estão principalmente em um estado metaestável. Além disso, células cultivadas de ES exibem hypermethylation global, mas células de ES ingênua da massa celular interna (ICM) e as células germinativas primordiais (PGCs) estão em um estado de hypomethylation global. O estado de hypomethylated do ICM e PGCs está intimamente associado com sua pluripotência. Para melhorar os métodos de cultura de células de rato ES, recentemente foi desenvolvido um novo método baseado na utilização seletivamente combinada de dois compostos da pequeno-molécula para manter o estado de hypomethylated e pluripotentes de DNA. Aqui, apresentamos que co tratamento da vitamina C (Vc), e a PD0325901 podem apagar cerca de 90% de 5-metilcitosina (5mC) em 5 dias em pilhas do ES do rato. O conteúdo gerado 5mC é comparável em PGCs. A investigação mecanicista mostra que PD0325901 acima-regula a expressão Prdm14 para suprimir Dnmt3b (de novo DNA metiltransferase) e Dnmt3l (o cofator de Dnmt3b), reduzindo a síntese de novo de 5mC. Vc facilita a conversão de 5mC 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) catalisada principalmente por Tet1 e Tet2, indicando o envolvimento de demethylations de DNA passivas e ativas. Além disso, em condições de Vc/PD0325901, pilhas do ES do rato mostram morfologia homogênea e estado pluripotentes. Coletivamente, propomos um método de cultura química-sinergia para alcançar o DNA hypomethylation e manutenção da pluripotência em células de rato ES e romance. O pequeno-molécula dependente químico método supera as principais deficiências da cultura de soro e a promessa de porões para gerar células homogêneas de ES para novas aplicações clínicas e pesquisas.

Introduction

Pilhas do ES são originadas do ICM de um blastocisto1. As células estão em um estado de pluripotência e podem formar todas as linhagens somáticas e de células da linha germinal2. Estabelecimento de células ES fornece a oportunidade de investigar o desenvolvimento processa-se em vitro e pode gerar células de relevância médica para medicina regenerativa, com base na sua pluripotência3.

Dois grupos seminally estabeleceram as linhas de células de rato ES em 1981 e em células derivadas do embrião de rato foram cultivadas em soro fetal bovino (FBS)-contendo meio com fibroblastos embrionários de rato (MEFs) como o alimentador camada1,4 . MEFs foram inactivados mitotically e pre-foram cultivadas em pratos antes de cultivo de células ES. MEFs fornecem suporte para fixação de células de rato ES e produzir fatores de crescimento para promover a propagação e reprimir a diferenciação5, enquanto FBS oferece essenciais fatores tróficos e hormônios para proliferação celular. Estudos posteriores indicaram que LIF produzido pelas células do alimentador foi o cytokine chave para autorenovação e manutenção da pluripotência em células de rato ES, pode substituir a adição de LIF no meio de alimentador células6. Atualmente, a sustentação do rato de pilhas do ES no meio de FBS/LIF em alimentadores ainda é o método padrão adotado por muitos pesquisadores. No entanto, alguns problemas surgem com esta abordagem da cultura clássica. Em primeiro lugar, alimentador células secretam fatores excessiva e descontroladas... e podem causar contaminação patogénica7. Para evitar esta interferência, revestir a superfície dos pratos com gelatina e a adição de LIF em soro contendo médio são métodos alternativos para a manutenção de células de rato ES sem células alimentador-camada. Além disso, células de rato ES cultivadas sob condições de soro/LIF apresentam heterogeneidade morfológica em populações de células e mesmo no nível de expressão de fatores relacionados a pluripotência8. Estudos recentes sugerem que, em condições de soro/LIF, os fatores de transcrição do núcleo pluripotência relacionados (incluindo OCT4, SOX2 e Nanog) podem sustentar a pluripotência através de LIF e WNT sinalização; no entanto, nomeadamente, eles também ativar um sinal de (FGF) do fator de crescimento fibroblástico para desencadear a diferenciação8. Devido à ação dupla ambivalente os núcleo de factores de transcrição, o rato ES células cultivadas no soro apresentam heterogeneidade, consistindo de duas populações intercambiáveis, um semelhante ao ICM e outro parecido com o epiblasto aprontada estado8. Além disso, as células de rato ES no soro muitas vezes apresentam hypermethylation global9, Considerando que ICM e PGCs estão em um estado de hypomethylated global, que está intimamente ligado com sua pluripotência9,10.

Há uma demanda considerável para desenvolver novos métodos de cultivo de células de rato ES. Foram estabelecidos vários protocolos melhorados desde 200311 mas continua a haver algumas limitações e deficiências7. Desde 2008, a utilização combinada de dois inibidores da quinase da pequeno-molécula, PD0325901 (inibidor de quinase da proteína mitogen-ativado (MAPK) / extracelular-sinal-regulada quinase (ERK) (MEK)) e CHIR99021 (inibidor de glicogénio sintase quinase 3 (GSK3)), em N2B27 médio com LIF e sem soro, abriu novas perspectivas para células de rato cultivo ES12. Este novo meio definido é caracterizado pelo uso de dois inibidores (2i). ES de mouse células cultivadas em meio de 2i/LIF são mais homogêneas em populações de células e a expressão de fatores de pluripotência. Além disso, pilhas do rato 2i/LIF-cultivadas ES apresentam DNA hypomethylation globalmente, que está mais perto de células ICM9,13. Mesmo assim, a cultura de 2i tem suas desvantagens. PD0325901 e CHIR99021 são insolúveis em água e geralmente dissolvem-se em dimetilsulfóxido (DMSO)-com base em solução para adicioná-los em meio de cultura. Estudos mostram que a longo prazo e baixa dose de exposição das células ao DMSO pode levar a citotoxicidade14.

