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Perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektion und Zelle-Lieferung in einem großen präklinischen Modell

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Summary

Neue therapeutische Strategien in der kardialen regenerativen Medizin erfordern umfangreiche und detaillierte Studien in großen präklinischen Tiermodellen, bevor sie für den Einsatz beim Menschen betrachtet werden können. Hier zeigen wir eine perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektionstechnik bei Kaninchen, die ist wertvoll für Hypothesentests die Wirksamkeit solcher neuartiger Therapien.

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Giraldo, A., Talavera López, J., Fernandez-Del-Palacio, M. J., García-Nicolás, O., Seva, J., Brooks, G., Moraleda, J. M. Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model. J. Vis. Exp. (131), e56699, doi:10.3791/56699 (2018).

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Abstract

Zell-und Gentherapie sind spannende und erfolgversprechende Strategien zur kardialen Regeneration im Rahmen der Herzinsuffizienz mit reduzierte Ejektionsfraktion (HFrEF). Bevor sie können für den Einsatz in Betracht gezogen und in den Menschen umgesetzt werden, müssen umfangreiche präklinische Studien in großen Tiermodellen, die Sicherheit, Wirksamkeit und Schicksal der Injectate (z.B. Stammzellen) einmal in das Myokard geliefert zu bewerten. Kleine Nager-Modelle bieten Vorteile (z. B.Preis-/Leistungsverhältnis, Hilfsbereitschaft für Genmanipulation); Allerdings übersetzen inhärente Einschränkungen dieser Modelle gegeben, die Ergebnisse in diesen selten in der Klinik. Umgekehrt haben große Tiermodellen wie Kaninchen, Vorteile (z.B. ähnliche kardiale Elektrophysiologie im Vergleich zu Menschen und andere Großtiere), Beibehaltung eine gute kostengünstige Balance. Hier zeigen wir, wie eine perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte Intramyocardial (IMI) Injektionstechnik, ausführen, die minimal-invasive, sichere, gut verträglich und sehr wirksam bei der gezielten Bereitstellung von Injectates, einschließlich der Zellen ist, in mehreren Standorten innerhalb der Herzmuskel eines Kaninchen-Modells. Für die Umsetzung dieser Technik haben wir auch eine verbreitete klinische Echokardiographie-System genutzt. Nachdem man in der Praxis das Protokoll beschrieben hier, ein Forscher mit grundlegenden Ultraschall wissen werden kompetent bei der Erfüllung dieser vielseitige und minimal-invasive Technik für den Routineeinsatz in Experimenten, die darauf abzielen, Testen von Hypothesen von der Funktionen der kardialen regenerativen Therapeutika in der Kaninchen-Modell. Kompetenz erreicht, kann die ganze Prozedur innerhalb von 25 Minuten durchgeführt werden, nach dem Betäuben der Kaninchens.

Introduction

Zell- und Gentherapie Therapien sind aufregend und immer Entwicklung von Strategien für die Regeneration/Reparatur der geschädigten Herzmuskel in HFrEF. Einige Studien haben die Wirksamkeit (z.B. Zelle Rückhalterate) von den verschiedenen Routen der Zelle Lieferung verglichen, die konsequent die Überlegenheit des IMI über intracoronary oder intravenös Routen1,2 unter Beweis gestellt haben , 3 , 4 , 5. so, ist es nicht verwunderlich, dass ein Großteil der Studien auf translationale Modelle der Stammzell-Therapie von der geschädigten Herzmuskel, liefern die Injectate über das IMI unter direktem Blick in einen offenen Brustkorb Verfahren6,7 durchgeführt . Dieser Ansatz hat jedoch einige Einschränkungen, einschließlich der invasiven Art des Verfahrens, die das Risiko von Peri prozedurale Sterblichkeit (oft unter-berichtet)8trägt. Darüber hinaus beseitigt ein IMI unter direkter Sicht nicht die Möglichkeit für die versehentliche Injektion in den linksventrikulären Hohlraum. In der klinischen Praxis könnte ein IMI während der offenen Brustkorb Operation eine geeignete Methode zur therapeutischen Zelle Lieferung, z.B., während koronare Bypasschirurgie Transplantat (CABG); jedoch kann dieser Ansatz nicht für Zelle Lieferung in globalen Kardiomyopathie nicht ischämischen Ursprungs (z. B.HFrEF sekundäre Anthracyclin-induzierten Kardiomyopathie (AICM)) geeignet.

Es besteht kein Zweifel, dass ischämische Herzkrankheit (IHD) ist die häufigste Ursache von HFrEF (~ 66 %)9,10; nicht-ischämische Kardiomyopathie, einschließlich AICM, betrifft jedoch noch einen Großteil der Patienten mit HFrEF (33 %)9 . In der Tat führten die jüngsten Fortschritte in der klinischen Onkologie in mehr als 10 Millionen Überlebende des Krebses in den USA allein11, mit Schätzungen über eine ähnliche Zahl in Europa, mit eine allgemeine Tendenz in Richtung verbesserte Überleben von Krebspatienten12 ,13. So angesichts erkunden die Vorteile der neuartigen Therapien, wie z. B. Stammzell-Transplantation für nicht-ischämische Kardiomyopathie sowie die Erprobung einer effektiven und minimal-invasive Route der Stammzell-Lieferung von größter Bedeutung ist, der wachsenden Zahl von Patienten Kardiotoxizität Krebsmedikamente Sekundär betroffen.

Der Hinweis beinhaltet Hypothesentests Studien mit Stammzell-Therapie mit dem Ziel, Reparatur/Regeneration der geschädigten Herzmuskel häufig die Verwendung von kleinen Nagetieren (z.B., Mäuse und Ratten). Diese Modelle erfordern oft teure Hochfrequenz-Ultraschall-Systeme für die Beurteilung der myokardialen Funktion, in der Regel ausgestattet mit linear-Array-Sensoren, die damit verbundenen Einschränkungen (z.B. Nachhall)14haben. Jedoch haben andere Modelle wie Kaninchen, ein großes präklinisches Modell vertreten einige Vorteile für Hypothesentests Stammzelltherapien in HFrEF. Auf diese Weise beibehalten im Gegensatz zu Ratten und Mäuse, Kaninchen eine Ca+ 2 Transportsystem und zelluläre Elektrophysiologie, die ähnelt der Mensch und andere große Tiere (z.B.Hunde und Schweine)15,16,17 ,18,19. Ein weiterer Vorteil ist ihre Bereitschaft für die Herzultraschalluntersuchung Bildgebung mit relativ preiswert und überall erhältlich klinische Echokardiographie Systeme ausgestattet mit relativ hoher Frequenz Phase-Array-Sensoren, z.B., 12 MHz, wie die häufig verwendeten in der Neugeborenen- und Pädiatrische Kardiologie. Diese Systeme ermöglichen hervorragende echokardiographische Bildgebung mit State-Of-The-Art Technologie, und sie profitieren von der Überlegenheit der Harmonic imaging-20. Darüber hinaus umfangreiche Hypothesentests das Potenzial der kardialen regenerative Therapien (z.B. Stammzell-Therapie), ihre Sicherheit, Wirksamkeit, Cardiomyogenic Potenzial, sowie Bewertung von dem Schicksal der Injectate einmal geliefert, in der Myokard, ist zwingend erforderlich, bevor sie für den menschlichen Gebrauch betrachtet werden können, und sie erfordern den Einsatz von großen präklinischen Tiermodellen, wie der Hase17,19. Hier beschreiben wir eine minimal-invasive Technik zur Zelle Lieferung über perkutane Kontrast-Echokardiographie geführte IMI mit einem klinischen Echokardiographie-System sich an Stammzell-Transplantation-Therapie für nicht-ischämische Kardiomyopathie20 richtet . Wir beschreiben auch die Vorteile der Tusche (InI, auch bekannt als China Tinte) als ein Ultraschall Kontrast Agent und in Situ Tracer von der Injectate im Herzen von Kaninchen.

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Protocol

Die hier beschriebenen Experimente wurden von der Ethikkommission der Forschung der Universität Murcia, Spanien, genehmigt und wurden gemäß Richtlinie 2010/63/EG der Europäischen Kommission durchgeführt. Die beschriebenen Schritte wurden unter operativen Standardprotokolle, die nicht ausschließlich für die Zwecke der Dreharbeiten des dazugehörigen Videos zu diesem Papier durchgeführt wurden und wurden Teil des Plans der Arbeit durchgeführt.

1. Vorbereitung der Zellen und Säugetieren Expressionsvektor

Hinweis: Hier beschreiben wir kurz ein Protokoll für die Vorbereitung und Transfektion einer Zelllinie (menschliche embryonale Nieren 293 (HEK-293)); entsprechende Zelle bestimmte Protokolle für die Zelle Art von Interesse sollte jedoch optimierte (z.B.Stammzellen).

  1. Pflegen, HEK-293-Zellen im hohen Glukose Dulbecco modifizierten Adlers Medium (DMEM) mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 1 % Natrium Pyruvat, 2 mM Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt und inkubiert bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 . Sobald Zellen Sub konfluierende, aufgeteilt in einem Verhältnis von 1:3 sind.
  2. Teilung der Zellen durch Absaugen von den Medien, dann waschen einmal mit sterilen Phosphat Kochsalzlösung (PBS gepufferte) zu starten, entfernen Sie überschüssige PBS und dann mit 2,5 mL 0,5 x Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (5 min, 37 ° C) inkubieren.
    1. Fügen Sie ein Volumen von DMEM Medien (ergänzt wie oben beschrieben), die Reaktion zu stoppen, und lösen Sie dann die Zellen durch langsam und sanft nach oben und unten mit einem elektronischen Pipette absaugen.
  3. Übertragen Sie anschließend die Zellsuspension auf einen geeigneten Behälter (z.B. konische Zentrifugenröhrchen 15-50 mL). In einem Schwung Eimer (100 X g) zentrifugieren, überstand verwerfen und das Pellet zweimal mit sterilen PBS waschen.
  4. Das Pellet in frischen DMEM Medien und Samen nach einer entsprechenden Zelldichte (z.B. 1 x 106 Zellen in einem 75 cm2 Kolben) in frischem Kulturflaschen oder große Gerichte nach lokalen Laborpraxis aufzuwirbeln.
    1. Ersetzen Sie vorhandene Medien mit neuen Medien alle 2 Tage.
      Hinweis: Dem Expressionsvektor wurde von pIRES1hyg abgeleitet und entsprechend den Anweisungen des Herstellers als zuvor beschriebenen21verwendet. p(EGFP) IRES1hyg wurde durch subcloning EGFP cDNA als eine BamHI + NotI aus pEGFP-N1 in der BamHI einfügen + NotI pIRES1hyg21 verdautgeneriert.
  5. 1 Tag vor Transfection Zellen bei einer Dichte von 0,5 x 105 Zellen/cm2 in 12 oder 24-Well Gewebekultur Platten Samen HEK-293.
  6. Am Tag der Transfektion bereiten Sie DNA-Lipid Transfection Reagens komplexe in separate 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (1 Röhre/Na).
    1. Starten Sie durch Zugabe von 250 µL reduzierte Serum Medium in jedem Röhrchen, und fügen Sie dann 4 µg DNA (mischen).
    2. Anschließend 250 µL aus hinzufügen eine vorbereitete Mischung aus 10 µL Lipid Transfection Reagens und 250 µL reduzierte Serum Medium, jede Röhre (wieder mischen).
    3. Schließlich gehen Transfektionen, indem HEK-293-Zellen mit DNA-Lipid Transfection Reagens komplexe für 4 h Inkubation und dann ersetzen mit DMEM Medium ergänzt wie beschrieben (Schritt 1.1), und ein weiteres 48 h. Perform Medikament Auswahl an stabilen inkubieren Transfectants mit 100 µg/mL Hygromycin B.
  7. HEK-293-Zellen mit Trypsin wie beschrieben (Schritt 1.2) zu lösen. Nach dem Waschen der Zellen in sterilen PBS, Aufschwemmen Sie in ein geeignetes Fahrzeug (z.B.10 % V/V InI mit PBS-Puffer), um eine endgültige Zellkonzentration von 5 x 106/mL zu erreichen.

2. Vorbereitung des Kaninchens

Hinweis: Die Positionierung der Kaninchen und der Wandler für IMI ist nicht optimal, Morphologie und Funktion des Herzens des Tieres zu bewerten. Daher ist es ratsam, eine komplette echokardiographische Untersuchung20 vor der IMI (siehe unten) und zu späteren Zeitpunkten durchzuführen, wie durch das experimentelle Design definiert. Dies soll die Grundlinie anatomischen und funktionellen Eigenschaften des Herzens in das Tier zu bewerten, die eine Injektion erhalten, und auch die Auswirkungen des IMI in der Funktion des Herzens zu bewerten.

  1. Führen Sie diese Untersuchung in einer verblindeten Mode und nach den Leitlinien des Ausschusses für Echokardiographie des American College of Veterinary Internal Medicine und der amerikanischen Gesellschaft der Echokardiographie/europäischer Verband für Cardiovascular Imaging 22 , 23 , 24.
  2. Erhalten Sie eine gleichzeitige 1-Blei Elektrokardiogramm (EKG) Verfolgung während der gesamten echokardiographischen Studie.
  3. Die Kaninchen mit Ketamin zu betäuben 10 mg/kg, kombiniert mit Medetomidine 200 µg/kg, intramuskuläre Injektion (i.m.).
  4. Überprüfen Sie die Höhe der Anästhesie nach 10-20 min nach Verabreichung der Anästhesie.
  5. Mit einem Haarschneider Haare der Brust weit entfernen (z. B.unterhalb des Halses in die Sub xiphoid Region) (Abbildung 1A).
  6. Weitere Regionen von 1 – 2 cm2 in die Innenseite der rechten Vorderbein (Mediocubital Region) und beide Hinterbeine (Mediotibial Region) zu rasieren (Abbildung 1 b).
  7. Legen Sie selbstklebende EKG-Elektroden auf die rasierten Regionen der Gliedmaßen, den Herzrhythmus synchron während des Verfahrens (Abbildung 1) zu überwachen.
  8. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf eine Wärmedecke Dekubitus mit den Gliedmaßen ausgestreckt mit chirurgischen Klebeband befestigt, die Tabelle (Abbildung 1).
    1. Stellen Sie sicher, dass die Ohren nach hinten gebeugt werden hinter dem Kopf/Rücken des Kaninchens und an einer Stelle, die niedriger ist als die Vorderbeine, da dies hilft, um korrekte Positionierung des Thorax des Tieres während des Verfahrens zu erhalten.
  9. Lassen Sie das Tier spontan zu atmen, während Sauerstoff durch Gesichtsmaske während des gesamten Verfahrens (100 %, 2-3 L/min) zu verwalten.

Figure 1
Abbildung 1: Vorbereitung des Kaninchens auf IMI. (A) Clip Haar vom Thorax; (B) Clip Haar von Gliedmaßen; (C) Elektroden anbringen und positionieren Sie die Kaninchen mit Beine ausgestreckt auf eine Wärmedecke. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte IMI-Technik bei Kaninchen

  1. Reinigen und desinfizieren der Haut des Thorax mit einer Chlorhexidin-basierten Lösung.
    1. Verwenden Sie eine aseptische Technik während des gesamten Verfahrens nach aktuellen best Practice.
    2. Wann immer möglich, und wenn möglich, führen Sie eine vollständig steril Verfahren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die Verwendung von sterilem Material wie Kleider, Handschuhe, chirurgische Wunde drapiert, sterilem Verbandsmaterial für die Tabelle, sowie ein steriler Ultraschall Wandler-Abdeckung und steril Ultraschallgel. Dies wird auf ein Minimum reduzieren das Risiko der Einschleppung von Krankheitserregern zum Empfangen von IMI Tier und ist gängige Praxis in der klinischen Einstellung (z.B., während Herzpunktion).
      Hinweis: Es wird empfohlen, immer im Einklang mit lokalen und nationalen Vorschriften von Tierversuchen für die lokalen Institution und Land der Praxis fortzufahren.
  2. Gelten Sie Ultraschallgel Übertragung, auf der Brust und/oder auf den Schallkopf und mit der Wandler Kordel um den Experimentator Hals, führen Sie einen schnellen Fenster Scan des Herzens, des Tieres, die oft hilfreich, Anatomie zu visualisieren und für das IMI zu planen ist.
  3. Legen Sie den Schallkopf manuell an der 4th-6th Intercostalneuralgie Raum, 2-3 cm von der Linie rechts Parasternal mit einem Einfallswinkel von ~ 90 ° in Bezug auf der rechten Seite der Brustwand (Abbildung 2A).
  4. Ändern Sie die Position des Wandlers im Verhältnis zu den Intercostalneuralgie Raum sowie seine Anteroposterior und dorsoventral Winkel um einen modifizierten kurze Achse Blick auf die Ebene der papillären Muskeln zu optimieren. In dieser Ansicht zu identifizieren, den rechten Ventrikel (RV), linken Ventrikel (LV), interventricular Septum (IVS), hinteren Wand (PW), sowie anterolateralen (AL) und Posteromedial (PM) papilläre Muskeln (Abbildung 2 b).
    1. Haben Sie ein weites Sichtfeld durch die Tiefe über das entsprechende Steuerelement auf dem System (z. B., Taste, Zifferblatt) deutlich zu erhöhen.
    2. Besonderes Augenmerk auf ein symmetrisches Bild in dieser Sicht als auch die entsprechende Differenzierung der endokardialen und epicardial Konturen zu erhalten, und passen Sie ggf. durch Bild-Optimierung-Steuerelemente (z.B.Gewinn).
  5. Sobald die optimale echokardiographische Ansicht (Abb. 2 b) vorliegt, halten Sie diese Stellung während der Rest des Verfahrens, während ein zweite Operator das IMI (siehe unten führt).
    1. Während Sie den Schallkopf zu halten, zu vermeiden, verschweigen die Wandler-Orientierung-Marke, die immer nach vorn, gegenüberstehen sollte damit die Ausrichtung mit der Nadel in den nachfolgenden Schritten (Abb. 2A, C).
  6. Positionieren Sie mit einer 24-G-Nadel befestigt eine 1 mL Spritze die Nadel in der Nähe der Haut des linken Hemithorax symmetrischen Spiegelung in Bezug auf den Schallkopf. Dann manuell ausrichten die Nadel mit dem Schallkopf Ausrichtung Zeichen in einem Winkel von ~ 90° (Abbildung 2), und die Nadel durch die Haut und in die Brusthöhle langsam vorwärts.
    Hinweis: Die perkutane Nadel Einfügung in dieser Position und Ausrichtung ermöglicht die Visualisierung der Nadel in der Ebene des Ultraschallstrahls (Abbildung 2D, E), so dass Echtzeit-Überwachung und, falls notwendig, Anpassung der die Position der Nadel im Verhältnis zu der Zielregion des Myokard (Abbildung 2 G, H).
  7. Mit der Spitze am Zielort, langsam liefern die Injectate (bis zu 0,25 mL Pro Injektionsstelle) innerhalb von 10-30 s (Abb. 2E), während langsam und vorsichtig zurückziehen der Nadelöhrs beim Einspritzen, erhöhen Sie den Umfang des Myokard behandelt.
    1. InI verwenden 10 % (V/V) verdünnt mit PBS-Puffer für Standardisierung der Technik und als eine in Situ -Tracer während Kompetenz, sowie Erwerb von bestätigen erfolgreiche Angriffe auf allen vier IMI-Standorten im Myokard durch grobe Pathologie und Histopathologie (siehe Vertreter-Ergebnisse). Kompetenz erreicht, konnte InI durch eine geeignete kommerzielle Ultraschall-Kontrastmittel ersetzt werden, falls gewünscht.
      Hinweis: Lieferung von 10 % (V/V) InI in PBS mit oder ohne Zellen in das Myokard Ergebnisse in Transmural Hyperechogenicity (d.h. Echo helles Aussehen) an die Ziel-Site der Einspritzung (Abbildung 2E, F) verdünnt. Vorübergehende Verlangsamung oder Beschleunigung der Herzfrequenz, vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen (z.B., isoliert, Couplets und Triplets) zugeordnet werden häufig beobachtet, sogar vom ersten Kontakt der Nadel mit der Epicardium sowie während bzw. kurz nach IMI. Allerdings keine lebensbedrohlichen Arrhythmien werden entwickelt und akute Nebenwirkungen sind selten beobachtet mit bis zu 0,25 mL (1,25 x 106 Zellen) Injectate Pro Injektionsstelle IMI (siehe Vertreter Ergebnisse und Diskussion).
  8. Führen Sie subtile Veränderungen in der Einfallswinkel der Nadel wie nötig Injektionen von 0,25 mL für jede der vier Ziel-IMI-Sites abgeschlossen (drei im linken ventricular freien Wand (LVFW) und in der IVS).
  9. Bewerten Sie nach Abschluss der perkutanen Kontrast Echokardiographie-geführte IMI Verfahren Herzrhythmusstörungen (z. B.durch serielle ECG Spur bzw. 24 h Holter ECG) zu, und führen Sie serielle Fenster echokardiographische Scans um zu überprüfen, das Fehlen von Komplikationen, bis das Tier vollständig aus Anästhesie, und übertragen Sie nur dann zu einem Lichtzyklus Raum gewonnen wird.
    1. Hier verwenden wir 24 h Holter ECG, um die Auswirkungen von IMI mit InI auf Herzrhythmus für 24 h zu überwachen. Dazu verglichen wir eine Gruppe von 6 Kaninchen mit normalen Phänotyp (normale Gruppe) und eine Gruppe von 6 Kaninchen, die intravenösen Gabe von Doxorubicin (eine kardiotoxische Anthrazyklin Droge, häufig verwendet für die Behandlung von Krebs; erhalten DOX-Gruppe) in einer Dosis von 2 mg/kg/Woche für 8 Wochen und dann beide Kohorten erhielt IMI mit InI.

Figure 2
Abbildung 2 . Perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektion bei Kaninchen. (A) Platzierung der Wandler in der rechten Hemithorax in einem Winkel von ~ 90 °. (B) repräsentatives Bild einer Parasternal kurze Achse Ansicht (PSSX) des Herzens auf der Ebene der papillären Muskeln bei Kaninchen. (C) Ausrichtung der Nadel in einem Winkel von ~ 90 ° im Verhältnis zu den Wandler Orientierung Mark. (D) Lage der Nadel an der Ziel-Site in einer PSSX Ansicht des Herzens (beachten Sie, dass die Nadel leicht in der Ebene des Ultraschallstrahls visualisiert wird). (E und F) Demonstration der Hyperechogenicity an die Ziel-Site nach Intramyocardial Einspritzung mit Tusche (Pfeilspitzen markieren die Transmural-Hyperechogenicity). (G) zufällige Position der Nadel in der LV-Kammer (Pfeilspitzen markieren die Nadel-Welle). (H) Neupositionierung der Nadel, um die LV freie Wand (Pfeilspitzen markieren die Nadel-Welle). RV = rechte Herzkammer; LV = linke Herzkammer; IVS = interventricular Septum; PW = hinteren Wand; AL = anterolateralen papillären Muskel; PM = Posteromedial papillären Muskel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

4. buchen Sie IMI-Analysen

  1. Führen Sie histopathologische Analyse von Gewebeproben Herz von Kaninchen.
    1. Beheben Sie Gewebe für 24 h in 10 % Formaldehyd, gefolgt von Dehydrierung mit zunehmendem Ethanol-Konzentrationen wie folgt:
      • 1 X 70 % (60 min)
      • 1 X in 95 % ethanol/5% Methanol (60 min)
      • 1 X 100 % (60 min)
      • 1 X 100 % (90 min)
      • 1 X 100 % (120 min)
      Hinweis: Alle oben genannten Inkubationen sind bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Dann zweimal mit 100 % Xylol (1 h, RT) ersetzen, und schliesslich in Paraffin in zwei Schritten (60 min, 58 ° C)25einbetten.
    2. Durchführen Sie 4-5 µm Gewebeschnitte mit einem Mikrotom25. Montieren Sie Abschnitte auf Folien.
    3. Führen Sie die Färbung mit Hämatoxylin-Eosin und Masson trichrome Methoden25,26,27.
  2. Führen Sie in Gewebeschnitten von transplantierten Herzen Immunohistochemistry um EGFP(+) HEK-293-Zellen (z. B.mit der Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Methode), kurz zu erkennen:
    1. De-Wachs 4-5 µm Dicke Herz Abschnitte in 100 % Xylol (10 min bei RT). Rehydrieren Sie Gewebe durch Waschen mit abnehmender Ethanol Konzentration Lösungen (2 X 100 % (2 min); 2 X 95 % (2 min); 1 X 70 % (2 min); 1 X 50 % (2 min); 1 X 30 % (2 min); 1 X ddH2O (2 min)) bei RT
    2. Durchführen Sie Hemmung der endogenen Peroxidase durch Abdecken der Abschnitte mit 100 µL 3 % H2O2 verdünnt in Methanol (vorbereitet mit 5 mL 30 %-Stammlösung von H2O2und Hinzufügen von Methanol auf ein Gesamtvolumen von 50 mL) ( 30 min, RT inkubieren), und dann waschen durch Untertauchen mit Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS; pH 7.6).
    3. Führen Sie Antigen Demaskierung durch enzymatische Behandlung durch Abdecken der Abschnitte mit 100 µL 0.1 % Pronase (vorbereitet mit 0,01 g Pronase verdünnt in 10 mL TBS) (12 min, RT inkubieren), dann waschen Sie mit TBS (5 min, RT).
    4. Brüten in blocking-Lösung (normalem Ziegenserum bei 10 % in TBS) mit 100 µL pro Folie (30 min, RT), und waschen Sie mit TBS (5 min, RT).
    5. Inkubieren mit Huhn Anti-grün fluoreszierendes Protein (GFP) als primären Antikörper (1: 500 in TBS) (1 h, 30 ° C), und waschen Sie mit TBS (5 min, RT).
    6. Inkubieren mit Sekundärantikörper biotinylierte Ziege-Anti-Huhn IgG (1: 250 in TBS) (1 h, 30 ° C), und dann waschen mit TBS (5 min, RT).
    7. Inkubieren mit Avidin-Biotin-Komplex (20 min, 30 ° C), und dann beschriften mit 3,30-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Schließlich durch Waschen in steigenden Ethanol-Konzentrationen (1 X 30 % (2 min); 1 X 50 % (2 min); 1 X 70 % (2 min); 2 X 95 % (2 min); 2 X 100 % (2 min)) bei RT, Abschnitte der Gegenfärbung mit Hämatoxylin-Eosin Methode25Entwässern Sie, und befestigen Sie dann die Abdeckung Folien. Enthalten Sie positiv, negativ sowie Isotype Steuerelemente.
      Hinweis: Das kurze Protokoll beschriebenen dient nicht für allgemeine Immunohistochemistry Gebrauch; Optimierung für das Gewebe der Zinsen und Bedingungen ist notwendig.

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Representative Results

Perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte IMI mit InI:

Mit dem Protokoll beschriebenen, und sobald die optimale Positionierung der Spitze der Nadel durch Echokardiographie und die Injektion initiiert bestätigt wurde, Transmural Hyperechogenicity bei der Lieferung von InI beobachtet wurde (10 % V/V mit PBS-Puffer) (Abb. 2E) , auch so kurz nach der IMI in der Zielregion (Abb. 2F). Bei IMI unmittelbar durch Euthanasie folgte und das Herz entfernt waren Ablagerungen von InI gut sichtbar auf externe Untersuchung des Herzens (Abb. 3A). Darüber hinaus zeigte Herz Gewebeschnitte, z.B.kurze Achse Abschnitt auf der Ebene der papillären Muskeln (Abb. 3 b), Transmural Ablagerungen von InI Farbstoff an der Injektionsstelle, so zeigen die erfolgreiche und effektive Lieferung Injectate in das Myokard mit dieser Technik. Der Hinweis die Transmural Hyperechogenicity in Vivo während IMI (Abbildung 2E, F), korreliert gut mit Transmural Ablagerungen ini in Ex Vivo Exemplare (Abbildung 3A, B) beobachtet. Das deutlich, dass InI dual Eigenschaften in der Einstellung des IMI hat: als eine in Vivo Ultraschall Kontrastmittel sowie eine ex-Situ Vivoin Tracer. Diese beiden Eigenschaften machen InI sehr vielseitig und kostengünstig Ultraschall Kontrastmittel, besonders für das Training schon beim Erwerb der Kompetenz in dieser Technik. So helfen die echogenen Eigenschaften der InI zu IMI z.B.überwachen, bestimmen erfolgreiche IMI gegen versehentliche Intra-Kammer oder Perikardialraum Injektion, und, wenn nötig, angesichts der Echtzeit-imaging-Funktionen des Ultraschalls, machen Korrekturen der Nadel verfolgen Sie in Echtzeit (Abbildung 2, H). Auf der anderen Seite sind die in Situ Tracing Fähigkeiten der InI von Wert für die Injectate in ex Vivo Exemplare von Myokard Ziel zu finden.

Perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte IMI mit InI und EGFP(+) HEK-293-Zellen:

Vor IMI bestätigte erfolgreiche Transfektion von EGFP(+) HEK-293-Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie in Vitro Kulturbedingungen (Abbildung 3). Die erfolgreiche Durchführung der EGFP(+) HEK-293-Zellen in das Myokard zeigte sich durch immunhistochemische Analyse der Herzen Gewebeschnitte wo InI Ablagerungen beobachtet wurden. So verwenden die Avidin-Biotin-Komplex-Methode (siehe Punkt 4.2), reichliche EGFP(+) HEK-293-Zellen wurden innerhalb der Herzmuskel, durchsetzt mit InI Einlagen (Abbildung 3D) identifiziert. Ablagerungen von InI wurden noch 24 h nach IMI in myokardialen Gewebeproben von Kaninchen beobachtet, die InI in Kombination mit EGFP(+) HEK-293-Zellen (Abbildung 3E) oder InI allein (Abbildung 3F) erhalten. Der Hinweis beobachtet eine akute entzündliche Reaktion zu diesem Zeitpunkt mit einer vorherrschenden Neutrophile Infiltrat in Proben von Tieren empfangen EGFP(+) HEK-293-Zellen (Abbildung 3E), akuten zellulären Abstoßung hindeutet. Auf der anderen Seite wurden die Makrophagen in Tiere erhalten InI allein (Abbildung 3F) beobachtet.

Figure 3
Abbildung 3 . In situ makroskopischen und histopathologische Beurteilung und Überwachung von Injectate. (A) Beweis für das Vorhandensein von Injectate auf externe Prüfung von einem ausgeschnittenen Herzen nach IMI mit InI (Pfeilspitzen markieren die Standorte der Injektion). (B) Demonstration der Transmural Verteilung der Injectate nach IMI mit InI in einen Querschnitt des Herzens auf der Ebene der papillären Muskeln (blaue Pfeilspitzen markieren die Transmural InI Kaution; weißer Pfeil markiert eine sichtbare Ablagerung von InI in der IVS). (C) Autofluoreszenz in Vitro EGFP(+) HEK-293-Zellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie. (DF) Histopathologische Analyse der injizierten Websites. EGFP(+) Zellen sind sichtlich durchsetzt mit InI Einlagen innerhalb der Herzmuskel um 0 Uhr (D) und 24 h (E) nach IMI (blaue Pfeilspitzen EGFP(+) Zellen zu markieren, rote Pfeile markieren die Anwesenheit der Neutrophilen). Ablagerungen von InI durchsetzt im Myokard bei 24 h (F) nach IMI mit InI allein (blaue Pfeile markieren die Anwesenheit von Makrophagen). RV = rechte Herzkammer; LV = linke Herzkammer; IVS = interventricular Septum; IMI = Intramyocardial Einspritzung; InI = Tusche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Über 60 perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte IMI Verfahren bisher durchgeführt wurde, glauben wir, dass mit viel Liebe zum Detail und guter Umgang mit Tieren und Sorgfalt, das Verfahren ist im Allgemeinen gut vertragen, und akute Komplikationen sehr selten sind und in der Regel mild. In der Regel bei Tieren, die unterziehen, IMI, die häufigste Beobachtung während und kurz nach die Prozedur vorübergehende Beschleunigung oder Verlangsamung der Herzfrequenz, ist im Zusammenhang mit isolierten vorzeitige ventrikuläre komplexe (PVC) (Abbildung 4A). So 24 h Holter ECG Überwachung von Tieren, die InI allein über das IMI, erhielt ergab, dass die häufigste Arrhythmie erkannt (Gesamtzahl der Episoden innerhalb von 24 h) PVC, isoliert, obwohl eine höhere Anzahl von Episoden bei Tieren festgestellt wurden, die waren vorher behandelt mit DOX für 8 Wochen (Abb. 5A). PVC in Couplets und Triplets erscheinen weniger häufig (Abbildung 4 b, C und Abbildung 5 b, C), auch wenn Drillinge sind deutlich weniger häufig im DOX behandelt als bei unbehandelten normalen Kaninchen (Abbildung 5). Auf der anderen Seite nicht nachhaltig ventrikuläre Tachykardie (NSVT) wurde häufiger bei normalen Tieren beobachtet (Abbildung 4 und Abbildung 5). Deutlich, während die mittlere Herzfrequenz nicht DOX und normale Gruppen unterschiedlich war nach Erhalt IMI mit InI allein (Abb. 5E), die Standardabweichung der normale R-R Intervall (SDNN), wurde deutlich reduziert (< 100 ms) in der Gruppe (DOX Abbildung 5F). Die SDNN ist nicht-Linear Measure Herz Gesundheitszustand, und daher dieses Ergebnis zeigt, dass die DOX-Gruppe verfügt über globale Veränderungen in den kardialen physiologischen Status.

