Establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el Virus Zika utilizando estrategias de inyección Intracerebral: embrionario, Neonatal y adulto

Neuroscience

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Summary

Aquí se describe un método para el establecimiento de un modelo de microcefalia inducida por virus Zika en ratón. Este protocolo incluye métodos para embrionario, neonatal y adulto etapa inoculación intracerebral del virus Zika.

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Herrlinger, S. A., Shao, Q., Ma, L., Brindley, M., Chen, J. F. Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult. J. Vis. Exp. (134), e56486, doi:10.3791/56486 (2018).

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Abstract

El virus Zika (ZIKV) es un flavivirus actualmente endémico en Norte, centro y Sudamérica. Ahora se ha establecido que el ZIKV puede causar microcefalia y anomalías cerebrales adicionales. Sin embargo, el mecanismo subyacente a la patogenesia de ZIKV en el cerebro en desarrollo sigue siendo confuso. Métodos quirúrgicos intracerebrales se utilizan con frecuencia en la investigación de la neurociencia para responder preguntas sobre desarrollo normal y anormal del cerebro y la función cerebral. Este protocolo utiliza técnicas quirúrgicas clásicas y describe métodos que permiten modelo ZIKV-asociado humano enfermedad neurológica en el sistema nervioso del ratón. Mientras que la inoculación directa del cerebro no modelo el modo normal de transmisión del virus, el método permite a los investigadores a hacer preguntas específicas sobre la consecuencia después de la infección ZIKV del cerebro en desarrollo. Este protocolo describe etapas embrionarias, neonatales y adulto de la inoculación intraventricular de ZIKV. Una vez dominado, este método puede convertirse en una técnica sencilla y reproducible que sólo tiene unas horas para llevar a cabo.

Introduction

Microcefalia es una condición que resulta del desarrollo defectuoso del cerebro caracterizado por más pequeño que el tamaño promedio de la cabeza en los recién nacidos. Los niños con microcefalia muestran un rango de síntomas que pueden incluir el retraso en el desarrollo, convulsiones, discapacidad intelectual, pérdida de la audición, problemas de visión y problemas con el movimiento y el equilibrio, entre otros, dependiendo de la severidad de la enfermedad y causar1,2,3. Esta condición es multifactorial en la naturaleza, con el agente infeccioso, genético y factores ambientales relacionados con causando microcefalia4,5,6,7,8, 9. Antes del estallido de 2015-2016 ZIKV, 8 niños de cada 10.000 nacimientos fueron diagnosticados con microcefalia en los Estados Unidos según la CDC10. 1 de febrero enst de 2016 la Organización Mundial de la salud declaró el virus Zika emergencia salud pública de preocupación internacional debido al alarmante aumento de diagnósticos de microcefalia asociada a infección por ZIKV en madres11, 12. Un estudio reciente de los CDC sobre casos ZIKV en los Estados Unidos sugiere que materna ZIKV infección resulta en un 20-fold riesgo para un niño desarrollar microcefalia en comparación con individuos no infectados y 4% de las madres ZIKV infectado de los Estados Unidos ha resultado en niños con microcefalia11. La tasa de defectos de nacimiento asociados microcefalia durante el embarazo de la infección por ZIKV en Brasil se han divulgado para haber afectado hasta un 17% de los bebés de madres infectadas, indicando que otros factores en América Latina pueden contribuir a un mayor riesgo 13. Si bien sabemos que el ZIKV puede causar microcefalia y patogenesia en progenitoras neurales celular (NPC) población7,8,14, la patogenesia completa de ZIKV en el desarrollo del cerebro sigue siendo elusiva. Es importante desarrollar modelos animales para investigar los mecanismos de la enfermedad que las anomalías cerebrales asociadas con infección por ZIKV.