Aqui, utilizamos dois compostos da pequeno-molécula e desenvolveu um novo método de cultura de células de rato ES. O método de cultura novela combina Vc e MEK inibidor PD0325901 para promover o DNA hypomethylation rapidamente e eficazmente a um nível comparável de PGC, nomeado como o protocolo de cultivo Vc/PD0325901. Pilhas do mouse ES em Vc/PD0325901-adicionado meio contendo soro apresentam homogeneidade na morfologia e são sustentadas em um estado fundamental. Comparado a cultura 2i, cultivadas sob condições de Vc/PD0325901 de pilhas do rato ES exibem cinética mais rápida da demetilação do ADN e podem atingir o nível de hypomethylation comparável do PGC. Além disso, o uso de um único inibidor (PD0325901) diminui a entrada quantidade de DMSO em média em comparação com que usado em 2i (PD0325901/CHIR99021) e reduz os danos às células.

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Protocol

1. preparações

  1. Preparar uma solução de 1,0 mM PD0325901 (inibidor MEK) e 3,0 mM CHIR99021 (inibidor de GSK3).
    1. Pesar 2 mg de PD0325901 e adicionar em um frasco de vidro âmbar 4,15 mL de DMSO.
    2. Pesar de 2 mg de CHIR99021 e adicionar 1,43 mL de DMSO em um frasco de vidro âmbar.
    3. Reconstituição de seguir, armazenar alíquotas (50 µ l/tubo em 200 tubos PCR µ l) a-20 ° C e protegido da luz. Remova um tubo contendo o estoque congelado de um freezer e descongelar à temperatura ambiente antes do uso.
  2. Pesar 0,0176 g de Vc em 1 mL de um tubo de centrífuga e reconstitui-lo com 1 mL de água estéril para uma concentração final de prévia de 100 mM para usar.
  3. Inactivar FBS: incube 500ml de FBS num banho de água a 56 ° C durante 30 min.
  4. Prepare-se para cultivo de células de rato ES 600 mL do meio de base.
    1. Utilize um frasco de meio de glicose DMEM/alto (500 mL) e remover 40 mL.
    2. Suplemento 460 mL de DMEM/alto médio de glicose com 20% inactivadas FBS (120 mL), 1.000 U/mL LIF (60 µ l de 107 U/mL de solução), 0.1 mM não aminoácidos essenciais (timina) (6 mL de solução-mãe de 10mm), piruvato de sódio 1 mM (6 mL de solução estoque de 100 mM) , 2 mM L-glutamina (6 mL de solução-mãe de 200 mM), 0.1 mM β-mercaptoetanol (600 µ l da solução estoque de 100 mM) e 33 UI/mL penicilina e estreptomicina 33 de µ g/mL (2 mL de penicilina-estreptomicina mistura solução (10.000 UI/mL penicilina e estreptomicina 10.000 de µ g/mL)) . Defina o meio básico como meio de soro.
    3. Pipete 50 µ l de solução-mãe de PD0325901 (1,0 mM) e Vc (100 mM), respectivamente, em 50 mL do meio de soro (concentração final: 1,0 µM PD0325901 e Vc de 100 µM) e definir o meio como Vc/PD0325901 médio.
      Nota: Prepare o fresco médio Vc/PD0325901 antes de usar devido à instabilidade de Vc.
    4. Utilizando uma pipeta, transfira 50 µ l de solução-mãe de PD0325901 (1,0 mM) e CHIR99021 (3,0 mM), respectivamente, em 50 mL do meio de soro (concentração final: PD0325901 1.0 µM e CHIR99021 3.0 µM) e definir o meio como meio de 2i.
  5. Prepare os pratos de gelatina-revestido.
    1. Preparar a solução de gelatina de 0,1%: dissolver 0,3 g de gelatina em 300 mL de água ultrapura em um frasco de reagente de vidro com uma tampa e esterilizar em autoclave a 121 ° C por 20 min. loja a solução estéril à temperatura ambiente.
    2. Incubar os pratos de cultura celular (6 cm de diâmetro) com 2 mL de solução de gelatina 0,1% por 15 min à temperatura ambiente e em seguida aspirar a gelatina. Secar os pratos no ar e usá-los no prazo de 12 h.
  6. Prepare-se 10 mL de células de rato ES congelamento médio em um tubo de centrífuga de 15 mL: 90% FBS (9 mL) e 10% DMSO (1 mL). Utilize o meio dentro de 1 dia.
  7. Prepare um recipiente de congelação: Adicionar álcool isopropílico 100% para a linha de enchimento do recipiente de congelação e descartar o velho álcool isopropílico. Adicione novo álcool isopropílico diretamente após cada utilização de quinta.
  8. Fazer o tampão de digestão enzimática: pesar 1,2114 g de Tris pó em 100 mL de água ultrapura para preparar 100 mM Tris solução e adicionar concentrado solução de HCl (cerca de 12 metros) para a solução de Tris para ajustar o pH para 7,6 (cerca de 0,6 mL de solução concentrada de HCl).
  9. Prepare-se 50 mL de tampão de ensaio de imunoprecipitação de rádio (amortecedor de RIPA): 20 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 150 mM de NaCl, glicerol 20%, 0,5% NP40, EDTA 1 mM, 1 mM EGTA. Suplemento com 1 mM DTT, 1 X coquetel de inibidor de protease e 1 mM antes PMSF de usar. Se adicionarmos a PMSF, use o tampão dentro de 30 min.

