Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

Developmental Biology

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Summary

Aquí, describimos un protocolo para montaje entero de la inmunofluorescencia y análisis volumétrico cuantitativo basado en imágenes de embriones de ratón de etapa temprana. Presentamos esta técnica como un potente enfoque cualitativa y cuantitativamente evaluar estructuras cardiacas durante el desarrollo, y proponer que sea ampliamente adaptable a otros sistemas del órgano.

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Bardot, E., Tzavaras, N., Benson, D. L., Dubois, N. C. Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (128), e56446, doi:10.3791/56446 (2017).

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Abstract

El uso de técnicas de imagen constante avance ha contribuido ampliamente a nuestra creciente comprensión del desarrollo embrionario. Organogénesis y desarrollo previo a la implantación son dos áreas de investigación que se han beneficiado enormemente de estos avances, debido a la alta calidad de los datos que pueden obtenerse directamente de la proyección de imagen antes de la implantación embriones o ex vivo de órganos. Mientras que antes de la implantación embriones han arrojado datos con muy alta resolución espacial, etapas posteriores han sido menos susceptibles de reconstrucción tridimensional. Obtención de datos 3D o volumétricos de alta calidad para estructuras embrionarias conocidas en combinación con la asignación de destino o localización del linaje genético permitirá un análisis más exhaustivo de los eventos morfogenéticos tienen lugar durante la embriogénesis.

Este protocolo describe un enfoque conjunto de montaje de la inmunofluorescencia que permite el etiquetado, la visualización y la cuantificación de poblaciones de células progenitoras en el desarrollo cardiaco la media luna roja, una estructura clave formada durante el desarrollo del corazón. El enfoque está diseñado de tal manera que se puede obtener tanto información a nivel de célula y tejido. Usando microscopia confocal y procesamiento de imágenes, este protocolo permite la reconstrucción espacial tridimensional de la media luna cardiaca, proporcionando así la capacidad de analizar la localización y organización de las poblaciones progenitoras específicas durante esta fase crítica del desarrollo del corazón. Lo importante es el uso de anticuerpos de referencia permite enmascarar sucesivo de la media luna cardiaca y posteriores mediciones cuantitativas de áreas dentro de la media luna. Este protocolo no sólo permitirá un examen detallado del desarrollo temprano de corazón, pero con adaptaciones debería ser aplicable a la mayoría los sistemas del órgano en la gástrula en embrión temprano de ratón de la etapa del somite.

Introduction

El estudio de la organogénesis ha dependido mucho de la observación de eventos morfogenéticos en el embrión en desarrollo. Estos estudios con frecuencia se basan en el uso de colorantes fluorescentes o linaje seguimiento reporteros en combinación con el etiquetado de las poblaciones de referencia definido. 1 mediante la comparación de posiciones relativas de estas etiquetas, puede extraerse información sobre el origen, el movimiento o la última contribución de una población de interés. Trasplante y experimentos de mapeo del destino utilizan hitos morfológicos o inyección de colorantes en linajes no-motile para definir el punto de partida de las células de interés, que luego son examinadas por contribución al embrión desarrollado. 2 , 3 , 4 , 5 experimentos de rastreo de linaje genéticos utilizan el mismo concepto con alelos de reportero bien definidos que se utilizan para las poblaciones de la célula de la etiqueta sin manipulación experimental. Clave de estos enfoques es la capacidad para determinar, con alta resolución espacial, los lugares de la experimental y etiquetas de referencia. Estos enfoques han dado progreso sobresaliente en desarrollo antes de la implantación y explantación estudios de organogénesis. 6 , 7 , 8 , 9

Los eventos del desarrollo que subyacen la morfogénesis del corazón han descrito cada vez más bien en los últimos años. 10 uno de los principales descubrimientos en este área de investigación es la descripción de un número de las poblaciones progenitoras que pueden distinguirse por la expresión de marcadores únicos. 11 estas poblaciones incluyen el primer y segundo campos de corazón (FHF y SHF), que están presentes dentro de la media luna cardiaca en el lado anterior del embrión en el día embrionario (E) 8.25 del desarrollo del ratón. 12 estas poblaciones son examinadas con frecuencia mediante una combinación de microscopía de amplio campo, que proporciona información a nivel de tejido y seccionamiento serial con ensayos de inmunofluorescencia, que ofrece alta resolución celular pero sólo información espacial bidimensional. 13 así, aunque estos estudios han avanzado enormemente nuestra comprensión del desarrollo del corazón, los métodos disponibles han limitado en profundidad cuantitativa de la morfogénesis durante estas etapas, creando la necesidad de enfoques examinar la Organización de estas poblaciones a nivel del organismo entero.

