الكشف السريع عن النماء العصبي تعمل في خلايا الإنسان العصبية السلائف (الشخصيات)

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

العمليات النمائية مثل الانتشار، والهجرة، وثمرة نورت هي غالباً بالقلق في الأمراض العصبية. وبالتالي، فإننا نقدم بروتوكولات لتقييم سرعة وتكاثر هذه العمليات النمائية في الشخصيات البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية. كما تسمح هذه البروتوكولات تقييم آثار عوامل النمو ذات الصلة والمداواة في التنمية للمجلس الوطني.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

عائدات التنمية الدماغ البشري من خلال سلسلة من عمليات مدبرة تحديداً، مع المراحل السابقة المتميزة بالانتشار، والهجرة، وثمرة نورت؛ والمراحل اللاحقة التي تتميز بتكوين ثمرة والمشبك إكسون/تغصن. في الاضطرابات النمائية، غالباً ما واحد أو أكثر من هذه العمليات تتعطل، مما يؤدي إلى تشوهات في تكوين الدماغ ووظيفة. مع ظهور التكنولوجيا البشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسك)، أن الباحثين الآن وفرة من الخلايا البشرية التي يمكن أن تكون متباينة في تقريبا أي نوع من الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية. يمكن استخدام هذه الخلايا لدراسة تطور الدماغ العادية والمرضية المرض. يميز عدد من البروتوكولات باستخدام هيبسكس نموذج استخدام الأمراض العصبية الميؤوس من شفائهم للخلايا العصبية أو استخدام الثقافة 3D النظم تسمى أورجانويدس. في حين أثبتت هذه الأساليب لا تقدر بثمن في دراسة الأمراض البشرية المرضية، هناك بعض العيوب. التفريق بين هيبسكس في الخلايا العصبية وجيل من أورجانويدس هي طويلة ومكلفة من العمليات التي يمكن أن تؤثر على العدد من المتغيرات التي يمكن تقييمها والتجارب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما تسمح الخلايا العصبية بعد الانقسامية وأورجانويدس دراسة العمليات المتعلقة بالمرض، بما في ذلك ثمرة تغصن وسينابتوجينيسيس، يحول دون دراسة العمليات السابقة مثل الانتشار والهجرة. في الاضطرابات النمائية، مثل مرض التوحد، تشير أدلة وافرة على الجثة والوراثية إلى العيوب في العمليات الإنمائية المبكرة. قد تكون الخلايا العصبية السلائف (الشخصيات)، وعدد سكانها خلية التكاثري عالية، نموذج مناسب لطرح أسئلة حول عمليات موسمية وبدء المرض. الآن نتقدم بمنهجيات المستخلصة من دراسة التنمية في الثقافات القشرية الماوس وفار للشخصيات البشرية. استخدام الشخصيات يسمح لنا بالتحقيق تعمل المتعلقة بالمرض وتحديد مدى اختلاف المتغيرات (مثلعوامل النمو والمخدرات) أثر العمليات الإنمائية بما في ذلك الانتشار، والهجرة، والتمايز في بضعة أيام فقط. في نهاية المطاف، يمكن استخدام مجموعة أدوات هذا بطريقة استنساخه والفائق للتعرف على الآليات الخاصة بالمرض وتعمل في الاضطرابات النمائية.

Introduction

استخدام أبسط الكائنات الحية ونماذج الفأر قد توضيح آليات نمو الدماغ الأساسية، فضلا عن منشأ المرض. وعلى الرغم من أوجه التقدم هذه، لا يزال مسببات العديد من الاضطرابات العصبية بعيد المنال لأن ليس كل النتائج التي توصل إليها في أبسط الكائنات ذات الصلة المباشرة بالجوانب المعقدة للأمراض البشرية. علاوة على ذلك، درجة أكبر من التعقيد في الدماغ البشري غالباً ما يجعل من الصعب لنموذج التنمية البشرية واضطرابات في الحيوانات. ومع تطور وتقدم البشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسكس) التكنولوجيا، يمكن برمجتها في الخلايا الجذعية خلايا جسدية وثم متباينة داخل الخلايا العصبية لدراسة الأمراض البشرية. التقدم في تكنولوجيات هيبسكس و "أوميك" (علم الجينوم، ترانسكريبتوميكس، البروتيوميات، وجميع) يبشر بأحداث ثورة في فهم تطور الدماغ البشري. هذه التكنولوجيات الآن تتيح نهجاً "طب دقة" لوصف الأمراض العصبية على أساس حالة بحالة.

هو المحصول الحالي في مجال النمذجة المرض هيبسك التفريق بين الخلايا في المخططات العصبية محددة في أحادي الطبقة أو استخدام نظام ثقافة 3D دعا أورجانويد بإيجاز جوانب الدماغ التنمية1،2، 3. وكانت هذه النظم بشكل لا يصدق قيمة في دراسة وكشف الجوانب الفريدة للتنمية البشرية والمرض4،5،،من67. ومع ذلك، الثقافات الخلايا العصبية وأورجانويدس غالباً ما تتطلب في أي مكان من أسابيع لأشهر في الثقافة قبل أنهم مستعدون لدراسة. طبيعة تستغرق وقتاً طويلاً لهذه البروتوكولات، ومقدار الموارد اللازمة للحفاظ على هذه النظم الثقافة كثيرا ما تحد من عدد التجارب التي يمكن القيام بها والعدد من المتغيرات (مثل عوامل النمو أو المخدرات) التي يمكن اختبارها. علاوة على ذلك، ركزت العديد من الدراسات استخدام الخلايا العصبية بعد الانقسامية وأورجانويدس على عمليات مثل تشكيل تغصن ثمرة أو المشبك، التي تحدث في وقت لاحق في التنمية. أثناء هذه العمليات قد تورطت في علم الأمراض اضطرابات النمو مثل التوحد وانفصام الشخصية، في وقت سابق الأحداث التنموية التي تحدث قبل تمايز الخلايا العصبية نهائي أيضا مهمة للمرض المرضية8 ،،من910،11،،من1213. والواقع أن الدراسات الجينية الحديثة تبين أن الفترة منتصف الجنين، التي تتألف من الانتشار وثمرة عملية، والهجرة، أهمية خاصة في التوحد المرضية11،14. وبالتالي، من المهم دراسة الجذعية العصبية والسكان خلية السلف فهم أفضل لهذه العمليات السابقة. نظم أورجانويد، وتنمية العقل البشري الخص مدروسة بشكل أفضل بسبب طبيعتها 3D وهيكل المنظمة، تحتوي على بركة السلف التي استخدمت لدراسة بعض هذه الأحداث السابقة. بيد أن السكان السلف في أورجانويدس في كثير من الأحيان متفرقة وأكثر مثل الخلايا الدبقية شعاعي من العصبية الجذعية أو السلف الخلايا5،15. وهكذا، فإنه سيكون مفيداً لأسلوب إنتاجية عالية لدراسة المراحل المبكرة من النماء العصبي في حالة خلية التكاثري بنشاط سكان.

لقد أنشأنا في المختبر، وهو بروتوكول يستخدم خلايا السلائف العصبية المشتقة من هيبسك (الشخصيات)، وعدد سكانها مختلطة العصبية الجذعية وخلايا السلف التي عالية التكاثري، دراسة العمليات النمائية مثل انتشار الهجرة الخلية، و تمديد العملية الأولية (نورت). ووضعت هذه الاختبارات من التقنيات المستخدمة في المختبر لدينا عقود بنجاح دراسة النماء العصبي في الفئران والفأر الثقافات القشرية16،17،،من1819،20، 21،،من2223. الأهم من ذلك، فإنه يظهر أيضا أن تعمل والإشارات التنظيمية المحددة في أنظمة الثقافة الجرذ والفأر تنبؤية عالية للآليات التي تكون نشطة في فيفو، مشيراً إلى قيمة هذه التقنيات16، 1718،،،من1924. بعد التفريق بين الأولية هيبسكس للشخصيات، هذه الأساليب تسمح لنا بدراسة العمليات الإنمائية الحيوية في غضون أيام. هذه الأساليب لها العديد من المزايا: (1) أنها تتطلب معدات متطورة قليلاً وهي سهلة التنفيذ، replicates التجريبية (2) عديدة يمكن أن تجري في فترة قصيرة من الوقت، مما يسمح لتأكيد السريع في إمكانية تكرار نتائج النتائج، و (3) ويمكن اختبار الثقافة متغيرات مثل مصفوفات الطلاء، وآثار عوامل النمو، والنشاط من المخدرات بسرعة وفعالية من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، علينا الاستفادة من دور راسخة من عوامل النمو خارج الخلية المنظمين الحرجة للعمليات الإنمائية المتنوعة. الشخصيات تعرضت لتحديد إشارات التنموية مباشرة تحفز الأحداث مثل الانتشار وثمرة نورت والهجرة الخلية، ووجدت أنها تعزز القدرة على تحديد العيوب التي ليست واضحة في مراقبة شروط19 , 25 , 26 , 27 , 28-وبالمثل، يوفر سهولة تقييم المخدرات وسيلة قوية اعتماد تقنيات الطب الدقة لاختبار فعالية التدخلات العلاجية المختلفة. وبالتالي، يسهل هذا البروتوكول إنتاجية عالية، قابل لإعادة الإنتاج، ومنهجية واضحة لدراسة تطور الدماغ المبكر والمرض المرضية، والآثار المفيدة المحتملة لعوامل النمو والمخدرات على النماء العصبي تعمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-سلامة الإجراءات وصيانة السلامة الأحيائية مجلس الوزراء

