합성 및 루 테 늄 기반 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물의 평가

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

합성, 정화, 및 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관의 루 테 늄 기반 억제제의 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. Permeabilized 포유류 세포에서 효능을 평가 하는 절차를 설명 했다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nathan, S. R., Wilson, J. J. Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor. J. Vis. Exp. (128), e56527, doi:10.3791/56527 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

우리는 합성과 정화는 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물, [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)]5 +의 선발. 이 화합물의 최적화 된 합성 1 m에서 [Ru (NH3)5Cl] Cl2 에서 NH4오 그린 솔루션 저조한 닫힌된 컨테이너에서 시작 됩니다. 정화는 양이온 교환 크로마토그래피와 함께 수행 됩니다. 이 화합물과 특징은 순수에 대 한 UV와 IR 분광학에 의해 확인. 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 속성 permeabilized HeLa 세포에 형광 분광학에 의해 평가 됩니다.

Introduction

미토 콘 드리 아 칼슘은 에너지 생산 및 apoptosis를 포함 하 여 정상적인 세포 기능에 중요 한 프로세스의 수에 대 한 키 레 귤 레이 터 이다. 1 , 2 , 3 미토 콘 드리 아 칼슘 uniporter (MCU), 내부 미토 콘 드리 아 막에 상주 하는 이온 운송업 자 단백질은 미토 콘 드리 아로 칼슘 이온의 유입을 통제 한다. 4 , 5 , 6 화학 억제제는 MCU의 기능이 수송 단백질과 미토 콘 드리 아 칼슘의 세포 역할을 공부 하 고 노력을 계속 하는 데 유용한 도구는. 복합 [(HCO2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, 24 µ M.7 보고 Kd 값 MCU에 대 한 유일한 알려진된 선택적 억제제 중 하나입니다. ,8,,910 이 복잡 한 상업적인 정립에서의 루 테 늄 빨강 (RuRed)는 triruthenium 디-μ-oxo 발견 일반적인 불순은 다리의 공식 [(NH3) hexacation 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(μ O) Ru (NH3)5)]6 +, 또한 칼슘 통풍 관 억제 물으로 사용 되었습니다. Ru360를 상업적으로 사용할 수 있지만 그것은 매우 비용이 많이 드는입니다. 또한, 합성 및 Ru360의 절연 어려운 정화 절차와 모호한 특성 방법에 의해 도전입니다.

우리는 최근 Ru360 아날로그, [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5액세스 절차 보고 있다. 11 이 화합물 높은 선호도, Ru360와 유사한 MCU 억제. 이 프로토콜에서 [Ru (NH3)5Cl] Cl2개시는 화합물의 우리의 가장 효과적인 합성을 설명 합니다. 강하게 산 성 양이온 교환 수 지를 사용 하 여 제품의 정화는이 절차에 대 한 일반적인 함정 함께 상세한입니다. 우리는 또한 특성화 및 복합 순도의 평가 대 한 방법을 제시 하 고 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 차단에 그 효능을 테스트 하는 간단한 방법의 윤곽을 그리 다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

참고: 농축된 산 및 기초가이 합성에 사용 됩니다. 모든 적절 한 안전 관행을 사용 하 여 엔지니어링 컨트롤 (증기 두건) 및 안전 안경, 장갑, 랩 코트, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발 등 개인 보호 장비 (PPE)의 사용을 포함 한 반응을 수행할 때.