Los recientes avances en microscopia confocal y análisis de imágenes 3D permiten reconstrucciones algorítmicas alta resolución y alto rendimiento de las células y estructuras en situ con relativa facilidad, abriendo así el camino para estudios detallados del complejo estructuras celulares. 14 con el aumento del poder computacional y el desarrollo de algoritmos de manejo grandes datos, ambos necesarios para manejar el aumento exponencial del tamaño de conjuntos de datos, la proyección de imagen análisis pueden ahora ser completamente automatizados. 15 análisis automatizado de imágenes de conjuntos de datos tiene la ventaja de ser imparcial, pero sólo es tan confiable como la calidad del conjunto de datos de entrada; es imperativo, entonces, que las mejores prácticas se utilizan durante la adquisición y pre-procesamiento de imagen para asegurar la más alta calidad, el análisis imparcial. 16 protocolos pueden ser completamente automatizado y compartido para la reproducibilidad, y los algoritmos utilizados por software privativo son fácilmente disponibles a través de bibliotecas para ser utilizado por los científicos que tienen familiaridad con el propietario moderno o de código abierto herramientas para desarrolladores. 17

El protocolo siguiente explica los pasos necesarios para realizar dicho análisis en un modelo bien definido de la organogénesis, la formación de la media luna cardiaca durante el desarrollo del corazón. Específicamente, este protocolo describe cómo (1) cosechar y diseccionar embriones en fase de media luna cardiaca, (2) realizar inmunofluorescencia montar todo de referencia (Nkx2-5) y experimental (Foxa2Cre:YFP18,19) marcadores (3) preparar y los embriones usando microscopia confocal, la imagen y finalmente (4) analizar y cuantificar las imágenes usando el enfoque tridimensional avanzada. Mientras que la media luna cardiaca se utiliza como un ejemplo aquí, con la modificación apropiada, este protocolo puede utilizarse para el análisis de múltiples linajes de gástrula a embriones en fase temprana somite.

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Protocol

todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la escuela de medicina de Icahn en el Monte Sinaí.

1. cosecha y procesamiento cardiaca embriones en fase de media luna

  1. Mate un ratón hembra fértil con un macho semental fértil.
  2. Enchufe de
  3. verificación de la presencia de una cópula vaginal usando una prueba contundente o fórceps. Mediodía en el día de detección de enchufe se considera embrionario día (E) 0,5 (ver figura 1A para la línea de tiempo completo).
    Nota: Tapones deberán ser revisados para por la mañana, ya que son perdidas durante todo el día.
  4. En la mañana del día 8 (E8.25), sacrificar la presa embarazada por inhalación de CO 2, o según las regulaciones locales e institucionales.
    Nota: Tiempo exacto puede ser dependiente de la tensión y debe determinarse empíricamente por morfología.
  5. Rociar el abdomen del ratón con etanol al 70% para limpiar la zona y minimizar el vertimiento. Exponer las vísceras mediante la realización de una incisión abdominal a través de la piel y la pared del cuerpo.
  6. Localizar el útero y retire con cuidado el cuerno uterino completo del animal. Comience cortando por encima de un oviducto, recorte la grasa lejos del útero y proceder a la terminación cervical. Corte a través del cuello uterino y continuar al extremo superior del otro oviducto, corte para liberar el útero entero.
  7. Lugar del útero en 10 cm plato con fosfato tampón salino (PBS, pH 7,4) lavar el exceso de sangre. Diseccionar el útero cortando el mesometrium entre cada deciduum, que contiene los embriones. Transfiera los embriones a un plato de 6 cm con PBS fresco.
  8. Bajo un microscopio de disección, usar pinzas finas (#5) para eliminar el tejido del útero de tejido decidual.
  9. Con pinzas, con cuidado corte la punta de la mitad embrionaria del deciduum para revelar el embrión. Pellizcar el deciduum para expulsar el embrión y saque con cuidado el embrión.
  10. Disecar tejidos extraembrionarias lejos tanto como sea posibles sin dañar la morfología del embrión ( figura 1B).
  11. Utilizar una pipeta para colocar los embriones en un tubo de 1,5 mL con PBS fresco y coloque en hielo. Repita 1.7-1.9 para los embriones restantes antes de continuar.
  12. PBS
  13. aspirado y enjuague una vez con PBS. Aspirar PBS.
    Nota: Intentar eliminar tanto PBS como sea posible sin dañar o secar los embriones. Extracción manual de las soluciones se recomienda en todas las medidas para evitar la pérdida de embriones.
  14. Embriones de solución con el 4% paraformaldehido (PFA) en PBS durante 1 h a RT.
    Nota: Los embriones pueden ser fijo durante la noche (O/N) a 4 ° C.
  15. Enjuague tres veces con PBS. Mantener los embriones a 4 ° C hasta que esté listo para proceder con inmunofluorescencia.
    Nota: Hacer una pausa en punto. Los embriones pueden ser guardados en PBS a 4 ° C durante varias semanas.