  1. إجراءات السلامة في مستوى السلامة الحيوية-2 (BSL-2)
    1. اتبع المبادئ التوجيهية لهذه المؤسسة في العمل مع المواد BSL-2. التخلص من المواد BSL-2 وفقا للممارسات للمؤسسة. وتشير إلى الغرف والمعدات المستخدمة لمواد BSL-2. ارتداء جميع معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، بما في ذلك مختبر المعطف والقفازات.
  2. صيانة السلامة الأحيائية مجلس الوزراء
    1. استخدام خزانة السلامة الأحيائية معتمدة لاستخدام مواد مستوى BSL-2.
    2. تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء لمدة 15 دقيقة على الأقل، ومن ثم رش الأسطح بمحلول التبييض 10%. تتيح حل التبييض للجلوس لمدة 15 دقيقة ومسح أسفل مجلس الوزراء بدوره على تدفق الهواء قبل الاستخدام.
  3. تريتياتيد المشعة [ح]3[-إجراءات السلامة thymidine (التريتيوم)
    ملاحظة: التريتيوم مصدر مشعة الفئة 5، 'معظم المحتمل أن تكون خطرة' الفئة. اتبع المبادئ التوجيهية للمؤسسة للعمل مع النشاط الإشعاعي. بعض المؤسسات قد تتطلب شهادات أو تراخيص للتعامل مع التريتيوم.
    1. تلقي التدريب من المؤسسة حول كيفية التعامل بشكل صحيح والتخلص من التريتيوم. التخلص من النفايات المشعة في أوعية مناسبة، وفقا لسياسات المؤسسة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية عند العمل مع التريتيوم.

2-العصبية الاستقراء من إيبسكس

ملاحظة: لجعل الشخصيات، أعقب نسخة معدلة قليلاً من البروتوكول التي ترافق مجموعة التعريفي العصبية متاحة تجارياً. الطقم يتكون من وسائل الإعلام نيوروباسال (ملحوظة) و 50 x ملحق الاستقراء العصبية (NIS)، الذي يستخدم لجعل 1 × العصبية التعريفي المتوسطة (نيم). شيكل إسرائيلي جديد يستخدم أيضا لجعل 100 ٪ "متوسطة التوسع" (انظر الفرع 3-1). تم العثور على ارتباط للبروتوكول في قسم المواد والمعدات والمراجع43.

  1. إيبسكس مرور عندما تصبح روافد 70-80%.
  2. لوحة 300,000 إيبسكس إلى 1 من هيسك-مؤهل خارج الخلية مصفوفة تقليد لوحة 6-جيدا هلام (جل تقليد ECM) المغلفة التي تحتوي على 2 مل من اللجنة التوجيهية خالية من التغذية المتوسطة مع 5 ميكرومترات المانع روك. انظر 3.2 الفرع للحصول على إرشادات على الآبار طلاء مع هلام تقليد إدارة المحتوى في المؤسسة.
  3. يوم واحد في وقت لاحق، إزالة المتوسطة اللجنة التوجيهية + روك إيبسكس المانع ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني x 1. إضافة 2 مل نيم إلى إيبسكس.
    ملاحظة: يرصد 50 مل نيم بإضافة 1 مل 50 x شيكل و 250 ميليلتر (50 وحدة/مل، 5 ميكروليتر/mL) للبنسلين/ستربتوميسين (P/S) لمل 49 NB وسائط الإعلام.
  4. تغير وسائل الإعلام التعريفي العصبية كل يومين قبل يسفط قضى المتوسطة واستبدال مع 2 مل نيم حتى تصبح المتلاقية الخلايا (حوالي 4-5 أيام). تغيير وسائل الإعلام يوميا، وبمجرد خلايا الجلد.
  5. مرور الخلايا بعد 7 أيام في نيم واللوحة إلى إدارة المحتوى في المؤسسة-تقليد جل لوحة 6-جيدا المغلفة التي تحتوي على 2 مل 100% "التوسع في وسائل الإعلام" ومثبط روك 5 ميكرومترات. وتعتبر الخلايا مرور 0 (P0) الشخصيات في هذه المرحلة. انظر الفرع 3-1 أدناه للحصول على إرشادات لجعل 100 ٪ التوسع في وسائل الإعلام.
  6. مرور الخلايا باستخدام الأساليب الموضحة في القسم 3-4. انتظر حتى وصلت P2 الخلايا وهي متكدسة أمام الناي بوصمة عار لنواب الشعب الصيني علامات والطلاء للتجارب (الشكل 1).

3-ثقافة الإعلام وطلاء وصيانة للشخصيات

  1. إعداد الوسائط لصيانة الشخصيات (وسائل الإعلام توسيع 100 ٪):
    1. جعل 50 مل 100% التوسع في وسائل الإعلام من خلال الجمع بين مل 24.5 من DMEM/F12 مع 24.5 mL NB.
    2. أضف 1 مل 50 س شيكل DMEM/F12 + الحل ملحوظة. إضافة 250 ميكروليتر من الحل P/S إلى وسائل الإعلام.
      ملاحظة: وسائل الإعلام يمكن أن تكون مبردة (4 درجة مئوية) وتستخدم لمدة تصل إلى أسبوعين. يمكن جعل كميات أصغر من وسائل الإعلام بضبط كميات دميم/F12 + NB + NIS باستخدام نسب نفسه أما بالنسبة لحجم 50 مل.
  2. إعداد ECM-تقليد هلام المغلفة لوحات الثقافة للحفاظ على المجلس الوطني
    1. اليكووت هلام ECM-تقليد في وحدة التخزين اللازمة لجعل 6 مل من محلول العامل. حساب حجم اليكووت بالنظر إلى شهادة ورقة تحليل منذ ECM-تقليد جل عامل إضعاف يختلف من دفعة لدفعة والكثير بالكثير.
    2. ذوبان الجليد تقليد ECM جل قاسمة على الجليد ويذوب في 6 مل من البرد DMEM/F12 الوسائط.
    3. أضف 1 مل من محلول هلام/DMEM/F12 ECM-تقليد لكل بئر من صفيحة جيدا 6. احتضان لوحة 6-جيدا مع الحل-جل تقليد إدارة المحتوى في المؤسسة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. نضح ECM-تقليد جل الحل بعد 30 دقيقة من الحضانة واستبدال 100% التوسع في وسائل الإعلام أو لوحات في الثلاجة (4 درجات مئوية، يصل إلى 1 في الأسبوع) دون يسفط ECM-تقليد جل-الحل.
  3. صيانة الشخصيات
    1. لوحة الشخصيات في كثافة الخلايا 1.5 مليون إلى تقليد ECM هلام المغلفة جيدا يحتوي على 2 مل 100% التوسع في وسائل الإعلام.
    2. احتضان الشخصيات في 37 درجة مئوية في بيئة رطبة مع شركة 5%2.
    3. إضافة 5 ميكرومترات من الصخور مثبط لوسائط الإعلام للشخصيات في P3 أو أقل، أو للشخصيات المذابة، لمنع موت الخلايا المفرط. تغيير وسائل الإعلام بعد 24 ساعة لإزالة المانع روك.
    4. مرور خلايا كل أيام 4-9، اعتماداً على عندما يصبحون المتلاقية. وتعتبر الخلايا المتلاقية عندما يصبحون أحادي الطبقة وجبات كثيفة تغطي كامل أسفل سطح الطبق.
    5. لوحة الشخصيات في كثافة الخلايا 1 إلى 1.5 مليون في بئر واحدة للوحة 6-جيدا (انظر الفرع 3، 4). قم بإزالة الوسائط قضى كل ح 48 واستبدال مع 2 مل من 100% التوسع في وسائل الإعلام.
  4. رفع وننأى وبيليه الشخصيات للصيانة و/أو تصفيح للظروف التجريبية
    1. نضح الخلايا المتوسطة، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني x 1. نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكروليتر 1 x الخلية المفرزة الحل إلى 1 من المتلاقية الشخصيات. إينكوباتي لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    2. إضافة 500 ميكروليتر من درجة حرارة الغرفة (RT) برنامج تلفزيوني وتغسل جيدا استخدام ماصة P-1000 لضمان التخلص خلايا. جمع الخلايا + حل برنامج تلفزيوني في أنبوب مخروطي 15 مل. أغسل اللوحة مرة أخرى مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة السائل إلى الأنبوب.
    3. تدور الخلايا لأسفل في 300 غرام x لمدة 5 دقائق بيليه.
    4. إزالة المادة طافية من بيليه الخلية وتعليق إعادة الخلايا في 1-5 مل من وسائط الإعلام DMEM/F12 المعالجون مسبقاً. تمييع الخلايا بكثافة من 1 إلى 4 مليون خلايا/مل من وسائل الإعلام. تحديد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
    5. لوحة العدد المطلوب من الخلايا، ومحددة لصيانة نواب (الفرع 3-3) أو المقايسة الفردية التي تجري (راجع الأقسام التالية لمزيد من التفاصيل).
    6. ضبط حجم تعليق الخلية مع وسائل الإعلام بحيث تستخدم بين 15 إلى 100 ميكروليتر من الخلايا لكل بئر/طبق. ويضمن هذا الطلاء الصغيرة الحجم أن هناك توزيع الخلية حتى وأن هي لم تضعف عوامل النمو، والمخدرات، أو ركائز على المديين المتوسط و.
    7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية. تغيير وسائل الإعلام كل 48 ساعة للصيانة لمجلس الشعب أو الاطلاع على تفاصيل محددة لفحوصات الفردية.
  5. إعداد الوسائط للظروف التجريبية (وسائل الإعلام توسيع 30%)
    1. تمييع وسائط الإعلام توسيع 100% بنسبة 70% (30% ووصف التوسع) بإضافة 1:1 DMEM/F12 + الحل ملحوظة لجعل وسائل الإعلام للظروف التجريبية.
    2. جعل 20 مل من 30% التوسع في وسائل الإعلام عن طريق إضافة 6 مل من 100% التوسع في وسائل الإعلام وتمييع مع 7 مل من NB و 7 مل من الإعلام DMEM/F12. إضافة 5 ميليلتر/مل من محلول P/S.
      ملاحظة: إذا كان يحتوي بالفعل على وسائل الإعلام 100% P/S، ثم إضافة 5 ميكروليتر/مليلتر بالنسبة دميم جنبا إلى جنب/F12 + NB = (14 مل) × (5 ميكروليتر/mL) = 70 ميكروليتر من P/S بدلاً من 100µL.
    3. إضافة ركائز طلاء وعوامل النمو في التركيزات المطلوبة لوسائل الإعلام توسيع 30%.

4-تقييم توليف الحمض النووي، ودخول مرحلة ثانية، وأرقام الخلية من الشخصيات

  1. التحضير لتركيب الدنا، ودخول المرحلة S، والمقايسة رقم الخلية
    1. جعل حل أسهم 1 ملغ/مل من بولي-د-يسين (PDL) في dH2س وتعقيم عامل التصفية. تمييع 01:10 في dH2س جعل 0.1 مغ/مل الحل PDL وإضافة 300 ميكروليتر لكل بئر من صفيحة جيدا 24 أو 1 مل إلى طبق 35 ملم. احتضان لمدة 20 دقيقة في الرايت
    2. غسل الآبار PDL 3 مرات لمدة 5 دقائق مع2dH dH O. أسبيراتي2س وإضافة 300 ميكروليتر/بئر أو 1 مل/طبق من لامينين (5 ميكروغرام/مل) المخفف في برنامج تلفزيوني x 1. تغطي اللوحات مع بارافيلم وتبقى في السلامة الأحيائية عقيمة، مجلس الوزراء بين عشية وضحاها في الرايت (ح 12 إلى 24).
    3. تحضير الوسائط توسيع 30% (انظر القسم 3.5) بعد 12 إلى 24 h. إضافة مركبات، عوامل النمو، أو المخدرات لمصلحة في التركيز المطلوب في وحدات التخزين التي هي أقل من 10% الحل الكلي لتجنب إضعاف المؤسسات الوطنية في 30% "متوسطة التوسع".
    4. تغسل كل جيدا لصفيحة 24-جيدا مرتين مع 1 x برنامج تلفزيوني (5 دقيقة في كل). نضح 1 x PBS وإضافة 450 ميكروليتر من وسائل الإعلام (بدون أو مع عوامل المخدرات/النمو). احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل طلاء الخلايا.
    5. لكل تجربة، إعداد الآبار أو أطباق كل الشرط 2-3.
    6. لوحة الشخصيات (انظر الفرع 3، 4):
    7. نواب الحمض النووي التوليف المقايسة: 100,000 الخلايا/بئر في صفيحة جيدا 24
    8. S-مرحلة الإدخال: 500,000 الخلايا/35 مم صحن
    9. المقايسة عدد الخلايا: 50,000 خلايا/بئر في صفيحة 24-جيدا
  2. السلائف العصبية خلايا الحمض النووي التوليف المقايسة
    1. لوحة 100,000 الخلايا/بئر في لوحة 24-جيدا وتقييم في ثلاث نسخ/الشرط.
    2. إضافة تريتياتيد المشعة، [ح]3[-التريتيوم للثقافة المتوسطة (1.5 μCi/mL) في كل بئر بعد ح 46 في الثقافة. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية ح 2.
      ملاحظة: عند استخدام المواد المشعة، تتلقى التدريب من المؤسسة ومتابعة النشاط الإشعاعي بروتوكولات الأمان، والتخلص من المواد المشعة في أوعية النفايات المعينة على النحو المناسب.
    3. إزالة بشكل صحيح التصرف الإعلامي المشعة بعد حاء 2 إضافة 300 ميكروليتر من قبل استعد 0.25% التربسين-يدتا (0.5 ملم) لكل بئر واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. قم بتشغيل حصاده الخلية (انظر المواد والمعدات قسم) والمضخة والتأكد من أن ضغط المضخة أدناه 200 رطل/بوصة مربعة. ضع ورق الترشيح من خلال الفضاء في حصاده الخلية والمسيل للدموع من الزاوية اليمنى بمناسبة اتجاه الورق.
    5. وضع أنابيب جمع من حصاده الخلية إلى علبة "فارغة" فارغة واضغط بروش ترطيب الورقة عامل التصفية. وضع أنابيب جمع في عينة الآبار وتشغيل (بدء).
    6. عند انتهاء حصاده خلية جمع العينات، ورفع المشبك ومقدماً ورقة مرشح لتكرار لجميع مجموعات عينة. بروش دائماً في صفيحة فارغة، "فارغة".
    7. الجاف لورق الترشيح تحت مصدر ضوء وإعداد قنينة المقابلة في علبة. لكمه من أصل تشادس الورقة في قنينات وإضافة 2 مل من سائل التﻷلؤ كوكتيل لكل قنينة. قارورة كاب والتسمية.
    8. احتضان القنينات في التﻷلؤ السائل كوكتيل على الأقل 1 ح قبل قراءة التهم في الدقيقة (CPMs) على جهاز التﻷلؤ.
  3. مقايسة دخول مرحلة ثانية للمجلس الوطني
    1. انظر 3.4 القسم لاتخاذ خطوات رفع وننأى وبيليه، وإعادة تعليق الخلايا.
    2. لوحة خلايا 500,000 كل طبق في الأطباق 35 ملم التي أعدت في الفرع 4-1، طبق فقط 1/شرطا لهذه الخطوة.
    3. تحرض الأطباق ذهابا وإيابا في جميع الاتجاهات لضمان التوزيع العادل للخلايا. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية ح 46.
    4. إعداد ثلاث لوحات 35 ملم المغلفة مع PDL/لامينين كل حالة بعد 24 ساعة. على سبيل المثال، إذا كان هناك واحد طبق 35 ملم من 30% التوسع في وسائل الإعلام وطبق 35 ملم واحد من 30% التوسع في وسائل الإعلام + صندوق الأجيال القادمة (10 نانوغرام/مل) ثم معطف 6 لوحات PDL/لامينين لاستخدامها في اليوم التالي.
    5. إضافة 2 ميكروليتر/مل من 5 مم إيدو للثقافات بعد 46 h. إينكوباتي عن ح 2.
    6. فصل وبيليه الخلايا (انظر الفرع 3، 4). إعادة تعليق بيليه الخلية في 3 مل من 30% التوسع في وسائل الإعلام أو 3 مل من 30% التوسع في وسائل الإعلام + عوامل النمو المنشود/المخدرات.
    7. بلايت 1 مل كل صحن قبل المغلفة PDL/Laminin الأطباق. تحرض الأطباق ذهابا وإيابا في جميع الاتجاهات لضمان التوزيع العادل للخلايا. احتضان في 37 درجة مئوية ح 2 للسماح للخلايا للانضمام إلى الطبق. انظر الشكل 2 لوضع جدول زمني مبسطة.
  4. تحليل دخول المرحلة S
    1. إصلاح الأطباق مع المثلج 4% بارافورمالدهيد (منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 1 x) لمدة 20 دقيقة. ثم، غسل الأطباق 3 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1 x.
    2. أضف 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني مع 0.05% "أزيد الصوديوم" لمنع نمو البكتيريا والفطريات. ويمكن تخزين الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر إذا كان يتم الاحتفاظ بالاطباق (مختومة مع بارافيلم) في برنامج تلفزيوني + الصوديوم أزيد الحل، على الرغم من كل شيء لا المناعية المستضدات يتم الحفاظ عليها جيدا بعد تأخير طويل في التحليل.
    3. الاعتداء الخلايا باستخدام فعل إيدو تجاري كيت (انظر البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة). وصمة عار الخلايا باستخدام DAPI أو علامة نووية أخرى، والصورة باستخدام مجهر الأسفار.
    4. تقييم نسبة الخلايا إيجابية إيدو على مجموع الخلايا الحية (عدد الخلايا الإجمالي) الأعمى في 10 حقول عشوائية بشكل منهجي (10 x). ولا تشمل الخلايا الميتة في التحليل.
    5. الاستفادة من كل مرحلة التباين الصور والصور الفلورية إلى تحديد تلطيخ إيدو الإيجابية والتأكد من الخلايا التي هي ميتة أو حية (الشكل 3).
    6. حساب كافة الخلايا التي تحتوي على حد سواء على نحو سلس وحتى غشاء الخلية في مرحلة إعدادات التباين، ونواة المجزئة كبيرة بنيون DAPI النووية وصمة عار، كما هي تعيش هذه الخلايا (الشكل 3 أ).
    7. استبعاد كافة الخلايا التي مرحلة مشرقة، غشاء الخلية غير متكافئ مكسورة، ويكون نواة صغيرة ومكثف كما تصور بنيون DAPI التصوير، كما أن هذه الخلايا ميتة (الشكل 3 أ). تقييم الخلايا الحية للتعبير عن إيدو بتحديد الخلايا التي تحتوي على إيدو الفلورسنت مشرق وصمة عار تغطي نواة كاملة أو تلطيخ الفلورسنت الأرقط في النواة (الشكل 3).
  5. نواب المقايسة رقم الخلية
    1. بعد 2 يوما في الثقافة، تسمية وإعداد أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل و 0.5 مل أنابيب ميكروسينتريفوجي. في كل أنبوبة 0.5 مل، إضافة 5 ميكروليتر تريبان الأزرق.
    2. لكل بئر من صفيحة جيدا 24، إزالة المتوسطة وإضافة 200 ميكروليتر 1 × الخلية المفرزة الحل والمكان في الحاضنة لمدة 10 إلى 15 دقيقة.
    3. بعد الوقت المخصص له، بمجرد رفعت الخلايا، إضافة المبلغ المطلوب من برنامج تلفزيوني x 1 لكل بئر.
      ملاحظة: بشكل عام، في اليوم 2، إضافة 300 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 1 x للخلايا التي تتضمن أيضا بالإضافة إلى 200 ميكروليتر من الحل مفرزة لإجمالي حجم 500 ميكروليتر. مع مرور الوقت احتضان ثقافة إضافية، كما تصبح الخلايا أكثر المتلاقية، زيادة حجم التخفيف حسب الضرورة. على سبيل المثال، في يوم 4، إضافة 500 ميكروليتر 1 × برنامج تلفزيوني، وفي يوم 6، إضافة 800 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 1 x. سوف يكون إجمالي حجم 700 ميكروليتر ومل 1، على التوالي.
    4. استخدام ماصة P-1000، "الماصة؛" صعودا وهبوطاً في كل جيدا من 4 إلى 5 مرات لإزالة الخلايا. فحص لوحة تحت مجهر للتأكد من أن كافة الخلايا وقد فصل. نقل الخلايا إلى أنابيب 1.5 مل.
    5. عكس أنابيب 1.5 مل مع خلايا المخفف 2 إلى 3 مرات. ثم تأخذ من 50 ميكروليتر الكوة من الخلايا في منتصف الأنبوبة وإضافة إلى أنابيب 0.5 مل مع تريبان الأزرق (انظر 4.5.1).
    6. حل الخلية الماصة صعودا وهبوطاً 2 إلى 3 مرات. إضافة خلايا إلى هيموسيتوميتير وتحليل فورا. الانتظار لفترة أطول من 10 دقيقة قد تزيد من موت الخلايا أو وجود خلايا التي اتخذت حتى تريبان الأزرق.
    7. إضافة 10 ميليلتر من خلية + خليط تريبان الأزرق بعناية على كل جانب من هيموسيتوميتير لإجراء نسخ متماثل التهم الموجهة إليه. حساب عدد الخلايا باستخدام المجهر الطوري. لا تحسب الخلايا الميتة أو الخلايا الزرقاء الداكنة التي اتخذت تريبان الأزرق.
    8. للحصول على استخدام رقم الخلية إجمالي المتوسط عدد الخلايا اعتبارا من 4 أركان هيموسيتوميتير وتطبيق المعادلة التالية:
      يعني عدد الخلايا × حجم الوسائط (mL) x 10,000 = خلية إجمالي عدد/جيد
    9. نضح وتكرار الإجراء على الآبار المتبقية. تغيير الوسائط في الخلايا التي لا يجري تحسب، كل حاء 48 تكرار الفحص في 4 أيام و 6.

