Preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo

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Cancer Research

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Summary

Este protocolo describe el uso de elutriación centrífuga para separar las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula.

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Delgado, M., Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation. J. Vis. Exp. (129), e56418, doi:10.3791/56418 (2017).

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Abstract

La capacidad de sincronizar las células ha sido fundamental para avanzar en nuestra comprensión de la regulación del ciclo celular. Técnicas comunes empleadas incluyen privación de suero; productos químicos que detención de células en ciclo celular diferentes fases; o el uso de mitotic shake que explota su adherencia reducida. Sin embargo, todos estos tienen desventajas. Por ejemplo, hambre de suero funciona bien para las células normales pero menos bien por las células del tumor con puestos de control de ciclo celular comprometida debido a la pérdida de supresores activación o tumor oncogen. Del mismo modo, poblaciones de la célula tratada químicamente pueden daño inducido por la droga del puerto y muestran alteraciones relacionadas con el estrés. Una técnica que evita estos problemas es elutriación centrífuga contracorriente (CCE), donde las células son sometidas a dos fuerzas opuestas, la fuerza centrífuga y la velocidad del fluido, que se traduce en la separación de células en base a tamaño y densidad. Como agrandan las células avanzando a través del ciclo por lo general, la CCE puede utilizarse para separar las células en diferentes fases de la célula. Aquí aplicamos esta técnica a las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria. Bajo condiciones óptimas, pueden obtenerse una población esencialmente pura de células en fase G1 y una población altamente enriquecida de células en las fases G2/M en el excelente rendimiento. Estas poblaciones celulares son ideales para estudiar dependiente de ciclo celular mecanismos de acción de drogas contra el cáncer y para otras aplicaciones. También mostramos cómo modificaciones en el procedimiento estándar puede resultan en rendimiento subóptimo y discutir las limitaciones de la técnica. La metodología detallada presentada debe facilitar la aplicación y exploración de la técnica a otros tipos de células.

Introduction

Las células cultivadas crecen típicamente asincrónicamente y las células individuales están presentes en diferentes fases del ciclo celular. Algunos organismos presentan ciclos celulares naturalmente sincrónicos o pueden ser sincronizados por estímulos fisiológicos específicos. Por ejemplo, núcleos de plasmodia gigante del limo molde Physarum polycephalum se dividen en una manera altamente sincrónico1y las células de las algas verdes que desmodesmus quadricauda puede ser sincronizado por la alternancia de claros y oscuros periodos2. Mientras que estos organismos ofrecen atributos experimentales únicos, mal modelo las complejidades de las células de mamífero. La capacidad de sincronizar artificialmente las poblaciones de células de mamífero ha sido fundamental para avanzar en nuestra comprensión de la regulación del ciclo celular y la base molecular de los puntos de control de ciclo celular. Métodos comunes incluyen privación de suero, bloque química y liberación o explotar características físicas3,4. Retiro de suero a menudo hace que las células a entrar en quietud, y la nueva adición de suero promueve el reingreso del ciclo celular en G1 fase5. Inhibidores químicos incluyen a agentes como timidina exceso o hidroxiurea que bloquean las células en el límite de G1/S o inhibidores de los microtúbulos que suelen detención las células en la fase M3,4. Métodos que aprovechan las características físicas incluyen mitotic shake-off que se puede utilizar para enriquecer las células mitotic puesto que son menos adherentes que la interfase las células6. Sin embargo, todas estas técnicas tienen desventajas potenciales. Por ejemplo, no todos los tipos de la célula mantienen viabilidad en ausencia de suero o la presencia de inhibidores químicos y el rendimiento de las células después de mitotic shake es limitada sin sincronización previa con inhibidores de la mitosis.