1.의 준비 [(오 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (오 2)] Cl 5

[Ru (NH 3) 5 Cl] Cl의
  1. 합성 2 12
      RuCl 3 · n H 2 O의
    1. 분해 1.00 g (40% 무게에 의해 Ru, 4.1 mmol) H 2 o. 쿨 얼음 목욕에서 0 ° C에 어두운 갈색 솔루션의 5 ml에서. Dropwise 방식에서 80% 히드라 진 하이드 레이트 솔루션의 11 mL (0.23 mol)를 추가 합니다. 초기 반응 갈색 솔루션의 결과로 진화 가스와 활발 한 것입니다. 16 h;에 대 한 실 온에서 저 결과 솔루션을 보자 최종 솔루션은 어두운 무엇이 될
      주의: 히드라 진은 심하게 독성과 발암 성. 또한, 무수이 시 약이 폭발 합니다. 항상 그렇듯이, 처리할 때 적절 한 보호구 및 연기 후드를 사용 합니다. 이러한 솔루션 건조에 집중 하지 마십시오.
    2. 가 솔루션 2로 pH를 조정에 집중 된 HCl의 약 5-10 mL을 추가. 이 시점에서, 솔루션 것입니다 노란색 갈색 색상에서.
    3. 1-2 시간 교 반 하면서 105 ° C에서이 솔루션을 열. 노란 고체 솔루션에서 침전 한다. 더 이상 침전 가시 형태, 열에서 제거.
    4. 하도록을 실내 온도에 냉각 후 0 ° C 얼음 욕조에 10 분 수집 진공 여과 및 세척 5 mL로 하 여 노란색 고체에 대 한 반응 혼합물의 에탄올과 에테르 diethyl.
    5. 완전히 15-25 mL의 뜨거운 물에 원유 제품을 분해. 얼음 목욕에서 그것을 배치 하 여 집중 HCl 솔루션 필터 플라스 크에 10 mL을 진정. 창백한 노란색 순수한 고체의 강 수를 유도 하기 위해 냉장된 HCl 솔루션으로 노란색 솔루션을 필터링 합니다. 이 침전을 필터링 하 고 각 0.5 M HCl, 에탄올 및 에테르 5 mL로 씻어.
    6. 특성과 복합 사용 하 여 적외선의 분광학 3226 c m -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1, 801 c m -1에서 기지개 주파수 식별에 의해 순도 확인 합니다. 2069 cm -1에 일반적인 작은 불순 [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3에 할당 됩니다.
  2. [(오 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (오 2)] Cl 5의 합성
    1. 100mg (0.34 mmol)을 녹 [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 50 ml의 1 M NH 4 200 mL 무거운 벽 라운드 바닥 압력 용기에 오. 느슨하게 캡 스 토퍼와 플라스 크 6 h. 제거 열에서 75 ° C에서 반응 혼합물이 열 하 고 어두운 녹색 솔루션을 4 일 동안 실내 온도에 저 어.
      주의! 압력 형성에 밀폐 용기 결과 난방. 적절 한 압력 안전 유리를 사용 하 여 있는지 확인 합니다. 이 반응에 대 한 선박을 씰링의 목적은 가스 NH 3의 손실을 최소화 하기 위해입니다. 따라서, 느슨하게 초과 압력의 릴리스에 대 한 수 있도록 스 토퍼를 배치.
  3. 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정화
    1. 25 mL 비 커에 5 g 양이온 교환 수 지를 일시 중단 (예: Dowex 50WX2 200-400 메쉬 (H + 형식) 10 ml 0.1 M HCl.
    2. 50 mL 용 저수지와 부착 (직경 10 m m, 높이 15 cm) 10 mL 열에이 슬러리를 로드 합니다. eluate 무색이 될 때까지 약 20-30 mL의 0.1 M HCl로 수 지를 세척.
    3. 단계 1.2.1에서에서 고립 된 녹색 반응 솔루션을 반환 합니다. 이 솔루션에 추가 2, 어느 시점에서 솔루션 색상이 갈색으로 변경 pH 조정에 집중 된 HCl.
    4. 부드럽게 수 지 위에 pipetting 단계 1.3.2에서에서 준비한 양이온 교환 수 지 열이 acidified 솔루션을 로드 합니다. 완전히 배수, 및 솔루션을 로드 계속 eluate 하자. 이 프로세스를 반복 하 여 전체 솔루션 추가 되었습니다. 수 지의 상단은 어두운 갈색/검은색 될 것입니다. 수 지에에서 약간 줄어듭니다.
    5. 사용 수 지의 상단을 충당 하기 위해 유리 구슬. 이 새로운 솔루션은 추가 될 때 방해 되 고에서 수 지를 방지 합니다.
    6. 20 mL의 1 M HCl와 열을 elute.
    7. Elute 1.5 m HCl 농도 증가 된 열 (≈ 50 mL). 노란 솔루션 열 내려와 시작 합니다. 2 m HCl 농도 증가 하 고 계속 방출는 eluate 무색이 될 때까지 또는 아주 창백한 녹색 황색. 150-200 mL의 총 볼륨이이 과정에 필요한 것.
    8. 2.5 m (20-50 mL) HCl 농도 증가. 분수에 시험관으로는 eluate를 수집 합니다. 3m HCl 늘립니다. 제품 열에서 녹색 갈색 솔루션으로 elute 것입니다. 레드 브라운 분수 또한 열에서와 서 시작할 수 있습니다. 이 분수는 산화 루 테 늄 빨강 불순물, 녹색 갈색 분수와 수영장 하지 마십시오.
  4. 특성화 및 검증 [(오 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (오 2)] Cl 5의 순수성의
    1. 에서 분수의 모든 테스트 1.3.8 단계입니다. UV-마주의 분광학에 의해 이 작업을 수행 하려면 3 M NH3 2 mL에 주어진된 분수의 100 µ L을 추가 하 고 자외선에 대 한 분광학에 의해 분석. 분수 순수한 제품을 포함 하는 큰 흡 광도 밴드 있을 것 이다 360 nm와 600 덜 강렬한 흡 광도 nm. 480 또는 533 nm에서 흡 광도 산화 루 테 늄 빨강 및 루 테 늄 빨강 불순물, 각각.
