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Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

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Summary

Novas estratégias terapêuticas na medicina regenerativa cardíaca exigem extensos e detalhados estudos em modelos animais pré-clínicos grandes antes que eles podem ser considerados para uso em seres humanos. Aqui, vamos demonstrar uma técnica de injeção contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelhos, que é valioso para a eficácia de tais terapias romance de testes de hipóteses.

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Giraldo, A., Talavera López, J., Fernandez-Del-Palacio, M. J., García-Nicolás, O., Seva, J., Brooks, G., Moraleda, J. M. Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model. J. Vis. Exp. (131), e56699, doi:10.3791/56699 (2018).

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Abstract

Terapia celular e gene são emocionantes e reduziram de promissoras para efeitos de regeneração cardíaca no cenário de insuficiência cardíaca com fração de ejeção (HFrEF). Antes que possam ser considerados para uso e implementados nos seres humanos, estudos pré-clínicos extensivos são necessárias em grandes modelos animais para avaliar a segurança, eficácia e destino do injectate (por exemplo, as células-tronco), uma vez entregado para o miocárdio. Pequenos roedores modelos oferecem vantagens (por exemplo, custo-eficácia, acessibilidade para manipulação genética); no entanto, tendo em conta as limitações inerentes destes modelos, estas conclusões raramente traduzem para a clínica. Por outro lado, grandes modelos animais como coelhos, têm vantagens (por exemplo, eletrofisiologia cardíaca semelhante em relação aos seres humanos e outros animais de grandes porte), mantendo um bom equilíbrio de custo-benefício. Aqui, demonstramos como executar uma técnica de injeção (IMI) contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica, que é minimamente invasiva, segura, bem tolerada e muito eficaz na entrega alvo de injectates, incluindo as células, em vários locais dentro do miocárdio de um modelo de coelho. Para a execução desta técnica, podemos também aproveitaram de um sistema de ecocardiografia clínica amplamente disponível. Depois de colocar em prática o protocolo descrito aqui, um pesquisador com conhecimento básico de ultra-som irá tornar-se competente no desempenho desta técnica minimamente invasiva e versátil para uso rotineiro em experiências, destinadas a testes de hipóteses do capacidades de terapêuticas regenerativas cardíaca no modelo de coelho. Uma vez que a competência é alcançada, todo o processo pode ser realizado em 25 min depois anestesiando o coelho.

Introduction

Terapias celulares e gene são emocionantes e sempre desenvolvendo estratégias para a regeneração/reparação de miocárdio lesionado em HFrEF. Alguns estudos compararam a eficácia (por exemplo, taxa de retenção de célula) com as diferentes rotas de entrega de celular, que têm consistentemente demonstrado a superioridade do IMI sobre rotas Intracoronário ou intravenosa1,2 , 3 , 4 , 5. assim, não é surpreendente que uma grande proporção de estudos sobre modelos translacionais de terapia com células estaminais do miocárdio lesionado, entregar o injectate através do IMI realizada sob visão direta em um peito aberto procedimento6,7 . No entanto, esta abordagem tem várias limitações, incluindo a natureza invasiva do procedimento, que acarreta o risco de mortalidade peri-processuais (muitas vezes sob-relatado)8. Além disso, um IMI sob visão direta não elimina a possibilidade de injeção inadvertida na cavidade ventricular. Na prática clínica um IMI durante a cirurgia de peito aberto pode ser um método apropriado para a entrega de célula terapêutico, por exemplo, durante a artéria coronária ignorar a cirurgia de enxerto (CABG); no entanto, esta abordagem pode não ser apropriada para a entrega de célula na cardiomiopatia global de origem não-isquêmica (por exemplo, HFrEF secundária à cardiomiopatia induzida pelo regime (AICM)).

Não há dúvida que doença isquêmica do coração (IHD) é a causa mais comum de HFrEF (~ 66%)9,10; no entanto, cardiomiopatia não-isquêmica, incluindo AICM, ainda afeta uma proporção significativa de pacientes com HFrEF (33%)9 . Com efeito, os avanços recentes em oncologia clínica resultaram em mais de 10 milhões de sobreviventes de câncer em os EUA sozinhos11, com estimativas de um número similar na Europa, consistente com uma tendência geral para a sobrevivência melhorada de pacientes com câncer12 ,13. Assim, explorando os benefícios da novela terapias tais como transplante de células estaminais para cardiomiopatia não-isquêmica, bem como a testagem de uma rota eficaz e minimamente invasiva de células-tronco de entrega é de extrema importância, dado o número crescente de pacientes afetados por cardiotoxicidade secundária a drogas anticâncer.

Digno de nota, estudos utilizando a terapia de células-tronco, com o objetivo de reparação/regenerar o miocárdio lesionado frequentemente de testes de hipóteses envolve o uso de pequenos roedores (por exemplo, ratos e ratazanas). Estes modelos, muitas vezes, exigem sistemas de ultra-som caro de alta frequência para avaliação da função miocárdica, geralmente equipada com transdutores de matriz linear que tem algumas limitações inerentes de associado (por exemplo, reverberação)14. No entanto, outros modelos tais como coelhos, representando uma grande maquete pré-clínicos, possuem algumas vantagens para testar a hipótese de terapias de células-tronco em HFrEF. Assim, em contraste com ratos e camundongos, coelhos mantêm um sistema de transporte do Ca+ 2 e Eletrofisiologia celular que se assemelha ao de seres humanos e outros animais de grande porte (por exemplo, cães e porcos)15,16,17 ,18,19. Outra vantagem, é a sua acessibilidade para ultrassom cardíaco de imagem usando relativamente barato e sistemas amplamente disponível ecocardiografia clínica equipados com transdutores array fase relativamente alta frequência, por exemplo, 12 MHz, tais como aqueles usados frequentemente em Cardiologia Pediátrica e neonatal. Estes sistemas permitem excelente imagem ecocardiográfica com tecnologia de ponta, e eles se aproveitam da superioridade da harmônica de imagem20. Além disso, testes de hipóteses extensa do potencial de terapias regenerativas cardíacas (por exemplo, terapia de células-tronco), sua segurança, eficácia, cardiomyogenic potencial, bem como avaliação do destino do injectate uma vez entregaram para o miocárdio, é obrigatório antes de eles podem ser considerados para uso humano, e eles exigem o uso de modelos animais pré-clínicos grandes, tais como o coelho17,19. Aqui, descrevemos uma técnica minimamente invasiva para a entrega do celular através do IMI de contraste-ecocardiografia percutânea guiada usando um sistema de ecocardiografia clínica, que se destina na terapia baseada em transplante de células-tronco para cardiomiopatia não-isquêmica20 . Descrevemos também os benefícios da tinta nanquim (InI, também conhecida como tinta de China) como um traçador ultra-som de agente e em situ de contraste da injectate no centro de coelho.