A excepción de primeros ciclos celular embrionarios, donde células disminuyen progresivamente de tamaño como reparten7, mayoría avanzando a través del ciclo de las células se someten a fases de crecimiento y ser más grandes. Esta propiedad es aprovechada en la técnica de elutriación centrífuga contracorriente (CCE), que puede ser utilizado para separar las células difieren en tamaño y por lo tanto, en el ciclo celular fase8,9. Durante el CCE, las células están bajo la influencia de dos fuerzas opuestas: la fuerza centrífuga, que conduce las células lejos del eje de rotación y la velocidad del fluido (contraflujo), que impulsa las células hacia el eje de rotación (figura 1). Las células en la cámara de elutriación llegan a una posición de equilibrio donde estas fuerzas son iguales. Los factores clave que dictan la posición de equilibrio son densidad y diámetro de la célula. Como el flujo se aumenta la velocidad de la solución tampón y la fuerza de arrastre de contracorriente compensa la fuerza centrífuga, se establece un nuevo equilibrio, provocando un cambio en la posición de las células dentro de la cámara. Todas las células se desplazan hacia la salida de la cámara, dando lugar a los más pequeños, dejando la cámara en primer lugar, mientras que las células más grandes permanecer dentro de la cámara hasta que la tasa de contracorriente se incrementa lo suficiente para promover su salida. Las células de escape de la cámara de elutriación con aumentos consecutivos en la tasa de contracorriente pueden ser colectadas en fracciones específicas y cada fracción contiene células de crecientes secuencialmente los tamaños. En el lugar de realización de elutriación con aumentos incrementales en tasa de contracorriente, secuenciales disminuciones en la fuerza centrífuga al disminuir la velocidad de centrifugación logrará el mismo resultado. El proceso de elutriación requiere optimización dependiendo del tipo de la célula, elutriación buffer empleadas y el aparato específico utilizado. La tasa de sedimentación de las células en estas condiciones es mejor descrita por la ley de Stokes: SV = [d2(ρ - ρpm) / 18η] .ω2r, donde SV = velocidad de sedimentación; d = Diámetro de la partícula; Ρp = densidad de la partícula; Ρm = densidad de la memoria intermedia; Η = viscosidad del tampón; Ω = velocidad angular del rotor; y r = posición radial de la partícula. Así, SV es proporcional a la densidad y el diámetro de la célula, y puesto que el diámetro se eleva a la potencia segunda, que contribuye más significativamente que la densidad que es generalmente constante a través del ciclo celular.

Una ventaja importante del CCE es que las células no están sujetos a duras condiciones del tratamiento químico o privación nutricional y pueden ser recuperadas en el excelente rendimiento de esencialmente imperturbable. Un requisito es que las células en cuestión se someten a un aumento significativo en el diámetro, de al menos el 30%, ya que atraviesan el ciclo celular. La principal desventaja es el costo de la centrífuga especializada, rotor y accesorios. Sin embargo, la capacidad de preparar las células enriquecidas en las fases del ciclo celular específica por CCE ha facilitado enormemente investigación de ciclo celular en organismos de la levadura a las células mamíferas9,10. Por otra parte, los avances recientes están ampliando usos a la separación de las células de saludables versus tejido canceroso, la separación de diferentes tipos de células en mezclas heterogéneas y a la producción de tipos específicos de la célula para inmunoterapia9.

Nuestro mayor interés ha sido comprender el mecanismo de acción de los microtúbulos a agentes (MTA) como alcaloides de la vinca y taxanos. Estos fármacos fueron pensados para actuar exclusivamente en la mitosis, bloqueo del husillo microtubule función11,12, pero la evidencia reciente sugiere que también puedan dirigir interfase microtúbulos13,14. Nos informó recientemente que las células primarios leucemia linfoblástica aguda (toda) someterse a la muerte tanto en la fase G1 o en los M fase cuando fueron tratados con vincristina y otros MTAs en una manera dependiente del ciclo celular15. La capacidad para separar todas las células en diferentes fases de la célula por CCE fue fundamental para llegar a esta conclusión. En este artículo, describimos los detalles técnicos y ofrecen consejos prácticos para la aplicación de camuflaje para la preparación de primaria todas las células en diferentes fases de la célula.

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Protocol


Nota: este protocolo ha sido optimizado para primaria-todas las células que varían en diámetro de aproximadamente 8 μm (fase G1) a 13 μm (fases G2/M). Así, la centrífuga específicas velocidades y caudales de bomba pueden no ser aplicables a las células con diferentes tamaños. Sin embargo, su caso elutriación parámetros se pueden calcular utilizando la ecuación de tasa de sedimentación. Las células son cultivadas en un medio definido libre de suero como descrito 16 a una densidad óptima de 1-3 x 10 6 células/mL. Con la excepción de la colección de fracciones que se lleva a cabo a 4 ° C utilizando tubos enfriado con hielo, todos los pasos se llevan a cabo a temperatura ambiente y la centrífuga a 20 ° C con una máxima de 24 ° C.