    2. 수영장 분수 순수한 제품을 포함 하 고 회전 증발에 의해 건조에 대 한 해결책을 증발. 제품 그린 브라운 단색으로 고립 될 것입니다. 수확량은 일반적으로 5-15 mg (수율 10-20%)의 순서. 단일-결정, x 선 회절에 대 한 적합 한 화합물의 수성 해결책에 에탄올의 증기 확산에 의해 얻어질 수 있다.
    3. 확인 순도, pH 7.4 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 솔루션에 대 한 UV 분광학 화합물 분석. 순도 360의 농도의 비율을 복용 하 여 사정 될지도 모른다 nm와 600 nm 봉우리. 이 비율은 이다 순수한 화합물에 대 한 31. 불순 한 화합물에 대 한 비율이 작은 것.
    4. IR 분광학에 의해는 고체에 샘플을 분석합니다. 진단 밴드 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 c m -1, 815 cm -1에 있습니다. 일반적인 불순물 밴드 1762 c m -1와 1400 c m -1에서 볼 수 있습니다, 뉴 햄프셔의 특성 4 cl. 루 테 늄 빨강 1404 cm -1, 1300 c m -1, 1037 cm -1 800 cm -1에 악대에 의해 확인 될 수 있다.
  5. 형광 분광학에 의해 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제의 평가
    주의! 다음 절차는 포유류 세포를 사용합니다. 작업 생물 안전 수준 2 (BSL2) 연구에 대 한 인증 된 적절 한 층 류 두건에서 실행 되어야 한다.
    ​ 참고: [(오 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (오 2)] Cl 5 참조 됩니다 [러]로이 단원의
    1. 버퍼링 확인 포함 하는 포도 당 생리 식 염 수 (BGSS)로 분석 결과 미디어입니다. BGSS 110 m KCl m, 1 mM KH 24, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 5mm 나트륨 호박, 30 µ M 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-구성 된 솔루션은 N, N N ', N '-tetraacetic 산 (EGTA). EGTA는 제외 하 고 모든 것을 결합, pH 7.4에 조정. EGTA를 추가 하 고 pH 7.4에 조정. 분석 결과 미디어의 50 mL에 대 한 추가 1 mg/mL 포도 당의 0.5 mL.
    2. Dulbecco에 500 cm 2 접시에 문화 HeLa 세포 ' s 수정이 글 매체 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 5% CO 2 시드 100 mm 페 트리 접시에에서 성장 하는 37 ° C. 증폭 HeLa 세포에서 습도 인큐베이터에서 500 cm 2 페 트리 접시에 그들을. 큰 접시에 총 미디어 볼륨은 115 mL. 각 큰 접시 약 18 백만 셀, 두 형광 분광학 실험을 위해 이젠 그만 얻을 것입니다.
      1. 성장 셀 90-95%를 도달할 때까지 confluency. 미디어를 제거 하 고 15 mL pH 7.4 PBS 가진 세포를 씻어. PBS에서 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 15 mL를 추가 하 고 셀을 분리를 10 분 동안 품 어. 아래 팔 콘 튜브 라운드 14 mL 셀 전송
    3. 거꾸로 현미경으로 trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 셀의 총 수와 1.8 mL 볼륨 당 7.5 백만 세포에 도달 하는 데 필요한 미디어의 볼륨 계산 중간. 원심 5310 × g. Decant는 상쾌한 10 분에 대 한 셀을 BGSS의 계산 된 볼륨을 추가 합니다. 부드럽게 세포를 resuspend.
      1. 가 분석이 결과 대 한 순수한 물에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 1 m m H 2 O 및 H 2 o [Ru]. 재고 솔루션, 10 m m CaCl 2 칼슘 그린-5N에서에서 40 m m digitonin의 재고 솔루션을 준비, 1-3 m m 범위 수.
        ​ 참고: 칼슘 그린-5N은 빛에 민감한. 어둠 속에 저장 하 고 빛의 노출을 최소화.
    4. 506 nm와 532에서 방출 읽기에 흥분 하는 fluorimeter를 설치 37에서 제어 베트 홀더 nm ° C. 준비 볶음 바와 휠, 1.8 mL 세포 현 탁 액 위에, 1.8 µ L digitonin 솔루션, 3.6 1.5.2에서 아크릴 베트 & # 181. L 칼슘 그린-5N (솔루션), 그리고 9 µ L [러] (1 m m 재고 솔루션, 5 µ M 최종 농도)에 대 한. 세포는 fluorimeter에 15 분 동안 품 어.
      1. 원시 흡수 대신 여기/방출 비율으로 데이터를 읽을. 광원에서 동요와 관련 된 오류를 최소화 하는이 연습.
      2. 셀의 응답에 CaCl 2의 추가의 효과 측정 하는 [루]의 부재에서 첫 샘플 분석 수행.
      3. 1.5.4에 설명 된 설정으로 fluorimeter에 시작 분석. 약 2 분 안정 방출 기준을 설정 하 고 CaCl 2 (10 µ M 최종 농도)의 1.8 µ L를 추가 합니다. 방출 강도 CaCl 2의 추가 시 즉시 증가 하 고 칼슘 이온 입력은 미토 콘 드리 아 분의 과정을 통해 다음 부패 합니다. 감퇴가 완료 될 때까지 기다립니다 (≈ 5 분). [러] 치료 하지 않을 셀의 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 응답을 확인 하려면 추가 칼슘 boluses 추가.
    5. 다른 멧에 포함 된 5 µ M [Ru] 반복 실험 1.5.4.3에서 위에서 설명한 대로. 억제제, 존재 방출 강도 증가, 그러나 부패 하지 것 이다. 이 관측 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관을 차단 하는 것을 의미 한다..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