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Protocol

Os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de ética pesquisa da Universidade de Múrcia, Espanha e foram realizados em conformidade com a Directiva 2010/63/UE da Comissão Europeia. As etapas descritas foram realizadas sob protocolos operacionais padrão que faziam parte do plano de trabalho e não tem sido realizados exclusivamente com o propósito de filmar o vídeo que acompanha este livro.

1. preparação de células e o vetor de expressão dos mamíferos

Nota: Aqui, vamos descrever brevemente um protocolo para a preparação e a transfeccao de uma linha de celular (rim embrionário humano 293 (HEK-293)); no entanto, protocolos específicos de célula apropriada para o tipo de célula de interesse devem ser otimizada (por exemplo, as células-tronco).

  1. Manter as células HEK-293 em alta glicose Dulbecco modificada do meio da águia (DMEM) suplementado com soro fetal bezerro de 10% (FCS), piruvato de sódio 1%, 2 mM de glutamina e 1% penicilina/estreptomicina e incubadas a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% umidificada CO2 . Uma vez que as células são sub confluentes, dividido na proporção de 1:3.
  2. Começar a dividir as células aspirando a mídia, em seguida, lave uma vez com fosfato estéril tampão salino (PBS), retire o excesso PBS e então incubar com 2,5 mL de 0.5 x ácido tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (5 min, a 37 ° C).
    1. Adicionar um volume de mídia DMEM (completada conforme descrito acima) para parar a reação e então separar as células aspirando lentamente e delicadamente acima e para baixo com uma pipeta eletrônica.
  3. Em seguida, transferi a suspensão de células para um recipiente apropriado (por exemplo, tubo de centrifuga conico de 15-50 mL). Centrifugue em um balde de balanço (100 x g), desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com PBS estéril.
  4. Resuspenda o pellet em mídia DMEM fresca e sementes em uma densidade de célula apropriada (por exemplo, 1 x 106 células em balão2 75 cm) em frascos de cultura fresco ou pratos grandes, de acordo com as práticas de laboratório local.
    1. Substitua a mídia existente com mídia fresca cada 2 dias.
      Nota: O vetor de expressão foi derivado de pIRES1hyg e usado de acordo com as instruções do fabricante, como descrito anteriormente,21. p(EGFP) IRES1hyg foi gerado pelo subcloning do cDNA EGFP como um BamHI + NotI inserir do pEGFP-N1 para o BamHI + NotI digerido pIRES1hyg21.
  5. 1 dia antes de transfeccao, semente HEK-293 células em uma densidade de 0,5 x 105 células/cm2 em placas de cultura de tecidos de 24 ou 12 --bem.
  6. No dia do transfection, prepare-se complexos de reagente de transfeccao lipídios-DNA em tubos de microcentrifuga separadas 1,5 mL (1 tubo/poço).
    1. Comece adicionando 250 µ l de meio de soro reduzida em cada tubo, e em seguida, adicione 4 µ g de DNA (misture suavemente).
    2. Posteriormente, adicionar 250 µ l de uma mistura previamente preparada de reagente de transfeccao 10 µ l lipídico e 250 µ l de meio de soro reduzida, para cada tubo (misture delicadamente novamente).
    3. Finalmente, proceder com transfections, incubando células HEK-293 com complexos de reagente de Transfeccao de lipídios de DNA por 4 h, então substitua DMEM suplementado como descrito acima (etapa 1.1) e incube por outro 48 h. Executar seleção de drogas de estábulo transfectants com 100 µ g/mL hptII B.
  7. Separe as células HEK-293 com tripsina como descrito acima (etapa 1.2). Depois de lavar as células em PBS estéril, resuspenda em um veículo apropriado (por exemplo, 10% v/v InI em PBS), para obter uma concentração final de célula de 5 x 106/mL.

2. preparação do coelho

Nota: O posicionamento do transdutor e do coelho para IMI não é o ideal para avaliar a morfologia e função do coração do animal. Assim, é aconselhável realizar um exame ecocardiográfico completo20 antes o IMI (veja abaixo) e nos pontos de tempo posterior, conforme definido pelo design experimental. Isto terá como objectivo avaliar as linha de base características anatômicas e funcionais do coração no animal que receberá uma injeção e também avaliar os efeitos, do IMI na função do coração.