Figure 4
Abbildung 4. Ventrikuläre Arrhythmien beobachtet während 24 h Holter Überwachung bei Kaninchen, die IMI mit InI erhalten. Screenshots von Holter-EKG Tachograms bezogen werden die gezeigten Bilder auf dem Bildschirm angezeigt, während der offline-Analyse und repräsentative Beispiele für die häufigsten Arten von Herzrhythmusstörungen während 24 h Überwachung gefunden zu veranschaulichen. (A) PVC isoliert. (B) PVC in den Couplets. (C) PVC in Triolen. (D) NSVT. PVC = vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen; NSVT = ventrikuläre Tachykardie nicht aufrecht erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . Arrhythmischen Ereignisse erkannt durch 24 h Holter ECG Überwachung bei Kaninchen nach IMI mit InI. Gesamtzahl der isolierte PVC (A), PVC in den Couplets (B), PVC in Triolen, (C) und (D), NSVT bei unbehandelten Kaninchen (Normal + IMI) versus Doxorubicin behandelt (3 mg/kg/Woche für 6 Wochen) Kaninchen (DOX + IMI), nach IMI mit InI. Meine Herzfrequenz (E) und SDNN (F), bei Kaninchen von IMI und DOX, Normal + IMI gruppiert nach IMI mit InI. Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt * zeigt p < 0,05; und # zeigt p < 0,01, vergleicht man Normal + IMI gegen DOX + IMI Gruppen von t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Das primäre Ziel war es, eine minimal-invasive Technik zu entwickeln, die für die Lieferung von Stammzellen in das Myokard Kaninchen (eine groß dimensionierte präklinischen Tiermodell)17,18, verwendet werden könnten, während die Verwendung von nutzen eine relativ kostengünstig imaging-System leicht zugänglich in vielen klinischen und Forschungszentren. Hier zeigen wir, dass mit einem klinischen Echokardiographie-System und unterstützt durch InI, ein weithin verfügbar-Agent mit in Situ Tracing Fähigkeiten und echogenen Eigenschaften, erfolgreiche perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte IMI ist sehr effektiv bei der Bereitstellung von Injectate für Zielregionen des Kaninchens Herz. Soweit wir wissen, ist dies die erste Beschreibung einer perkutanen Kontrast Echokardiographie-geführte IMI und Zelle Lieferung in einem großen Tier Modell wie Kaninchen18,19. InI für in Situ Lokalisierung von Injectate in Geweben7,28bereits in Studien verwendet wurde, ist unseres Wissens die erste Beschreibung der dual Eigenschaften dieser Mittel als in vivo Ultraschall-Kontrastmittel und als eine in Situ -Tracer Injectate ex Vivo. In der Tat wurden komplexe Mischungen aus Kontrastmittel und in Situ aufspüren Stoffe zuvor in murinen Studien, die darauf abzielen, Bereitstellung von Injectates in das Myokard-29beschrieben. Angesichts der echogenen Eigenschaften der InI und seine Fähigkeiten in Situ nachzeichnen könnte diese Substanz sehr nützlich beim Kompetenzerwerb jedoch während einer Ausbildung mit dieser Technik.

Bestätigung der Lieferung des Injectate mit beiden InI sowie als EGFP(+) HEK-293-Zellen mit Immunohistochemistry demonstriert die Anwendbarkeit dieser Technik zur präklinischen Forschung zur Stammzell-Therapie. Ein IMI InI in Verbindung mit EGFP(+) HEK-293 ergab eine akute entzündliche Reaktion mit einer vorherrschenden Neutrophile Infiltrat schlägt eine Reaktion des akuten zellulären Abstoßung (innerhalb von 24 h) xenogene Zellen. Diese Antwort ist wohl nicht verwunderlich bei einem immunkompetenten Tier. Auf der anderen Seite löste ein IMI mit InI allein auch eine akute entzündliche Reaktion (innerhalb von 24 h) in den behandelten Herzmuskelgewebe, der eine vorherrschende Makrophagen Infiltrat ausgestellt. Dies ist im Einklang mit der Beobachtung einer akuten Entzündung in früheren Studien nach IMI unter direktem Blick in einen offenen Brustkorb Verfahren4,30,31,32,33beschrieben. Akute Entzündung auch nach Einspritzung von normalen Kochsalzlösung oder PBS Lösungen in das Myokard34,35, und sogar in der Gastrocnemius Muskeln der Ratte36beobachtet worden, und daher wurde diese Antwort zurückzuführen auf direkte Gewebeverletzungen statt auf die Injectate schlechthin. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 in der Tat, der internationalen Gesellschaft für Herz-Kreislauf-translationale Forschung das gemeinsame Auftreten von Entzündungen in der Umgebung von IMI erkennt, aber es keinen Konsens darüber, ob oder nicht gibt Maßnahmen zur diesen Prozess während der Peri-prozedurale Zeit sind nützlich (z.B.intravenöse (IV) Kortikosteroide)37. Obwohl Entzündung in dieser Studie auch zugeschrieben werden, könnte um Gewebeschäden zu lenken, zufolge die Ergebnisse auch InI wie ein Fremdkörper in diesem Prozess, legte eine Reihe von Makrophagen auch eine Rolle spielen muss, scheinen InI (Abbildung 3F) Erregerelimination werden. Eine gründliche Analyse der funktionellen Auswirkungen diese akute Entzündung sekundär zu IMI im Herzen, oder unabhängig davon, ob diese über Administration von prophylaktischen Medikamente wie Kortikosteroide gelindert werden können sprengt den Rahmen dieser Handschrift. Dennoch, perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte IMI zu vier Zielregionen des Myokard, mit einem Volumen von Injectate von bis zu 0,25 mL (1,25 x 106 Zellen) pro IMI Site wurde bei Kaninchen sehr gut vertragen.

Mit mehr als 60 Verfahren durchgeführt, um Datum und nach Kompetenz erreicht wurde war die Sterblichkeit gegenüber dem Verfahren sehr gering. Zum Beispiel trat keine Todesfälle in den zwei Kohorten im Schritt 3,9 (Normal und DOX Gruppen) nach IMI beschrieben. In der Tat haben wir bisher nach 67 IMI-Verfahren im Rahmen eines laufenden Forschungsprogramms durchgeführt, nur zwei Todesfälle, die direkt im Zusammenhang mit dem Verfahren (2,9 % Mortalität) gehabt. In einem davon, das Vorhandensein einer Hemopericardium zeigte sich in der post-mortem -Untersuchung, während der andere neurologische Symptome, Einklang mit akuter zerebraler Ischämie sekundär zu einem Cardioembolic Event, erfordern somit entwickelt eine humane Endpunkt. Diese Sterblichkeit (2,9 %) ist deutlich geringer als die von Lu Et Al. berichtet (11 %)8 und Mu Et Al. (27 %)38, bei Kaninchen, die IMI unter direkter Sicht in einem offenen Brustkorb Verfahren erhalten. So betrachten wir das Verfahren beschrieben, die in der aktuellen Studie um sicher zu sein, und wir sind mit dieser Technik in laufenden Studien auszuwertende Stammzell-Therapie in einem Kaninchen-Modell der AICM mit vielversprechenden Ergebnisse39,40.

Es gibt mehrere kritische Punkte für eine erfolgreiche perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte IMI. Zunächst sicherstellen Sie, dass ein Parasternal kurze Achse Blick auf die Ebene der papillären Muskeln mit klare Abgrenzung der endokardialen und epicardial Konturen gewonnen wird. Als nächstes sicherstellen Sie, dass die Nadelspitze in das Sichtfeld jederzeit sobald dies eingetreten ist, der Brusthöhle und das Myokard, versehentliche Zustellung in den Herzbeutel Raum oder LV Kammer zu verhindern. Stellen Sie sicher, auf ein Minimum beschränken die Anzahl der Durchgänge durch die Brusthöhle und in den Herzbeutel und Myokard, da dies die Wahrscheinlichkeit eines lokalen Trauma (z.B. Platzwunde) diese Strukturen und die damit verbundene Gefahr der erhöhen könnte, Hemopericardium. Für diese Beibehaltung die Nadel in der Brusthöhle (und für einige Ziel-Sites zum selben Zeitpunkt des Eintrags im viszeralen Perikardium (z.B. Seitenwand)) sorgfältig subtile Veränderungen in der Einfallswinkel der Nadel durchführen. Schließlich verwenden Sie immer eine Nadel, die eine klare und einfache Passage durch die Haut in die Brusthöhle, wodurch stumpfen Nadel Fasen Eingabe Myokard und erhebliche Schäden verursachen.

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht nicht nur zuverlässige und erfolgreiche Lieferung von Injectate an mehrere Ziel-Sites innerhalb der Herzmuskel, aber es erlaubt auch Korrektur der Nadel-Bahn in Echtzeit verhindert versehentliche Intrachamber Lieferung) Abbildung 2, H). Während geschlossen Brust IMI Verfahren wurden bisher bei Mäusen beschrieben, gibt es einige Einschränkungen, die dieses kleine Tiermodell. Diese Einschränkungen gehören die Anzahl der Zielregionen des Myokard Therapie zugänglich, und die niedrige Lautstärke/Anzahl der Zellen, die pro Ziel Seite29,41injiziert werden kann. Darüber hinaus genaue Lieferung der Injectate ist oft ein Anliegen, mit einer Erfolgsquote von fast 60 %-70 %42, und daher ist die Verwendung von weniger zugänglichen Hochfrequenz-Ultraschall-Systeme in der Regel erforderlich29,41, 42. Diese Systeme sind ausgestattet mit linear-Array-Sensoren, die auch bildgebende Einschränkungen (z. B.Nachhall ist ein häufiges Artefakt)14. Eine weitere Einschränkung der kleinen Nager-Modelle wie Mäuse und Ratten, ist ihre innere Differenzen in Ca+ 2 Transportsystem und zelluläre Elektrophysiologie, die Mensch und groß dimensionierte Tiermodellen wie Hunde, Schweine und Kaninchen anders 15,16,43. Alle diese Einschränkungen erstellen oft Schwierigkeiten bei der Umsetzung der Erkenntnisse in diesen Modellen in der Klinik ohne vorherige Bestätigung in einer großen Tiermodell.

Sorgfältige Überwachung des Tieres in der Peri-Verfahren ist obligatorisch nach modernen Richtlinien für die Pflege von Labortieren. Wie hier dargestellt, könnte dies durch serielle Echokardiographie Fenster Scans und ECG Umzeichnungen, zumindest bis das Tier aus der Narkose erwacht ist. Die akuten Wirkungen des IMI auf Herzrhythmus auch durch 24 h Holter ECG überwacht werden können und unsere gängige Praxis ist. Der Hinweis, der häufigsten Arrhythmien wurden isoliert PVC, die relativ harmlos in der Natur sind, und die waren häufiger bei Tieren, die mit Doxorubicin vor IMI mit InI behandelt wurden (siehe Abbildung 4A und Abb. 5A). Andere Herzrhythmusstörungen, die relativ seltener waren enthalten: PVC in den Couplets; PVC in Triolen; sowie NSVT (siehe Abbildung 4 bD und Abbildung 5 bD). Allerdings wurden keine Leben bedrohlichen Arrhythmien wie anhaltende ventrikuläre Tachykardie festgestellt. Der Hinweis fanden wir auch, dass einige kardiotoxische Manifestationen in der DOX-Gruppe durch Holter-EKG Überwachung, mit Zeitvariablen Frequenzbereich der Herzfrequenz-Variabilität (HRV) wie SDNN nachgewiesen werden konnte. So wurde eine reduzierte SDNN (Abb. 5E, F), nicht-Linear Measure Herz Gesundheitszustand in der DOX-Gruppe im Vergleich zu den Normal-Gruppe beobachtet. Dies ist der erste Bericht über reduzierte HRV, wie durch eine reduzierte SDNN, im Rahmen eines Kaninchens Modell der AICM, die im Einklang mit der Beobachtung, die SDNN reduziert ist als unabhängige aussagekräftiger Herztod bei Patienten mit HFrEF44 ,45,46. Die Veränderungen der SDNN in der DOX-Gruppe beziehen sich wahrscheinlich nicht auf die IMI-Verfahren selbst; Bestätigung dieser Ergebnisse bei Kaninchen Doxorubicin, sowie normale Tiere, die nicht IMI, erhalten ist jedoch erforderlich. Ob reduzierte SDNN in HFrEF auch sein könnte verbessert und daher als ein Surrogat Maß des Nutzens der Therapie mit Stammzellen basiert, bleibt ausgewertet werden, und werden im Mittelpunkt der künftigen Forschung.

Mehrere Routen von Lieferung von Zellen in das Herz, einschließlich intravenös, intracoronary, und Intramyocardial Lieferung; erforscht worden, die Intramyocardial Route wie hier verwendet hat jedoch immer wieder gezeigt das größte Maß an Zelle Retention Rate1,2,3,4,5,37. Wir Zelle Rückhalterate hier vorgelegten Studien nicht beurteilen, wie die verwendete Methodik nicht ist robust und spezifisch genug, um quantitate dieser in Vivo und ex Vivo, das ist eine Einschränkung dieser Studie. Stattdessen verwendet wir EGFP(+) HEK-293-Zellen deren phänotypischen Eigenschaften uns erlaubt, das Vorhandensein von diesen Zellen innerhalb der Herzmuskel leicht zu unterscheiden, was darauf hindeutet, erfolgreiche Intramyocardial Lieferung. Allerdings war das Hauptziel, eine minimal-invasive Technik zu entwickeln, wobei wir IMI und Zelle Lieferung in das Myokard eines großen Größe, präklinischen Modell der nicht-ischämische Kardiomyopathie führen könnte. Wie in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigt hat, war dies für das erste Mal durch perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte IMI. Weitere Studien sind notwendig, um die Zelle Rückhalterate sowie mögliche positive Auswirkungen von Stammzellen in das Myokard Verwendung des beschriebenen Verfahrens hierin geliefert zu beurteilen; Diese Studien werden derzeit durchgeführt. Vor kurzem haben wir viel versprechende Ergebnisse in Bezug auf die funktionellen Auswirkungen39,40kommuniziert.

Im Vergleich zu IMI in einem offenen Brustkorb-Verfahren, IMI in einem großen präklinischen Modell als in dieser Studie beschriebenen ist ein perkutaner Kontrast Echokardiographie-geführte deutlich weniger invasiv in der Natur mit schnelle Genesung des Tieres nach dem Eingriff und als oben erwähnt, hat es auch niedrigere Sterblichkeit Rate8,38. Ein weiterer Ansatz zur IMI ist Katheter-basierten IMI, die auch in präklinischen Modellen und mehreren kleinen klinischen Studien getestet wurde (eine Übersicht finden Sie unter Sheng Et Al.) 47. mit diesem Ansatz einen Katheter rückte in den LV-Hohlraum und dann am Ziel-Sites innerhalb des Endokards positioniert. Diese Ziel-Sites sind, dass entweder vor dem Eingriff, z.B.mit Kontrast Kardiale Magnetresonanztomographie (CMR)48, oder während des Verfahrens, z. B.durch elektromechanische endokardialen Mapping (EEM), identifiziert eindeutig tragfähige Myokard vor Injektion49zu unterscheiden. Dieser zweite Ansatz ist weniger invasiv im Vergleich zur Brust IMI unter direkter Sicht zu öffnen, die ein klarer Vorteil ist. Da IHD beim Menschen eine lückenhafte Verteilung hat, hilft EEM auch, direkt die Therapie speziell auf tragfähige Stätten der Herzmuskel, das ist besonders wichtig in der Umgebung des IHD. Ein großer Nachteil ist jedoch die Induktion von ventrikulären Arrhythmien, die ein gemeinsames Merkmal aller IMI Ansätze sind. Andere Nachteile schließen die langwierigen Verfahren Zeit, vorausgesetzt, EEM ist eine höchst anspruchsvolle Technik umfangreiche Ausbildung und eine damit verbundene Risiko einer kardialen Perforation erfordert. Im Gegensatz dazu perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte IMI als in dieser Studie beschriebenen ist technisch weniger anspruchsvoll als Katheter-basierten IMI, und Kompetenz erreicht, kann es sicher innerhalb von 25 Minuten nach der Narkose durchgeführt werden. Ähnlich, da nur ein kurzen Teil der Nadel in das Myokard fortgeschritten ist, gibt es ein geringeres Risiko für kardiale Perforation, obwohl kardiale Platzwunde noch möglich ist.

Zusammenfassend ist die perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte IMI beschriebene Technik in dieser Studie in einem großen Tier-Modell, wie die Kaninchen16,43, sicher, gut verträglich und wirksam bei der Bereitstellung von Injectate in der Herz. Daher stellt es eine vielversprechende Strategie für präklinische Hypothesentests der Auswirkungen der kardialen regenerativen Therapeutika in nicht-ischämische Kardiomyopathie (z.B.AICM), einschließlich, aber nicht beschränkt auf, stammzellbasierte Therapie.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

Die Autoren danken Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz und Manuel Molina für exzellente Unterstützung bei der Sammlung von Daten und Carlos Bueno für die Bereitstellung der EGFP(+) HEK-293-Zellen. Diese Arbeit wurde teilweise durch unterstützt: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spanien (JT) (Anzahl zu gewähren: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de ich + D + I 2008-2011 (keine zu gewähren. RD12/0019/0001) (JMM), kofinanziert mit Mittel aus den Strukturfonds der Europäischen Union (FEDER) (JMM); und der University of Reading, Vereinigtes Königreich (AG, GB) (zentrale Finanzierung). Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HD11 XE Ultrasound System Philips 10670267 Echocardiography system.
S12-4 Philips B01YgG 4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) Parket laboratories Inc N 01-08
Vasovet 24G Braun REF 381212  over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe Braun 9161406V
Imalgene (Ketamine) Merial RN 9767 Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine) Esteve CN 570686.3 Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1 Faber-Castel 16 33 99 India (China) Ink
Holter Syneflash Ela medical SF0003044S 24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor® Ambu (NUMED) VLC-00-S Holter ECG electrodes.
Microtome Leica Biosystems RM2155
Microscope Olimpus CO11
ABC Vector Elite Vector Laboratories PK-6200 Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody Invitrogen A10262 Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody Vector Laboratories BA-9010 Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) DAKO (Agilent) S3000
Fluorescence Microscope Carl Zeiss
MicroImaging
Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG Elamedical Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  Fisher Scientific 11965084
10% fetal calf serum (FCS) Fisher Scientific 11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific 25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Fisher Scientific 31985070
Hygromycin B Calbiochem (MERCK) 400051
Xylene (histological) Fisher Scientific X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) Sigma H1009
Pronase Fisher Scientific 53-702-250KU

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