5-المجلس الوطني نورت الإنزيم

  1. إعداد الأطباق ووسائط الإعلام للمقايسة نورت
    1. جعل حل أسهم 1 ملغ/مل من بولي-د-يسين (PDL) في dH2س وتعقيم عامل التصفية. تمييع 01:10 في dH2س لجعل حل PDL 0.1 مغ/مل وإضافة 1 مل لكل طبق 35 ملم. احتضان لمدة 20 دقيقة في الرايت
    2. وفي الوقت نفسه، تحضير الوسائط توسيع 30% (انظر القسم 3.5) وإضافة 5 ميكروغرام/مل (5 ميليلتر/mL) من محلول فيبرونيكتين (1 ملغ/مل الأسهم) إلى وسائل الإعلام.
    3. مرة واحدة مستعدة، في وسائل الإعلام إضافة المركبات، وعوامل النمو، أو العقاقير ذات الاهتمام في التركيزات المطلوبة.
      ملاحظة: من الأفضل إضافة المركبات، وعوامل النمو، أو المخدرات، وفي وحدات التخزين < 10% من مجموع الحل لتجنب إضعاف فيبرونيكتين والمكونات الأخرى في المتوسط 30% التوسع.
    4. وبعد 20 دقيقة، غسل الأطباق PDL 3 مرات لمدة 5 دقائق مع dH2س لإزالة الزائدة PDL. ضمان جافة الأطباق قبل إضافة وسائط الإعلام.
    5. ضع 1 مل من وسائل الإعلام (مع أو بدون عوامل المخدرات/النمو) + الحل فيبرونيكتين في كل طبق المغلفة PDL.
    6. احتضان الأطباق في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل طلاء الخلايا لضمان ارتباط السليم فيبرونيكتين PDL.
    7. لكل تجربة، قم بإعداد أطباق 2-3 كل شرط (مثلاً، الأطباق المحتوية على المركبات 3، 3 الأطباق التي تحتوي على المخدرات).
  2. تصفيح الشخصيات للمقايسة نورت
    1. انظر 3.4 القسم لاتخاذ خطوات رفع وننأى وبيليه، وريسوسبيند الخلايا.
    2. لوحة 50,000 الخلايا الواحدة وطبق في الأطباق التي أعدت في القسم 5-1. تحرض الأطباق ذهابا وإيابا في جميع الاتجاهات لضمان توزيع حتى من الخلايا.
    3. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية ح 48.
  3. تحليل نيوريتيس
    1. بعد حضانة الخلايا ح 48، نضح المتوسطة، وإصلاح الأطباق مع الجليد الباردة 4% منهاج العمل لمدة 20 دقيقة.
    2. وبعد 20 دقيقة، غسل الأطباق 3 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1 x. بعد الغسيل النهائي، أضف 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني مع 0.05% "أزيد الصوديوم".
    3. تحليل الأطباق عمياء على مجهر تباين المرحلة في 32 X. حساب مجموع الخلايا والخلايا مع نيوريتيس في الصفوف 1 سم 3،، تم اختيارهم عشوائياً من مواقف لكن استنساخه. حساب الحد ني خلايا 150 كل طبق لضمان أخذ العينات كافية.
      ملاحظة: يعرف نورت كملحق (العملية) من جسم الخلية هو > 2 أقطار الخلية الجسم في الطول. للخلايا مع عمليات متعددة، تعتبر عملية أطول للمعيار. الخلايا مع العمليات التي < جسم الخلية 2 أقطار في الطول لا تشمل (الشكل 4).
    4. إضافة معا العدد الإجمالي للخلايا، والعدد الكلي للخلايا مع نيوريتيس في كل طبق. حساب النسبة المئوية للخلايا مع نيوريتيس. متوسط النسبة المئوية للخلايا مع نيوريتيس عبر تكرار الأطباق. يتم تأسيس الثقة في إمكانية تكرار نتائج تجريبية عند كافة الصفوف داخل كل طبق متشابهة، والمتوسطات بين أطباق متشابهة جداً، مع الخطأ المعياري للوسط (SEM) < 10%.
    5. وبدلاً من ذلك، تحليل نيوريتيس بإجراء إيمونوسيتوتشيميستري لعلامات مثل بيتا-ثالثا-tubulin (TUJ1) أو MAP2. بعد تلطيخ لعلامة اهتمام، تأخذ 10 صور عشوائية بشكل منهجي على مجهر فلوري في 10 X. صورة الخلايا 200 على الأقل. وفي هذه الحالة، الحصول على الصور غير قريبة جداً إلى حافة الطبق. تحليل النسبة المئوية للخلايا مع نيوريتيس TUJ1 أو MAP2 + (انظر الشكل 10 على سبيل مثال).