2. crescer pilhas do ES do Mouse em pratos de gelatina-revestido

  1. Cultura de células pre-quente do ES (tipo selvagem, SvEv 129) médio, tripsina e solução de tampão fosfato (PBS) em banho maria a 37 ° C.
  2. Passagem das células. Aspire a médio e a louça para lavar as células completamente do prato e pipeta 2 mL de PBS.
    1. Remover a PBS com uma pipeta e lavar as células novamente com 2 mL de PBS.
    2. Remover a PBS e adicionar 0,3 mL de tripsina-EDTA (0,25%) para cada prato.
    3. Cubra todo o prato com a tripsina rapidamente e depois removê-lo imediatamente.
    4. Coloque o prato em uma incubadora a 37 ° C por 1 min separar as células do prato. Retire os pratos da incubadora e adicione 2 mL do meio de soro pré-aquecido para encerrar a ação da tripsina.
    5. Dissocia as colônias de células em suspensão uma única célula por resuspending com uma pipeta (ponta da pipeta de 5 mL) 10 vezes.
  3. Transferência de 150 µ l de 2 mL da solução de célula (cerca de 190.000 células contando com um hemocytometer) para uma nova placa de gelatina-revestido e complementar com 3 mL de meio de Vc/PD0325901 feito recentemente por placa de cultura de 6 cm. Cultura de células em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2.
  4. Todos os 24 h durante a incubação, remover o meio de cultura antigo e adicionar 3 mL de meio-Vc/PD0325901 fresco para o prato de cultura devido à instabilidade da confluência Vc. Expect 70 – 80% após 2-3 dias.
  5. Depois de alcançar a confluência de 70-80%, passagem das células e continuar a cultura-los conforme descrito nas etapas 2.2 – 2.4.

3. congelar e descongelar as células ES do Mouse

  1. Congele as células de rato ES.
    1. Separe as células desde os pratos com tripsina a seguir passo 2.2.
    2. Transferi as células em um tubo plástico de 15 mL e centrifugar 800 x g e temperatura de quarto por 3 min.
    3. Despejar o sobrenadante cuidadosamente para um copo e resuspenda o pellet de células com 1 mL de acabadas congelamento médio. Prepare o congelamento médio 30 min antes desta etapa para garantir que é a temperatura ambiente antes do uso.
    4. Transfira as células no meio de um tubo de microcentrifugadora de 1,8 mL com uma pipeta de 1ml de congelação e o tubo de microcentrifugadora em um recipiente de congelação. Adicionar álcool isopropílico para a linha de enchimento do recipiente congelação e mantê-lo em temperatura ambiente antes de usar.
    5. Deixe os recipientes de congelação durante a noite em um freezer-80 ° C.
    6. Transferi os tubos microcentrifuga para um recipiente de nitrogênio líquido para até 2 – 3 anos.
      Nota: Não manter as células no meio de congelação por um longo tempo e transferir rapidamente as células para um freezer-80 ° C, devido à toxicidade de DMSO.
  2. Pilhas do rato ES de descongelar.
    1. Pré-aqueça 50 mL de meio de soro em banho maria a 37 ° C.
    2. Pegue um frasco que contém a célula do contêiner de nitrogênio líquido e mergulhe o frasco tampado em banho maria a 37 ° C. Agitá-lo rapidamente em banho-maria para derreter. Transferi as células em um tubo de 15 mL com uma pipeta de 1 mL. Adicione 2 mL de meio de cultura de soro previamente aquecido dentro do tubo para diluir o meio de congelação e então centrifugar a x 800 g e a temperatura ambiente por 3 min.
    3. Remover o sobrenadante e ressuspender delicadamente as pelotas de célula com 3 mL de meio fresco Vc/PD0325901, usando uma pipeta de 5 mL.
    4. Transferir as células do tubo de 15 mL para um prato de gelatina-revestido e cultura as células por 24 h. cultura de células novamente como descrito na etapa 2.