  1. Efectuar este exame de forma cega e seguindo as orientações do Comité de ecocardiografia do colégio americano de medicina interna de veterinária e associação americana de sociedade de ecocardiografia/Europeia para Cardiovascular Imaging 22 , 23 , 24.
  2. Obter um rastreamento simultâneo 1-chumbo eletrocardiograma (ECG) ao longo do estudo ecocardiográfico toda.
  3. Anestesiar o coelho com ketamina 10mg/kg, combinado com a medetomidina 200 µ g/kg, injeção intramuscular (IM).
  4. Verifique se o nível da anestesia após 10-20 min após a administração da anestesia.
  5. Usando uma tesoura Retire os cabelos do peito amplamente (por exemplo, abaixo do pescoço à região sub xifoide) (figura 1A).
  6. Raspar as regiões adicionais de 1-2cm2 na face interna do membro direito anterior (região mediocubital) e de ambos os membros posteriores (região mediotibial) (figura 1B).
  7. Coloque o adesivos eletrodos de ECG nas regiões depiladas dos membros de forma síncrona, monitorar o ritmo cardíaco durante o procedimento (Figura 1).
  8. Coloque o animal na posição decúbito supino em uma manta térmica, com os membros estendidos usando fita cirúrgica anexada à tabela (Figura 1).
    1. Certifique-se que as orelhas são flexionadas para trás por trás das costas/cabeça do coelho e em uma posição que é inferior a seus membros dianteiros, pois isso ajuda a manter o correto posicionamento do tórax do animal durante todo o procedimento.
  9. Permitir que o animal de respirar espontaneamente enquanto administrar oxigênio por máscara durante todo o processo (100%, 2-3 L/min).

Figure 1
Figura 1. Preparação do coelho para IMI. (A) cortar o cabelo do tórax; (B) grampo de cabelo de membros; (C) Coloque eléctrodos e posicione o coelho com as pernas estendidas em uma manta térmica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. técnica de contraste percutânea guiada por ecocardiografia IMI no coelho

  1. Limpar e desinfectar a pele do tórax com uma solução à base de clorexidina.
    1. Use uma técnica asséptica durante todo o processo, de acordo com a actual melhor prática.
    2. Sempre que possível e se possível, realizar um procedimento totalmente estéril, incluindo, mas não limitado a, o uso de material estéril como vestidos, luvas, cortinas de ferida cirúrgica, estéril vestir material para a mesa, bem como um ultra-som estéril cobertura do transdutor e o gel de ultra-som estéril. Isto irá reduzir ao mínimo o risco de introdução de patógenos ao animal recebendo IMI e é uma prática comum na prática clínica (por exemplo, durante a punção cardíaca).
      Nota: Recomenda-se sempre proceder em conformidade com os regulamentos locais e nacionais de investigação animal aplicável à instituição local e país de prática.
  2. Aplicar o gel de transmissão do ultra-som no peito e/ou para o transdutor e com o cabo do transdutor em volta do pescoço do experimentador, executar uma verificação de janela rápida do coração do animal, que muitas vezes é útil para visualizar a anatomia e planejar para o IMI.
  3. Coloque o transdutor manualmente no 4th-6th intercostal espaço, 2-3 cm da linha paraesternal direita com um ângulo de incidência de ~ 90 ° em relação ao lado direito da parede torácica (Figura 2A).
  4. Ajuste a localização do transdutor em relação do espaço intercostal, bem como seus ântero-posterior e ângulo dorsoventral para otimizar uma visão do eixo curto modificado ao nível dos músculos papilários. Identifica-se neste ponto de vista do ventrículo direito (RV), ventrículo esquerdo (LV), septo interventricular (IVS), parede posterior (PW), bem como ântero-lateral (AL) e músculos papilar póstero-medial (PM), (Figura 2B).
    1. Tem um amplo campo de visão, aumentando significativamente a profundidade utilizando o controle apropriado no sistema (por exemplo, botão, dial).
    2. Prestar especial atenção à obtenção de uma imagem simétrica nesta vista, bem como a diferenciação adequada de contornos endocárdico e epicárdico e, se necessário, ajuste através de controles de otimização de imagem (por exemplo, ganho).
  5. Uma vez que a visão ecocardiográfica ideal é obtida (Figura 2B), manter esta posição durante o resto do procedimento, enquanto um segundo operador executa o IMI (veja abaixo).
    1. Enquanto segura o transdutor, evite esconder a marca de orientação do transdutor, que deve sempre ser virado para a frente, permitindo assim o seu alinhamento com a agulha em etapas subsequentes (Figura 2A, C).
  6. Com uma agulha 24G ligada a uma seringa de 1 mL, coloca a agulha perto da pele do hemithorax esquerdo em uma posição de espelhamento simétrica em relação ao transdutor. Em seguida, manualmente, alinhe a agulha com a marca de orientação do transdutor em um ângulo de ~ 90° (Figura 2) e avançar lentamente a agulha através da pele e na cavidade do peito.
    Nota: A inserção da agulha percutânea nesta posição e orientação facilita a visualização da agulha no plano do feixe de ultra-som (Figura 2D, E), permitindo o monitoramento em tempo real e, quando necessário, ajuste de a localização da agulha em relação à região alvo do miocárdio (Figura 2, G, H).
  7. Com a ponta do local de destino, lentamente entregar o injectate (até 0,25 mL por injecção) dentro de 10-30 s (Figura 2E), enquanto a lenta e suavemente retracção da agulha durante a injeção para aumentar a extensão do miocárdio tratados.
    1. Use InI 10% (v/v), diluído em PBS para padronização da técnica e como um traçador em situ enquanto adquirindo competência, bem como para confirmar a segmentação bem sucedida de todos os quatro sites IMI dentro do miocárdio por patologia bruta e Histopatologia (ver Resultados do representante). Uma vez que a competência é alcançada, InI poderia ser substituído por um agente de contraste de ultra-som comercial adequado, se desejado.
      Nota: Entrega de 10% (v/v) InI diluída em PBS com ou sem células em resultados de miocárdio em hyperechogenicity transmural (ou seja, a aparência brilhante eco) no local de destino da injeção (Figura 2E, F). Transiente desaceleração ou aceleração da frequência cardíaca, associada com contrações ventriculares prematuras (por exemplo, isolado, parelhas de versos e trigêmeos) frequentemente são observados até mesmo do primeiro contato da agulha com o epicárdio, bem como durante e/ou logo após o IMI. No entanto, sem arritmias fatais são desenvolvidas, e efeitos adversos agudos raramente são observados usando até 0,25 mL (1,25 x 106 células) de injectate por injecção IMI (consulte Representante resultados e discussão).
  8. Realizar mudanças sutis no ângulo de incidência da agulha conforme necessário para completar a injeções de 0,25 mL para cada um dos sites IMI de quatro destino (três na ventricular esquerda livre parede (LVFW) e no IVS).
  9. Depois de concluir o procedimento IMI contraste percutânea guiada por ecocardiografia, avaliar o ritmo cardíaco (por exemplo, através da série ECG rastreamento e/ou 24 h Holter ECG) e realizar exames ecocardiográficos de serial janela para verificar a ausência de complicações, até que o animal está totalmente recuperado da anestesia e só então transferência para um quarto de ciclo de luz.
    1. Aqui, usamos o Holter ECG de 24h para monitorar os efeitos de IMI com InI no ritmo cardíaco durante 24 h. Para isso, comparamos um grupo de 6 coelhos com fenótipo normal (grupo Normal) e um grupo de 6 coelhos que receberam a administração intravenosa de doxorrubicina (uma cardiotóxicos regime droga, comumente usada para o tratamento de câncer; Grupo DOX) na dose de 2 mg/kg/semana por 8 semanas e então as duas coortes recebeu IMI com InI.