1. preparación del tampón de elutriación y materiales

  1. para reducir la aglutinación de las células, preparar una memoria intermedia de elutriación de Hank ' s balanceada (HBSS) una solución salina con rojo de fenol con 2% de suero bovino fetal ( FBS), para proteger las células contra estrés mecánico durante el proceso de elutriación y 1.6 g/L de sal dipotásico ácido 2-naftol-6,8-disulfónico (NDA), que representa el exterior de la célula con carga negativa y reduce la aglutinación.
    1. Añadir 1,6 g de NDA a un tubo cónico de 50 mL.
    2. Bajo condiciones estériles, añadir 35 mL de HBSS de una botella de 1 L a tubo cónico de 50 mL que contiene el NDA. Agitar el tubo hasta que se disuelva el NDA.
    3. Usando un filtro de 0.2 μm, transferencia de la NDA disuelta en un nuevo tubo cónico estéril 50 mL. Luego añadir la NDA a la restante 1 L de HBSS.
    4. Por último, añadir a la HBSS para obtener una concentración final de 2% (v/v) 21 mL FBS.
      Nota: El buffer de elutriación puede ser preparado y almacenado a 4 ° C hasta la fecha de caducidad en la HBSS, o hasta que haya un cambio importante en el pH como se indica por un amarillamiento del tinte indicador.
  2. Etiqueta 50 mL tubos cónicos para la recogida de fracciones que hay tubos etiquetados lavan 1 y 2 (W1 y W2), fracciones 1-20 (F1 - F20) y parada.
    1. Enfriado previamente estos tubos en hielo antes de recoger fracciones.

2. Montaje del sistema de elutriación

  1. en primer lugar, instale el conjunto de luz estroboscópica en la centrifugadora para que el cable de alimentación se alimenta de la cámara a través del puerto en el lado izquierdo. Asegúrese que la lámpara de flash estroboscópico en el frente de la cámara para que se alinee con la ventana de visualización cuando la centrífuga está cerrada.
    1. Fijar el conjunto en su lugar primero apretando dos tornillos de cabeza Phillips en los dos agujeros en la parte superior de cada soporte y luego a apretar los tornillos en la parte inferior de cada soporte.
    2. Enchufe el cable en el puerto de alimentación del strobe en la parte posterior de la centrifugadora.
  2. a continuación, ajustar el rotor hacia abajo sobre el eje de impulsión de centrífuga y asegure con una llave hexagonal de mango en T.
    Nota: Si la centrifugadora no es necesario para los propósitos no-elutriación, la Asamblea del estroboscópico y el rotor pueden conservarse en la centrifugadora entre.
  3. Una vez que el rotor está asegurado, coloque el conjunto de desenganche rápido que contiene la cámara de elutriación, contrapeso, rotación de conjunto del cierre y una placa de montaje en el rotor.
    1. Empuje hacia abajo uniformemente con una mano en la cámara de elutriación y otra parte en el contrapeso hasta que los pernos en el rotor encajen en los orificios de la placa de montaje.
    2. Finalmente, fije el cable de acerrojado colocar el pasador en un extremo del cable en el agujero en el ensamblaje del sello rotatorio y lograr la mirilla en el otro lado del cable con uno de los tornillos de cabeza Phillips (mencionados en 2.1.1) sobre el soporte en el lado izquierdo o f la cámara de.
  4. a continuación, montar el sistema de flujo utilizando una bomba de velocidad variable y tubería a almacenador intermediario de la bomba en la elutriación cámara y recoger buffer que fluye fuera de la cámara de elutriación.
    1. Inserte el tubo de entrada de tamaño 16 procedente de la bomba de velocidad variable a través del puerto en la parte superior izquierdo de la cámara de la centrífuga que entra en la cámara de.
    2. Acople un accesorio en el extremo libre de la tubería de entrada e Inserte el accesorio en el agujero de entrada en el lado el ensamblaje del sello rotatorio.
    3. Insertar el tamaño 16 de salida de la tubería a través del puerto y fije el tubo de transferencia en la parte superior de la rotación del sello conjunto.
      Nota: El sistema de flujo también puede permanecer montado entre elutriación.
  5. Por último, encienda la centrifugadora y establecer las especificaciones necesarias para el experimento.
    1. Cambio el rotor ID.
    2. Si la centrífuga requiere una entrada de tiempo, establecido por 2 h, que es más que suficiente para completar un elutriación ejecutar.
    3. Ajustar la temperatura a 20 ° C con una temperatura máxima de 24 ° C.
    4. Establecer la aceleración de la máximo y la desaceleración para lento.
    5. Por último, establecer la velocidad de 867 x g.