4. extrair proteína Total de células

  1. Enxagúe as células coletadas com 1 mL de PBS e então centrifugar a x 800 g e a temperatura ambiente por 3 min.
  2. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o celular completamente com o amortecedor de RIPA suplementado com TDT, coquetel de inibidor de protease e PMSF pipetando suavemente. O volume de tampão RIPA é cerca de 5 x que da célula de Pelotas.
    Nota: Efectue a ressuspensão de célula no gelo.
  3. Manter as células no buffer RIPA por 30 min no gelo e centrifugar a 13.000 x g e 4 ° C por 5 min.
  4. Transferir o sobrenadante para um tubo novo e armazenar alíquotas a-80 ° C.
  5. Determine a concentração da proteína com um kit de ensaio de proteína de Bradford.

5. extrair DNA de células e DNA Digest em único nucleosídeo usando enzimas

  1. Colete as células com tripsina conforme descrito nas etapas 3.1.1 e 3.1.2.
  2. Realize a extração de DNA com um kit de purificação de DNA genômico seguindo as instruções do fabricante.
  3. Guarde o DNA extraído em tubos de centrifugação de 1 mL. Adicionar 100 µ l de água ultrapura no tubo de centrífuga e dissolver o DNA pipetando aproximadamente 15 vezes. Determinar a concentração e avaliar a qualidade do DNA por medição da absorvância em 260 nm e 280 nm15. A concentração de DNA é de cerca de 500 ng / µ l.
  4. Digest 5 µ g de DNA em um sistema de 50 µ l de solução: Adicione 5 µ l de solução de Tris-HCl, pH 7,6 a 100 mM (concentração final: 10 mM), 2 fosfatase intestinal de U bezerro, 1 U DNase I, 0.005 U cobra veneno fosfodiesterase, eu e 5 µ g de DNA (calcular o volume adicionado de acordo com a medição concentração de DNA vermelha, ~ 10 µ l) em um tubo de centrífuga e aumento do volume de solução a 50 µ l com água ultrapura. Incube a mistura a 37 ° C durante a noite. Centrifugue a solução de DNA digerida em 1.000 g e temperatura ambiente durante 1 min coletar a solução para o fundo do tubo.
  5. Transferir a solução de DNA digerida dos tubos de centrífuga para tubos de ultrafiltração (um peso de molécula corte: 3 kDa) e centrifugar a 13.000 g e 4 ° C, por 30 min remover as enzimas de digestão.
  6. Prepare as amostras para análise de 5mC e 5hmC.
    1. Para análise de 5hmC: Pipetar 36 µ l da solução de filtro para uma centrífuga de Nova tubo (1ml) e adicione 4 µ l de 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5hmC) com a concentração final de 3 nM.
    2. Para a análise de 5mC: Adicionar 196 µ l de água ultrapura para um novo tubo de centrifugação e pipetar 4 µ l da solução de filtro para o tubo (50-fold diluição), devido à alta densidade de 5mC no DNA genômico. 36 µ l da solução diluída de transferência para um novo tubo de centrífuga e adicione 4 µ l de (-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine de 5' ([D3]-5mC) com a concentração final de 50 nM. Uso [D3]-5hmC e [D3]-5mC como padrão interno para calibrar 5hmC e 5mC, respectivamente.
  7. Transferir a solução de amostra para tubos de medição e armazenar a 4 ° C. Analise 5mC e 5hmC com ultraelevado-desempenho líquido cromatografia-triplo quadrupolo espectrometria de massa com Múltiplo-reação monitoramento (UHPLC-MS/MS (MRM)), conforme descrito no relatório anterior15.