이 메서드는 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물 [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5 [Ru (NH3)5Cl] Cl2, 시작의 합성에 설명 합니다는 잘 알려진 ruthenium(III) 시작 소재입니다. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 IR 분광학, 3200 c m-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1, 798 cm-1 (그림 1)에서 진동 모드와 특징입니다. 2069 cm-1 에 작은 불순 [Ru (NH3)5N2] Cl3을 지정할 수 있습니다. 1 M NH4오가 Ru(III)의 반응 [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5월급. 이 반응의 진행은 극적인 변화 녹색 노란색에서 솔루션의 색깔에 의해 입증 됩니다. 최종 반응 해결책은 색깔에서 진한 녹색 이다. 브라운; 색상 변경에 집중 된 HCl 결과 함께이 솔루션의 산성화 이 중립화의 부산물은 염화 암모늄, 케어를 행사 하지 아니 하면 최종 제품을 오염 시킬 수 있는. 화합물의 정화 강산 메쉬 (H+ 양식) 수 지를 사용 하 여 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 진행 한다. 수 지는 0.10 M HCl로 먼저 equilibrated 하 고 [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5 의 솔루션 열에 로드 됩니다. 염화 암모늄 부산물 1 M HCl 빨 래와 elutes. 포함 하는 루 테 늄 화합물 높은 HCl 농도 elute. Unreacted [Ru (NH3)5Cl], Cl2 시작 물자를 포함 하는 노란색 분수의 시리즈 올 열에서 HCl 농도 1.5 M 이다. 원하는 제품 2.5-3.0 M 사이 elutes HCl, 그리고 결과 분수 표시를 녹색 컬러로 그린-브라운.

제품의 분수를 풀링, 이전 그들의 순도 확인 한다. 때문에 원하는 화합물 스펙트럼 상 자외선에 대 한 몇 가지 pH 의존 전시, 분수의 작은 aliquots 스펙트럼 기능 분수의 모두를 위해 동일을 매우 기본적인 3 M NH3 솔루션에 추가 하는 것이 좋습니다. 순수한 분수 해야 표시는 강렬한 피크 360 nm와 600에 약한 피크 nm (그림 2). 480, 533 nm 근처 봉우리 각각, 루 테 늄 브라운과 레드의 존재를 나타내는 260에서 상당한 피크 nm, 290에서 어깨 nm, Cl [Ru (NH3)5Cl]2 시작 물자 (그림 3의 존재 의미 ). 순수한 분수의 로타리 증발 그린 브라운 솔리드로 원하는 화합물을 준다.

고립 된 화합물 더 대 한 UV와 IR 분광학에 의해 특징 수 있습니다. 대 한 UV 스펙트럼 (그림 2) 표시는 360 nm와 600 nm 흡 광도 밴드 위에서 설명한 대로 600 nm 밴드에 대 한 소멸 계수 850 M-1c m-1 이며 360 nm 악대를 위한 27000 M-1c m-1이다. 600 nm 밴드에 비해 360 nm 대역의 휘도 비율 pH 7.4 PBS에 31 고이 통계는 화합물의 순도 측정 하기 위해 효과적으로 사용할 수 있습니다. IR 스펙트럼은 그림 4와 같이 표시 되어야 합니다. Ru-O-Ru 기지개 주파수, 예를 들어 850 c m-1에서 진단입니다. IR 스펙트럼 Ru-O-Ru 스트레치를 확인 하 고 아무 염화 암모늄은 최종 제품에 보장 하기 위해 고용 되었다. 일반적인 불순물, 염화 암모늄 1762 cm-1 (매우 약한) 및 1400 c m-1 (강한) IR 스펙트럼 (그림 5)에서 쉽게 분별 될 수 있는 진동 모드 있다. 루 테 늄 빨강 반응의 일반적인 부산물 이다 IR 스펙트럼 1404 cm-1에 뻗어, 1300 c m-1, 1037 cm-1 및 800 c m-1에서 식별 될 수 있습니다, 그리고 비록 일부 겹칠 원하는 제품 (발생 그림 6)입니다.

Digitonin permeabilized HeLa 세포에서 칼슘 통풍 관 응답 (그림 7) 관찰 됩니다. 별표는 CaCl2 bolus의 추가 나타냅니다. [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)]의 Cl5 방출 강도 증가 칼슘 뿐만 아니라, 하지만 미토 콘 드 리아 칼슘으로 인해 아무 부패 시 관찰 통풍 관은 관찰 된다.

Figure 1
그림 1 : [Ru (NH3)5Cl] Cl2의 적외선 스펙트럼. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 매우 작은 [Ru (NH3)5N2] Cl3 불순물의 적외선 스펙트럼. 빨간색 화살표는 2,069 c m-1에서 불순물을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 순수한 물질에 대 한 대표 UV-vis 스펙트럼. [(오2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(오2)] Cl5 대 한 UV 흡수도 스펙트럼 적외선 (삽입 된) pH 7.4 PBS에 근처. 360에서 주요 흡 광도 대 한 소멸 계수 nm 27000 M-1 c m-1이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 원유 반응 혼합물의 대 한 UV 스펙트럼. [(오2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(오2)] Cl pH 7.4 PBS에 정화 하기 전에 원유 반응 혼합물의5 대 한 UV 흡수도 스펙트럼. 빨간색 화살표는 일반적인 불순물을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 순수한 물질에 대 한 대표적인 적외선 스펙트럼. [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5의 적외선 스펙트럼. Ru-O-Ru 스트레치 850 c m-1에, NH3 발진기에서 다른 뻗 기는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5/>
그림 5 : NH4Cl 불순물을 포함 하는 적외선 스펙트럼. [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5 염화 암모늄 불순물의 적외선 스펙트럼. 빨간색 화살표는 1400 c m-1에 염화 암모늄을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : 상업 루 테 늄 무엇이의 적외선 스펙트럼 [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5 (검은 추적)와 상업 루 테 늄 빨강 (빨간 추적)의 적외선 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 : 대표적인 칼슘 통풍 관 결과. 헬러 세포 digitonin permeabilized, 칼슘 그린-5N과 [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5 의 칵테일에 칼슘의 추가 때문에 형광 증가 BGSS에서. 빈 포함 아니 [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5 와 형광 감소 캘리포니아2 + 통풍 관 때문에 미토 콘 드리 아로 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물 [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5 [Ru (NH3)5Cl] 합성된 Cl2, 잘 알려진 ruthenium(III) 수 있습니다. 이 절차에 설명 된 대로 자료를 시작 합니다. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 의 합성은 쉽게 작은 어려움으로 달성 됩니다. 히드라 진에 RuCl3 16 h 교 반 후 수 화, 솔루션의 pH는 HCl와 2의 값을 조정 한다. PH 드롭은 원하는 제품을 달성 하기 위해 중요 합니다. 원하는 경우,이 합성 HCl 대신 HBr에 의하여 여 양식 [Ru (NH3)5Br] Br2 수정할 수 있습니다.

우리는 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물의 합성 중 원치 않는 부산물의 형성을 최소화 하기 위해 몇 가지 전략을 관찰 했습니다. 특히, 출장 플라스 크를 유지 하는 것은이 반응;의 성공에 중요 한 플라스 크가 열려 있으면 다른 부산물, 루 테 늄 빨강 (RuRed)를 포함 하 여 몇명의 감지할 수량에 형성 된다. 아마도, 기체 암모니아 오픈 반응 배를 원하는 제품의 이벤트 타협 형성이 손실 됩니다. 플라스 크의 크기와 수성 암모니아의 볼륨도 수정 해서는 안 크게이 프로토콜에서 설명에서 있듯이 우리 작은 플라스 크에이 반응의 효율 감소는 중요 한 매개 변수가 있습니다. 이 방법은 크게 우리가 이전 공개 했다 다른 두 방법에 비해이 화합물의 수율을 증가 하지 않습니다. 그러나 그것은, 몇몇 단계를 포함 하 고 RuRed 적은 측면 제품 대형을 않습니다. 낮은 수익률 unreacted [Ru (NH3)5Cl] Cl2 알 수 없는 높은 충전 칼럼의 상단에 유지 되는 불순물의 작은 금액의 존재에 표시 될 수 있습니다. 우리는 많은 추가 반응 조건 탐험 하지 않은, 비록 개선 반응 시간과 반응 물 농도 높은 수익률을 얻기 위해 변화 하 여 실현 될 수 있다 가능 하다.

[(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5 의 정화는이 프로토콜의 가장 지루한 하 고 어려운 부분 이다. 잘 포장된 열 분리;에 크게 도움이 될 것입니다. 슬러리로 수 지를 로드 하는 것은 열 팩을 효과적인 접근 이다. 그것은 열 차입 과정 HCl 농도 증가로 수 지 크기에 계약 것입니다 주목 해야한다. 순수한 물자를 성공적으로 얻기 위해 산 성 농도 증가 속도 하지 명시 절차에서 이탈 한다. 최종 제품 그린 브라운 고체; 될 것 이다 기본 솔루션 진한 녹색 하지만 산 성 솔루션 갈색 될 것입니다. 밝은 핑크 레드 솔루션, 관찰 하는 경우 루 테 늄 빨강 오염 있습니다. RuRed의 금액 소멸 계수를 사용 하 여 확인할 수 있습니다 (533에서 62000 M-1·cm-1 nm). 이 정화 과정은 상대적으로 강한 양이온 교환 수 지 열에 대 한 일반.

미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 permeabilized HeLa 세포, 칼슘 그린-5N, 형광 성 칼슘 센서는 spectrofluorimeter를 사용 하 여 테스트할 수 있습니다. 13 , 14 이 분석 결과 세포의 대량 필요 하 고 따라서 매우 큰 500 cm2 페 트리 접시에에서 문화의 증폭을 할 거. 이러한 큰 문화 플라스 크 방지 추가 과제는 노출 표면 영역은 매우 큰 있기 때문에 미생물 오염을 최소화 합니다. 일 층 류 무 균 유지 캐비닛에 밖으로 실행 되어야 한다. Permeabilized HeLa 세포에서 칼슘 그린-5N의 형광 응답 형광 분광학에 의해 모니터링 됩니다. 베트에 칼슘의 외부 bolus의 추가 센서와 상호 작용 하는 칼슘 이온에서 발생 하는 형광에 즉각적인 증가 트리거합니다. 동안 몇 분, 억제제의 부재에 때문에 이해는 미토 콘 드리 아에서 칼슘 이온이 염료에 의해 액세스할 수 없는 세포 기관이 강도 자연 붕괴의 과정. 이 분석 결과 억제제 칼슘 이온의 큰 알 약의 추가의 실시는 때 방출 강도 증가에 상승을 제공 합니다. 하지만 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 때문에 감퇴, 하지 않습니다,이 화합물의 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 속성을 확인. 이 과정은 칼슘 흡수 억제제에 대 한 일반 화면으로 사용할 수 있습니다. 또한,이 절차의 다른 진 핵 세포에 적용할 수 있습니다. 이 분석 결과 외부의 permeabilization에 따라 세포 막 이렇게 복잡 한의 세포질 통풍 관 능력에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다.

요약 하자면,이 프로토콜 합성 및 소설 루 테 늄 기반 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물의 정화를 설명 합니다. 이 화합물은 미토 콘 드리 아 칼슘과 포유류 세포의 생리학에서의 역할의 생물학을 공부에 대 한 중요 한 가치입니다. 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관을 테스트 하기 위해 비교적 간단한 분석 결과 심사 및 새로운 억제제의 조사에 대 한 사용의 또한 이다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자 공개할 게 없다

Acknowledgments

이 연구는 코넬 대학에 의해 지원 되었다. 이 작품은 코넬 센터의 시설에 대 한 재료 연구 공유, NSF MRSEC 프로그램 (그랜트 DMR-1120296)을 통해 지원 되는 사용 했다. S.R.N.는 NSF 대학원 연구 장학금 (그랜트 DGE-1650441) / 닥터 데이브 Holowka를 통해 칼슘 실험 지원을 인정합니다. 모든 의견, 결과, 결론 또는 권고가이 자료에서 표현은 저자 (들)의 고 반드시 국립 과학 재단의 의견을 반영 하지 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ruthenium Trichloride hydrate Pressure Chemical 3750
Concentrated hydrochloric acid J.T. Baker 9535
Concentrated ammonium hydroxide Mallinckrodt Chemical Works A669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 Mesh Alfa Aesar 13945
Calcium Green 5N Invitrogen C3737
Digitonin Aldrich 260746
DMSO Aldrich 471267
EGTA Aldrich E3889
KCl USB 20598
KH2PO4 Aldrich P3786
MgCl2 Fisher Scientific M33-500
HEPES Fluka 54466
Sodium Succinate Alfa Aesar 33386
EDTA J.T. Baker 8993-01
Glucose Aldrich G5000
200 Round bottom flask ChemGlass CG-1506-14
Glass stopper ChemGlass CG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirs Custom - similar to Chemglass columns Similar to CG-1203-20
DMEM Corning 10-017-CV
FBS Gibco 10437028
PBS Corning 21-040-CV
Round bottom Falcon tubes Fisher Scientific 14-959-11B 
500 cm2 petri dishes Corning 431110
Trypan blue ThermoFisher Scientific 15250061
Hemacytometer Aldrich Z359629
Acrylic Cuvettes VWR  58017-875
UV-Vis spectrometer Agilent Model Cary 8454 
Spectrofluorimeter SLM Model 8100C
IR spectrometer Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment
Centrifuge ALC Model PM140R
Inverted light microscope VWR  89404-462

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797, (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12, (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476, (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476, (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16, (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30, (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115, (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273, (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533, (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56, (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45, (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics