压和外尿道括约肌测量在清醒大鼠植入导管和电极允许重复测量

Biology

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Summary

本协议首先介绍了膀胱导管与外尿道括约肌电极联合永久性植入的手术方法, 其次, 对膀胱及外尿道功能的测量在植入的清醒动物的括约肌。

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Foditsch, E. E., Roider, K., Sartori, A. M., Kessler, T. M., Kayastha, S. R., Aigner, L., Schneider, M. P. Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements. J. Vis. Exp. (131), e56506, doi:10.3791/56506 (2018).

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Abstract

下尿路功能主要通过对啮齿动物的压膀胱功能分析来评估。常规 cystometries 通常在聚氨酯麻醉下进行终端分析。众所周知, 麻醉药能影响膀胱功能。因此, 该技术的目的是进行压测量的膀胱和外尿道括约肌轻度克制清醒大鼠。为此, 膀胱导管被植入膀胱圆顶。随后, 两个电极被植入双侧的外部尿道括约肌和一个接地电极缝合的非反应性骨骼肌。膀胱导管和三电极最终通过隧道皮下注射到颈部区域, 并贴在安全带上。采用这种技术, 可以在同一动物的多个时间点测量下尿路, 以评估下尿路功能。该技术的主要应用是在清醒健康的大鼠和诱导的疾病或损伤后同时膀胱和外括约肌功能的随访。此外, 随后的下尿路监测可以进行评估的疾病/伤害和监测治疗效果。

Introduction

为了分析尿液的储存和排尿功能和功能障碍, 大多数研究都使用了啮齿动物模型。通过连续的反应激活, 排尿产生。这些反射的协调对于有效地排尿1至关重要。压记录技术为分析其神经控制下的膀胱功能提供了有价值的工具1

大多数传统的 cystometries 在大鼠是作为一个单一的, 最终分析麻醉, 主要是聚氨酯2, 并专注于膀胱完全。然而, 在某些病症中如神经源性下尿路功能障碍 (NLUTD), 不仅膀胱, 而且排尿口, 外部尿道括约肌, 是功能失调的3,4。这使 NLUTD 困难跟随-, 如果仅膀胱在一个单一压测量被审查。为了获得与人类相媲美的可靠结果, 必须准确测量膀胱和尿道外括约肌功能及其相互作用2。此外, 对清醒大鼠进行功能分析非常重要, 因为麻醉很可能会改变膀胱功能2,5,6。一个好的压记录在醒的动物是依据为识别膀胱作用和故障7

使用的小动物 cystometry 驻地 (例如, 猫 cystometry 驻地 (CCS)) 是一个单位执行压分析在小醒的动物8。通过永久性膀胱导管和植入的外部尿道括约肌电极, 可在较长时间内进行重复性测量2。因此, CCS 为啮齿动物模型中的非神经源和 NLUTD 评价提供了一个有价值的工具, 在这种模式中, pathomechanisms 可以在短期或中期随访中改变。此外, 该方法包括通过使用抑制剂在清醒大鼠中进行膀胱测量来减少压分析。

在本文中, 我们描述了永久性植入膀胱导管和外尿道括约肌电极的手术方法, 以及在清醒大鼠的压测量。

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Protocol

这里描述的所有规程由奥地利政府道德委员会批准动物研究 (Bundesministerium Wissenschaft, Forschung 和 Wirtschaft, WF/伏/3b) 和符合协会为实验室评估动物使用动物保育指南。用于这种方法的老鼠是雌性, 12 周大的路易斯鼠。在整个协议中使用无菌仪器。

1. 材料制备

  1. 导管的制造
    1. 将导管 (聚乙烯导管 PE-50) 在适当长度 (20 到25厘米) 上, 以适合动物的大小。
      注: 留一些额外的长度隧道和更容易处理。
    2. 耀斑一个结束了一个打火机得到一个圆润的提示。检查导管的最后合适的开口和钝端。
    3. 将一个2毫米长的硅胶管放在导管上方, 直到它位于喇叭的正下方。
  2. 电极的制造
    1. 准备一个20-25 厘米的聚四氟乙烯涂层钢丝 (长短取决于动物的大小)。
    2. 准备一个银线长度2厘米和扭曲的两端, 直到一个小循环保持。在一端剥去2毫米的聚四氟乙烯绝缘。焊接扭曲的银线结束的剥离钢丝。
    3. 在涂布区应用常规指甲油。在涂敷区域上准备4毫米长的聚乙烯导管, 并通过将热量应用于压缩钳来密封末端。

2. 动物制剂

  1. 麻醉
    1. 使用适当的麻醉鸡尾酒机构批准的全身麻醉。
    2. 准备麻醉鸡尾酒与 medetomidine (0.15 毫克/千克), 咪唑安定 (0.08 毫克/千克), 和芬太尼 (0.01 毫克/千克), 并注射注1毫升注射器与27测量针。
  2. 手术准备
    1. 用电动剃须刀刮伤腹部, 包括肩胛骨的生殖器区域和背部区域。
    2. 先用70% 乙醇消毒腹部和颈部区域, 然后用聚维酮碘溶液3交替擦洗。

3. 膀胱导管植入

  1. 在第三和第四奶嘴 (大约2到2.5 厘米长) 的水平上进行低线剖腹手术, 使用手术刀为皮肤和外科剪刀为腹部肌肉。
  2. 通过在颅尾的方向引导腹壁并将其固定在膀胱的后面, 以避免重新定位, 从而使膀胱显露出来。
  3. 使用6-0 不可吸收的单丝缝线和锥形针尖针在膀胱圆顶周围放置一个包线缝合。
  4. 切开膀胱圆顶在钱包串内, 或者由手术刀尖或18G 针, 插入膀胱导管 (参见协议步骤 1)。
  5. 插入导管预与无菌生理0.9% 氯化钠溶液, 并仔细收回膀胱导管, 直到扩口的导管是位于膀胱圆顶以下。
  6. 在导管周围固定包线缝合, 并在导管体周围进行停止缝合, 以进行进一步的固位。
  7. 通过导管缓慢填充膀胱, 用无菌生理0.9% 氯化钠溶液, 检查膀胱穹窿的渗漏。

4. 尿道括约肌电极植入术

  1. 准备三电极植入 (见协议步骤 1)。
  2. 标记一电极用色的永久毛毡笔为未来空电极的进一步证明。用70% 乙醇消毒电极。
    注: 导管不适合于热化学灭菌程序。相反, 冷杀菌的电极24小时。
  3. 用外科剪刀将腹部切口延伸至耻骨, 但不要切开耻骨联合。
  4. 通过尿道两侧的细钳, 识别尿道并创建钝袋, 但要避免血管或神经的损伤。
  5. 确定适当的脂肪囊靠近尿道在这个窗口。
  6. 使用6-0 不可吸收的单丝缝合线, 通过双边方式将电极固定在适当的脂肪袋上。
    注意: 电极的最后位置应该是双侧的在尿道的中部区域。
  7. 将两个电极与6-0 不可吸收的单丝缝合在一起。
  8. 将标记的空电极缝合到尿道的距离内的腹壁肌肉。将所有三电极与一条缝合线绑在一起。

5. 隧道

  1. 在肩胛骨之间做一个小的皮肤切口为隧道。
  2. 隧道电极线到颈部, 并做最后检查正确放置, 并验证在隧道后电极的位置。
  3. 隧道膀胱导管到肩胛骨水平-注意膀胱, 而隧道导管, 以避免膀胱扭曲。为了达到这个目的, 在进入膀胱穹窿前按住导管, 以避免膀胱扭曲。
  4. 用 4-0 polyfilament 可吸收缝合线连续或间断缝合, 关闭腹部肌肉。通过中断的床垫缝合关闭皮肤切口。
  5. 将动物伸展至其全长, 使电极线和导管的最大膨胀。
  6. 将导管和电极丝固定在肩部肌肉的缝合线上。
  7. 用4-0 缝线缝合皮肤。

6. 吊带配件

  1. 在动物头上拉上安全带, 将前肢拉到两个硅胶条之间的末端位置, 以适应动物。在与分销商进行手术之前, 检查一下动物的重量。
  2. 隧道的膀胱导管的中心孔的线束和电极通过定制孔的钻头调整, 以电极线的大小。
  3. 通过拉动硅胶条来调节安全带。调整安全带, 使其不太松散, 但确保一些空间仍然保持移动能力的大鼠。
  4. 使用电缆带固定硅条。
  5. 将膀胱导管的长度削减到3厘米以上的线束, 连接到23克塞子, 最后修复它的安全带。