Figure 2
Figura 2 . Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelho. (A) colocação do transdutor no hemithorax direito a um ângulo de ~ 90 °. (B) imagem representativa de uma visão do eixo curto paraesternal (PSSX) do coração ao nível dos músculos papilários no coelho. (C) alinhamento da agulha em um ângulo de ~ 90 ° em relação a marca de orientação do transdutor. (D) localização da agulha no local de destino em uma exibição PSSX do coração (nota que a agulha é facilmente visualizada no plano do feixe de ultra-som). (E e F) demonstração de hyperechogenicity no local de destino mediante injeção Intramiocárdica com tinta nanquim (pontas de seta destacam o hyperechogenicity transmural). (G) localização acidental da agulha na câmara de LV (pontas de seta destacam o eixo da agulha). (H) reposicionamento da agulha para a parede livre de LV (pontas de seta destacam o eixo da agulha). RV = ventrículo direito; LV = ventrículo esquerdo; IVS = septo interventricular; PW = parede posterior; AL = músculo papilar ântero-lateral; PM = músculo papilar póstero-medial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. publicar análises IMI

  1. Realizar análise histopatológica de amostras de tecido do coração de coelhos.
    1. Fixar o tecido para 24h em formol 10%, seguido de desidratação, com o aumento da concentração de etanol como segue:
      • 1 x em 70% (60 min)
      • 1 x em ethanol/5% de 95% de metanol (60 min)
      • 1 x em 100% (60 min)
      • 1 x em 100% (90 min)
      • 1 x em 100% (120 min)
      Nota: Toda a incubação do acima é realizadas à temperatura ambiente (RT). Em seguida, substituir duas vezes com 100% de xileno (1h, RT) e finalmente incorporar em parafina em duas etapas (60 min, 58 ° C)25.
    2. Execute 4-5 µm, cortes de tecido com um micrótomo25. Monte seções em slides.
    3. Execute a coloração com hematoxilina-eosina e2726,25,do métodos corante tricromo de Masson.
  2. Em cortes de tecido do coração transplantada, execute imuno-histoquímica para detectar células HEK-293 de EGFP(+) (por exemplo, usando o método (ABC) complexo avidina-biotina), resumidamente:
    1. Cera de 4-5 µm seções de coração grosso em xilol 100% (10 min, a RT). Reidratar o tecido por lavagem com a diminuição de soluções de concentração de etanol (2 x em 100% (2 min); 2x em 95% (2 min) 1 x em 70% (2 min); 1 x em 50% (2 min); 1 x em 30% (2 min); 1 x ddH2O (2 min)) no RT
    2. Realizar a inibição da peroxidase endógena, cobrindo as seções com 100 µ l de 3% H2O2 diluído em metanol (preparado com 5 mL de solução stock de 30% de H2O2e a adição de metanol acima para um volume total de 50 mL) ( Incubar 30 min, RT) e em seguida lavar por imersão com solução salina tamponada de Tris (TBS; pH 7,6).
    3. Executar o antígeno desmascaramento através de tratamento enzimático, cobrindo as seções com 100 µ l de 0,1% Pronase (preparado com 0,01 g Pronase diluído em 10 mL TBS) (incubar 12 min, RT), em seguida lavar com TBS (5 min, RT).
    4. Incubar em solução (soro de cabra normal a 10% em TBS) de bloqueio usando 100 µ l por deslize (30 min, RT) e lavar com TBS (5 min, RT).
    5. Incube com frango antiproteína verde fluorescente (GFP) como anticorpo primário (1: 500 em TBS) (1 h, 30 ° C) e lavar com TBS (5 min, RT).
    6. Incube com anticorpo secundário biotinilado cabra-antifrango IgG (1: 250 em TBS) (1 h, 30 ° C) e em seguida lavar com TBS (5 min, RT).
    7. Incube com complexo avidina-biotina (20 min, 30 ° C) e então rotular usando tetrahydrochloride 3,30-diaminobenzidina (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Finalmente, desidrata-se por lavagem em aumentar as concentrações de etanol (1 x em 30% (2 min) 1 x em 50% (2 min) 1 x em 70% (2 min); 2 x em 95% (2 min); 2 x em 100% (2 min)) no RT, seções de corante de contraste usando o método de hematoxilina-eosina25e montar slides de capa. Incluem o positivo, negativo, bem como controles de isotipo.
      Nota: O protocolo breve descrito acima não se destina para uso geral imuno-histoquímica; otimização para o tecido de interesse e condições é necessária.

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Representative Results

IMI guiada por ecocardiografia com contraste percutânea com InI:

Usando o protocolo descrito acima, e uma vez que o posicionamento ideal da ponta da agulha foi confirmado pela ecocardiografia e iniciada a injeção, transmural hyperechogenicity foi observada durante a entrega do InI (10% v/v na PBS) (Figura 2E) , bem como logo após o IMI para a região de destino (Figura 2F). Quando IMI foi imediatamente seguido por eutanásia e o coração retirado, depósitos de InI eram facilmente visíveis ao exame externo do coração (Figura 3A). Além disso, coração cortes de tecido, por exemplo, seção de eixo curto ao nível dos músculos papilários (Figura 3B), revelaram depósitos transmural do InI tintura no local da injeção, demonstrando assim a entrega bem sucedida e eficaz de injectate para o miocárdio usando esta técnica. Digno de nota, a hyperechogenicity transmural observada na vivo IMI (Figura 2E, F), correlacionado com depósitos transmural do InI em amostras ex vivo (Figura 3A, B). Isto claramente demonstrado que o InI tem propriedades duplas no cenário do IMI: como um agente de contraste de ultra-som na vivo , bem como um marcador ex situ vivoin . Ambas as propriedades fazem InI um agente de contraste de ultra-som muito versátil e de baixo custo, especialmente para o treinamento durante a aquisição da competência nesta técnica. Assim, as propriedades ecogénica de InI ajudam a monitorar IMI , por exemplo, determinar sucesso IMI versus intracâmara acidental ou injeção de espaço pericárdico e, quando necessário, tendo em conta os recursos de imagem em tempo real do ultra-som, para fazer correções da agulha controlar em tempo real (Figura 2, H). Por outro lado, os recursos de rastreamento em situ do InI são de valor para localizar o injectate ex vivo espécimes do miocárdio alvo.

IMI guiada por ecocardiografia com contraste percutânea com células de HEK-293 InI e EGFP(+):

Antes da IMI, sucesso transfecção de células HEK-293 de EGFP(+) foi confirmada por microscopia de fluorescência em vitro cultura nas condições (Figura 3). A entrega bem sucedida de células EGFP(+) HEK-293 em miocárdio foi demonstrada através de análise imuno-histoquímica de cortes de tecido do coração onde InI depósitos foram observados. Assim, usando o método complexo avidina-biotina (consulte a etapa 4.2), abundantes células HEK-293 de EGFP(+) foram identificadas dentro do miocárdio intercalado com depósitos InI (Figura 3D). Depósitos de InI ainda foram observados 24h após IMI em amostras de tecido do miocárdio de coelhos que receberam InI em combinação com células HEK-293 de EGFP(+) (Figura 3E) ou InI sozinho (Figura 3F). Digno de nota, observou-se uma resposta inflamatória aguda, neste ponto do tempo, com um infiltrado neutrofílico predominante, em amostras provenientes de animais recebendo EGFP(+) HEK-293 células (Figura 3E), sugerindo assim a rejeição celular aguda. Por outro lado, os macrófagos foram observados em animais recebendo InI sozinho (Figura 3F).

Figure 3
Figura 3 . In situ avaliação macroscópica e histopatológica e rastreamento de injectate. (A) demonstração da presença de injectate no exame externo de um coração extirpado seguindo IMI com InI (pontas de seta destacam os locais de injeção). (B) demonstração de distribuição transmural de injectate seguindo o IMI com InI em uma secção transversal do coração ao nível dos músculos papilários (pontas de seta azuis destacam o transmural InI depósito; seta branca destaca um depósito visível de InI no IVS). (C) autofluorescência em vitro de células EGFP(+) HEK-293 usando microscopia de fluorescência. (DF) Análise histopatológica dos sites injetados. EGFP(+) células são visivelmente intercaladas com InI depósitos dentro do miocárdio às 0h (D) e 24 h (E) postar IMI (pontas de seta azuis realçar células EGFP(+); setas vermelhas destacar a presença de neutrófilos). Depósitos de InI intercalados dentro do miocárdio a 24 h (F) seguindo o IMI com InI sozinho (setas azuis destacam a presença de macrófagos). RV = ventrículo direito; LV = ventrículo esquerdo; IVS = septo interventricular; IMI = injeção Intramiocárdica; InI = tinta da Índia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tendo realizado mais de 60 contraste percutânea guiada por ecocardiografia IMI procedimentos até à data, acreditamos que, com cuidadosa atenção aos detalhes e boa manipulação de animais e cuidados, o procedimento é geralmente bem tolerado, e complicações agudas são muito raras e geralmente leve. Em geral, nos animais que passam por IMI, a observação mais frequente durante e logo após o procedimento é transiente aceleração ou desaceleração da frequência cardíaca, associada a complexos ventriculares prematuros isolados (PVC) (Figura 4A). Assim, ECG de Holter de 24 h, monitoramento de animais que receberam InI sozinho através do IMI, revelou que a arritmia mais frequente detectada (número total de episódios dentro de 24 h) foi isolado PVC, apesar de um maior número de episódios foram detectado em animais que foram previamente tratados com DOX para 8 semanas (Figura 5A). PVC em parelhas de versos e trigêmeos parecem ser menos frequentes (Figura 4B, C e Figura 5B, C), apesar de trigêmeos são significativamente menos frequente em DOX-tratadas do que nos coelhos normais não tratados (Figura 5). Por outro lado, taquicardia ventricular não-sustentada (NSVT) foi mais frequentemente observada em animais normais (Figura 4 e Figura 5). Significativamente, enquanto a frequência cardíaca média não foi diferente entre os grupos normais e DOX após ter recebido o IMI com InI sozinho (Figura 5E), o desvio padrão do intervalo RR normal (SDNN), foi significativamente reduzida (< 100 ms) no grupo (DOX Figura 5F). O SDNN é uma medida não-linear de estado de saúde do coração, e, portanto, este resultado indica que o grupo DOX tem globais alterações em seu estado fisiológico cardíaco.