Para estudiar directamente el efecto que la ZIKV tiene en el desarrollo del cerebro, primero desarrollamos un modelo de ratón con inoculación intracerebral del cerebro de (E14.5) 14,5 día embrionario ZIKV7. Esta etapa fue elegida ya que se considera a representante del final del primer trimestre de gestación humana14. Los cachorros pueden sobrevivir hasta día postnatal 5 (P5) con este método de inyección intracerebral embrionario (~ 1 μl de 1.7 x 106 cultivo de tejidos dosis infectiva (DICT50/mL)). Estos cachorros postnatales muestran un rango de fenotipos similar observado en neonatos humanos infectados incluyendo ventrículos agrandados, pérdida neuronal, axonal vacuo, astrogliosis y microglial activación12,15. El cerebro de un ratón recién nacido es relativamente inmaduro, similar a la etapa de desarrollo del cerebro humano en mitad de la gestación16, y el desarrollo del cerebro del ratón incluye un importante componente postnatal. Para estudiar más adelante infecciones de etapa de gestación, también se describe un método de infección postnatal. Los recién nacidos infectados por ZIKV en P1 son capaces de sobrevivir hasta que después de la inyección 13 días. Infección de la sangre-llevado de la etapa adulta se ha descrito en el ratón previamente17 pero requiere el uso de factores de la transcripción del factor regulador (IRF) de interferón (IFN) IRF-3, -5, cepa-7 triple nocaut. Este protocolo describe un método de inoculación ZIKV intraventricularly para evitar la desactivación de la respuesta antiviral del modelo murino en el adulto. Mientras que esto evita el sistema inmune murino, esta ruta de inyección no directamente mímico la ruta típica de la infección. Para resolver esta discrepancia directamente, el experimentador puede llevar a cabo una infección intrauterina de ZIKV en lugar de la vía intracraneal. Adoptado del anterior trabajo18, hemos descrito brevemente esta técnica en el presente Protocolo de infección embrionaria.

Las cepas de virus Zika implementadas con esta técnica incluyen la cepa mexicana 44 MEX17,19 y el africano aislar Señor-766 aislado en 194720. Zika MEX1-44 fue aislado en Chiapas, México en enero de 2016 de un infectado Aedes aegypti mosquito. Obtuvimos este virus con permiso a través de la rama médica de la Universidad de Texas en Galveston (UTMB). Además, se inoculó el virus del Dengue serotipo 2 (DENV2) utilizando esta técnica en un estudio de comparación. DENV2, cepa S16803 (secuencia de GenBank GU289914), fue aislada de una muestra de paciente de Tailandia en 1974 y pasados en células C6/36. El virus fue pasado dos veces en células Vero por el centro de referencia mundial de virus emergentes y arbovirus (WRCEVA) antes de las inyecciones de ratón. Esto demuestra que esta técnica funciona igualmente bien para diversas cepas de ZIKV y otros flaviviruses que puede tener un impacto en el desarrollo del cerebro.

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Protocol

Todo animal use protocolos seguir las pautas de cuidado de los animales de la Universidad de California del sur y la Universidad de Georgia. Métodos de eutanasia para presas embarazadas y los adultos se realizan según protocolos aprobados: asfixia dióxido de carbono, seguido por dislocación cervical como método secundario para eutanasia. Cachorros neonatales son sacrificados por decapitación.

PRECAUCIÓN: El siguiente protocolo incluye un virus patógeno. Debe tenerse precaución adecuada durante la manipulación de los virus. Todos los protocolos deben ser aprobados por la previa Comisión institucional para utilizar.