7. 电极连接器的制造

  1. 准备三小的热收缩管 (一个不同的颜色为零电极)。准备两个进一步的热收缩管在一个合适的较大的大小。
  2. 缩短电极导线的长度到最佳长度, 以便能够在以后插入女性插头, 而不太松或太短。剥去三根电线 (约2毫米) 的聚四氟乙烯绝缘, 并将钢丝绳捻成一个字符串。
  3. 将大型热收缩管置于所有电线上, 将小管单独放置在所有三根电线上, 并使用有色管作为空电极。
  4. 焊锡电极到男性3连接插头。将空电极放在中间, 将三小的单个管收缩到焊接区域之上。
  5. 收缩的第一个较大的管在年底的个别管尾和最后大管到男性插头边界。
  6. 将雄性插头连接到固定在吊带上的母接头上, 并用一条胶带固定以进一步安全。

8. 术后护理

  1. 清洁手术区, 用聚维酮碘消毒。
  2. 将动物放在加热垫上直到清醒, 然后根据当地动物护理指南, 在手术期间和术后给0.9% 氯化钠溶液进行水替代。
  3. 管理镇痛药 (昔1毫克/千克) 和抗生素 (sulfadoxinum 200 毫克, trimethoprimum 40 毫克, 15 毫克/千克) 作为联合注射溶液皮下注射。每天两次, 给镇痛药 (早晚), 每天一次给予抗生素, 随后五天。
  4. 继续使用相同剂量的抗生素, 在整个随访期间, 每周注射两到三次。
  5. 每天检查适当的吊带, 并进行外科实地检查, 特别是颈部区域。调整线束, 如果它变得太紧, 仔细地拉在硅胶条。
  6. 每周定期冲洗导管, 避免阻塞。

9. 压测量的准备

  1. 执行第一次压测量后六后手术天。
    注: 早期的测量可以受镇痛药和/或尿囊刺激, 由于导管植入。
  2. 打开主开关、计算机和肌电信号放大器。
  3. 用室温加热0.9% 氯化钠填充注射器泵。以下行方式依次打开三路连接器, 从泵开始, 然后冲洗管子。
    注: 仔细检查剩余气泡, 因为气泡会改变压的测量。

10. 校准

  1. 启动程序 uroflowmeter 软件, 然后转到校准。
  2. 关闭泵和动物的三路连接器。
  3. 打开阀门到连接的压力表, 并按零在程序中。
  4. 调整压力在压表到100柱, 并按100柱按钮的程序。按 "确认" 以保存校准调整。窗口将自动关闭。
  5. 关闭阀门的压力表和打开三路连接器从泵到动物准备好测量。

11. 动物数据库 (动物 DB)

  1. 要注册动物, 给动物一个简明的 ID。
  2. 输入进一步的数据, 如 SCI 的日期, 开始治疗, 导管植入日期, 实验组, 和动物的出生年月。
  3. 要最终记录数据, 请按 "存储记录" 并保存到文件。

12. 记录前的测量设置

  1. 按 "开始" 按钮启动软件程序。
  2. 选择动物和压重量秤和零压力。
    注意: 在将动物放入抑制剂时要注意, 这样就不会有电缆卡住, 因为这可能会导致肌电信号线的移除。

13. 动物制剂

  1. 拔下导管插头, 从吊带上拔下肌电信号插头。
  2. 把老鼠放在抑制剂。关闭抑制剂, 用钳锁安全带。
  3. 把导管和肌电信号插入抑制剂。
  4. 将抑制剂放置在猫单元中。把尾巴穿过管子, 用胶带固定管子, 避免运动。
  5. 将男性肌电信号插头连接到记录女性肌电信号连接器。
  6. 再按零压力, 然后将导管连接到灌装/录音管。检查软件中的压力。
    注: 压力应该是正数, 大约5-10 厘米 H2O 在基线。如果压力是负的, 断开导管从套管, 按零压力, 然后重新连接导管。

14. 记录

  1. 如果导管和肌电信号连接, 按下运行泵和录音。
  2. 使灌装速度适应μ l/分钟的实验需要。
  3. 记下记录开始的时间和日志簿中的室温。
  4. 要停止压记录, 请按下运行泵并再次按下记录停止泵。
    注: 水泵将关闭, 泵的绿灯熄灭。
  5. 断开导管并使用23G 塞子插头关闭导管末端。断开肌电信号电缆。
  6. 打开抑制剂的前面, 引导老鼠走出抑制剂。
    注意: 小心地处理老鼠, 并监视电线, 以避免电缆的任何锁定。
  7. 将导管插回安全带。将肌电插头重新插到吊带上, 并在插头周围放置一条胶带。
    注: 如果动物有病理性下尿路状况, 请在末端手动表达膀胱以避免膀胱 overdistention。
  8. 把动物放回笼子里
  9. 按退出键关闭程序。
  10. 清洁抑制剂和烧杯。
  11. 关闭泵和动物出口的三路连接器。
  12. 通过主交换机关闭计算机、肌电信号单元和系统。
    注意: 数据保存在单独的文件夹 "记录的数据" 与被测量的鼠 ID 的子文件夹文件。单个记录按日期在单个 rat ID 文件夹中排序。