6. analisar 5mC e 5hmC usando UHPLC-MS/MS15

  1. Configurar vários parâmetros para analisar 5mC e 5hmC usando o software de UHPLC-MS.
    1. Estabelece um novo método. Abra o software e clique em "arquivo | Novo | Método". Exibir a caixa de mensagem "Do Editor de método" com o conteúdo "Você quer salvar as alterações para o método atual" e clique em "Não".
    2. Construa os parâmetros do sampler. Clique em "Sampler | Instalação | Injeção". Selecione "Injeção padrão" e "5 µ l volume de injeção" de entrada.
    3. Construa os parâmetros da bomba em UHPLC.
      1. Clique em "BinPump2 | -Setup"para construir os parâmetros da bomba. Configure o "Fluxo" em "0,25 mL/min" e "Parar o tempo" a "15 min".
      2. Configurar o "Solvente B em 5%" e "Limites de pressão", no "bar Max 600".
      3. Clique em "BinPump2 | Calendário"para construir a isocrática parâmetros de eluição para análise de 5mC. Clique em "Append" para adicionar uma linha. Entrada "0,00" no "Tempo" e "5.0" em "% B". Clique em "Acrescentar" mais uma vez para adicionar uma nova linha. Entrada "15.00" no "Tempo" e "5.0" em "% B".
      4. Clique em "BinPump2 | Calendário"para construir os parâmetros de gradiente de eluição para análise de 5hmC. Clique em "Append para adicionar uma linha. Entrada 0,00 no tempo e 5.0 em "% B". Clique em "Acrescentar" mais uma vez para adicionar uma nova linha. Entrada "3,00" no "Tempo" e "5.0" em "% B". Clique em "Append" para outro 6 vezes adicionar 6 linhas. Entrada "3.01" no "Tempo" e "15,0" em "% B", "6,00" no "Tempo" e "15,0" em "% B", "6.01" no "Tempo" e "100" em "% B", "10,00", no "Tempo" e "100,0" em "% B", "10.01" no "Tempo" e "5.0" em "% B", "15.00" no "Tempo" e "5.0" em "% B" em sequência.
        Nota: Efectuar a análise de 5mC e 5hmC individualmente devido às condições de separação diferente de UHPLC.
    4. Construa os parâmetros da temperatura do compartimento da coluna (TCC) em UHPLC.
      Clique em "TCC | Instalação | temperatura (à esquerda) "e"30 ° C"de entrada.
    5. Estabelece os parâmetros do Queiroz-MS/MS.
      1. Clique em "MS Queiroz | Parar o tempo | Não limite/como bomba"," fonte de íon | ESI"," tempo de filtragem | Largura: 0,07 min ". Configurar "segmentos de tempo: hora de início: 0"; "Tipo de digitalização: MRM"; "Valor Div: A MS"; "Delta EMV (+): 200" e "Delta EMV (-): 0".
      2. Construir os parâmetros de monitoramento das transições de 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC e D3-5hmC
        1. Clique em "MS Queiroz | Aquisição | Varredura de segmentos: habitar: 90"; "Fragmentor: 90"; "Energia de colisão: 5"; "Acelerador tensão da pilha: 4" e "polaridade: positivo".
        2. Entrada "5mC" no "Composto nome", "242", no "Precursor Ion", "126" no "Produto íon" para análise de 5mC. Clique com o botão direito e selecione "Adicionar a linha" para adicionar uma nova linha. Entrada "D3-5mC" no "Composto nome", "245" em "Precursor Ion", "129" de"produto" para D3-análise de 5mC.
        3. Outro suplemento três linhas usando o mesmo modo. "DC" no "Composto nome", "228" em "Precursor Ion", "112", de"produto" para análise de dC de entrada. Entrada "5hmC" no "Composto nome", "258" em "Precursor Ion", "142" de"produto" para análise de 5hmC. Entrada D3-5hmC no nome composto, "261" em "Precursor Ion", "145" de"produto" para D3-análise de 5hmC.
      3. Construa os parâmetros da fonte de gás. Clique em "MS Queiroz | Fonte | Parâmetros de origem: gás Temp: 300 ° C "; "Fluxo de gás: 11 L/min"; "Nebulizador: 15 libras por polegada quadrada"; "Positivo-capilar: 3500 V".
      4. Salve o método proposto. Clique em "MS Queiroz | Instrumento | Método como Save". Selecione um caminho para o método proposto pelo "Diretório" e dê um nome para o método inserindo o conteúdo no "Método", por exemplo: análise de 5mC e 5hmC.
  2. Separação de UHPLC e MS/MS análise de mononucleosides
    1. Preparar a fase móvel para 5mC e citosina (C) análise: formam a fase móvel da solução A e B. solução a: 500 mL de água ultrapura com 500 µ l de ácido fórmico (concentração final: 0,1%) e a solução b: 500 mL de metanol 100%. Misturar a solução A e B no 95:5 (v: v) como fase móvel a eluir 5mC e C (definido na etapa 6.1.3.3). Defina a taxa de fluxo em 0,25 mL/min (definido na etapa 6.1.3.1).
    2. Prepare a fase móvel por solvente A e B, para análise de 5hmC. A solvente é 2.0 mM NH4HCO3 aquoso (pH 9,0) (500 mL), e o solvente B é 100% de metanol (500 mL). 5hmC separadas por uma eluição gradiente otimizada: 0-3 min, 5,0% B e 95% por (v: v); 3-6 min, 15,0% B e 85% A; 6-10 min, 100% B; 10-15min, 5,0% B e 95% A (definida na etapa 6.1.3.4). Defina a taxa de fluxo em 0,25 mL/min (definido na etapa 6.1.3.1).
  3. Utilize electrospray MS/MS com modo de MRM (definido na etapa 6.1.5.1) para analisar a eluição da coluna e adotar o modo de íon positivo (definido na etapa 6.1.5.2.1).
    1. Monitorar as transições: 5mC, 242→126 m/z (energia de colisão, eV 5); [D3]-5mC, 245→129 m/z (eV 5); dC, 228→112 m/z (eV 5); 5hmC, 258→142 m/z (eV 5); [D3]-5hmC, 261→145 m/z (5 eV) (definido no passo 6.1.5.2.2).
    2. Definir as tensões capilares e fragmento em +3,500 V (definido na etapa 6.1.5.3) e 90 V (definido na etapa 6.1.5.2.1), respectivamente.
    3. Definir o volume de injeção em 5 µ l e analisar cada amostra 3 vezes (definidos na etapa 6.1.2). Emprega as correspondentes curvas de padrão para avaliar a quantidade de 5mC e 5hmC.
      1. Estabelecer a curva padrão de 5mC: transferir 1 – 50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, concentração final) solução-padrão de 5mC em centrifugar tubos e adicionar 50 nM [D3]-5mC para tubos. Suplemento do volume total de 50 µ l. efectuar a análise do padrão 5mC, seguindo as instruções para a amostra de 5mC (etapa 6).
      2. Construir a curva padrão de 5hmC: transferir 1 – 20 nM (1, 2, 5, 10, 20 nM, concentração final) solução-padrão de 5hmC tubos de centrifuga e adicionar 3 nM [D3]-5hmC para os tubos. Suplemento do volume total de 50 µ l. efectuar a análise do padrão 5hmC, seguindo as instruções para a amostra de 5hmC (etapa 6).