3. Cebado del sistema de elutriación

  1. para esterilizar el sistema de elutriación, coloque la tubería del embalse en una botella de plástico de 500 mL que contiene 5% de blanqueador y coloque la tubería de salida a una botella vacía 1 L plástico inútil.
    1. Encender la bomba y ajustar la velocidad a 25 mL/min y deje que el blanqueador de 5% a fluir a través del sistema de elutriación hasta que se bombea en el tubo de salida hacia la botella de residuos.
    2. Encender la centrifugadora y permita que venga al máximo señalado velocidad (867 x g) para lanzar las burbujas y la contrapresión.
    3. Parar la centrífuga. Una vez que el rotor haya dejado de girar, abrir la tapa e inspeccione la cámara en busca de fugas.
    4. Si no hay fugas, deje que la solución de lejía al flujo a través del sistema durante al menos 5 min
  2. a continuación, lave el sistema con agua esterilizada como blanqueador puede conducir a la formación de precipitados desde el búfer de elutriación que puede dar lugar a la aglutinación de las células, así como causar daño a las células.
    1. Lugar la tubería del embalse en una botella de 1 L de autoclave agua y permita que purgar durante al menos 10 min
  3. Después del lavado con agua, introducir el tampón de elutriación en el sistema. Utilizar un frasco de vidrio de 150 mL que ha sido esterilizado para crear una reserva para el búfer de elutriación y las células.
    1. Agregar 100 mL de tampón de elutriación a la botella y mover el tubo del depósito a la botella de vidrio para que el tubo está en el fondo muy.
    2. Inicie la centrifugadora y permitir que el tampón de flujo a través del sistema para eliminar el agua.
    3. Una vez que la botella de depósito está casi vacía y el agua se enjuaga completamente fuera del sistema, mueva el salida de la tubería de la botella de residuos al depósito para que el buffer es ser reciclado a través del sistema.
  4. Finalmente, ajuste la ventana de visualización para que la cámara de elutriación puede verse en la velocidad de la corriente.
    1. Prensa el estroboscópico lámpara de alimentación botón en la parte exterior de la centrifugadora para que la lámpara se enciende. Gire la elutriación kNob también en el exterior de la centrifugadora hasta la izquierda.
    2. Mientras mira por la ventana, lentamente gire la perilla a la derecha hasta que la cámara de elutriación entra en vista y la luz estroboscópica es en el tiempo con la rotación del rotor.
      Nota: El sistema de elutriación puede dejarse en este estado hasta que las células están preparadas.

4. Preparación de la muestra de células

células
  1. Conde y alícuota media de 300 a 400 millones en crecimiento en varios tubos cónicos de 50 mL. Desactivación de las células a 1210 x g durante 3 min
  2. Aspiración de crecimiento los medios de comunicación y resuspender las células en 25 mL de tampón de elutriación transfiriendo hacia arriba y hacia abajo suavemente.
  3. Para reducir la aglutinación de la célula, las células Pase dos veces por un 25 calibre aguja.
    1. Utilizando una jeringa de 10 mL elaborar las células y luego acople la aguja de calibre 25 y pasar las células a través de en el interior pared de un tubo cónico estéril 50 mL. Repetir este proceso hasta que hayan pasado los 25 mL a través de la aguja.
    2. Obtener una nueva aguja y jeringa y repetir el proceso por encima de una vez.
      PRECAUCIÓN: Las agujas de la jeringa deben ser colocadas en envases de los sostenidos.
      Nota: Es crítico que las células son empujadas a través de la aguja inmediatamente antes de la introducción al sistema de elutriación para mantener células agrupar a un mínimo.

5. Introducción de la muestra de células en el sistema de elutriación y colección de fracciones

  1. Introduzca la muestra de células en el sistema de elutriación vertiendo la muestra de células en el depósito que tiene el buffer restante de elutriación reciclaje a través de .
    1. Que las células entrar en el sistema y alcanzar el equilibrio dentro de la cámara de elutriación.
      Nota: Este proceso tardará alrededor de 5 minutos y progreso puede ser rastreado por observación de las células al entrar en la cámara a través de la ventana de visualización. Para garantizar todas las células en la cámara, toma una gota de eluyente, coloque en un portaobjetos de vidrio y ve bajo el microscopio. Si la muestra está libre de las células intactas, esto confirma su retención en la cámara de.
  2. Comenzar a recoger fracciones de una vez todas las células han entrado en la sala y hay un límite distinto en la parte más ancha de la cámara en la que las células están en equilibrio.
    1. Comenzar moviendo el tubo de salida para el tubo cónico de 50 mL etiquetado como W1. Recoger 50 mL de tampón de elutriación de esta fracción, asegurándose de mantener un ojo en el tanque de depósito y llenar con tampón de elutriación cuando sea necesario.
      Nota: Para asegurarse de que todas las células han entrado en el sistema, permita que el depósito a ser casi vacío antes de rellenar el depósito de la primera vez. Después de la primera recarga no será necesario esperar el depósito a ser casi vacío. Además, no siempre deje que el tanque se convierten en vacíos como esto creará burbujas y contrapresión en el sistema.
    2. Una vez que se han recogido 50 mL para W1, cambiar la velocidad a 821 x g y mover el tubo de salida para el tubo cónico etiquetado W2 y simultáneamente recoger más a esta velocidad 50 mL.
    3. Continuar cambiando la velocidad y la recolección de fracciones como se indica en la tabla 1. Asegúrese de que hay medios en el depósito del tanque y mantienen los tubos cónicos en el hielo en todo momento. Por último, ajustar la ventana girando la perilla a la derecha poco a poco a medida que disminuye la velocidad de.
    4. Una vez 20 fracciones todos han sido recogidos, parar la centrífuga y recoger 50 mL en el tubo cónico marcado STOP.