1. embrionaria inoculación Intracerebral del Virus Zika

  1. Para apareamiento tiempo embarazada, considere mediodía del día después de aparearse como E0.5. Par de ratones al final del día y comprobar enchufes temprano en la mañana para reducir la variabilidad del tiempo de acoplamiento.
  2. Preparar la aguja de vidrio antes de la cirugía. Tire de la aguja cortada en 1/3 de su longitud y afila a un ángulo de 45° usando una amoladora de la micropipeta con un goteo de agua hasta que el poro tiene un tamaño de 50-70 μm. verificación extremidades de la aguja bajo un estereoscopio para calidad y rotura.
  3. Mantener el virus de la alícuota en el hielo. Justo antes de la cirugía, cargar la mezcla de inyección ZIKV en la aguja de inyección de vidrio preparada. Montar la jeringa de inyección gas-tight (volumen de 50 μL), conexión luer-lock y tubo y saturar la jeringa montada con el tubo con aceite mineral. Una vez saturado, conecte la aguja y dibujar ~ 6-7 μl ZIKV en la aguja (~ 1 μl es 1,7 × 106 DICT50/mL).
  4. Inyectar el C57BL/6J embarazada o ratones 129S1/SvImJ con embrionario día E14.5 embriones (para inyección intracraneal) o embriones E10.5 (por inyección intrauterina) con clorhidrato de ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (5-10 mg/kg) diluidos en solución salina estéril por vía intraperitoneal para inducir la anestesia en la madre. También puede anestesiar a las madres con isoflurano isoflurano vigilada proporcionada por inhalación, con barrido de gases residuales, si procede. Inyectar la buprenorfina-SR (0.5-1.0mg/kg) por vía subcutánea para inducir analgesia.
  5. Pinch test anestesiado las madres en la punta del dedo del pie o la cola y luego los ponen decúbito supino en una almohadilla de calefacción aprobado por animal (almohadilla térmica de 2, 5 100 x 200 mm). El fórceps del pellizco del dedo del pie no son estéril y no están acostumbrado a manejar tejidos en cirugía. Alternativamente, pueden utilizarse las manos enguantadas para poner a prueba el reflejo de retirada de pellizco del dedo del pie.
    Nota: Consulte a su personal veterinario institucional para el perioperatorio recomendado: método de calefacción. Una cubierta se colocó entre el animal y esta almohada.
  6. Añadir pomada oftálmica en los ojos.
  7. Afeitar la superficie del abdomen y esterilizar con yodo y alcohol tres veces. Alternan las toallitas alcohol y yodo; Limpie con un movimiento circular del sitio quirúrgico.
  8. Cubra la piel que rodea el campo quirúrgico con paños estériles para evitar la contaminación de la incisión y los instrumentos.
    Nota: La apertura de la cortina no debe ser mayor que el sitio quirúrgico preparado; no debe verse pelo en la abertura de la cortina.
  9. Pellizcar la piel de la madre de su abdomen con pinzas y corte la parte inferior del abdomen en una línea de 1-1,5 cm en la línea sagital medial con tijeras quirúrgicas estériles. Este cortes en la piel y más en la cavidad abdominal para que los embriones están expuestos ahora.
    Nota: Tijeras quirúrgicas se utilizan para incidir la piel y la capa peritoneal. Instrumentos estériles y guantes se utilizan para cada cirugía.
  10. Corte una abertura en medio de una pequeña gasa estéril y aplique en la parte superior la abertura quirúrgica. Hidratar con solución salina estéril. Tire de los embriones a través de la ranura en la gasa estéril, con cuidado para no retirar más de 4-5 embriones centrándose en un cuerno uterino al mismo tiempo.