7. analisar a significância estatística

  1. Realizar a análise estatística utilizando o software.
    1. Abra o software e selecione "Coluna" na "nova tabela & gráfico". Defina os parâmetros da seguinte maneira: "dados de exemplo | Iniciar com uma tabela de dados vazio"; "Escolher um modo gráfico, o primeiro"; "Representação gráfica de repetições ou barras de erro | Sinopse | Quer dizer com SEM".
    2. Clique em "Criar" para entrada as três repetições do grupo controle e Vc/PD0325901-tratados na linha "A" e "B", respectivamente. Selecione os seis dados e clique em "Analisar" na "Análise".
    3. Selecione "testes det (e testes não-paramétricos)" em "Análises de coluna" e clique em "Okey" para entrar na interface de próxima.
    4. Defina os parâmetros da seguinte maneira: "escolha teste | Nome de teste | Unpaired t teste; Opções | Two-tailed"; "Intervalos de confiança: 95%"; "Dígitos significativos | Mostre 4 dígitos significativos". Clique em "Okey" para adquirir o valor de p entre o tratamento controle e Vc/PD0325901.
  2. Avaliar a significância estatística entre o controle e os grupos experimentais empregando o Student bicaudal e unpaired t-teste16.
    Nota: p < 0.05 denota a diferença possuindo significância estatística. * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001.

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Representative Results

Vc/PD0325901 induzida em sinergia global de eliminação de pilhas do ES do rato. Pilhas do mouse ES no soro apresentam hypermethylation de DNA, enquanto células ICM pluripotentes e PGCs mostram apagamento global de metilação do DNA e o estado de hypomethylated é estreitamente associado com sua pluripotência9,10.

Anteriormente, nós e os outros encontraram que Vc pode melhorar mediada por Tet 5mC desmetilação15,17. Enquanto isso, 2i também foi encontrado para inibir a síntese de novo de 5mC. No contexto destes achados, propusemo-nos ainda mais a manipulação sinérgica de células ES de rato usando Vc e 2i juntos. Após a análise de UHPLC-MS/MS, nós encontramos que Vc e 2i completadas no meio contendo soro podem reduzir drasticamente o conteúdo de 5mC de 3,2 para 0,33 por 100 C (~ 90% de perda de 5mC) por dia 11 em células de rato ES (figura 1A). Em contraste, Vc ou 2i-tratamento sozinho só causou 58% de eliminação com o nível constante na redução de 5mC ou 61% 1,4% a nível de 1,3% 5mC.

O meio de 2i é composto de inibidor MEK PD0325901 e GSK3β inibidor CHIR99021. Em seguida, investigamos qual componente induz a perda global de 5mC durante o tratamento co de Vc e 2i. Interessante, Vc/PD0325901 causou um declínio mais rápido em níveis de metilação do DNA do que Vc/2i. Vc/PD0325901 alcançado níveis 5mC constante (5mC ~0.33%) depois de 5 dias, enquanto Vc/2i alcançou um nível comparável no dia 11. Em contraste, o suplemento de CHIR99021 parcialmente suprimida demetilação do ADN acionadas por Vc (figura 1A). Estes dados sugerem claramente que PD0325901 em 2i contribui para o hypomethylation global do DNA genômico em células de rato ES, enquanto CHIR99021 de 2i inibe parcialmente o apagamento de 5mC. Portanto, podemos especular que o mais rápida demetilação do ADN induzida por Vc/PD0325901 em relação a Vc/2i pode ser atribuída à inibição parcial de CHIR99021 na desmetilação.

Formulamos a hipótese que o apagamento global de 5mC em pilhas do ES do rato induzido por Vc/PD0325901 pode ser parcialmente pertinente para a melhoria da demetilação do ADN. Daí, nós examinamos produtos de oxidação genômica de 5mC. Tem sido relatado que 5mC pode ser convertido em 5hmC pela oxidação catalítica do Tet família dioxygenases, que estão dependentes de Fe (II) e 2-do oxoglutarate18,19. 5hmC genômica pode ser diluído pelo DNA replicação20. Além disso, 5hmC pode ser ainda mais oxidado por Tet dioxygenases para produzir 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC), que pode eficientemente ser extirpado por timina DNA glycosylase (TDG) recuperar unmethylated citosina, indicando um DNA ativo desmetilação21,22.