6. Flushing del sistema de elutriación

  1. después de la centrífuga ha detenido totalmente al ras del sistema colocando el tubo reservorio en la botella de 1 L de agua esterilizada y el tubo de salida nuevamente en la botella de residuos.
    1. Girar a la velocidad de la bomba a 50 mL/min y deje el agua correr por el sistema hasta que se gaste.
  2. Girar a la bomba, retire la manguera de entrada y salida de la liberación rápida y saque la clavija del cable de anclaje de.
    1. Retire el conjunto de desenganche rápido del rotor.
      Nota: Dependiendo de lo que la centrífuga se usará para, el sistema de elutriación puede ahora dejarse como está. De lo contrario, todo el conjunto puede ser derribado en orden inverso como se describió anteriormente. La cámara de elutriación puede retirarse de la Asamblea de liberación rápida y limpia entre tramos mediante un baño de agua ultrasónico. Esto elimina desechos y contaminantes de la pared de la cámara que puede afectar negativamente corre más tarde.

7. Análisis de fracciones y colección del G1 o G2/M piscinas.

Nota: para demostrar la eficacia de elutriación, cada fracción se analiza para el recuento de células, la célula diámetro y contenido de ADN, y piscinas son creadas de células en las fases G1 o G2/M para el análisis de immunoblot, como se describe en Representante de los resultados. Esta sección del protocolo describe cómo crear estas piscinas y prepararlos para su uso experimental.

  1. Spin cada fracción a 2000 x g durante 5 min a 4 ° C y aspirado de búfer de elutriación.
  2. Combinar fracciones para obtener una piscina de fase G1 y una piscina de fases G2/M.
    1. Para el G1 fase piscina, resuspender fracciones que fueron recogidas en el rango de velocidad de 788 g x 661 x g (F1 - F5) en un total de 1 mL de solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS) y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL. Para el grupo de fases G2/M, resuspender fracciones que fueron recogidas en el rango de velocidad de 387 x g y g x 333 (F17 - F20).
    2. Desactivación de células a 2000 x g durante 5 min a 4 ° C y aspirado apagado PBS.
  3. Resuspender las células en 10 mL de medio de crecimiento y llevar un conteo de.
  4. Tomar una alícuota de cada grupo de análisis ADN contenido mediante tinción de yoduro de propidio y flow cytometric análisis 15.
    Nota: El resto de cada piscina se puede utilizar para experimentos adicionales.

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Representative Results

Primaria todas las celdas (3-4 x 108) fueron objeto de elutriación centrífugo y recogido en dos fracciones del lavado y veinte fracciones principales, como se describe en el protocolo. La tabla 1 muestra datos representativos donde se presenta el número total de células en cada fracción, así como la correspondiente velocidad de rotor. Total rendimiento era típicamente sobre 80%. Medición del diámetro de la célula en fracciones individuales confirmó que diámetro celular aumentado con avance de elutriación (figura 2). Estos resultados representan promedios de dos determinaciones independientes y reflejan el alto grado de reproducibilidad de los datos. Fracciones siguientes fueron sometidas a coloración de yoduro de propidio y citometría de flujo para determinar el contenido de ADN (figura 3). Primeras fracciones (F1 - F5) contuvieron casi exclusivamente las células con 2N contenido de ADN que representa la fase G1. Una mezcla de células en fase S y fase G1 se observó en fracciones intermedias (F6 - F9) y células con contenido de ADN 4N fueron observados a partir de F10. Fracciones más adelante tenían principalmente de células con contenido de ADN 4N que representan fases G2/M. Estos datos junto con los resultados de la figura 2 confirman una relación entre el tamaño de la célula y la fase del ciclo celular.