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Representative Results

图 1中显示了唤醒压测量过程的示意图, 并在图 2中显示了膀胱导管植入的内部解剖。手术需要2小时, 术后镇痛和抗生素, 在手术后五天内包括疼痛和感染。此后没有发现任何疼痛的迹象。每天两次仔细检查腹部、腹部缝合和颈部缝合是维持动物健康所必需的。线束控制 (位置和松紧度) 应在头五天和以后定期进行一次。腹部缝合线可以删除在 10th后手术天。

我们在手术后的前10天使用柔软的非木本寝具来避免炎症。床上用品每周至少更换两次, 以进一步降低炎症的风险。动物被保存在单一的住房中, 因为群体住房增加了利用、导管或电极电缆咬住笼友的风险。

导管应至少每周冲洗一次, 无论是在压测量过程中, 还是用1-3 毫升无菌0.9% 氯化钠以低输液速度手动冲洗导管 (图 3)。定期的抗生素覆盖的动物进一步减少感染的风险和泌尿系结石的形成。监测体液摄取是防止泌尿系结石形成的又一重要点。柠檬酸在低浓度 (2-3%) 是通过导管或进入饮用水 intravesically, 以防止结石形成。

手术的成功率, 以及维持膀胱导管和电极完整, 大约80%。在余下的20% 的情况下, 主要的问题是从插头的电极线脱离。因此, 小心地将电极线连接到线束上是避免电极损耗的关键。

压测量通常做, 直到三连续的排尿周期记录每测量, 采取在20到 40 min 之间, 取决于焦虑和处理状态的鼠。第一次压测量通常是在导管植入手术一周后进行。

压记录的主要读出参数是基线压力、阈值压力、最大逼尿肌压力、无效容积、平均流量、排尿时间、平均压力、膀胱顺应性以及同时读出外部尿道括约肌肌电-活动 (图 4)。

连续的压测量在后续的期间可以执行至少四星期在手术以后。如果导管线经常冲洗, 导管堵塞是没有问题的。在整个随访期间, 应进行大鼠的常规处理和光控。

如果导管是避免或阻断, 膀胱灌注压力将增加线性到非常高的压力 (100 厘米 H2O)。在这种情况下, 应停止灌装和可见的导管端应检查康祺。如果未发现康祺, 则应检查导管是否有堵塞的插座。为此, 导管可以手动冲洗通过导管。如果液体不是容易地流动入膀胱, 拉扯和向前轻轻地可以被尝试。最后一次尝试, 酸性冲洗液 (柠檬酸 2-3%) 可用于尝试清除导管内的受阻区域。这个解决方案可能有更高的机会解除封锁, 然而, 膀胱将被激怒后, 成功冲洗和连续的测量应只执行两天后冲洗与酸性溶液。如果没有液体能被冲洗入膀胱, 导管永久地被阻拦, 并且没有进一步测量是可能的, 并且动物丢失为后续。

Figure 1
图 1: 清醒大鼠压测量的原理图.此图已从2进行了改编。(a) 尿动力学设置的图示。(b) 实验室站进行尿动力学检查。(c) 外侧尿道括约肌肌电电极植入尿道、术中观察。(d) 膀胱导管植入时的膀胱穹观, 术中观察。(e) 在植入电极和导管后, 老鼠将配备安全带, 以安全地储存插头和连接器。(f) 人类尿。b-e中的数字与a中的图例相关。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 大鼠膀胱导管植入的内部解剖.此图已从8中修改。