Na linha do trabalho anterior15, tratamento contendo Vc (Vc, Vc/2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021) aumentou dramaticamente frequência 5hmC (5hmC/106 C) depois de 1 dia e, posteriormente, 5hmC níveis declinou gradualmente (figura 1B) devido à progressivamente a redução em substrato de 5mC. Notavelmente, Vc/PD0325901 e Vc/2i mostraram mais rápida cinética de perda de 5hmC em comparação com Vc e Vc/CHIR99021 devido a redução mais rápida de 5mC. Além disso, observou-se também que no dia 1, Vc-tratamento estimulou a geração de mais de 5hmC em comparação com Vc/CHIR99021, indicando que CHIR99021 parcialmente suprimida a produção induzida por Vc de 5hmC e inibida demetilação do ADN. perda de 5hmC no tratamento de 2i deverão ser atribuída para a diminuição do substrato 5mC. Tomados em conjunto, esses resultados mostraram que a atividade de desmetilação DNA Vc aprimorado em parte contribuiu para o hypomethylation em sinergia no tratamento co da PD0325901/Vc e Vc/2i.

Ambos Habibi et al et al . 23 e von Meyenn 24 também relatou que células de rato ES sob condições de 2i mostraram global DNA hypomethylation e ingênuo pluripotência. níveis de 5mC mostrou diminuir gradualmente e alcançou um estado estacionário (~ 1% 5mC) 12 – 14 dias após a reversão de soro para 2i. No sistema de cultura Vc/PD0325901, o tratamento co causado mais rápida demetilação do ADN e atingiu um nível estável (0,33% 5mC) após suplementação de Vc/PD0325901 no meio de soro durante 5 dias, devido ao efeito sinérgico de Vc/PD0325901. O nível alcançado de metilados (0,33% 5mC) foi pronouncedly menor do que em condições de 2i relatadas por Habibi et al e von Meyenn et al, enquanto 5hmC eram mais elevados devido a geração promovida de Vc.

PD0325901 elevada expressão Prdm14 para reprimir Dnmt3b e Dnmt3l, mas não Dnmt3a25. Para investigar a ação de PD0325901 na indução de perda de 5mC, uma série de expressão de proteínas relacionadas com 5mC foi examinada, incluindo a manutenção (Dnmt1) e de novo (Dnmt3a e Dnmt3b) DNA metiltransferases e seu cofator (Uhrf1 e Dnmt3l) e Regulamento da proteína (Prdm14) 8,9,26. Após análise ocidental do borrão, Prdm14 pronouncedly foi elevada em PD0325901, incluindo cultura (Figura 2). Em contraste, Dnmt3b e seu cofator Dnmt3l mostraram considerável para baixo-regulamento de expressão de proteínas em PD0325901, incluindo tratamento (Figura 2). Tratamento de CHIR99021 não mostrou ou ligeiro efeito sobre o nível de Prdm14, Dnmt3b e Dnmt3l. A expressão de Dnmt3awas não mudar, e a causa é pouco clara. Além disso, a manutenção do ADN da Dnmt1 e o seu factor de selecção Uhrf1 também não mostraram nenhuma alteração, e os dados não foram mostrados.

Estudos recentes têm indicado que a Prdm14 pode recrutar polycomb 2 complexo repressivas (PRC2) de alguns promotores de genes para reprimir a sua expressão, como de novo DNA metiltransferases (Dnmt3a e Dnmt3b) e seu cofator (Dnmt3l) e contribui para manutenção de hypomethylation sob condições de 2i8,27. Nossos dados revelaram que PD0325901 elevou o nível de expressão de Prdm14 para inibir a Dnmt3b e Dnmt3l e diminuído o mecanismo de síntese de 5mC genômica de novo .

Para explorar a manutenção da pluripotência das células de rato ES Vc/PD0325901 condições, níveis de expressão de RNAm de vários fatores de pluripotência vinculados ao núcleo foram examinados, e esses fatores foram confirmados para desempenhar um papel vital no pluripotência28. Análise PCR em tempo real encontrado que Oct4, SOX2, Esrrb e Sall4 mostraram níveis de expressão uniforme através de 5 dias de tratamento com Vc/PD0325901 em contraste com a cultura de soro (Figura 3A). NANOG e Tcf3 maior 1.3-fold e 1.6-fold, respectivamente. Por outro lado, Klf4 mostrou 42% para baixo-regulamento e Rex1 só diminuiu cerca de 12%. Estes resultados sugerem que o tratamento co Vc/PD0325901 induzido diversas alterações na expressão de factores de pluripotência; no entanto, Oct4 e SOX2, a maioria dos fatores de núcleo, mantiveram quase constantes níveis de expressão.