  11. Hidratar los embriones con solución salina estéril antes de y a través de la inoculación para garantizar que no se sequen. El seguimiento de que los embriones son inyectados y su ubicación en el cuerno uterino. Los embriones así son tratados como experimentos separados, como embriones no cambian de posición mientras se desarrolla en el útero. (Seguir al 1.15 por inyección intrauterina).
  12. Coloque suavemente una espátula debajo de la cabeza del embrión. Iluminar los embriones con una lámpara para visualizar las suturas de la cabeza y el cráneo.
    Nota: Se sigue una técnica aséptica, incluyendo instrumentos y guantes quirúrgicos estériles. Después se manipulan elementos no estériles (como la lámpara), guantes deben cambiarse con nuevos guantes estériles antes de manipular instrumentos estériles y áreas.
  13. Posición de la cabeza mediante la manipulación del embrión con la lámpara (detrás de la cabeza de visibilidad) y los dedos libres hasta que la cabeza del embrión es empujado hacia arriba contra la pared del útero y se sujeta con la mano no dominante.
    Nota: Colocación del embrión es una parte fundamental y la técnica que lleva a la práctica la mayoría. Demasiada presión de los dedos puede dañar las membranas embrionario conduce a mortalidad y no hay suficiente presión puede dificultar la inyección.
  14. Uso de los vasos sanguíneos a lo largo de la sutura del cráneo como una guía. Inyectar el virus ZIKV (~ 1 μl, 1,7 × 106 DICT50/mL aislamiento mexicano MEX1-44) en los ventrículos laterales del cerebro de embriones E14.5 con el montado de la jeringa y la aguja. Utilizar los medios de control como una inyección simulada.
  15. Para mejorar la retención del embarazo, evitar inyección viral de los dos embriones al lado de los ovarios y los dos embriones al lado de la vagina superior (figura 1A). En general, se inyectan no más de 6 embriones por camada para reducir el tiempo de la cirugía y evitar pérdida del embrión.
  16. Coloque los embriones inyectados en las presas embarazadas y llenar la cavidad abdominal con ~ solución salina estéril 0.5 mL. Para cerrar, primero la sutura tanto el músculo abdominal peritoneal y luego en segundo lugar de la sutura la capa externa de la piel con suturas estériles 4,0. Es preferible utilizar suturas interrumpidas; hay posibilidad de dehiscencia de la herida si el ratón mastica la sutura.
  17. Coloque el ratón en una jaula parcialmente apoyado sobre una almohada para permitir que el ratón para escapar a un área sin calefacción si es necesario. Monitorear a las madres mientras se recupera (1-2 h) de la anestesia. Desarrollo de los embriones después de cirugía de variados tiempos según experimentos individuales.
  18. Inyección intrauterina
    1. Con un cuerno uterino y embriones expuestos, utilizar una aguja de jeringa y 27G de 1 mL a inyectar virus de Zika de 100 μL (106 TCID50 unidades en 100 μL de DMEM), o medio de control, en el espacio intrauterino o en el tejido placentario. Tenga en cuenta que los embriones han inyectado para disecciones de fase embrionaria. Ver trabajo publicado anteriormente para más detalles18.
    2. Coloque los embriones inyectados en las presas embarazadas y llenar la cavidad abdominal con ~ solución salina estéril 0.5 mL. Para cerrar, primero la sutura del músculo abdominal peritoneal y luego en segundo lugar de la sutura la capa externa de la piel con suturas estériles 4,0. Es preferible utilizar suturas interrumpidas; hay posibilidad de dehiscencia de la herida si el ratón mastica la sutura.
    3. Coloque el ratón en una jaula parcialmente apoyado sobre una almohada para permitir que el ratón para escapar a un área sin calefacción si es necesario. Monitorear a las madres mientras se recupera (1-2 h) de la anestesia. Desarrollo de los embriones después de cirugía de variados tiempos según experimentos individuales.