Figure 4
Figura 4. Arritmias ventriculares observaram durante o monitoramento de Holter 24h em coelhos que receberam IMI com InI. As imagens mostradas são screenshots obtidos de Holter ECG tachograms exibidas na tela durante a análise off-line e ilustram exemplos representativos dos tipos mais comuns de arritmias encontradas durante 24 h de monitoramento. () Isolado PVC. (B) PVC em parelhas de versos. (C) PVC em trigêmeos. (D) NSVT. PVC = Contrações ventriculares prematuras; NSVT = taquicardia ventricular não-sustentada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . Eventos arrítmicos detectados pelo ECG de Holter de 24 h, monitoramento após IMI com InI em coelhos. Número total de PVC isolado (A), PVC em dísticos (B), PVC em trigêmeos, (C) e NSVT (D), em coelhos não tratados (Normal + IMI) versus tratados com doxorrubicina (3 mg/kg/semana por 6 semanas) coelhos (DOX + IMI), depois de IMI com InI. Quer dizer a taxa de coração (E) e SDNN (F), em coelhos do Normal + IMI e DOX IMI grupos depois de IMI com InI. Dados são expressos em média ± SEM. * indica p < 0,05; e # indica p < 0,01, comparando Normal + IMI contra DOX + IMI grupos pelo t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O objetivo principal era desenvolver uma técnica minimamente invasiva que pode ser utilizada para a entrega de células-tronco em miocárdio de coelhos (um grande porte pré-clínicos modelo animal)17,18, enquanto aproveitando-se da utilização de um relativamente barato prontamente disponível em muitas clínicas do sistema de imagem e centros de pesquisa. Aqui, mostramos que, usando um sistema de ecocardiografia clínica, e auxiliado por InI, um agente amplamente disponível, com recursos de rastreamento em situ e propriedades ecogénica, sucesso contraste percutânea guiada por ecocardiografia IMI é muito eficaz na entrega de injectate para regiões-alvo do coelho coração. Tanto quanto sabemos, esta é a primeira descrição de um contraste percutânea guiada por ecocardiografia IMI e célula entrega em um modelo animal grande como o coelho18,19. Enquanto InI tenha sido usado anteriormente em estudos para localização em situ de injectate dentro de tecidos7,28, isto é para o nosso conhecimento, a primeira descrição das propriedades desse agente duplas como um na vivo Agente de contraste de ultra-som e como um traçador em situ de injectate ex vivo. Na verdade, misturas complexas de agentes de contraste e em situ traçado substâncias anteriormente têm sido descritas em estudos murino destinados a entrega de injectates para o miocárdio29. No entanto, tendo em conta as propriedades ecogénica de InI e suas capacidades de rastreamento em situ , esta substância pode ser muito útil durante a aquisição de competência enquanto em formação com esta técnica.

Confirmação de entrega de injectate contendo ambos InI, bem como EGFP(+) HEK-293 células usando a imuno-histoquímica demonstra a aplicabilidade desta técnica de investigação pré-clínica destinada a terapia de células-tronco. Um IMI do InI, em conjunto com EGFP(+) HEK-293 resultou em uma resposta inflamatória aguda, com um infiltrado neutrofílico predominante, sugerindo uma resposta de rejeição celular aguda (dentro de 24 h) para as células xenogénicas. Provavelmente esta resposta não é surpreendente em um animal imunocompetentes. Por outro lado, um IMI com InI sozinho também suscitou uma resposta inflamatória aguda (dentro de 24 h) no tecido do miocárdio Tratado, que exibiu um infiltrado de macrófagos predominante. Isto está em consonância com a observação de inflamação aguda descrito em estudos anteriores, seguindo o IMI sob visão direta em um peito aberto procedimento4,30,31,32,33. Inflamação aguda também tem sido observada após injeção de solução salina normal ou soluções de PBS para o miocárdio34,35e mesmo para os músculos gastrocnêmio do rato36, e, portanto, esta resposta tem sido atribuída a lesão tecidual direta em vez do injectate por si. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 com efeito, sociedade internacional para investigação de translação Cardiovascular reconhece a ocorrência comum de inflamação no cenário do IMI, mas não há consenso quanto à possibilidade ou não medidas para reduzir esse processo durante o tempo de peri-processuais são úteis (por exemplo, por via intravenosa (I.V.) corticosteroides)37. Mesmo que a inflamação neste estudo também poderia ser atribuída para direcionar a lesão tecidual, os resultados também sugerem que InI como um corpo estranho deve também desempenhar um papel neste processo, desde que um número de macrófagos parecem ser fagocitando InI (Figura 3F). Uma análise aprofundada dos efeitos funcionais desta inflamação aguda secundária a IMI dentro do coração, ou se estas podem ser amenizadas através de administração de medicamentos profiláticos, como corticosteroides está além do escopo deste manuscrito. Não obstante, percutânea contraste guiada por ecocardiografia IMI para quatro regiões-alvo do miocárdio, com um volume de injectate de até 0,25 mL (1,25 x 106 células) por site do IMI, foi muito bem tolerada no coelho.

Com mais de 60 procedimentos realizados até à data, e depois foi alcançada a competência, a mortalidade secundária ao procedimento foi muito baixa. Por exemplo, não há mortes ocorreram nas duas coortes descritas no passo 3.9 (grupos Normal e DOX) depois de IMI. Com efeito, até à data após 67 IMI de procedimentos realizados como parte de um programa de pesquisa em andamento, só tivemos duas mortes diretamente relacionadas ao procedimento (2,9% de mortalidade). Em um desses, a presença de um Hemopericárdio foi demonstrada no exame post-mortem , enquanto o outro desenvolveu sinais clínicos neurológicos, consistentes com isquemia cerebral aguda secundária a um evento embólicos, exigindo assim uma ponto de extremidade humano. Esta taxa de mortalidade (2,9%) é significativamente menor do que o relatado por Lu et al (11%)8 e Mu et al (27%)38, em coelhos que receberam IMI sob visão direta em um procedimento de peito aberto. Assim, consideramos que o procedimento descrito no estudo atual para ser seguro, e nós estamos usando essa técnica em estudos em andamento para avaliar a terapia baseada em células-tronco em um modelo de coelho de AICM com promissores resultados39,40.

Existem vários críticos para uma bem sucedida percutâneas guiada por ecocardiografia IMI de contraste. Primeiro, certifique-se que uma visão do eixo curto paraesternal ao nível dos músculos papilários é obtida com os contornos endocárdico e epicárdico delineada. Em seguida, certifique-se que a ponta da agulha está dentro do campo de visão em todos os momentos, quando este possuir a cavidade torácica e o miocárdio para impedir a entrega acidental no espaço pericárdico ou câmara de LV. Em seguida, certifique-se de manter ao mínimo o número de passagens através da cavidade torácica e para o pericárdio e miocárdio, uma vez que isto poderia aumentar a probabilidade de trauma local (por exemplo, laceração) para estas estruturas e o risco associado de Hemopericárdio. Por isso, embora mantendo a agulha na cavidade torácica (e para alguns sites de destino, no mesmo ponto de entrada no pericárdio visceral (por exemplo, parede lateral)), cuidadosamente realizar mudanças sutis no ângulo de incidência da agulha. Finalmente, utilize sempre uma agulha que tem uma clara e fácil passagem através da pele na cavidade do peito, evitando assim o bisel da agulha de entrar o miocárdio de causar danos significativos.

O procedimento descrito neste documento, não só permite a entrega confiável e bem sucedida de injectate para vários sites de destino dentro do miocárdio, mas também permite a correção da trajetória da agulha em tempo real, evitando (entrega de intrachamber acidental Figura 2, H). Enquanto fechado procedimentos IMI peito têm sido descritos anteriormente em camundongos, existem várias limitações inerentes a este modelo de animais pequeno. Essas limitações incluem o número de regiões-alvo do miocárdio favorável à terapia e o baixo volume/número de células que podem ser injetados por alvo local29,41. Além disso, entrega exata do injectate muitas vezes é uma preocupação, com uma taxa de sucesso perto de 60-70%42, e, portanto, o uso de sistemas de ultra-som menos amplamente disponível alta frequência é geralmente necessário29,41, 42. Estes sistemas estão equipados com transdutores de matriz linear que também possuem limitações inerentes de imagem (por exemplo, reverberação é um artefato frequente)14. Outra limitação dos modelos pequenos roedores, como ratos e ratos, é suas diferenças intrínsecas no sistema de transporte do Ca+ 2 e Eletrofisiologia celular, que é diferente dos seres humanos e de grandes porte modelos animais como cães, porcos e coelhos 15,16,43. Todas estas limitações, muitas vezes, criam dificuldades em traduzir os resultados nestes modelos para a clínica sem confirmação prévia em um modelo animal grande.

Monitorização cuidadosa do animal no período peri-processuais é obrigatória de acordo com as diretrizes contemporâneas para cuidar dos animais de laboratório. Como mostrado aqui, isso poderia ser feito por exames de ecocardiografia serial janela e traçados de ECG, pelo menos até que o animal está acordado da anestesia. Os efeitos agudos do IMI no ritmo cardíaco também podem ser monitorados por 24 horas Holter ECG e é nossa prática padrão. Digno de nota, as arritmias mais frequentes foram isoladas PVC, que são relativamente benignos na natureza, e que eram mais comuns em animais que tenham sido tratados com doxorrubicina antes da IMI com InI (ver Figura 4A e 5A figura). Outras arritmias que foram relativamente menos frequentes incluem: PVC em parelhas de versos; PVC em trigêmeos; assim como NSVT (veja Figura 4BD e Figura 5BD). No entanto, observaram-se sem arritmias ameaçadora de vida tais como a taquicardia ventricular sustentada. Digno de nota, também achamos que algumas manifestações cardiotóxicos no grupo DOX poderiam ser detectadas pelo ECG de Holter, monitorização, usando variáveis de domínio da frequência tempo de variabilidade da frequência cardíaca (VFC) como SDNN. Assim, observou-se uma reduzida SDNN (Figura 5E, F), uma medida não-linear de estado de saúde do coração, no grupo DOX em relação ao grupo Normal. Este é o primeiro relatório do VFC reduzida, como demonstrado por uma reduzida SDNN, no contexto de um coelho modelo de AICM, que está em consonância com a observação de que reduziu o SDNN é um poderoso preditor independente de morte cardíaca em pacientes com HFrEF44 ,45,46. As alterações no SDNN no grupo DOX provavelmente não estão relacionadas com o procedimento IMI em si; no entanto, a confirmação destes achados em coelhos recebendo doxorrubicina, bem como animais normais que não recebem IMI, é necessária. Se SDNN reduzida em HFrEF também poderia ser melhorado e, portanto, utilizado como uma medida de substituto do benefício da terapia de células-tronco com base, continua a ser avaliada, e será o foco da pesquisa futura.

Várias rotas de entrega de células dentro do coração tem sido exploradas, incluindo intravenosa, Intracoronário e Intramiocárdica entrega; no entanto, a rota intramiocárdica como usado aqui, demonstrou consistentemente o maior nível de célula de retenção taxas1,2,3,4,5,37. Nós não avaliar taxa de retenção celular nos estudos apresentados aqui, como a metodologia utilizada não é específico o suficiente para dosar na vivo ou ex vivo, que é uma limitação deste estudo e robusto. Em vez disso, usamos EGFP(+) HEK-293 células cujas características fenotípicas nos permitiram facilmente discriminar a presença dessas células dentro do miocárdio, indicando assim a entrega bem sucedida Intramiocárdica. No entanto, o objectivo principal era desenvolver uma técnica minimamente invasiva, através do qual podemos fazer entrega IMI e célula para o miocárdio de um modelo de grande porte, pré-clínicos de cardiomiopatia não-isquêmica. Conforme demonstrado na Figura 2 e Figura 3, isso foi realizado para a primeira vez por percutânea guiada por ecocardiografia IMI de contraste. Mais estudos são necessários para avaliar a taxa de retenção de células, bem como quaisquer potenciais efeitos benéficos de células-tronco entregaram no miocárdio usando o procedimento descrito neste documento; Estes estudos estão em andamento. Nós recentemente comunicados resultados promissores no que diz respeito a efeitos funcionais39,40.

Comparado ao IMI em um procedimento de peito aberto, um contraste percutâneo guiada por ecocardiografia IMI em uma grande maquete pré-clínicos como descrito no presente estudo, é significativamente menos invasivo na natureza com rápida recuperação do animal após o procedimento e, como mencionado acima, também tem baixa mortalidade taxa8,38. Outra abordagem para IMI é baseada no cateter IMI, que também foi testado em modelos pré-clínicos e vários pequenos ensaios clínicos (para uma revisão, ver Sheng et al) 47. com esta abordagem, um cateter é avançado na cavidade de LV e então posicionado em locais de destino dentro do endocárdio. Estes sites de destino são que também identificados antes do procedimento, por exemplo, usando o contraste de ressonância magnética cardíaca (RMC)48, ou durante o procedimento, por exemplo, pelo mapeamento endocárdico eletromecânico (EEM), claramente Diferencie o miocárdio viável antes da injeção,49. Esta última abordagem é menos invasiva em comparação para abrir o peito IMI sob visão direta, que é uma clara vantagem. Também, desde IHD nos seres humanos tem uma distribuição desigual, EEM ajuda a direcionar a terapia especificamente para sites viáveis do miocárdio, que é particularmente importante no cenário do IDH. No entanto, uma grande desvantagem é a indução de arritmias ventriculares, que são uma característica comum de todas as abordagens IMI. Outros inconvenientes incluem o longo tempo processual, fornecendo que eem é uma técnica altamente exigente, que requer treinamento extensivo e um risco associado de perfuração cardíaca. Em contraste, contraste percutânea guiada por ecocardiografia IMI como descrito no presente estudo, é tecnicamente menos exigente do que o IMI baseado no cateter e, uma vez que a competência é alcançada, pode ser realizada com segurança dentro de 25 min após a anestesia. Da mesma forma, uma vez que apenas uma curta parte da agulha é avançada para o miocárdio, há um menor risco de perfuração cardíaca, embora laceração cardíaca ainda é possível.

Em conclusão, contraste percutânea guiada por ecocardiografia IMI técnica descrita neste estudo em um modelo animal grande, como o coelho16,,43, é segura, bem tolerada e eficaz na entrega do injectate para o coração. Portanto, constitui uma estratégia promissora para testes de hipóteses pré-clínicos dos efeitos da terapêutica regenerativa cardíaca em cardiomiopatia não-isquêmica (por exemplo, AICM), incluindo, mas não se limitando a terapia baseada em células-tronco.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

Os autores agradecer Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz e Manuel Molina excelente apoio prestado durante a coleta de dados e Carlos Bueno para fornecer as células EGFP(+) HEK-293. Este trabalho foi financiado em parte por: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, região de Múrcia, Espanha (JT) (número de concessão: 11935/PI/09); Vermelho de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de eu + D + I 2008-2011 (conceder n. RD12/0019/0001) (JMM), co-financiado com fundos estruturais da União Europeia (FEDER) (GMC); e, a Universidade de Reading, Grã-Bretanha (AG, GB) (financiamento Central). Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HD11 XE Ultrasound System Philips 10670267 Echocardiography system.
S12-4 Philips B01YgG 4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) Parket laboratories Inc N 01-08
Vasovet 24G Braun REF 381212  over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe Braun 9161406V
Imalgene (Ketamine) Merial RN 9767 Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine) Esteve CN 570686.3 Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1 Faber-Castel 16 33 99 India (China) Ink
Holter Syneflash Ela medical SF0003044S 24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor® Ambu (NUMED) VLC-00-S Holter ECG electrodes.
Microtome Leica Biosystems RM2155
Microscope Olimpus CO11
ABC Vector Elite Vector Laboratories PK-6200 Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody Invitrogen A10262 Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody Vector Laboratories BA-9010 Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) DAKO (Agilent) S3000
Fluorescence Microscope Carl Zeiss
MicroImaging
Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG Elamedical Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  Fisher Scientific 11965084
10% fetal calf serum (FCS) Fisher Scientific 11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific 25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Fisher Scientific 31985070
Hygromycin B Calbiochem (MERCK) 400051
Xylene (histological) Fisher Scientific X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) Sigma H1009
Pronase Fisher Scientific 53-702-250KU

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