Em seguida, realizou-se um ensaio de fosfatase alcalina (AP), para avaliar se as pilhas do rato ES eram um estado indiferenciado ou diferenciado. Fotos de células (Figura 3B e 3C) foram obtidas a partir de uma câmera conectada a um microscópio invertido com 10 vezes a amplificação por uma lente objetiva. Após o cultivo contínuo de 26 dias em Vc/PD0325901-adicionado suporte de soro, as células de rato ES mostraram morfologia homogênea. Além disso, quase todas as células estavam manchadas de roxo-preto... e exibiram um bola estado sem consequência (Figura 3), mostrando um estado indiferenciado. Por outro lado, em condições de soro, uma parte das células do mouse ES no dia 26 foram roxo-preto depois de coloração e tinha um estado de bola na morfologia, enquanto outros apresentaram cor clara com outspreading marcado pela brancas oval as linhas tracejadas (Figura 3B); Isto indicavam as células cultivadas de soro rato ES heterogêneas em estado pluripotentes, que é consistente com os anteriores relatórios13e na morfologia. Coletivamente, os dados suportados que PD0325901 em combinação com Vc pode sustentar excelente morfologia e um estado indiferenciado em células ES do mouse.

Figure 1
Figura 1: Vc/PD0325901 induzida em sinergia global de eliminação de células de rato ES genômica 5mCin. (A) frequência de 5mC (5mC/C) e (B) tempo de frequência (C) 5hmC/5hmC-dependente mudança durante um tratamento de 26-dia de um suplemento contínuo com Vc, 2i, Vc/2i, Vc/PD0325901 ou Vc/CHIR99021 no soro contendo médio. Barra de erro mostra o desvio padrão (SD) de três análises repetidas por citosina c: UHPLC-MS/MS.. Esta figura foi modificada de Li et al. 25. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: a alteração de expressão de proteínas de Prdm14 e DNA metiltransferases (Dnmt3a, Dnmt3b e Dnmt3l). As bandas apresentadas (da esquerda para a direita) foram obtidas através de um dia 5-tratamento da cultura de soro (controle), Vc, PD0325901, CHIR99021, 2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021 e Vc/2i, respectivamente. a expressão de Prdm 14 foi acima-está regulada e Dnmt3b e Dnmt3l diminuíram após PD0325901, incluindo a cultura. Dnmt3a não exibiu nenhuma mudança. Β-tubulina foi definido como referência interna. Con: Controle; PD: PD0325901; CH: CHIR99021. Esta figura foi modificada de Li et al. 25. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Vc/PD0325901-induzido a alteração na expressão do mRNA de genes pluripotentes e na atividade da fosfatase alcalina. (A) mRNA nível de genes pluripotentes parcial foi alterada através de um tratamento de 5 dias de Vc/PD0325901 em relação ao que sob condições de soro (controle). Os dados foram representados como média ± SD A significância estatística foi avaliada e p < 0.05 foi estatisticamente significativa. * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 e ns representaram não significativas. PD: PD0325901. Pilhas do mouse ES no soro por 26 dias (B) exibiram parcial consequência marcada pela brancas oval as linhas tracejadas, enquanto Vc/PD0325901-adicionado suporte de soro mantida grande morfologia e um estado indiferenciado (C). Estas imagens foram adquiridas a partir de um microscópio invertido conectado com uma câmera no campo brilhante. Esta figura foi modificada de Li et al. 25. grades de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

No trabalho, temos demonstrado um novo método de combinar Vc e PD0325901 para sustentar as células de rato ES em um estado indiferenciado e hypomethylated, que foi alcançado por uma ação sinérgica de promover demetilação do ADN por Vc e suprimindo de novo DNA metilação de PD0325901. Além disso, as células ES do rato mostraram grande morfologia sob o sistema de cultura Vc/PD0325901.

Para melhor sustentar o estado das pilhas do rato ES no sistema de cultura Vc/PD0325901, existem algumas etapas críticas. Em primeiro lugar, a FBS lotes precisam ser pré-selecionados para encontrar e estocar os melhores lotes; também, a substituição frequente de soro é prejudicial a proliferação celular e para a manutenção da pluripotência. Em segundo lugar, evite pipetagem células durante a desassociar das colónias a uma suspensão de célula única célula no estágio de passagem de célula. Em terceiro lugar, para atenuar o efeito adverso de tripsina durante o cultivo de células, a tripsina deve ser removida imediatamente depois que cobre as células nos pratos durante a passagem da célula. Além disso, o meio de cultura Vc/PD0325901 deve ser substituído diariamente devido à instabilidade de Vc.

Em comparação com a cultura clássica de soro, células de rato ES sob condições de Vc/PD0325901 mostram uma população mais homogênea da célula (Figura 3B, C) e um estado de hypomethylated, que se assemelha a ICM e PGC. Além disso, comparado com a cultura de 2i recentemente desenvolvidos, nosso método pode realizar o hypomethylation com cinética mais rápida, e a utilização de um único inibidor (PD0325901) reduz a quantidade de entrada de DMSO, diminuindo assim os danos às células. No entanto, devido à adição da FBS em nosso sistema de cultura, as ações de duplas ambivalentes da FBS podem causar diferenciação celular durante a cultura a longo prazo. Em geral, este sistema de cultura romance é adequado para a manutenção e expansão em larga escala de células ES de rato.

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Disclosures

Os autores não divulgar nenhuma potenciais conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Nacional Natural Science Foundation da China (21435008 e 21327006 de h. w) e o programa de pesquisa de prioridade estratégica da Academia Chinesa de Ciências (XDB14030200 de H.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

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