2. neonatal inoculación Intracerebral del Virus Zika: P0/P1

  1. Asegurar que las jeringas de inyección gas-tight (volumen de 10 μl) y agujas no estén obstruidas. Limpiar y probar cargando tres jeringas desechables de 20 mL con agujas calibre 26: uno con solución salina, uno con etanol al 70% y otro con aire para eliminar las soluciones. Esterilizar con 10% de lejía si previamente utilizado para la inyección de virus.
  2. Mantener el virus en el hielo. Cargar la jeringa llena con solución salina para reducir el volumen muerto de la jeringa y extraer 0,75 μl de aire para separar el material de inyección de la solución salina.
  3. Configurar una cámara de recuperación humidificado calentado para cachorros inyectados. Usando un bloque de la calefacción, coloque un recipiente cerrar (como un cuadro de punta vacía) con una gasa estéril y humedecer con solución salina. Precalentamiento antes de comenzar las inyecciones.
  4. Configurar la microinyectora incluyendo la bomba y el controlador. Determinar el código de tipo de dispositivo para la jeringa específica (es decir, para una jeringa de 10 μl, el tipo de dispositivo es "D"). Determinar la velocidad de inyección.
  5. Recoger las crías día postnatal 0 o 1 (P0/P1) cerca de la instalación quirúrgica. Cargar la jeringa de inyección con el virus. Desinfectar el Monte cabeza de cachorro con el 70% EtOH.
  6. Envuelva los cachorros en una fina capa de Gasa y enterrarlas completamente en hielo para lograr un estado anestésico. Los cachorros son cryoanesthetized por 5 minutos, asegúrese de que los cachorros son suficientemente anestesiados para inyección realizando una pizca de cola toe sin respuesta. Esto rinde aproximadamente 15 min de un estado anestésico.
  7. Colocar el cachorro sobre Monte cabeza, esterilizar la superficie de la cabeza y yodo, etanol (tres veces) y luego seque con un paño estéril (isopropanol 70% EtOH).
  8. La marca lambda con un marcador negro y grabar las coordenadas en lambda utilizando el instrumento estereotáxicas. Mida la distancia desde lambda en el borde del ojo y el comenzar de las coordenadas estereotáxicas de lambda calcular la distancia de 2/5 de lambda a ojo (para ambos hemisferios si inyectan ambos).
  9. Vuelva a comprobar la profundidad anestésica antes de crear un agujero para el sitio de inyección. Usar una aguja de calibre 26 para superficialmente y cuidadosamente perforar el cuero cabelludo y el cráneo en el sitio de inyección (el cráneo es muy suave en los recién nacidos) para crear una abertura para la aguja de inyección.
  10. Baje la aguja de inyección en el lugar pinchado y una vez que la aguja ha infringido a la piel, calcula una profundidad de 1 mm para el sitio de inyección (ventrículo lateral) utilizando el instrumento estereotáxicas.
  11. Una vez que la aguja se baja a la profundidad de la inyección, programa la microinyectora para inyectar: 1 μl de virus, a una velocidad de 10 nL/s, inyectando aproximadamente 1 μl sobre 1,5 minutos (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV).
  12. Cuando termine la inyección, esperar 30 s y retraer la aguja en incrementos de 0,5 mm, girando el tornillo (dorsal), esperar 30 s después de cada incremento.
    Nota: Esto reduce la salida del virus inyectado.
  13. Una vez retirado, ya sea rápidamente cargar la jeringa y aguja con más virus (virus diferentes o controles de simulacros se deben cargar en distintas jeringas/agujas) o quitar el cachorro desde el Monte de cabeza a la cámara de vapor precalentada. Supervisar el cachorro cada pocos minutos para medir la recuperación. Vuelva a colocar los cachorros con su camada.