2. Tinción de inmunofluorescencia

Nota: las condiciones de incubación más abajo se pueden ajustar para adaptarse a diferentes horarios. Se recomienda el uso de agitación suave o mecedora para todos los pasos de incubación largo.

  1. PBS de quitar y añadir 1 mL de solución amortiguadora de bloqueo (saponina del 0.5%, 1% albúmina sérica bovina (BSA) en PBS).
  2. Incubar al menos 4 h a TA. Esto se puede también hacer O/N a 4 ° C.
  3. Quitar el amortiguador de bloqueo y agregue la mezcla de anticuerpo primario diluido en solución amortiguadora de bloqueo. Incubar O/N a 4 ° C.
    Nota: Ver materiales de sección para la descripción de los anticuerpos utilizados y sugirió diluciones. Las diluciones del anticuerpo deben determinarse empíricamente. El uso de Nkx2-5 como una referencia para la media luna cardiaca se recomienda y es imagen clave para posteriores pasos de análisis y segmentación de.
  4. Eliminar anticuerpos primarios por la aspiración de.
  5. Lavado 3 veces durante 1 hora cada uno con 0,1% Triton en PBS.
  6. Retirar lavado y añadir mezcla de anticuerpo secundario diluido en buffer de bloqueo. Incubar durante 3 h a TA. Esto se puede también hacer O/N a 4 ° C.
  7. Lavado 3 veces durante 1 hora cada uno con 0,1% Triton en PBS. Esto se puede también hacer O/N a 4 ° C.
  8. Contratinción con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en PBS durante 10 minutos
    Nota: Este contraste puede realizarse simultáneamente con el anticuerpo secundario.
  9. Lavado 2 veces durante 5 minutos cada uno con 0,1% Triton en PBS.
  10. Suspender lentamente embriones en medios de montaje anti-fade (2% w/v n-propil galato (nPG), 90% glicerol, 1 x PBS; Consulte la sección materiales para más detalles). Permita que se alcancen por lo menos 1 h antes del montaje. Suavemente mueva el tubo periódicamente para ayudar a los embriones a la gota en la solución de tratamiento anti.
    Nota: Hacer una pausa en punto. Los embriones pueden almacenarse durante varios días en la solución de anti-fade hasta que esté listo de montar y de imagen.

3. Embriones de montaje para microscopia

microscopio
  1. preparar diapositivas para montaje con cinta de pegar o separadores de silicona. Si usa cinta de pegar, hacer dos pilas paralelas de 5-6 capas unos 15-20 mm aparte. Esto dejará suficiente espacio para colocar los embriones y asegurar el cubreobjetos ( figura 1).
  2. Coloque una gota de 15 μl de anti-fade en la diapositiva, entre la cinta de pegar. Cuidadosamente transferir un embrión a la diapositiva.
    Nota: más de un embrión se puede colocar sobre un portaobjetos. Sin embargo, los pasos subsecuentes de la orientación son más difíciles con múltiples embriones, e imagen larga duración puede conducir a blanquear foto.
  3. Bajo un microscopio de disección con unas pinzas finas, coloque el embrión, que se enfrenta a la parte anterior de la corredera con el eje del cuerpo en línea con el eje largo de la diapositiva. Ver figura 1 para un diagrama esquemático de la configuración del montaje.
  4. Coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre la muestra descansando a un lado en una pila de la cinta de pegar y usar pinzas para bajar suavemente el cubreobjetos hasta que toque la cinta otros.
    Nota: Los pasos 3.3 y 3.4 son críticos para asegurar la orientación correcta del embrión para la proyección de imagen. Bajando el cubreobjetos a lo largo de la parte posterior hacia anterior, no debe funcionar el embrión y la región cardiaca media luna quedará orientada de la diapositiva, que es ideal para la proyección de imagen en un microscopio invertido.
  5. Utilice una pipeta para añadir más anti-fade entre portaobjetos y cubreobjetos para evitar que la muestra muriendo durante el almacenamiento de información e imágenes.

4. Proyección de imagen confocal

  1. adquirir imágenes con el más alto objetivo de ampliación que permite la región media luna todo cardiaca ser capturado en un campo de visión. Utilice velocidades de muestreo de Nyquist para determinar dimensiones de x-y-z voxel. Mayoría de fabricantes de microscopio tendrá un " optimizar " botón para muestreo de Nyquist.
    Nota: Tinción de Nkx2-5 es beneficioso, como lo será delinear toda la región cardiaca de media luna. Paso Z más pequeñas (sobremuestreo) producirá resultados de modelado en 3D mejor pero puede conducir a tiempos de adquisición prolongado de blanqueo para algunas muestras.
  2. Establecer parámetros mediante las prácticas estándar de la mejor imagenológicos de la proyección de imagen. Es decir, utilizar la menor intensidad posible láser para lograr buena relación señal a ruido para cada fluoróforo y elegir la ganancia y offset niveles que producen un amplio rango dinámico sin saturar la señal de.
    Nota: Ser coherente con los parámetros entre las muestras que se comparará directamente la proyección de imagen. Esto es especialmente importante para posteriores análisis 3D y cuantificación.

5. Análisis y modelación 3D cuantitativa de la imagen

Nota: De este protocolo, imágenes se analizaron con el paquete de software Imaris. Análisis similar posible utilizando paquetes alternativos. La descripción siguiente cubre la tubería de análisis para un canal de referencia (es decir, Nkx2-5) y un canal experimental (es decir, YFP). Canales adicionales pueden ser analizados a través de la repetición de estos pasos. Un conjunto de datos de ejemplo ha sido siempre que puede utilizarse para replicar el análisis abajo.

  1. Cargar conjuntos de datos de imagen raw en vista Imaris Arena y abrir archivo para embrión deseado en la vista Surpass. Deben cargar datos en la vista 3D en modo (máximo) de MIP. Abra la ventana de ajuste de la pantalla y seleccionar sólo el canal de referencia.
  2. Ajustar el umbral de la imagen si es necesario para la mejor visualización. Para este análisis, ajustar la gamma si la relación señal a ruido es demasiado baja para segmentación.
    Nota: En caso de correcciones de gamma, que son ajustes no lineales, las imágenes ajustadas no pueden utilizarse para mediciones de intensidad o comparaciones. En esta etapa se puede realizar más tratamiento previo de la imagen (es decir, correcciones de iluminación, Desenfoque gaussiano u otro filtrado), si su cociente signal-to-noise no es satisfactorio. Si usted decide hacer un tratamiento previo, debe realizar los mismos pasos de preprocesamiento para todas las imágenes en el conjunto de datos.
  3. Crear una nueva superficie para el canal de referencia usando el diálogo algoritmo superficie.
    1. Seleccione el " sólo una región de interés del segmento " checkbox.
    2. Ajustar la región de cuadro delimitador que contiene la región de interés (ROI, es decir, el área media luna cardiaco) según lo delineado por la mancha de la referencia.
    3. Seleccione el canal de referencia en el menú desplegable de canales de origen. La configuración predeterminada para alisar (igual al tamaño de voxel de z) es normalmente suficiente, pero puede requerir optimización empírica. Para este análisis, utilice suavizado igual a la mitad el z voxel tamaño.
    4. Realizar umbral de intensidad absoluta. Para asegurar que la superficie no se extiende más allá de la señal del canal, ajustar el límite inferior usando los cursores.
      Nota: Para determinadas imágenes donde las células se pueden delinear fácilmente, puede incluir la " split tocar objetos " algoritmo, para separar aún más la señal de fondo.
    5. Filtro de objetos por volumen o número de voxel y rechazar objetos de fondo (pequeñas o en zonas fuera del área de Nkx2-5) que el algoritmo podría haber generado. Terminar el algoritmo de.
  4. Con la superficie recién creada, crear un canal encubierto para el canal experimental.
    1. Con la superficie seleccionada, elija la " máscara Sel... ͟ " función de la ventana de edición.
    2. Seleccionar el canal experimental de interés (es decir, YFP). Asegúrese de que el " duplicar canal antes de aplicar mascarilla " casilla de verificación está seleccionada.
  5. Ventana en el ajuste de la pantalla seleccionar sólo el canal enmascarado. Crear una nueva superficie para el canal enmascarado siguiendo pasos 5.3-5.3.5.
    Nota: En este punto puede ser útil ajustar el aspecto de cada máscara para facilitar la visualización del modelo 3D: seleccionar cada superficie y seleccione la ficha color ajustar el color de Base y la transparencia según sea necesario. Colores superficiales se combinan cuando comprometidos.
  6. Para obtener los datos volumétricos, con cada superficie seleccionada seleccione la ficha de estadísticas. En la " detalle " sub pestaña, elige " valores medios " en el menú desplegable. El volumen total de la superficie se puede encontrar en la columna de suma de la tabla generada.
    Nota: Si la superficie generada contiene fragmentos erróneos (es decir, los fragmentos que de señal de fondo no se excluyen durante la segmentación o áreas discontinuas de la superficie principal), puede ser necesario calcular el volumen total manualmente, o las superficies por volumen o número de voxels del filtro y asegurar que sólo los segmentos de señal están incluidos en el cálculo. El volumen de cada porción de la superficie se puede encontrar seleccionando " todos los valores " en el menú desplegable. Seleccionar cada valor hará que la región correspondiente aparecen amarillo, que ayuda en la determinación de los valores a excluir.

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Representative Results

La calidad de los datos y análisis depende en gran medida en (1) la integridad y la morfología de los embriones disecados, (2) el uso de anticuerpos de alta especificidad y (3) la configuración adecuada de los parámetros de la proyección de imagen. Embriones dañados a confundir el proceso de generación de superficie y dificultan el análisis cuantitativo. Ejemplos de embriones bien disecados y etapas se muestran en la figura 2B. Los embriones pueden ser disecados más quitando el saco vitelino, a la que se con frecuencia se unen no específicamente. Sin embargo, eliminación del saco de yema de huevo hará que los embriones menos robusta, por lo que debe tenerse cuidado durante la manipulación de aguas abajo.

La combinación de anticuerpos de alta calidad y ajustes de imagen apropiados son cruciales para lograr imágenes de alta relación de señal a ruido. Figura 2A muestra una imagen de ejemplo usando los anticuerpos contra Nkx2-5 como un marcador de referencia a la etiqueta la cardiaca media luna y GFP a la etiqueta un linaje remontado población de interés (células progenitoras cardiovasculares ventricular de Foxa2Cre:YFP) (véase el suplemento datos para los archivos raw de imagen y datos). 19 esta estrategia permite la comparación de una población dada con toda la región cardiaca de media luna. Para algunos experimentos, pueden ser de interés para examinar los subdominios FHF y SHF de la media luna cardiaca. En este caso, la FHF y SHF pueden etiquetarse con Hcn4 y Islet1, respectivamente (ver referencia19 imágenes y análisis cuantitativo con estas combinaciones de anticuerpos). Con la configuración apropiada y combinaciones anticuerpo secundario, con éxito hemos reflejado y analizado tres linajes simultáneamente (es decir, la media luna cardiaca YFP y HF primera o segunda).

Incapacidad de lograr señal fuerte también limitarán la capacidad de generar modelos 3D de alta confianza, pues sería difícil de quitar la señal de fondo de las superficies finales. En estos casos, debe tenerse cuidado al ajustar la gamma de la imagen (durante el procesamiento previo, figura 2B, 2N, 2C, 2O) o superficie umbral (durante la generación superficial algoritmo, figura 2, 2 H, 2 L ) y ajustes similares pueden usarse para todas las imágenes dentro de un experimento. No hacerlo resultará en datos incoherentes volumétricos que serían inadecuados para la comparación directa. A menudo, erróneas superficies resultantes de la señal de fondo se pueden quitar con tamaño de filtro (figura 2I, 2J), aunque hacerlo de imágenes de fondo de alta va a ser difícil sin perder la verdadera superficie fragmentos así.

Figure 1
Figura 1: línea de tiempo Experimental y esquemas. (A) todo el experimento, del análisis de datos, puede llevarse a cabo en aproximadamente dos semanas. Embriones se recogen por la mañana en la post cópula (E8.25) del día de la 8th para el análisis de la etapa media cardiaca (B). Una vez fijo, embriones son bloqueados y teñidos con anticuerpos primarios y secundarios antes del montaje. Embriones se montan con microscopia estándar portaobjetos y cubreobjetos, usando cinta de doble cara como espaciador (C). Embriones son colocados en una gota de anti-fade en la orientación de la muestra (C, superior) y un cubreobjetos se baja lentamente en la cinta (C, más baja). Proyección de imagen confocal y análisis de imágenes se realizan para generar imágenes de alta resolución z-stack (D) y modelos 3D de superficie (E). HF, doble cabeza; CC, cardiaca media luna; A anterior; P, posterior; AF, anti-fade. Barras de escala son 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: procesamiento de imagen confocal Stepwise y 3D superficial generación. (A) Confocal serie z cargada en la vista del volumen. El canal de referencia (Nkx2-5) es seleccionado (B) y la intensidad y el ajuste de gamma (C) antes de comenzar el algoritmo de crear superficies. Después de la región de interés es seleccionado (D) y el nivel de detalle superficial es escogida (E). La superficie inicial (F) es thresholded para incluir todo el señal real en la superficie (G). Filtrado se realiza para quitar fondo pequeños fragmentos (H) para producir una superficie de referencia final (). Mediante la selección de la superficie de referencia (J), el canal de comparación (YFP) puede ser reproducido y enmascarados (K). La intensidad y la gamma para este canal son entonces ajustado (L) antes de generar una segunda superficie a través de la misma secuencia de pasos (M, N). El volumen total para cada superficie se calcula automáticamente y se puede comparar cuantitativamente y visualmente (O, tenga en cuenta que colores superficiales se combina cuando los comprometidos). Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo de arriba describe una estrategia para la obtención de datos cuantitativos de las imágenes de inmunofluorescencia de todo Monte alta calidad de embriones de ratón tras el implante. Cuando se realiza correctamente, los datos volumétricos 3D generados a través de estos pasos pueden utilizarse para el análisis comparativo y de concurrencia de varios dominios en el embrión. La señal superficial enmascara el procedimiento descrito es de uso particular al investigar poblaciones de celulares nuevos en comparación con las estructuras de referencia bien establecidos.

Creemos que este enfoque ofrece una ventaja distinta sobre los enfoques existentes. Inmunofluorescencia de todo Monte con proyección de imagen de campo amplio puede ofrecer información a nivel de tejido pero carece resolución celular. Por el contrario, inmunofluorescencia de secciones seriadas puede dar detallada de celulares-nivel resolución, aunque estos datos carecen de la ventaja tridimensional del Monte toda la proyección de imagen. Mientras que la proyección de imagen confocal tridimensional aborda estas deficiencias, algunos usuarios, aprovechando el potencial cuantitativo de estos datos, y esperamos que nuestro protocolo permitirá a más investigadores a aprovechar al máximo los datos que recogen.

Aquí, este enfoque ha sido ejemplificado con el marcador de Nkx2-5 para delinear la media luna cardiaca y examinar la presencia de células de linaje remontado Foxa2Cre:YFP dentro de ese dominio. Sin embargo, debido a la capacidad de por lo menos tres linajes simultáneamente y los datos de las tres dimensiones de alta resolución generados imágenes, este Protocolo será útil a los investigadores en muchos campos. Proponemos que este enfoque puede ser aplicado a múltiples estadios embrionarios, órganos y linajes a través de pequeños ajustes en el protocolo basado en las necesidades específicas del sistema. En nuestra experiencia, este protocolo es directamente aplicable a un rango de edades embrionarias (E6.5-E9.5 mínimo) con adaptaciones limitadas. 19 hemos no encontramos problemas con la permeabilidad o penetración del anticuerpo en embriones tan grandes como E9.5 con los tiempos de incubación en la lista, aunque esperamos que con tejidos más gruesos o más densos estas tendría que ser alargado para conseguir penetración completa.

El análisis aquí descrito se realizó utilizando un paquete de software privativo, pero puede ser adaptado para realizarse en paquetes propietarios alternativos optimizados para el manejo de grandes datos. Por otra parte, tuberías similares pueden fácilmente implementar utilizando lenguajes computacionales o paquetes de software de código abierto, que conducirán al rápido desarrollo de una base de datos de los protocolos. El crecimiento de una red mundial de científicos, con acceso a herramientas libremente disponibles y protocolos para la adquisición de imágenes y análisis, rápidamente será avanzar en el campo y aumentar la reproducibilidad de los estudios. 17

En nuestra experiencia, la mayor limitación de este enfoque fue profundidad de imagen, especialmente para después de las etapas embrionarias y dependerá en gran medida los detalles específicos de la configuración de la microscopia se utiliza. Del mismo modo, cómo las muestras están montadas para la proyección de imagen dependerá de las necesidades específicas del usuario. Hemos encontrado que colocar la región de interés más cercanos a la lente mejora la imagen de la profundidad y disminuye la señal de fondo, y le sugerimos que use cinta de doble cara capas para el montaje, ya que permite a los usuarios crear una cámara que se adapte a sus necesidades específicas. Uso de una base de glicerol montaje multimedia con un reactivo anti-se descolora y equilibrando las muestras en este medio antes del montaje, se recomienda suprimir el fotoblanqueo. Por último, las muestras utilizadas en este análisis son casi transparentes; los usuarios pueden necesitar incorporar medidas de compensación para los más avanzados estadios embrionarios, fragmentos de tejido u organoides, y determinar el mejor protocolo para la aplicación del claro requerirá pruebas empíricas.

Morfogénesis cardíaca, pueden utilizarse diversos métodos de proyección de imagen. Mientras que aquí se utiliza la microscopia confocal, microscopía de luz de hoja es muy adecuado para estos estudios debido a la velocidad, resolución y relación señal a ruido de la imagen adquirida. 20 se espera que la mayor disponibilidad de esta nueva tecnología para avanzar la utilidad y la riqueza de enfoques similares de proyección de imagen. Del mismo modo, el continuo avance de reporteros fluorescentes,21 cromóforos, tintes,22 y23,de cultivo de embriones en vivo24 llevará a estos estudios a cuatro dimensiones, añadiendo el elemento de tiempo, y rendimiento aún más información sobre la forma cómo embrionaria de estructuras durante el desarrollo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por NIH/NHLBI R56 HL128646 y salud Mindich y desarrollo Instituto (MCHDI) en ISMMS (en Dakota del norte). E.B. es apoyado por una beca NIH/NIDCR T32 HD075735. Se realizó análisis de microscopía e imagen en el centro de microscopía en la Facultad de medicina de Icahn en el Monte Sinaí, que es apoyado en parte por el Instituto de cáncer de Tisch en Monte Sinaí P30 CA196521-beca de apoyo Centro de cáncer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blunt probe Roboz RS-9580
Forceps Roboz RS-8100
Fine forceps Roboz RS-5015
Dissection scissors Roboz RS-5912
Saponin Sigma Aldrich 84510
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A8022
Triton RPI A4490
Goat anti-Nkx2-5 Santa Cruz Biotech sc-8697 Used at 1:100-1:500
Chicken anti-GFP abcam ab13970 Used at 1:500
Rabbit anti-Islet1 abcam ab109517 Used at 1:100
Rabbit anti-Hcn4 Millipore AB5808 Used at 1:100
488 anti-chicken Jackson Immunoresearch 703-546-155 Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
555 anti-goat Thermo Fisher Scientific A21432 Used at 1:500
647 anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-606-152 Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
DAPI Sigma Aldrich D9542
n-Propyl gallate Sigma Aldrich 2370 Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution.
Superfrost Plus microscopy slides VWR Scientific 48311-703
22x22 mm coverslips VWR Scientific 48366-227
Imaris 8.4.1 Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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