Figure 3
图 3: 大鼠导管线的冲洗.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 导管植入后12天的动物尿动力学脉象.(a) 代表性的尿动力学追踪从一个天真的老鼠。顶部显示膀胱压力示踪, 在中间分泌的尿量追踪, 并在底部的外部尿道括约肌肌电追踪。(b) 缩放窗口从六十年代的一个天真的动物, 取自 (a)。一个重要的说法是, 排尿时的外部尿道括约肌肌电活动少于排尿前后。顶部显示膀胱压力示踪, 在中间分泌的尿量追踪, 并在底部的外部尿道括约肌肌电追踪。在底部, 一个热图显示与时间匹配的频率频谱图 (对应于当前时间点的频率)。红色代表高功率, 蓝色代表低功耗。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

本协议描述了永久性导管和尿道括约肌电极植入的手术过程和压记录技术在清醒, 轻度抑制大鼠包括同时分析膀胱和尿道外括约肌。

手术中的关键步骤是仔细植入膀胱导管, 避免渗漏和广泛操作。此外, 对尿道外括约肌的双侧电极进行精确的植入, 对于外括约肌的声音测量至关重要。在植入后对手术场进行严密检查对维持动物的健康也是必不可少的。后续的抗生素覆盖有助于预防沿导管线感染, 以及发生尿路感染。

在压测量期间, 处理过的老鼠会比以前没有处理过的老鼠更镇定、更放松。因此, 压记录的结果可能会有所不同。此外, 抑制剂为鼠提供了一个封闭的空间与一个黑暗的前沿区域感到更舒适, 从而减少压力水平。在其他被出版的醒的压测量, 老鼠在测量的笼子可以自由地移动。然而, 这在测量过程中具有较高的人工风险, 可能会增加记录的时间, 同时也会提高动物的应力水平。在健康的大鼠, 最佳的压测量可以复制在多个测量时间点在后续。在压测量过程中, 通常出现的问题是避免导管, 或者是协议的步进式传导中的一个错误。如果发生技术或软件错误, 则强烈建议重新初始化压测量和协议的逐步重复, 以便进行故障排除。

这项技术的局限性是压记录的动物间变异性, 植入导管引起的膀胱组织结构改变, 这可能会阻碍组织的组织学或分子生物学检查,和动物在随访期间的单一住房。此外, 这项技术只在雌性大鼠中进行了试验, 对雄性大鼠的适用性和结果尚未进行检查。

这项技术的主要优点是同时测量膀胱和外尿道括约肌, 以及清醒的测量设置。因此, 对清醒动物下尿路的一个更具平移性的检查是可用的, 相比之下, 在麻醉的单一, 终端压分析5,6,9,10。此外, 随着这种方法, 一个较低的泌尿道功能障碍或病理的进展可以遵循在同一动物随着时间的推移, 以及治疗的成功。特别是, NLUTD 可以被审查在一个时间路线, 是不可能的到一个充分的程度与共同的压技术2

最后, 提出的手术和压测量用于多, 人工减少下尿路的分析, 包括膀胱和外尿道括约肌在清醒大鼠的相互作用。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

作者没有任何致谢。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylene tubing PE 50 Becton Dickinson 427411 Catheter
Prolene 6-0 (BV-1, 9.3 mm, 3/8c) Ethicon EH7403H Suture
Teflon coated steel wire Cooner wire AS631 Electrode material
Silver wire 0.250 mm World Precision Instruments AGW1030 Electrode material
Rotilabo - PVC tube Carl Roth 97241 Harness
Vicryl rapide 4-0 (P-3, 13 mm, 3/8c) Ethicon V4940H Suture
Quick Connect Single Harness SAI Infusion Technologies QCH-23CW Harness
Shrinking tubes ChiliTec 17894 Electrode soldering
Soldering wire Pb60 Sn40 Stannol LD0029 Electrode soldering
Fluxing agent 157 Castolin Eutectin 157 0150 Electrode soldering
Conn Unshrouded Header HDR 3 POS, 2.54mm Solder ST Thru-Hole Box Preci-dip 801-87-050-10-001101 Electrode soldering
Conn Socket Strip SKT 50 POS 2.54mm, Solder ST Thru-Hole Box Preci-dip 890-18-003-10-001101 Electrode soldering
Rat Cystometry Package (contains pump, scale, pressure transducer, hardware for cystometric analysis) Catamount Research and Development Inc. CAT-CYT-R
Differential amplifier with active headstage AD instruments DP-311 EMG amplifier
Restrainer Medium size for rats 200-300 g emka Technologies HLD-RM
Uro Dyn Software Zürich of University MTA-based
Female rats (Strain Lewis) 12 weeks of age Charles River, Sulzfeld, Germany animals

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References

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