3. adulta inoculación Intracerebral del Virus Zika

  1. Inyectar a ratones adultos por vía intraperitoneal con clorhidrato de ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (5-10 mg/kg) diluidos en solución salina estéril para inducir la anestesia. Inyectar la buprenorfina-SR (0.5-1.0mg/kg) por vía subcutánea para inducir analgesia. Pies y cola pellizcar el ratón para garantizar su estado anestésico y posteriormente montar el instrumento estereotáctica (con una almohada) para inmovilizar la cabeza durante la cirugía.
  2. Añadir pomada oftálmica en los ojos para evitar que los ojos del ratón se seque durante la cirugía. Afeitado del cuero cabelludo a partir detrás de los ojos hasta el comienzo de las orejas. Esteriliza la piel con yodo y el 70% EtOH tres veces. Alternan las toallitas alcohol y yodo; Limpie con un movimiento circular del sitio quirúrgico.
  3. Vuelva a comprobar la profundidad anestésica antes de la incisión de la piel. Con un bisturí, hacer una incisión de 0.5 cm a lo largo de la línea sagital medial de la cabeza en la ubicación esterilizada, exponiendo el bregma. Usando un movimiento de balanceo con un aplicador con punta de algodón, limpiar la superficie del cráneo de los tejidos meníngeos, mientras que simultáneamente empuja la piel lejos de los sitios de inyección.
  4. A partir de bregma, alinee la broca quirúrgica e identificar los sitios de inyección utilizando las coordenadas siguientes: AP mm-0,50, ML: +-1,5 mm. con el pedal de control, perforar el cráneo lentamente como sólo perforar hueso hasta que se ha borrado un agujero para la aguja.
  5. Reemplazar el taladro con la microinyectora bomba y estanqueidad jeringa (volumen de 10 μl) en el estereotáxicas. Dejando una burbuja pequeña del aire entre la solución salina y el virus, dibujar ~ 4-5 μl de virus. Determinar el código de tipo de dispositivo para el volumen de la jeringa específica (es decir, D para jeringa de volumen de 10 μL). Baje la aguja a DV:-1,50 mm de la superficie del cerebro. Para inyectar 1 μl del virus, el programa un índice de 10 nL/s, aproximadamente 1 μl más de 1,5 min de la inyección.
  6. Cuando termine la inyección, esperar 30 s y retire la aguja en incrementos de 0,5 mm, esperar 30 s después de cada vuelta. Esto reduce el reflujo y la salida del virus inyectado.
  7. Cuando el injection(s) terminado, utilice pinzas para aflojar la piel y recuperar el cráneo expuesto. Sutura el cuero cabelludo de nuevo con 4,0 suturas y quitar el mouse del instrumento estereotáxicas. Coloque el ratón en una jaula parcialmente apoyado sobre una almohada para permitir que el ratón para escapar a un área sin calefacción si es necesario y vigilar mientras se recupera (1-2 h) de la anestesia.

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Representative Results

Imágenes representativas de nuestros métodos de inyección para la inoculación de ZIKV del cerebro embrionario se muestran en diagramas que representan las inyecciones intracerebrales (figura 1A) e intrauterina y intraplacental inyecciones (figura 1B), ilustrando el manera la presa embarazada y embriones deben ser vistos y orientada a la cirugía (Protocolo de inoculación embrionario). Figura 2A presenta infección por ZIKV (MEX1-44) (immunostained con el anticuerpo contra el antígeno del grupo flavivirus, verde) en la corteza cerebral E18.5. PAX6 (rojo) etiqueta NPCs en la corteza en desarrollo. ZIKV fue inoculado en el cerebro embrionario E14.5. Usando el análisis DICT50 del tejido las muestras7, nuestros análisis de la curva de crecimiento muestran que la ZIKV puede replicar eficientemente y crecer en los cerebros en desarrollo (figura 2B, 2C), como publicados7. Figura 2D muestra infección exitosa con DENV2 en la corteza en desarrollo mediante el método de inoculación embrionario. DENV2 se detecta mediante un anticuerpo contra el antígeno del grupo flavivirus (verde). Figura 2E muestra infección con una cepa diferente de ZIKV, el linaje africano (Señor-766). Figura 2F demuestra una infección representativa para la inoculación de intraplacental ruta alternativa, de ZIKV-Asia (MEX1-44) en etapa E10.5.

Figura 3A es un diagrama que representa los puntos de referencia para identificar la ubicación de la inyección en los ventrículos laterales para inoculación ZIKV de los cachorros de P0/1. Figura 3B muestra la infección ZIKV (MEX1-44) en corteza cerebral de P13 después de la inyección de P0/1. ZIKV (MEX1-44) se detecta mediante el anticuerpo contra el antígeno del grupo flavivirus (rojo). La figura 4 muestra los granos fluorescentes (rojo) que fueron utilizados para la práctica de la ubicación de la inyección y ventrículo lateral inyección éxito en adultos.

Figure 1
Figura 1: inoculación embrionaria de la ZIKV. (A) diagrama que representa la exposición de un cuerno uterino, con una nota para evitar la inyección de embriones adyacentes a la vagina y el embrión más lateral a lo largo de la bocina. (B) diagrama que representa la exposición de un cuerno uterino, que representa la ubicación de intraplacental e inyecciones intrauterinas. Estos diagramas se han modificado de su original de la publicación21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: inoculación embrionaria ZIKV en E14.5. (A) en E18.5 está infectado el cerebro embrionario con ZIKV-Asia (MEX1-44) a través de todas las capas del neocórtex en desarrollo (barra de escala es 200 μm). Las células progenitoras neurales son immunolabeled con Pax6 (rojo) y ZIKV por flavivirus antígeno (verde). TCID50 (B) resulta del tejido fino del cerebro Postnatal día 3 (P3) inoculado en E14.5 ZIKV-Asia (MEX1-44). Barras de error indican SEM de tres mediciones independientes con una mofa y un cerebro infectado por ZIKV en cada medición (***p < 0.0001, prueba t de Student)7. TCID50 (C) los resultados que describe la curva de crecimiento típica de viremia ZIKV en tejido cerebral fetal infectado. Barras de error indican la SEM de tres mediciones independientes con una mofa y un cerebro ZIKV-Asia (MEX1-44) infectado en cada medición. Análisis de varianza (ANOVA) detecta un aumento significativo en el título viral desarrollo procede7. (D) infectados por el virus del Dengue (DENV2) histología representativa (E14.5 embriones inocularon con ~ 1 μl de 3.4 x 105 TCID50/mL, barra de escala es 200 um) y (E) ZIKV-África (MR766) representante histología (escala de la barra 200 μm). (F) ZIKV-Asia (MEX1-44) infectados histología representativa de la estrategia de inyección intraplacental (barra de escala es 200 μm). En todas las imágenes, Hoechst tiñe núcleos. Estas cifras se han modificado de su original de la publicación7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: histología representativa de la inoculación de P1 de ZIKV. (A) diagrama que demuestra el método para determinar la ubicación de la inyección en los ventrículos laterales de cachorros P1. (B) representación coronal cryosections immunostained para el antígeno de grupo flavivirus con baja (izquierda, barra de escala es de 100 μm) y alto (de derecha, barra de escala es de 50 μm) aumento de la inoculación de P1 de ZIKV en P15 (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV). Hoechst tiñe núcleos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: adulto etapa inyección intraventricular. Ratón adulto inyectado con perlas fluorescentes fue sacrificado poco después de la cirugía para determinar el éxito de la ubicación de la inyección (barra de escala es 200 μm). Criosección sagital puede considerarse inmediatamente después de seccionamiento como cuentas no requieren mayor coloración. Hoechst tiñe núcleos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se describe aquí es un método de inoculación intracerebral de la ZIKV en etapas embrionarias, neonatales y adultos para la investigación de los daños inducidos por ZIKV en el desarrollo cerebral. Si bien sencilla, hay algunas consideraciones que los investigadores deben tomar para asegurar la calidad del estudio y la seguridad de los involucrados.

DENV está estrechamente relacionado con ZIKV del género flavivirus. DENV no ha sido causalmente vinculado con trastornos cerebrales pediátricos en los seres humanos. DENV2 con éxito puede infectar y replicarse en el cerebro en desarrollo mediante el método de inoculación embrionario (~ 1 μl de 3.4 x 105 TCID50/mL) (Figura 2D). Por lo tanto, además no infectada Vero cell los medios (simulacros), infección por DENV puede utilizarse como un control negativo con el fin de estudiar la patogenesia ZIKV específicos en el cerebro en desarrollo. Es importante evitar el virus de la salida en el útero, que puede resultar en una contaminación no deseada de otros embriones. Por lo tanto, es necesario verificar a individuos infectados y no infectados a través de aislar el tejido fino del cerebro de cada embrión seguida por qRT-PCR o el ensayo TCID50. Un colorante puede añadirse al medio viral visualmente confirmar la inyección, pero la prueba para asegurarse de que el tinte no hace dano.

Cepas de ratón exhiben variabilidad de crecimiento, y por lo tanto lugares de inyección P1 necesitan verificarse para cada línea de ratón. Realizar una inyección falsa recién nacido con los granos fluorescentes para visualizar el sitio de inyección. Este estudio le informará si la inyección alcanza el ventrículo o entra demasiado profundamente en el tejido cerebral. Para los resultados ideales, los cachorros pueden ser sacrificados poco después de la inyección para identificar la ubicación de los granos fluorescentes en el ventrículo. Toda la cabeza de la cría puede ser fijo durante la noche, encajado y cryosectioned para observar la ubicación precisa de la inyección. Inyección con la jeringa de aceite saturado requiere experiencia y se recomienda practicar inyecciones de farsa con tinte en parafilm para verificar que el volumen de inyección es correcta.

Medidas de bioseguridad son fundamentales en estos estudios para evitar la infección accidental del personal del laboratorio con el virus. Aprobaciones de seguridad de la biotecnología deben hacerse por adelantado en las instalaciones donde se completa el trabajo. ZIKV es considerado un patógeno de bioseguridad nivel 2 (BSL2) por los centros de Estados Unidos para el Control y la prevención. Todas las personas trabajan con el virus o trabajan en áreas donde se manipula el virus deben ser consciente y familiarizados con protocolos de bioseguridad para su institución. Todas las herramientas y superficies expuestas a la ZIKV o DENV2 deben ser desinfectadas con lejía 10% destruir quedan partículas virales después de uso. Las mujeres que están embarazadas o están tratando de concebir están recomendable no interactuar con las áreas de investigación expuestas a ZIKV o DENV2. Todo el tejido utilizado para histología se fijan en el 4% PFA para inactivar los virus para su análisis. Guardar y cultivar el virus deben hacerse en células Vero en una campana para BSL2 trabajo. Virus comunes y valoración del tejido pueden cuantificarse mediante el protocolo TCID50.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer el Dr. Abdellatif Benraiss de la Universidad de Rochester por su tutoría y discusiones relevantes para aprender las técnicas de recién nacido y adulto quirúrgico. Los autores también agradece a Dr. James Lauderdale en UGA para el uso de su equipo estereotáxicas y discusiones relacionadas con ajuste de la metodología de esta técnica y la promoción para la Fundación de investigación Colegio científicos (arcos) para su apoyo y nuestro apoyo de NIH (NINDS becas R01NS096176-02 R01NS097231-01 y F99NS105187-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor Leica 39416001
Mouse Stereotax Kopf 04557R
Micro4 Microsyringe Pump Controller WPI SYS-MICRO4
UMP3 UltraMicroPump WPI UMP3
Modulamp Schott -
Luer-lock tubing (19-gauge) Hamilton 90619
Melting Point Capillary Kimble 34500-99 Glass needle
Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres Thermo Scientific R25 No dilution; Use for practice injections
10 µL, Model 1701 LT SYR Hamilton 80001 for embryonic inoculation
10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 Hamilton 80030 for neonate/adult
4-0 Ethilon Nylon Sutures Ethicon -
Mineral Oil VWR -
micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Micropipette Grinder Narishige EG-44
Fastgreen FCF Dye Sigma F7252 inject with 0.5% Dye
Antibodies
Flavivirus group antigen antibody Millipore MAB10216 ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3)
Pax6 DBHB Pax6-s ms IgG1 1:20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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