6-مجلس الشعب نيوروسفيري الهجرة الإنزيم

  1. تشكيل نيوروسفيري
    1. إضافة 1 مل من 100% التوسع في وسائل الإعلام إلى طبق 35 ملم مع لا طلاء الركازة. احتضان الأطباق لمدة 15 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية قبل أن تصفيح الشخصيات. تحضير الأطباق 2-3 لضمان عدم وجود ما يكفي نيوروسفيريس لفحص الهجرة الخلية.
      ملاحظة: نظراً لغياب الركيزة طلاء يضمن أن الشخصيات تظل معلقة في وسائل الإعلام، هو أمر أساسي لتشكيل نيوروسفيري. طلاء أطباق سيمنع تشكيل نيوروسفيري.
    2. انظر القسم 3.4 في خطوات لرفع وننأى وبيليه الخلايا. ريسوسبيند بيليه الخلية في 2-5 مل من قبل حرارة 100% "التوسع في وسائل الإعلام". الشخصيات بلايت 1 مليون إلى طبق 35 ملم كل إعداد في المقطع 6.1.1.
    3. احتضان الشخصيات في 37 درجة مئوية ح 48 إلى 96 للسماح للشخصيات بالكلية ونموذج نيوروسفيريس. تقييم حجم المجال باستخدام مسطرة يعيش في مجهر تباين مرحلة. الانتظار لمعظم المجالات للوصول إلى قطرها تقريبي من 100 ميكرومتر (± 20 ميكرومتر) (الشكل 5). سوف تفريق مجالات أصغر والتفكك أثناء فحص الهجرة تماما.
  2. إعداد لوحات لفحص الهجرة نيوروسفيري
    1. حل مختبرين جل ECM-تقليد (راجع قسم 3.2) إلى 6 مل من 30% التوسع في وسائل الإعلام. مرة واحدة على استعداد gel/30% ECM-تقليد حل "التوسع في وسائل الإعلام"، إضافة المركبات، وعوامل النمو، أو العقاقير للمصالح في التركيزات المطلوبة.
      ملاحظة: السيارة، والمخدرات، وتركيزات عامل النمو تحتاج إلى زيادة للحساب لإضافة 200 ميليلتر من نيوروسفيريس في القسم 6.3.
    2. بلايت 1 مل من إدارة المحتوى في المؤسسة-تقليد جل حل "توسع وسائل الإعلام" 30% (± المركبات، وعوامل النمو، أو المخدرات) في بئر واحدة للوحة 6-جيدا. جعل الآبار 2-3 في حالة تجريبية. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام الأطباق 35 ملم. احتضان لوحات لمالا يقل عن 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: لا نضح gel/30% ECM-تقليد حل "التوسع في وسائل الإعلام" لهذا التحليل. تصفيح المجالات على جل ECM-تقليد يستنشق سيؤدي إلى الهجرة السريعة والزائدة.
  3. طلاء نيوروسفيريس
    1. جمع نيوروسفيريس التي شكلت في القسم 6-1، ووضعها في أنبوب مخروطي. أغسل 35 ملم يتم جمع الأطباق مع 1 مل من برنامج تلفزيوني x 1 لضمان جميع نيوروسفيريس. زيادة ونقصان لأسفل نيوروسفيريس التي تم جمعها في 100 غ س لمدة 5 دقائق.
    2. إعادة تعليق في نيوروسفيريس في 1-3 مل من قبل حرارة 30% "التوسع في وسائل الإعلام". إذا كان يتم جمع الصحن 1 من نيوروسفيريس، يتم استخدام 1 مل من وسائل الإعلام ريسوسبيند المجالات. إذا كان يتم تجميع الأطباق 2، 2 مل من وسائل الإعلام إضافة إلى ريسوسبيند المجالات، إلخ "الماصة؛" بلطف واستخدام فقط P-1000 للتأكد من المجالات ليست مقطوعة.
    3. لوحة 200 ميكروليتر من نيوروسفيريس ريسوسبينديد في gel/30% ECM-تقليد توسيع الحل المقدمة في القسم 6-2. لوحات روك في كافة الاتجاهات لتوزيع نيوروسفيريس بالتساوي. احتضان لوحات ل 48 ساعة في 37درجة مئوية.
    4. إزالة المحتوى-تقليد gel/30% الحل "التوسع في وسائل الإعلام"، وإصلاح الخلايا في 4% منهاج عمل بيجين، والغسيل، وإبقاء الخلايا في 1 × برنامج تلفزيوني + 0.05% "أزيد الصوديوم".
  4. تحليل نيوروسفيريس
    1. الحصول على الصور من أسرة نيوروسفيريس باستخدام إعدادات التباين المرحلة في 10 X. ضمان مجالات عدم لمس كل منهما الآخر. قياس متوسط الهجرة باستخدام البرمجيات إيماجيج.
    2. تتبع المنحنى الخارجي من نيوروسفيري باستخدام أداة الخط اليدوي. يمكن الوصول إلى خط يدوي بالنقر على أيقونة "المستقيم". تتبع يدوياً باستخدام ماوس.
    3. استخدم الدالة التدبير لحساب مجال التتبع. تأكد من تحديد "المنطقة" كقراءة في الإطار "تعيين قياسات" الموجودة ضمن علامة التبويب تحليل. انظر الشكل 6 للتتبع للمحيط الخارجي باللون الأزرق.
    4. تتبع كتلة الخلايا الداخلية من ناحية المجال والتدبير. انظر الشكل 6 لتتبع كفاف الداخلية باللون الأحمر. قياس متوسط الهجرة بطرح كتلة الخلايا الداخلية من منطقة نيوروسفيري الإجمالي.
    5. نيوروسفيريس التدبير الذي يحمل كتلة خلية داخلية كثافة مع الخلايا المهاجرة بها كسجادة متجاورة (الشكل 6).
    6. لا تقم بتضمين الخلايا خارج السجاد أو بعيدة عن نيوروسفيري للقياس. انظر الشكل 6 للحصول على أمثلة من الخلايا (دائري باللون الأبيض) التي تستبعد من قياس السجاد الخارجي. تحليل الحد أدنى من 20 نيوروسفيريس لكل حالة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الهدف من هذه الدراسات تحديد النشاط التكاثري للشخصيات، وهي زيادة في إعداد الخلايا. ويتحقق ذلك بتقدير تركيب الدنا من خلية إجمالي السكان، نهجاً الفائق الذي يقيس إدماج thymidine تريتياتيد المشعة التتبع في مقتطفات الخلية، ويعكس جميع خلايا تعمل في مرحلة ثانية، سواء كانوا توليف لمدة 5 دقائق أو ساعتين كاملة. بالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الاختبارات لتحديد نسبة الخلايا التي تدخل المرحلة S وأرقام مجموع الخلية، مقايسة كثيفة العمالة أكثر من الخلايا المفردة. خلايا توليف الحمض النووي في المرحلة S، خطوة التي تسبق الانقسام وانقسام الخلية، التي يجب أن تحدث من أجل زيادة إعداد الخلايا. نظراً لهذه العمليات تستغرق بعض الوقت، قد لا تكون التغيرات في تركيب الدنا المقررة في 48 ساعة المقترنة مع التغيرات في أرقام الخلية في هذه المرحلة الزمنية. ومع ذلك، وجد أن التغيرات في تركيب الدنا في 48 ساعة التنبؤ موثوق زيادات أرقام الخلية في أيام 4 و 6.

في تقييم تركيب الدنا، خلايا يتم مطلي في كثافة الخلايا 100,000 (روافد ~ 50 ٪) في لوحة 24-جيدا، ويسمح لتنمو لمدة 48 ساعة قبل إجراء القياسات. ويضمن استخدام هذه الكثافة أن الخلايا تشبه بيئتها أحادي الطبقة، ولكن أيضا لا تنمو بسرعة في فترة 48 ساعة أن وسائل الإعلام تصبح حمضية جداً. وسائل الإعلام أن حمضية جداً يمكن أن تؤثر تأثيراً كبيرا على استقلاب الخلية وهكذا، يغير نتائج انتشار. إذا كانت خطوط الخلايا المحددة عالية التكاثري، الباحث يجب أن تنظر في تغيير كثافة الخلية، وسائط التخزين، أو تبادل وسائل الإعلام تردد لمنع الظروف الحمضية العالية. إذا تغيرت الظروف، من المهم أن تكون متسقة عند مقارنة خطوط الخلايا المختلفة لأن التأكيد خلية إلى خلية الاتصال تعتمد التغييرات تؤثر على معدلات النمو. تصميم بسيط لهذه الاختبارات يسمح لنا باختبار عوامل النمو المختلفة. كما هو موضح في الشكل 7، الإضافة لعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (صندوق الأجيال القادمة، 10 نانوغرام/مل) ليزيد 48 ساعة تركيب الدنا ~ 40%. وعلاوة على ذلك، المقايسة توليف الحمض النووي استنساخه كجميع الحيوانات المستنسخة والأفراد تظهر زيادة في تركيب الدنا بعد تنشيط صندوق الأجيال القادمة. إمكانية تغير خط الأساس وصندوق الأجيال القادمة حفزت الحمض النووي التوليف بين مختلف الأفراد غير متأثرة، فضلا عن الإمكانات لتقلب الاستنساخ في نفس الشخص ويظهر في الجدول 1. بسبب هذا التغير، من المهم اختبار استنساخ اللجنة التوجيهية المتعددة للفرد، فضلا عن تقييم الحد أدنى من 3 إلى 5 نواب خطوط المستمدة من كل استنساخ اللجنة التوجيهية المختلفة. وأجرى كحد أدنى من 3 تجارب لكل سطر لمجلس الشعب.