Basado en estos resultados, fracciones F1 - F5 se combinaron para crear un grupo de células en fase G1, y fracciones F17 - F20 se combinaron para crear un pool de células en fase G2/M. La proporción de células con contenido de ADN de 2N en la piscina de la fase de G1 era típicamente 99%, y la proporción de células con contenido de ADN 4N en la piscina de G2/M era típicamente 85%, según lo determinado por la coloración de yoduro de propidio y citometría de flujo. Condiciones asincrónica, 60-70% de todas las células están en fase G1 y 15-20% de primaria están en G2/M fases15, por lo tanto los valores obtenidos después de elutriación reflejar altos niveles de enriquecimiento. Para autentificar aún más las dos piscinas con respecto a la fase del ciclo celular, los extractos de cada uno fueron sometidos a immunoblotting con marcadores de fases G1 o G2/M. En primer lugar, se utilizó un anticuerpo específico de fosfo que fosforila la proteína retinoblastoma (Rb) en Ser-807 o Ser-811, ya está bien establecido que cada vez más se convierte en fosforila Rb como avance de las células a través del ciclo celular17 . Como se muestra en la figura 4, niveles de fosfo-Rb eran mucho más altos en las células en la piscina de G2/M frente a la piscina de la fase G1, consistente con las expectativas. También hemos sondeado para ciclina B1, que se expresa altamente en células en fase G2/M, y ciclina D1, que se expresa altamente en G1 fase células18 (figura 4). La piscina de G2/M tenía niveles superiores de la ciclina B1 frente a la piscina de G1, consistente con las expectativas. Ciclina D1 dio solamente una señal débil en estas preparaciones, pero sin embargo fue indetectable en la piscina de G2/M y perceptible en la piscina de G1. GAPDH se utilizó un control para confirmar la carga de proteína igual.

Se realizaron modificaciones en el protocolo estándar para evaluar sus efectos y establecer las condiciones para un rendimiento óptimo. En primer lugar, el número de fracciones recogidas disminuyó, desde los veinte estándar a sólo tres, utilizando velocidades determinadas la tabla 1 para representar los puntos terminales de colección de células en las fases G1, S o G2/M, como se muestra en la tabla 2. Análisis del contenido de ADN de las fracciones F1 y F3 se muestran en la figura 5A. Fracción 1 contuvo las células altamente enriquecidas en fase G1 (95%) y era así de pureza similar a la obtenida en condiciones estándar (figura 3). Sin embargo, fracción 3, aparentemente las células altamente enriquecido en fase G2/M, dio una población mixta, con células en las fases G1 y S también presentes. G2/M células representaban sólo el 51% del total, comparado con 85% bajo condiciones estándares. Estos resultados indican que los intentos simplificar el procedimiento, reduciendo el número de fracciones compromisos muestra calidad. A continuación, probamos el efecto de reducir el volumen de la fracción, como un medio para reducir el consumo de reactivo. Se realizó un elutriación estándar excepto que se recolectaron 40 mL en lugar de fracciones de 50 mL. Se analizaron fracciones F1 y F20 para contenido de ADN. Como se muestra en la figura 5B, fracción F1 se enriquece altamente en células en G1 fase (98%), similares al obtenido bajo condiciones estándar. Sin embargo, las células F20 contenida la fracción en las tres fases, con células en fase G2/M sólo que representa 64% del total, compararon con 85% bajo condiciones estándares. Estos resultados indican que también reduce el volumen de fracción compromete la calidad de la muestra.

Figure 1
Figura 1 . Principio de elutriación centrífuga contracorriente.
Nota que elutriación de células se logra mediante el aumento de la tasa de contracorriente como se indica o disminuyendo la velocidad del rotor. Adaptado con permiso de Macmillan Publishers Ltd: [protocolos] de naturaleza (Ref 8)., copyright (2008)8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Diámetro de todos los primarios de las células aumenta en fracción de elutriación.
Se determinó el diámetro promedio para cada fracción usando un analizador celular que graba datos de celdas individuales de 500 4.500 por muestra. Los datos son medias ± D.E. de dos experimentos independientes. Cuenta que barras de error de muchos puntos son más pequeños que el símbolo fueron omitidos para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Análisis de contenido de ADN confirma separación exitosa de primaria todas las células en diferentes fases de la célula.
10 mL de cada fracción se fija en el 70% EtOH, teñidos en yoduro de propidio y analizadas por citometría de flujo, como describe a15. Intensidad de integrado el yoduro de propidio (eje x) se representan gráficamente frente al conteo (eje y) para determinar la porción de células en cada fase, donde el contenido de ADN de 2N indica fase G1, y contenido de ADN 4N células en las fases G2 o M. Los datos mostrados son de un experimento representativo y esenciales idénticos resultados se han obtenido en cuatro repeticiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Combinaron el análisis de Immunoblot de proteínas relacionadas con el ciclo celular enfracciones.
Siguiendo un estándar elutriación de primaria todas las células, fracciones F1 - F5 se combinaron para crear una piscina de fase G1 y fracciones F17 - F20 se combinaron para crear un pool de fase G2/M. Los extractos fueron preparado y 40 μg/carril sometido a análisis del immunoblot, tal como se describe anteriormente15, con anticuerpos fosfo-Rb (Ser807/811), ciclina B1 y ciclina D1, todo usado en la dilución de 1:2,000. GAPDH (1:10, 000) fue utilizado como un control de carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Datos ilustrativos de elutriations subóptimas.
A) efecto de la disminución del número de fracciones recogidas. Sólo tres principales fracciones (F1 - F3), en lugar del estándar de veinte, cada una de 100 mL, se obtuvieron, a velocidades como se indica en la tabla 2. Se analizaron fracciones F1 y F3 para el contenido de ADN como en la figura 3. B) efecto de reducir el volumen de la fracción. Se colectaron veinte fracciones, en las mismas condiciones como en la tabla 1, pero sólo 40 mL de tampón de elutriación en lugar de la estándar 50 mL se utilizó para cada uno. Se analizaron fracciones F1 y F20 para contenido de ADN como en la figura 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fracción Velocidad (rpm) G-Force Total de células (x 10 ^ 6)
W1 3000 867 g x 17,75
W2 2920 821 x g 7.00
F1 2860 788 x g 4.60
F2 2800 755 x g 10.75
F3 2740 723 x g 15,25
F4 2680 692 x g 22.50
F5 2620 661 x g 26.75
F6 2560 631 x g 25.00
F7 2500 602 x g 22.75
F8 2440 573 x g 18.00
F9 2380 546 x g 14.00
F10 2320 518 x g 10.75
F11 2260 492 g x 7.43
F12 2200 466 x g 8.63
F13 2140 441 x g 6.63
F14 2100 425 g de x 4,98
F15 2060 409 x g 3.46
F16 2020 393 x g 3.43
F17 1980 378 x g 2.63
F18 de 1940 363 x g 3.17
F19 1900 248 x g 2.78
F20 1860 333 g de x 1.66
PARADA 0 0 x g 5.19
Rendimiento total 245.06
Por ciento de la producción 81.69

Tabla 1. Rendimiento y velocidad de rotor correspondiente para cada fracción de la célula.
Conteo de células se determinó utilizando un contador de células automatizado. El rendimiento total fue determinado por la suma de fracciones individuales versus entrada (3 x 108 células). Los datos son un promedio de dos experimentos representativos. Fuerza centrífuga y la velocidad del rotor correspondientes se dan.

Fracción Velocidad (rpm) G Force
W1 3000 867 g x
W2 2920 821 x g
F1 2620 661 x g
F2 2020 393 x g
F3 1860 333 g de x
Parada 0 0 x g

Tabla 2. Parámetros de velocidad de elutriación subóptima.
Se muestran las fuerzas centrífugas y correspondientes velocidades de rotor para los lavados y tres fracciones recogidas en un comprimido elutriación subóptima. Ver figura 5A para el correspondiente contenido de ADN y el texto para más detalles.

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Discussion

Hemos descrito un método para la obtención primaria todas las células en diferentes fases del ciclo celular mediante camuflaje. Bajo condiciones óptimas una población esencialmente pura de células en fase G1 y una población altamente enriquecida de células en las fases G2/M podrían fácilmente obtener en rendimiento excelente, y las células altamente enriquecidas en fase S también pueden obtenerse si se desea. Los resultados aquí presentados se obtuvieron mediante una primaria de que toda cultura (específicamente, ALL-5) y esencialmente idénticos resultados se han obtenido con una cultura independiente, todo-215. Además, todos los demás primaria todas las culturas examinadas hasta la fecha tienen similares rangos de densidad durante el crecimiento asincrónico y probablemente realizar semejantemente cuando se someten a CCE. Nuestros estudios previos han demostrado también que otras líneas celulares de leucemia, incluyendo HL60 y K562, pueden dividirse en fases de ciclo celular diferentes utilizando CCE19,20. Pasos críticos en el procedimiento incluyen garantizar que las células son dispersadas por el mono y no agrupadas en el inicio de la carrera. optimización de las condiciones de contracorriente tasa y rotor de velocidad; asegurar los componentes del sistema estén limpios y libres de escombros; y evitar la introducción de burbujas de aire en las líneas de flujo. CCE funciona mejor con las células que aumentan significativamente en tamaño de celda que avanzan a través del ciclo celular. Para una determinada población de células en suspensión, esto se puede establecer inicialmente y fácilmente examinando la relación entre el contenido de ADN y dispersión lateral, el último dependiente en tamaño de celda. Ambos parámetros pueden medirse simultáneamente mediante citometría de flujo después de la coloración, el yoduro de propidio como hemos descrito15. Una relación lineal entre el contenido de ADN y dispersión lateral proporciona confianza en que el tamaño de la celda aumenta con el avance del ciclo celular y así que CCE tiene el potencial para separar las células basada en fase de ciclo celular.

Como hemos mostrado (figura 5), las desviaciones del procedimiento optimizado de resultan en la calidad de la muestra comprometida, especialmente para las células en las fases G2/M. Sin embargo, la reducción en el número de volumen de la fracción o fracciones no apreciable afectó a la pureza de las células en fase G1 (figura 5). Por lo tanto, atajos para el procedimiento pueden tolerarse si sólo se necesitan células en fase G1 purificadas. Aunque el camuflaje es fácilmente susceptible a los cultivos celulares de suspensión, también se puede aplicar a fracciones subcelulares. Por ejemplo, núcleos de las células pre-b murinos han sido exitosamente tamaño-separados utilizando CCE8. Tipos de células adherentes representan posibles problemas debido a su propensión para agrupar y posible adherencia a las superficies de la cámara de tubo y elutriación y así se deben investigar con cautela.

La principal limitación del CCE es el costo de los equipos; una posible solución es la colaboración con un laboratorio que tiene el aparato necesario. Tenga en cuenta que mientras que el rotor es un instrumento dedicado, la centrífuga se puede utilizar para fines generales de la centrifugación, reduciendo así el costo invertido únicamente en la CCE. Otra limitación es que la programación de experimentos más problemática respecto a la flexibilidad de otros métodos como la sincronización de inanición o química de suero. Elutriación funciona típicamente toma 5-6 horas, y si las células obtenidas son necesarios posteriormente para experimentos a corto plazo o multi-tiempo punto, esto puede resultar en horarios inconvenientes. La mayor ventaja es que las células obtenidas por este método son imperturbable y pueden ser cultivadas por muchos días sin ningún signo de angustia, como hemos demostrado15. Esto contrasta con las células sincronizadas por medios químicos que pueden abrigar el daño inducido por la droga. Un estudio reciente, utilizando NB4 en células de la leucemia mieloide aguda de blastos, comparó directamente CCE y otros métodos, incluyendo la detención con hambre de suero, hidroxiurea o tratamiento con un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina 1, RO-330621. Elutriated células y detenido en fases comparables parecían similares en relación con el contenido de ADN y expresión de ciclina. Sin embargo, cuando se examinó el proteoma, grandes cambios en la abundancia de la proteína, particularmente relacionados con el estrés y las proteínas específicas de detención, se observaron en las células detenidas y no en las células elutriated en las posiciones de tamaño equivalente de la célula. Estos resultados destacan la utilidad de la CCE para la producción de células imperturbable y hacer hincapié en que debe tener precaución al interpretar los datos de las células sincronizadas por otros medios.

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Disclosures

Anisha Kothari está actualmente en el Departamento de biología celular y Molecular de St. Jude Children Research Hospital.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por NIH CA109821 (a la TCC). Agradecemos a Beckman-Coulter generosamente fondos para cubrir los costos de publicación y de asistencia técnica en la instalación y operación del sistema de elutriación. Agradecemos a Dr. Fred Falkenburg para proporcionar primaria inicial de todas las culturas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks' balanced salt solution Lonza 10-508Q 1 L bottle
Fetal Plus bovine serum Atlas Biologicals FP-0500-A 500 mL bottle
2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt Acros Organics 212-672-4 100 g powder
50 mL concial tubes Denville Scientifics C1062-P 500/case
PES Membrane 0.22 µm filter unit Millipore SLGP033RB 250/pack
Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V Beckman Coulter B14544 centrifuge compatible with elutriation system
JE 5.0 elutriator rotor kit Beckman Coulter 356900 rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly
Chamber, standard, 4-mL, "A" Beckman Coulter 356943 standard elutriation chamber 
Masterflex L/S Easy-Load pump head Cole-Parmer EW-07518-10
Masterflex L/S Variable-Speed Drive Cole-Parmer EW-07528-10
Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 Cole-Parmer EW-96420-16
25 G x 1.5 Precision Glide needle BD 305127 sterile, single-use needles
10 mL Luer-Lok syringe BD 309604 sterile, single-use syringes
Vi-Cell XR Beckman Coulter 383556
PI/RNase staining buffer BD Pharmingen 550825 propidium iodide/RNase staining buffer
cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-245
cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 8516s
GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 2118s
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6516
Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6515

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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