والرزن توليف الحمض النووي يسمح لنا بتقييم سرعة العديد من المجموعات التجريبية بطريقة الفائق والتدبير يعكس المجموع الكلي لتركيب الدنا بغض النظر عن مدة المرحلة S (5 دقائق إلى ساعتين). لتحديد نسبة الخلايا في مرحلة ثانية، كان يعمل مقايسة دخول مرحلة ثانية. لهذا التحليل، خلايا تزرع في نفس الكثافة كما سبق ذكره للسماح لديناميات أحادي الطبقة مثل أن يحدث، ولكن ثم يتم فصله بعد يومين ويسمح بالتمسك بإيجاز في لوحات لإجراء تحليل لخلية واحدة. عد الخلايا في أحادي الطبقة يمكن أن يكون صعباً بسبب ارتفاع خلية إلى خلية الاتصال والتقلبات المناخية الإقليمية في اللوحة. هذا النموذج يسمح لنا بنموذج الخلايا ما أحادي الطبقة وتحليلها ثم كخلايا مفردة. أنها أيضا بمثابة تأكيد مستقل من الناحية المنهجية للبيانات التي تم الحصول عليها في مقايسة توليف الحمض النووي. كما يظهر في الشكل 8، 48 ساعة من صندوق الأجيال القادمة (10 نانوغرام/مل) التحفيز يزيد من نسبة الخلايا مرحلة S ~ 25%.

في تقييم أرقام الخلية، يستخدم خلية أقل كثافة مما في فحوصات المذكورة آنفا، مع خلايا 50,000 يجري مطلي كل بئر 24 أيضا لوحة. مرة أخرى، اختارت هذه الكثافة للتأكد من أن خطوط الخلايا أسرع لا تنمو بسرعة على مدى فترة 6 أيام أن الرقم الهيدروجيني للوسط يصبح حمضية جداً، ويتحول إلى اللون الأصفر. في الشكل 9، بينما قد لا تكون أرقام الخلية تختلف اختلافاً كبيرا بين التحكم وصندوق الأجيال القادمة (10 نانوغرام/مل) المجموعات في أيام 2، التغيرات في تركيب الدنا في 48 ساعة (الشكل 7) التنبؤية للتغيرات في أرقام الخلية في 4 و 6 أيام.

بينما الشخصيات تستزرع عادة في كثافة عالية، يجري الفحص نيوريتي في كثافة الخلايا 50,000 مطلي في طبق 35 ملم من أجل تقييم الخلايا المفردة. حتى في هذه الكثافة المنخفضة، نواب الثقافات بروتينات cytoskeletal صريحة وعوامل النسخ المميزة من الشخصيات مثل نيستين و SOX2 و PAX6 ( أ-دمنالشكل 10 ). يشير هذا إلى أن استزراع منخفض الكثافة لا يغير إلى حد كبير مصير الخلية في هذا الإطار الزمني. وعلاوة على ذلك، الظروف منخفضة الكثافة مشابهة قد استخدمت في نظم الثقافة الجرذ والفأرة لكشف تعمل الذي تم استنساخه في نهاية المطاف في فيفو16،17،،من1819، 20،21،،من2223. بعد 48 ساعة حضانة، تبدأ بتمديد نيوريتيس كما هو مبين في الشكل 11 ألف وباء، نسبة صغيرة من الشخصيات وكمياً في الرسم البياني في الشكل 11. ويمكن قياس نسبة الخلايا التي تمتد على طول نيوريتيس نيوريتيس وعدد نيوريتيس/خلية لتقييم المعلمات التنموية. من أجل إجراء تقييم دقيق للنسبة المئوية للخلايا مع ثمرة نورت، من المهم أن يتم مطلي بالخلايا كخلايا مفردة أو مجموعات من < 5 خلايا ومجاميع ليست كبيرة. كما يتضح في الشكل 10 E-F، الخلايا تحمل نيوريتيس (السهم الأبيض) كما أعرب العلامة العصبية غير ناضجة الثالث بيتا توبولين (TUJ1). كما هو مذكور في الأساليب، يمكن الحصول على صور مضيئة من TUJ1 الملون الشخصيات وثم هذه الصور يمكن أن تحسب نسبة من TUJ1 + نيوريتيس التأكد من منشأ العصبية للعمليات. في لدينا مختبر، والتحليلات بأي من الطريقتين نتائج مشابهة إحصائيا.

تصميم بسيط والطابع السريع للمقايسة نورت أيضا تسمح لنا باختبار آثار عوامل النمو ذات الصلة تنمويا، السيتوكينات، والببتيدات. على سبيل المثال، الرقم 11 يظهر أن في نيوروبيبتيدي الغدة النخامية adenylate cyclase تفعيل ببتيد (باكاب, 3 نانومتر) ثمرة نيوريتي الزيادات في الشخصيات. باكاب عامل هام إنمائية التعبير على نطاق واسع في الجهاز العصبي المركزي وقد ثبت أن تكون هامة في نمو الدماغ. وقد وجدت الدراسات القوارض لدينا مختبر ومختبرات أخرى أن باكاب قد آثاراً نمائية تعتمد على المرحلة على نطاق واسع مثل تنظيم ثمرة نورت، والهجرة، والانتشار في كل هيندبرين وفوريبرين16،22، 29،،من3031. الدراسات الحديثة التي اتامان et al. استخدام (2016) مثقف البشرية الخلايا القشرية الجنين تشير إلى أن نشاط الخلايا العصبية يدفع بزيادة 9-fold في باكاب التعبير الجيني، مما يشير إلى أهمية الببتيدات في تنمية الخلايا العصبية البشرية32. في الواقع، يبين الجدول 2 النسبة المئوية نيوريتيس في السيطرة وباكاب (3 نانومتر) الشروط بين خطوط عديدة مستمدة من الأفراد غير متأثرة. كما يتضح من الجدول 2، هناك بعض التغير في النسبة المئوية نيوريتيس المعرب عنها في خطوط الخلايا المستمدة من مختلف الحيوانات المستنسخة من الشخص نفسه ومن الشخصيات المستمدة من مختلف الأفراد. بيد أن هؤلاء الأفراد لم تتأثر لها زيادة في ثمرة نورت ردا على باكاب، مما يشير إلى إمكانية تكرار نتائج لفحوصات.

مثل ثمرة نورت، الهجرة الخلية عملية إنمائية مهمة أساسية لاتصال سليمة ومنظمة، وأسلاك الدماغ. نيوروسفيريس تسمح لنا بدراسة الهجرة لمجلس الشعب في حالة نموذجية عالي الكثافة الذي يحافظ على خلية خلية الاتصال بين الشخصيات (الشكل 12). ويمكن أيضا اختبار العوامل ذات الصلة تنمويا في نيوروسفيريس تقييم آثارها على الهجرة. على سبيل المثال، يوضح الشكل 12 التي باكاب (10 نانومتر) يزيد من هجرة الشخصيات.

Figure 1
رقم 1: الشخصيات في مرور 3- الشخصيات في P3 التعبير عن علامات خاصة بمرحلة متعددة بما في ذلك عامل النسخ pluripotent (A) ، SOX2 (ب) النسخ عامل محدد ل forebrain الشخصيات، PAX6، ونيستين البروتين سيتوسكيليتال للمجلس الوطني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: التخطيطي مقايسة دخول المرحلة S- التسلسل الزمني لدخول المرحلة S بالانزيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التحديد الكمي لدخول المرحلة S- (أ) مرحلة الصورة تظهر مرحلة الظلام تعيش الخلايا (الأسهم البيضاء) وخلية ميتة مرحلة مشرقة (النجم الأبيض) وخلية يعيش مرحلة مشرقة (السهم الأخضر). (ب) DAPI نيون البقع تظهر نواة مكثف في خلية ميتة (النجم الأبيض) ونواة كبيرة في خلية حية (الأسهم البيضاء والخضراء). (ج) صورة "إيدو الفلورية" عرض مشرق النوى إيجابية إيدو (السهم الأحمر) والارقط إيدو إيجابية نوى (النجم الأحمر). (د) دمج الفلورسنت من صور 3A-ج 3 والمرحلة.

Figure 4
الشكل 4: تحديد نيوريتيس. الصور المرحلة-على النقيض من الشخصيات- (أ) ألف خلية مع عملية > الهيئات الخلية 2 في الطول، وبالتالي الوفاء بمعيار نورت. (ب) خلية مع عملية < الهيئات الخلية 2 في الطول، وتحمل نورت ولذلك لا تعتبر. (ج) يمثل خلية مع العمليات 2-يتم تقييم هذه العملية وقتاً أطول لمعيار نورت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تحديد نيوروسفيريس لفحص الهجرة- (أ) مرحلة تباين الصورة من حقل نيوروسفيريس في 24 h. الممثل المجالات كل أقل من 100 ميكرومتر وهكذا، ليست جمعها لفحص الهجرة. (ب) مرحلة الصورة التباين حقل الممثل في نيوروسفيريس في 72 ساعة. جميع المجالات حدود 100 ميكرومتر ± 20 ميكرومتر، مشيراً إلى أنهم على استعداد ليتم جمعها لفحص الهجرة.

Figure 6
رقم 6: التحديد الكمي للهجرة- (أ) مرحلة التباين صورة نيوروسفيري الممثل. (ب) يعرض المخطط الأزرق تتبع لقياس مجموع نيوروسفيري المنطقة. الأحمر يظهر كفاف المستخدمة لقياس مجال الخلية الداخلي الشامل. يتم تعريف الهجرة كمنطقة نيوروسفيري مجموع الخلية المنطقة الداخلية الشامل. ملاحظة، دوائر بيضاء بإظهار الخلايا التي ليست في سجادة متجاورة، كما يتم استبعاد هذه الخلايا من معالم الهجرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: تقييم تركيب الدنا. نتائج الممثل السيطرة مقابل صندوق الأجيال القادمة-التعامل مع الشخصيات-صندوق الأجيال القادمة (10 نانوغرام/مل) زيادات تركيب الدنا في ح 48 (p ≤ 1 × 10-3). (n = 2-4 آبار/مجموعة/التجربة؛ وتجارب 3). أشرطة الخطأ تمثل sem.

Figure 8
الشكل 8: نسبة الخلايا مرحلة S- (أ) مرحلة التباين الصور من الخلايا للمجلس الوطني المحتضنة في السيطرة مقابل صندوق الأجيال القادمة (10 نانوغرام/مل) تعامل وسائل الإعلام ل Insets 48 h. تمثل الصور التكبير أعلى من الخلايا الملون لعلامة إيدو الفلورسنت في المراقبة والإعلام صندوق الأجيال القادمة نانوغرام/مل 10. الأسهم الحمراء تشير إلى الخلايا التي أسهم إيجابية والأبيض إيدو تشير إلى الخلايا التي تكون إيدو السلبية. (ب) رسم بياني لنتائج تمثيلية للتحكم مقابل صندوق الأجيال القادمة (10 نانوغرام/مل) تعامل الشخصيات-صندوق الأجيال القادمة زيادات S-مرحلة الدخول في ح 48 (دي وان ف × 10-3). (n = 2-4 أطباق/مجموعة/التجربة؛ وتجارب 3). أشرطة الخطأ تمثل sem.

Figure 9
الشكل 9: تعداد الخلايا في أيام 2 و 4 و 6. (أ) المرحلة الصور على النقيض من الخلايا الموجودة في عنصر التحكم وصندوق الأجيال القادمة (10 نانوغرام/مل) تعامل وسائل الإعلام في أيام 2 و 4 و 6. (ب) الرسم البياني لنتائج تمثيلية؛ علما أن صندوق الأجيال القادمة (10 نانوغرام/مل) لا يزيد دائماً أرقام الخلية على 2 يوما، ولكن في 4 و 6 أيام هي زيادات واضحة (ف ≤0.05). (n = 2-4 آبار/مجموعة/التجربة؛ وتجارب 3). أشرطة الخطأ تمثل sem.

Figure 10
رقم 10: توصيف الشخصيات في الظروف منخفضة الكثافة. (أ، ج، ه) المرحلة الصور على النقيض من الشخصيات في الظروف منخفضة الكثافة. (ب) التعبير عن الشخصيات علامات الخلية الجذعية/السلف نيستين (الأخضر)، SOX2 (أحمر)، وعلامة النووية DAPI (أزرق). (د) PAX6 (أحمر)، DAPI (أزرق). (و) في منخفضة الكثافة، الخلايا تمتد نيوريتيس (السهم الأبيض) أيضا التعبير عن العصبية غير ناضجة علامة TUJ1 (الأخضر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 11
رقم 11: ثمرة نورت. (أ) المرحلة تباين الصورة من الشخصيات. السهام السوداء تشير إلى الخلايا مع نيوريتيس. (ب) إضافة neuropeptide باكاب (3 نانومتر) يزيد عن النسبة المئوية للخلايا مع نيوريتيس (دي وان ف × 10-2). (ج) التحديد الكمي لثمرة نيوريتي في عنصر التحكم و 3 نانومتر باكاب الوسائط التي تحتوي على. (n = 2-4 أطباق/مجموعة/التجربة؛ وتجارب 3). أشرطة الخطأ تمثل sem.

Figure 12
الشكل 12: الهجرة نيوروسفيري. (أ) المرحلة الصور على النقيض من نيوروسفيريس. إضافة باكاب (ب) (10 نانومتر) يزيد من الهجرة الخلية نيوروسفيري (دي وان زيرو ف-2) (ج) التحديد الكمي للهجرة الخلية. (n = 20 المجالات/مجموعة/التجربة، وتجارب 3). أشرطة الخطأ تمثل sem.

وسائط الإعلام
المريض استنساخ # CTRL صندوق الأجيال القادمة
(10 نانوغرام/مل)
المريض 1 1 21,853 47,538
2 20,336 38,070
المريض 2 1 7,664 14,060
2 16,573 30,087

الجدول 1: تركيب الدنا. ملخص قيم توليف الحمض النووي (في CPMs) من الشخصيات المستمدة من استنساخ اللجنة التوجيهية اثنين كل شخصين لم تتأثر.

وسائط الإعلام
المريض استنساخ # CTRL باكاب
(3 نانومتر)
المريض 1 1 13.60% 18.10%
2 16.50% 21.10%
المريض 2 1 8.90% 14.10%
2 14-20 تكمن % 21.10%

الجدول 2: النسبة المئوية للخلايا مع نيوريتيس. موجز للنسبة المئوية للخلايا التي تحمل نيوريتيس في الشخصيات المستمدة من استنساخ اللجنة التوجيهية اثنين كل شخصين لم تتأثر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكولات المقدمة هنا توضيح طرق سريعة وبسيطة دراسة العمليات النمائية الأساسية واختبار عوامل النمو والعقاقير استخدام الخلايا السليفة العصبية المشتقة من هيبسك. وثورة التكنولوجيا هيبسك دراسة الآلية المرضية للأمراض العصبية النمائية بتزويدنا بالوصول غير مسبوق يعيش الإنسان الخلايا العصبية من الأفراد المتضررين. وفي الواقع، كانت هناك العديد من الدراسات هيبسك من الاضطرابات النمائية، بما في ذلك متلازمة ريت، متلازمة تيموثي، متلازمة X الهشة، وانفصام الشخصية، الذي اكتشف الانحرافات الخاصة بالمرض في dendrites، سينابسيس، والخلايا العصبية وظيفة4،،من3334،،من3536. معظم هذه الدراسات قد ركزت أساسا على الميؤوس من شفائهم متباينة، والخلايا العصبية بعد الانقسامية التي، على الرغم من أن تعتبر غير ناضجة نسبيا وظيفيا، باستثناء دراسة النمائية السابقة عمليات مثل الانتشار والهجرة. هذه العمليات الأخيرة قد تورطت بشكل كبير في الآلية المرضية للاضطرابات النمائية وأمر بمواصلة دراسة8،،من910،،من1112 , 35 , 37 , 38-استخدام الشخصيات يسمح لنا بدراسة هذه الأحداث الهامة في وقت سابق بينما أيضا إتاحة الفرصة للتحقيق في عمليات أكثر نضجاً مثل قدرة الخلايا على تمديد غير ناضجة محاور عصبية/dendrites (نيوريتيس). علاوة على ذلك، بعض من هذه الاختبارات يمكن أيضا توسيع لدراسة معايير أخرى، مثل طول نورت، وعدد، والتفريع أو المسافة الأبعد سافر لخلية.

واستخدمت بعض الدراسات الأحدث نظم نموذجية أورجانويد للدراسة في وقت سابق الإنمائية الأحداث في ثلاثي "نظام الدماغ المصغر"1،،من3940. حتى الآن، حتى في هذه النظم أورجانويد، السكان الخلية التكاثري السلائف من النضج المبكر ومحدودة والهجرة ويصعب دراسة15،39. بالإضافة إلى الحد من دراسة الظواهر الإنمائية في وقت سابق، الاستخدام الميؤوس من شفائهم متباينة من الخلايا العصبية أو أورجانويدس في كثير من الأحيان، يستغرق وقتاً طويلاً ومكلفا، ويحد من العدد من المتغيرات التي يمكن تقييمها في النظام. وهذا يرجع إلى أن يجعل الخلايا العصبية وقد تتطلب أورجانويدس بروتوكولات تحريض الفيروسية وحاضنات خاصة ومعدات، أسابيع عدة من الزمن، وكميات كبيرة من وسائل الإعلام. على النقيض من ذلك، باستثناء المقايسة توليف الحمض النووي (التي يتم تناولها في وقت لاحق أدناه)، هذا البروتوكول يمكن سهولة تطبيقها لدراسة الاضطرابات النمائية، ولا تتطلب تدريبا مكثفا، وأدوات باهظة التكاليف، والموارد، أو البرمجيات. بسهولة وتكلفة منخفضة نسبيا لإضافة المخدرات وعوامل النمو في هذه الاختبارات، جعل هذه التكنولوجيا البروتوكول الفائق مفيدة لاختبار مختلف العلاجات المحتملة للنمو العصبي والأمراض العصبية. وعلاوة على ذلك، نظراً لعوامل النمو القانون عن طريق تحديد مسارات الإشارات الخلوية، يمكن أيضا استخدامها كأدوات لاختبار إمكانات مما يشير إلى وجود عيوب في تطوير النظم. أخيرا، حيث الشخصيات سكان الذاتي تجديد التكاثري، كميات كبيرة من الخلايا يمكن أن تنتج و cryopreserved التجارب يسمح إجراء كفاءة دون الحاجة إلى جعل الشخصيات من إيبسكس في كل مرة.

لتوظيف هذه الاختبارات بنجاح، فإنه من المهم ملاحظة الخطوات الحاسمة التالية. هذا البروتوكول يضع الشخصيات في الظروف المختلفة لصيانة وتوسيع مقابل التجريب. على وجه التحديد، بينما هي الناجمة عن الشخصيات، نمت، وباساجيد في المتوسط تحتوي على العصبية التعريفي الملحق (NIS)، لدينا الظروف التجريبية الحد من الملحق بنسبة 70%، مما يضع الخلايا في بيئة تحد، مما يتيح لنا الفرصة لإضافة إلى الوراء واختبار آثار عوامل نمو هامة. ثانيا، من الضروري لتعقب مرور اللجان التحضيرية الوطنية. في دراساتنا، ونحن عموما قيدت مرور عدد من خطوط الخلايا من P3-P8. في الممرات أقدم من P3، بعض الخطوط لا قوة تعبر عن علامات مميزة. في الممرات العليا، بينما بعض خطوط الخلية لها معدلات نمو متسقة للغاية أو الردود على عوامل النمو، قد خطوط الخلايا الأخرى تغييرات دراماتيكية في نمو الخلايا أو الاستجابة. لو ذكرت ليس روتينيا، نحن، وكثير غيرها قد شهدت هذا تغيير جذري في معدلات التكاثري في الممرات العليا. والسبب في هذا غير مؤكد، ولكن هذا التغيير قد تعكس قدرة محدودة على التجديد الذاتي للشخصيات. تحديد لماذا وكيف تتغير معدلات الانتشار عبر الممرات الموسعة قد ثاقبة التنمية ومنشأ المرض، ولكن إجراء المزيد من البحوث سوف تحتاج إلى القيام به. وأخيراً، البروتوكول التجاري التعريفي العصبية التي نستخدمها يمكن أن يحقق أحياناً الخلايا الجذعية العصبية، ورداءة نوعية خاصة إذا إيبسكس البداية ليست ذات جودة عالية (أي.، يكون التفريق بين الخلايا في حدود الخلية المستعمرات، تناذر شذوذ). في بعض الحالات، يتم تشويه مورفولوجيا الخلايا والتعبير عن علامات غير موجود. لا تستخدم هذه الثقافات. وفي حالات أخرى، تنمو الشخصيات مع تملق "الملوث" الخلايا، والتي يمكن إزالتها باستخدام علاج حل مفرزة الخليوي تفاضلية لضمان السكان المجلس الوطني الخالص تقريبا قبل استخدامها في التجارب. وجود الشخصيات عالية الجودة حاسم بالنسبة للنتائج الصحيحة: انظر القسم على المواد والمعدات لتصل إلى "بروتوكول التعريفي العصبية" حيث يمكن الاطلاع على صور للشخصيات عالية ومنخفضة الجودة.

لكل من فحوصات قدم، من المهم ملاحظة الخطوات الحاسمة التالية والأخطاء المحتملة وتلميحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها. لعدد الخلايا وتوليف الحمض النووي، وفحوصات نورت، من المهم أن خلايا لوحة فصل الخلايا المفردة، وليس ككتل، كهذا يمكن أن تحرف التدابير توليف الحمض النووي وعدد خلايا والسلوك نورت. لضمان لا يتم مطلي بكتل من الخلايا، عينة كمية صغيرة من الخلايا التي تحتوي P1000، لوحة على شريحة، ومعرفة ما إذا كان كتل الخلية الحالية. إذا كان تتم الإشارة إلى كتل، "الماصة؛" خلايا صعودا وهبوطاً لكسر كتل بعيداً قبل الطلاء يدوياً. لتركيب الدنا والمقايسة رقم في الخلية، يتم رفع الخلايا مع الإنزيمات للفرز والتحليل. من المهم تأكيد بصريا الخلايا رفعت تماما من السفينة الثقافة للحصول على حساب دقيق، وإذا لزم الأمر، يمكن استخدام أطول من فترات حضانة الإنزيم. في حالة حساب الخلية منخفضة أو CPMs منخفضة للمقايسة توليف الحمض النووي، يمكن مطلي الخلايا في أعلى الكثافات الأولية، تريتياتيد المشعة [ح]3[-يمكن إضافة thymidine لمضاعفة الوقت (4 ساعات بدلاً من 2)، أو تريتياتيد [ح]3[-thymidine يمكن أن تضاعف تركيز. لفحص نيوريتي، يمكن مضاعفة كثافة الطلاء الأولى دون المخاطرة بزيادة خلية بخلية الاتصال. الاهتمام بتوزيع الخلايا عبر صحن وحساب عدد الصفوف 1 سم مثل أن يتم أخذ عينات كل جزء من الطبق. إذا كانت النسبة المئوية نورت منخفضة جداً في 48 ساعة، يمكن تمديدها المقايسة ما يصل إلى 6 أيام أو نوع الركيزة طلاء أو يمكن تغيير التركيز إلى تعزيز نسبة أكبر من نيوريتيس. ومع ذلك، من المهم ملاحظة تحديد مرات طلاء وأساليب عمل وقدمنا في البروتوكول للصحة المثلى نيوريتي ثمرة وخلية بعد اختبار ركائز مختلفة عديدة، وتركيزات الركازة، ومرات طلاء. للانزيم نيوروسفيري، يمكن أن يؤدي استخدام أصغر بيبيتورس (P20، P200) للقص والكسر من مجالات أكبر. وبالتالي، من المحتم أن بيبيتينج ويتم ذلك بلطف ومع P1000 أو ماصة مصلية. للتكوير نيوروسفيريس، يوصي أيضا بسرعات أقل (100 غرام x بدلاً من 300 س ز) لمنع الانفصال نيوروسفيري. أثناء الطلاء المجال، ضمان أن مجالات هي الأنسب متباعدة وبصرف النظر كمجال لمجال الاتصال يمكن أن تؤثر الهجرة. في الحالات التي يكون فيها هجرة سريعة جداً أو بطيئة للغاية، ويمكن انخفض وقت الحضانة أو زادت على التوالي. ويمكن أيضا تغيير طلاء ركائز لتغيير معدلات الهجرة.

حين التقنيات المستخدمة السريع، بسيطة وقابلة للتطبيق لدراسة الاضطرابات النمائية، هناك بعض القيود. لأحد، يتطلب الكثير من التحليلات التي قدمت (المقايسة رقم الخلية، والمقايسة نورت، والمقايسة الهجرة) المحققين اتخاذ قرارات موضوعية (مثلاً، هل هذا نورت؟ ميت هذه الخلية؟) يحتمل أن يؤدي إلى تحيز المحقق وإمكانية تكرار نتائج أقل. ومع ذلك، إجراء تحليلات للمكفوفين ووضع معايير صارمة لكل مقرر خلال فحص، كما هو موضح في الأساليب، يمكن تحسين هذه التحيزات. وبالمثل، تتطلب فحوصات هذه القياسات اليدوية والتهم، التي يمكن أن تكون مضيعة للوقت والعمل المكثف. ومع ذلك، في المختبرات التي تحتوي على المعدات والموارد التقنية، هذه فحوصات يمكن الإسراع مع استخدام عدادات خلية الآلي والبرامج التي يمكن إجراء القياسات التلقائية41،42. في حالة فحص توليف الحمض النووي، هذه الأساليب محددة إلى ماكينة حصاده والتلألؤ الخلية (انظر المواد والمعدات)؛ ومع ذلك، هناك غيرها النماذج المتاحة والأساليب التي يمكن استخدامها للحصول على نفس المعلومات، مثل حصاده خلية أومنيفيلتير-95. لبعض المؤسسات، واستخدام المصادر المشعة قد لا يكون ممكناً. في هذه الحالة، سوف تسمح thymidine نيون تناظرية، مثل إيدو، حلل على قارئ ميكروسكوبية فلورسنت، باستخدام أسلوب بديل للحصول على نفس المعلومات في تحليل الجزء الأكبر من الحمض النووي التوليف44.

لدينا نظام الثقافة المنخفضة الكثافة يفصل بين الشخصيات في خلايا فردية أو كتل صغيرة، شرط أن يختلف عن طبيعة كثافة من الشخصيات في الأنبوب العصبي النامي. حتى الآن، الشخصيات علامات مناسبة صحية، ونعرب عن (الشكل 1، الشكل 10). وعلاوة على ذلك، موازية لدراساتنا السابقة للثقافات القشرية الماوس وفار عرض النتائج التي توصل إليها في الثقافات في المختبر و في فيفو نماذج تشير إلى فائدة وقيمة استخدام هذا النهج16،،من1718 , 19 , 24-وبالإضافة إلى ذلك، يوفر هذا النظام نهج قوية لفهم نضج الخلايا ودراسة السكان الفرعية الخلية. على سبيل المثال، يمكن إجراء immunohistochemistry على مقايسة نورت لتحديد نوع معين من الخلايا العصبية وتوسع نورت. وفي نهاية المطاف، على الرغم من بعض القيود، يوفر هذا البروتوكول فريدة أساليب واضحة وقوية وسريعة لدراسة الاضطرابات النمائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

هذا العمل كان يدعمها مجلس حاكم ولاية نيو جيرسي للبحوث الطبية والعلاج من مرض التوحد (CAUT13APS010؛ CAUT14APL031؛ CAUT15APL041)، لوري نانسي يمثل مؤسسة الأسرة، والمبرات تؤدي ميندوركس، ومؤسسة الجالية اليهودية من أكبر مترويست نيوجيرسي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 
ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9, (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20, (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60, (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320, (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66, (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94, (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155, (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171, (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474, (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155, (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33, (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139, (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21, (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29, (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72, (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26, (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66, (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90, (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5, (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33, (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39, (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10, (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47, (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539, (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23, (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17, (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20, (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45, (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15, (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22, (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1, (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5, (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics