一种有效的体外转位方法由转录调节的睡眠美容系统封装到一个集成缺陷的慢向量

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

该协议描述了一种方法, 以实现稳定的基因的兴趣进入人类基因组由转录调控的睡美人系统。本文报道了有缺陷的慢载体的合成、人体细胞的体外转导和转细胞的分子检测。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Benati, D., Cocchiarella, F., Recchia, A. An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector. J. Vis. Exp. (131), e56742, doi:10.3791/56742 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

睡美人(SB) 转是一种病毒的集成系统, 具有有效的基因转移和功能基因组学的功效。为优化 SB 转机械, 采用转录调节过动转 (SB100X) 和 T2-based 转。通常, 转和转通过质粒转染而瞬时提供, SB100X 表达由本构子驱动。在这里, 我们描述了一个有效的方法, 将 sb 组件传递给那些对几种物理和化学转染方法有抵抗力的人体细胞, 控制 SB100X 表达, 并通过 "剪切和粘贴", 稳定地整合一个感兴趣的基因 (印度)。机制.自1992年以来, 多动转的表达受到了系统的严格控制, 广泛用于控制基因表达。该基因的兴趣是两侧的反向重复 (IR) 的 T2 转。在 HEK293T 细胞中, 两个部件都被封装在集成缺陷的慢载体上。人类细胞, 无论是细胞系或人类组织的主要细胞, 都是在体外瞬时转与病毒载体。在添加强力霉素 (dox, 四环素模拟) 到培养基中, fine-tuning 的转表达的测量, 并导致长期的基因的兴趣在处理细胞基因组的结合。这种方法是有效的和适用于细胞线 (如, HeLa 细胞) 和原细胞 (如, 人原发角质形成), 从而代表了一个有价值的工具, 基因工程和治疗基因转移。

Introduction

多动 SB100X 转耦合到 T2-based 转已被用于临床前基因治疗应用1,2,3, 基因组修改4,5, 以及诱导多能干细胞 (iPSC) 重新编程6,7。典型地, SB 组分由质粒转染瞬时地提供, 并且一个强的本构子推动转的表示。然而, 尽管改进了新的转染方法, 但两组分系统的交付仍然是许多应用的挑战。因此, 新的交付议定书的发展引起了越来越多的兴趣。除转染方法为质粒8和 mRNA9, 病毒传递的基础上腺病毒10,11, 腺相关病毒 (AAV)12, 病毒性13, gammaretroviral14和慢向量15已在过去提出。值得注意的是, 选择系统必须保证在不集成病毒载体的情况下暂时交付 SB 部件。然而, 由于转的不可控 rehopping 的风险, 转的本构表达引起了安全问题。

因此, SB100X 的转录调控是第一个挑战。通过将原发育的最小巨细胞病毒 (CMV) 启动子替换为单纯疱疹 Virus-1 (HSV-1)16的 Timidine 激酶 (TK) 基因的最小启动子 (-81), 在SB100X cDNA (pTetOTKSB100X)。突变的反转四环素-反 rtTA2s-M217是在强本构子 (甘油促进剂, PGK) 的控制下, 在不同质粒 (pCCL-PGKrtTA2s-M2) 中克隆的。当添加到培养基中时, dox 绑定 rtTA2s-M2 调制器和系的新的启动子复合体或, 从而导致严格调节的 SB100X 表达式的归纳18

第二个主要的挑战是由几种物理和化学方法对人类原细胞的低效转染。为了有效地将转在人类细胞中抗转染, SB100X 和 rtTA2s-M2 表达式磁带被打包成两个集成缺陷慢向量 (IDLVs)19: IDLVTKSB 和 IDLVrtTA2sM2病毒载体瞬时产生作为第三代载体在 HEK293T 细胞20和型的糖蛋白 g 的 Vescicular 口炎病毒 (VSV-g), 它提供了广泛的感染范围。矢量粒子由离心和滴定 HIV-1 塞 p24 免疫。对于传感器细胞系和原细胞, 载体颗粒与凝聚复合, 在 dox 存在或缺失时与靶细胞孵育。用定量 rt-pcr (qRT-pcr)18测定了转细胞中 SB100X 表达的药物依赖性活化。

一旦春节调控的 SB100X 表达被证明, 将印度 (如绿色荧光蛋白, GFP) 转到靶细胞基因组中的分子事件, 由 Bak 和泰尔杰·密盖尔森21清楚地化。在 T2-transposon 国税局 (IDLVT2) 之间复制的一个表达式卡带的第三 IDLV 载体必须在上面提到的构造和包装。最后, 三 IDLV 载体可用于有效地传感器人体细胞 (如, 原发角质形成细胞)在体外, 并在强力霉素18的存在中整合印度。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 质粒受雇

注: 质粒 pCCL-PGKrtTA2S-M2 提供了 Prof. Zappavigna (摩德纳大学和雷焦艾米利亚, 摩德纳, 意大利)。pCMVSB100X 质粒携带的多动转和 pT2/BH 转质粒的编码序列由 z 伊维西 (保罗, 兰, 德国) 和 Prof. z Izvak (最大汗分子医学中心, 柏林,德国)。

  1. 对于大肠杆菌(大肠杆菌) 中的所有克隆, 请遵循选择和限制酶程序的克隆策略或克隆片段的 PCR 扩增.
    注:表 1总结了本协议中使用的所有质粒。提供了每个质粒的描述和参考。

2. 病毒载体生产

注意: 所有的病毒载体都是在生物安全防护罩的 BSL2 中产生的, 根据机构的规章制度。

  1. Dulbecco 氏改良鹰培养基中的培养附着 HEK293T 细胞, 辅以 10% HyClone 血清、100 U/毫升青霉素-链霉素和2毫米谷氨酰胺。
  2. 0天: 准备五15厘米的盘子/病毒制剂和种子5.5x10 在30毫升的培养基中6细胞。
  3. 1天: 转染
    1. 在开始转染前, 准备100毫升的 2x HEPES 缓冲盐水 (HBS):
      氯化钠 (5 米) 5.6 毫升
      HEPES (1 米) 10.0 毫升
      Na2HPO4 (0.5 M) 0.3 mL
      无菌水84.1 毫升
      调整到 pH 值7.1 与 37% HCl。
      注: 2x HBS 可存储在4° c。准确的 pH 值对于高效转染非常重要。最佳 pH 值范围为7.10 到7.12。
    2. 在转染前取出培养基, 加入22.5 毫升/新培养基4小时。
    3. 染 HEK293T 细胞与转移质粒, pMD. Lg/pRRE D64VInt 包装质粒, pMD2. G 信封编码质粒, 和 pRSV-转速 (表 1) 根据以下数量/板块:
      转移质粒25.00 µg
      Lg/pRRE D64VInt 16.25 µg
      pMD2 8.75 µg
      pRSV-启示录6.25 µg
      注: 质粒 dna 是根据 Maniatis22描述的中海协议编写的, 或使用无内毒素质粒纯化试剂盒。
      1. 重56.25 µg 的 DNA (混合4质粒) 在1.125 毫升的无菌水和添加125µL 2.5 M CaCl2 (解决方案 A)。
      2. 增加1.250 毫升的 2x HBS 到一个无菌15毫升圆锥离心管 (解决方案 B)。
      3. 添加解决方案 a (1.250 毫升), 以 B (1.250 毫升) 滴, 而起泡与1或2毫升吸管 (转染解决方案, 总容量2.500 毫升)。
      4. 室温孵育20分钟 (RT)。
      5. 使用 P1000 微, 将所有的转染溶液 (2.500 毫升) 分布到细胞单层滴。
    4. 在37° c、5% CO2的细胞培养箱中过夜。
  4. 2天: 取出培养基, 加入15毫升的新鲜培养基 (见步骤 2.1)。
  5. 3天: 收集并浓缩含有慢颗粒的上清液。
    1. 从所有 (n=5) 转染的细胞板中收集上清液 (70 毫升), 过滤通过0.45 µm-过滤器和填充 2 polyallomer 管 (1 英寸 x 3.5 英寸)/病毒制剂。
    2. 将矢量粒子离心在 10.6万 x g 为2.5 小时, 在15° c 与制动器。
    3. 在停止离心 (为了避免悬浮的颗粒在试管中), 轻轻地将上清液倒入含有10% 漂白剂的容器中, 并在100µL 1x PBS (+ 1% BSA) 中悬浮2勉强可见的小球。这是正常的, 因为颗粒是明确和非常小的。使用在-80 ° c 的新制备的浓缩载体, 或分和存储病毒制剂。
      警告: 上清液中含有慢的微粒, 在生物危害废物中丢弃之前必须彻底漂白。
  6. 为了滴定病毒载体的准备, 根据制造商的协议, 使用 HIV-1 堵嘴 p24 免疫套件。
    注: 为规范病毒载体的生产, 可采用 liposomes-based 试剂。然而, 病毒载体的效价高度依赖于质粒 DNA 的转染效率和纯度。

3. 人类细胞系的转导 (如 HeLa 细胞)

注意: HeLa 细胞在 Dulbecco 氏改良的鹰培养基中进行培养, 并辅以10% 胎小牛血清、100 U/毫升青霉素-链霉素和2毫米谷氨酰胺。表 1总结了此协议中使用的所有向量。提供了每个向量的描述。HeLa 细胞的转导使转在两个 IDLV 载体的最佳剂量组合中对转录调控进行验证。IDLV 剂量的变化可能与载体颗粒滴定和靶细胞类型有关。

  1. 0天: 种子 2x105细胞在3毫升培养基中为6井板的每一个井。准备4口井。
  2. 1天: HeLa 细胞的转导。
    1. 对于每个条件, 稀释慢向量到最后的体积1毫升培养基 (见上文注) 在10μ l 的凝聚 (最终浓度8微克/毫升):
      稀释为井 #1: 模拟转细胞 (阴性控制)。
      稀释为井 #2: IDLVTKSB 载体 (2600 ng p24)。
      稀释为井 #3, #4: IDLVTKSB 向量 (2600 ng p24) + IDLVrtTA2s-M2 向量 (9600 ng p24)。
    2. 在0天将 HeLa 细胞镀在每一个井中, 并在相应的井中添加慢矢量稀释。
    3. Spinoculate 6 井板在 754 x g 为45分钟在20-25 ° c, 然后转移 6-井板到细胞培养孵化器在37° c 和 5% CO2
    4. 6小时后, 在所有井中用新鲜培养基取代培养基, 并在井 #4 中加入强力霉素至1μ m。将板材放入37° c 48 小时的细胞培养箱中。
  3. 3天: RNA 提取用细胞颗粒的制备。
    1. 在分离细胞之前, 准备一个胰蛋白酶工作溶液 (1x):
      2.5% 胰蛋白酶 (10x) 5.0 毫升
      500毫米 EDTA (最终浓度 = 5 mm) 0.5 毫升
      1x PBS 44.5 毫升
    2. 热胰蛋白酶工作溶液在37° c 使用前。储存胰蛋白酶工作溶液在4° c。
    3. 用 1x PBS 去除培养基和洗涤细胞。添加0.5 毫升的 5ml 37 ° c 胰蛋白酶工作溶液, 并在37° c 孵育7分钟 (在细胞培养孵化器)。
    4. 在孵化后, 在每个井中加入0.5 毫升的含血清培养基, 使胰蛋白酶失效, 并在离心管中收集细胞。用3毫升 1x PBS 冲洗一次, 并将细胞悬浮液离心5分钟, 在 240 x g。
    5. 用5毫升 1x PBS 洗涤细胞, 离心5分钟, 在 240 x g 和丢弃上清液。使用新鲜收集的细胞小球或储存在-80 ° c。从小球中提取总 RNA, 进行半定量 rt-pcr (见步骤 6)。

4. 人原发性细胞的转导 (如角质形成)

注意: 人类原发性角质形成细胞被播种到致命辐照的 3T3-J2 电池 (饲养层)23, 一种来自燕 Barrandon (洛桑, 洛桑, 瑞士) 的礼物。

  1. 在 Dulbecco 的改良鹰培养基中种植瑞士老鼠 3T3 J2 细胞, 辅以10% 供体牛血清、50种 U/毫升青霉素-链霉素和4毫米谷氨酰胺 (3T3 培养基)。
  2. 在 cFAD 培养基上致命辐照的 3T3 J2 细胞生长角质形成, Dulbecco 的改良鹰培养基和火腿的 F12 培养基混合物 (3:1) 含有胎儿牛血清 (10%), 青霉素-链霉素 (1%), 谷氨酰胺 (2%), 胰岛素 (5 µg/毫升), 腺嘌呤 (0.18 毫米), 氢化可的松 (0.4 µg/毫升), 霍乱毒素 (0.1 nm), 和甲状腺 (2 nm)。
  3. 0天: 种子 3x10^-75致命辐照的 3T3 J2 细胞, 以前稀释为3T3 培养基, 最终浓度为 1X105细胞/毫升, 每井 6-井板。准备9口井。
  4. 1天: 原发性角质形成细胞的转导
    注意: 角质形成细胞的转导允许定量的转录调节 SB 转的最佳剂量组合的两个 IDLV 载体 (通过 qRT PCR) 和验证的融合, 印度 (GFP) 的目标单元 (由 cytofluorimetric分析)。
    1. 分离细胞前, 准备胰蛋白酶工作溶液:
      0.5% 胰蛋白酶-EDTA (10x) 5.0 毫升
      500mM EDTA (最终浓度 = 5 mM) 0.5 毫升
      1x PBS 44.5 毫升
    2. 热胰蛋白酶工作溶液在37° c 使用前。储存胰蛋白酶工作溶液在4° c。
    3. 分离 subconfluent 角质形成细胞的培养, 去除培养基, 用 1x PBS 清洗电池, 并添加1毫升的5ml 胰蛋白酶工作液, 每一个井。孵育在37° c 为15分钟在细胞培养孵化器。
    4. 在孵化后, 重彻底的细胞, 并将细胞悬液转移到含有2毫升含血清培养基的离心管中 (如果仍有许多细胞附着, 则在37° c 下孵育一分钟)。用3毫升的 1x PBS 或新鲜培养基冲洗每一次井, 并在离心管上添加冲洗液, 使其与细胞悬浮液一起使用。
    5. 离心机5分钟, 在 580 x 克, 并丢弃上清。
    6. 用5毫升的 1x PBS 洗涤细胞, 离心5分钟, 在 580 x g 和丢弃上清液。
    7. 在15毫升聚丙烯管, 稀释 1.6x105角质形成1毫升的 cFAD 培养基, 一个稀释为每个条件。
    8. 在1毫升的 cFAD 培养基中, 在20μ l 凝聚 (最终浓度为8µg/毫升, 在最后的2毫升) 中稀释慢载体:
      稀释为井 #1, #2, #3: 模拟转细胞 (阴性控制没有传染媒介)。
      稀释为井 #4, #5: IDLVTKSB 向量 (1.3万 ng p24) + IDLVrtTA2s-M2 向量 (4.8万 ng p24)。
      稀释为井 #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB 向量 (1.3万 ng p24) + IDLVrtTA2s-M2 向量 (4.8万 ng p24) + IDLVT2 向量 (9160 ng p24)。
    9. 传感器细胞在悬浮通过增加每个慢向量稀释 (1 毫升) 到相应的角质形成悬浮 (1.6x105角质形成1毫升)。
    10. 从致命照射的 3T3-J2 细胞中去除培养基, 在0天和平板转角质形成 (1.6x105角质形成2毫升) 到他们身上。在换以后一个井继续与下一个。
    11. 孵育在25° c 为30分钟, 然后转移细胞到37° c 在细胞培养孵化器为 6 h。
      注意: 不要 spinoculate 原发性角质形成细胞, 因为存活和增殖会受到强烈的影响。
    12. 6小时后, 每井加1毫升的 cFAD 培养基。在水井 #5、#8 和 #9 中加入1μ m 强力霉素 (最终浓度)。返回细胞到37° c。
  5. 2天: 用3毫升的 KC 培养基替换 cFAD 培养基, 10 ng/毫升 EGF。
  6. 3天: 处理和洗涤细胞从井 #1, #4 和 #5 前面描述 (参见4.4.1 到 4.4.6)。在-80 ° c 下冷冻细胞颗粒提取总 RNA qRT-PCR 分析 (见步骤 7)。
  7. 处理细胞从井 #2, #6 和 #8 的步骤 4.4.1 4.4.5 和执行 cytofluorimetric 分析 GFP 表达 (见步骤 5)。
  8. 保持从水井 #3, #7 和 #9 至少 3-4 doublings 的文化, 足以稀释七零八落 IDLVT2 载体 (5 天的人原代角质形成在饲养层)。
  9. 6天: 大约5天后转导, 处理细胞 (见步骤 4.4.1 4.4.5) 从水井 #3, #7, 并 #9 执行 cytofluorimetric 分析 GFP 表达 (见步骤 5)。
    注意: 实验时间和转导效率受原细胞类型和采集样本变异性的影响很大。

5. 转原代角质形成细胞的 Cytofluorimetric 分析

注: 使用蓝色激光 (488 nm)、红色激光 (633 nm) 和用于检测 GFP 和 APC 荧光的过滤器配置的流式细胞仪 (参见材料表)。

  1. 要区分角质形成细胞从 3T3 J2 饲养层, 标签转角质形成细胞分离在3天和一天 6 (见步骤4.7 和 4.9) 与鼠标单克隆 APC 共轭抗馈线抗体。
    1. 为每个样品准备4毫升的染色缓冲液:
      5% FBS 200 μ l
      500毫米 EDTA (最终浓度 = 2.5 毫米) 20 μ l
      PBS 1x 3780 μ l
    2. 用1毫升的染色缓冲液冲洗分离细胞。离心机5分钟, 在 580 x 克, 并丢弃上清。
    3. 在流式细胞仪采集管中, 重 5x104细胞在100μ l 的染色缓冲液中, 并添加2μ l 抗馈线抗体 (1:50)。在黑暗中混合好, 在冰上孵育30分钟。
    4. 30分钟后, 用2毫升的染色缓冲液冲洗。离心机5分钟, 在 580 x 克, 并丢弃上清。重在200μ l 的染色缓冲液中。
    5. 通过 cytofluorimetric 分析18获取 APC 和 GFP 信号。APC 单元格中的 GFP+单元格分数表示转角质形成细胞.
      注: 如果需要, 在流式细胞仪前固定染色样品, 2% 甲醛在 PBS 1x 和存储在4° c 在黑暗中, 直到运行。
  2. 分析流式细胞仪数据通过绘制端点 (5 天) 的 gfp+单元格百分比和 gfp+单元格的百分比 (2 天后转导), 归入 IDLVT2-transduced 的剩余水平。细胞.

6. 半定量 rt-pcr

注: 使用 PCR 热循环。

  1. 根据制造商的协议, 使用 rna 纯化试剂盒从转或控制细胞提取总 rna。
    注: 总 RNA 可以被存放在-80 ° c。
  2. 根据制造商的协议, 用 100 ng 总 RNA 和逆转录酶试剂盒合成20µL 反应中的 cDNA。
    注: cDNA 可贮存于-20 ° c。
  3. 设计底漆专门为 SB100X, rtTA2s-M2 和 GAPDH (一个管家基因)。
    建议的设计:
    SB 前锋底漆: 5-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3 "
    SB 反转底漆: 5-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3 "
    rtTAM2 前引物: 5"-GACGACAAGGAAACTCGCTC-3"
    rtTAM2 反向底漆: 5-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3 "
    GAPDH 前引物: 5 "-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3"
    GAPDH 反向引物: 5 "-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3"
  4. 在50µL 的最终反应量中进行 PCR。特别是, 在每个 PCR 管集合以下反应:
    cDNA (1:5 稀释) (从步骤 6.2) 1.00 µL
    前引底漆 (10 µM 库存) 1.00 µL
    反向底漆 (10 µM 库存) 1.00 µL
    dNTPs (10 µM 库存) 1.00 µL
    缓冲区 (+ 氯化镁2) (10x 库存) 5.00 µL
    Taq 聚合酶 (5 U/µL 库存) 0.25 µL
    无菌水40.75 µL
  5. 使用热循环的以下节目: 1 周期在95° c 为5分钟然后继续与95° c 为三十年代, 58 ° c 为三十年代和72° c 为三十年代为34个周期为 SB100X, 32 周期为 rtTA2s-M2, 25 周期为 GAPDH。
  6. 准备1% 琼脂糖凝胶。将1克琼脂糖溶于100毫升的 1x (10x 库存稀释在无菌水中), 在烧杯或烧瓶中。融化在微波炉, 每分钟旋转, 直到琼脂糖完全溶解。冷却融化的琼脂糖, 直到它达到约50° c, 然后添加5µL 溴化溴 (10 毫克/毫升的股票)。倒入融化的琼脂糖在一个组装的凝胶托盘与梳子, 为凝胶铸造。
  7. 在琼脂糖凝胶上装载样品 (10 µL), 并进行电泳。
  8. 如果需要, 获取凝胶图片和执行密度分析的 PCR 带。

7. 定量 rt-pcr (qRT pcr)

注意: 采用了商业序列检测系统。PCR 引物和 6-羧基 (家族) 探针为甘油 3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 是购买商业。

  1. 对于复古转录, 见步骤6.2。
  2. 使用软件为 SB100X 设计底漆和探头。
    建议设计:
    SB 2 前引物: 5 "-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3",
    SB 2 反向底漆: 5 "-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3"
    探索 SB: 5-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3 "
  3. 在25µL 的最终反应量中, 用 pcr 主混合和引物 + 探针混合, 在96井板上进行实时 pcr。特别是, 考虑以下反应为每井:
    cDNA (1:10 稀释在无菌水中) 1.00 µL
    2x 主混合12.50 µL
    底漆 + 20x 探头混合1.25 µL
    无菌水10.25 µL
    注: 执行所有反应三份。为了防止移的错误, 准备一个混合至少 n+3 反应 (没有 cDNA)。分使用多通道吸管。
  4. 使用以下程序运行 real-time PCR: 1 周期在95° c 为 10 min, 然后40个周期95° c 为十五年代和60° c 为 1 min 和举行在4° c。
  5. 采用典型的数据分析软件, 通过 2-ΔΔCT量化, 将 SB100X 的相对表达式 (RQ 值) 正常化到同一 cDNA 样品的 GAPDH 水平, 对 qRT PCR 数据进行分析。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

使用这里介绍的程序, 三 IDLV 载体运载被调控的 sb 组分 (SB100X, rtTA2S-M2 和 T2-GFP 转) 被包装并且用于高效率地运载和严密地调控 sb 系统在人的细胞。图 1A显示了一个用于 HeLa 细胞的体外转导的方案, 它是用两个 IDLV 向量的最佳剂量组合 (在表 2中报告) 来评估 SB 转的转录调节。用 qRT PCR (图 1B) 测量了 SB100X 的转录调节, 并以相对数量 (RQ) 值作为态 (IDLVTKSB 单独 RQ=1) 的数值进行绘制。在转 HeLa 细胞, 获得8倍的活化 (+ dox) 的 SB100X 表达的背景 (IDLVTKSB)。值得注意的是, cotransduced HeLa 细胞在缺乏 dox 显示转表达可媲美的状态, 表明严格控制 TetTK 启动子 rtTA2sM2 调制器。

Figure 1
图 1: 转录表达的 HeLa 细胞的转导转由 IDLV 载体携带.(a)一种用于 IDLVs 表达转的 HeLa 细胞的体外转导的方案。(B) qRT-PCR 分析转 IDLVTKSB (2600 ng p24) 的 HeLa 细胞在 IDLVrtTA2S-M2 (9600 ng p24) 和1µM 强力霉素 (dox) 的存在 (+) 或缺席 (-)。虚线连接的示例显示了明显不同的值 (*** < 0.005)。实验以三份进行。平均东南亚 M 显示为误差线。(图修改自 Cocchiarella, F. et al., 201618)。请单击此处查看此图的较大版本.

例如, 图 2显示了为达到转的最佳转录调节而设置的剂量范围实验。在 M2 的存在或缺失的情况下, HeLa 细胞以 IDLVTKSB 的剂量 (130、260和 2600 ng p24) 与 IDLVrtTA2s-p24 (960 和 9600 ng dox) 联合转。半定量 rt-pcr 分析表明, 高剂量的两种 IDLVs 都需要强烈诱导 SB100X 表达。不同靶细胞类型和病毒载体滴定的变化可能导致最佳的 SB 表达, 因此我们建议进行剂量设置实验。

Figure 2
图 2: HeLa 细胞 IDLV 剂量设置实验, 以确定两个 IDLVs 的最佳剂量组合.不同剂量 IDLVTKSB 载体 (130、260、2600 ng p24) co-transduced HeLa 细胞的半定量 rt-pcr 分析在 IDLVrtTA2s-M2 向量 (960 和 9600 ng p24) 和 dox 的缺席或存在。GAPDH 被放大为标准控制。SB100X 转和 rtTA2s-M2 表达式在所有测试条件中报告;NC = 负控制。(图修改自 Cocchiarella, F. et al., 201618)。请单击此处查看此图的较大版本.

转录调控的 SB 系统也可以用于初级细胞, 特别是在那些抗几种转染方法的细胞中, 如人原发角质形成。图 3显示了在致命辐照 3T3 J2 饲养层上培养的原角质形成细胞的转导方案, IDLV 载体携带受管制的 SB 成分, 在 dox 存在或缺席的情况下诱导 SB100X 表达。

Figure 3
图 3: 人原发性角质形成细胞悬浮的转导与 IDLV 表达转录转和转.人原发性角质形成细胞的体外转导 IDLVs 转录转和转在1µM dox 的存在或缺失请单击此处查看此图的较大版本.

图 4A中的 qRT PCR 分析显示, 表2中所报告的转和调制器向量的最佳剂量组合导致了在态 (-dox) 上对 SB 表达式的15倍激活。转位试验在角质形成细胞转与三 IDLV 载体 (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 和 IDLVT2) 在存在或缺席 dox。T2-transposon, 在 APC 的-舱内, 用流式细胞仪分析2天 post-transduction (百白破) 和 endopoint 的培养物 (人类原发角质形成的5天) 来测定受 (GFP) 的表达。当不 T2-GFP 转下降到一个几乎可检测的水平 (平均为 0.6%) 由于细胞分裂依赖性稀释到达终点。图 4B显示了端点的 APC-间隔内的 GFP+单元格的百分比与2天后转导的比例, 仅对转的剩余水平进行规范化。这表明, 至少1拷贝的细胞所占的百分比在他们的基因组中稳定地整合在一起, 被评估为12% 为人类原发角质形成。

Figure 4
图 4: 转和 GFP 在转人原发性角质形成细胞中的表达分析。(A)在1µM dox 的存在或缺席的情况下, 对原发性角质形成细胞转与 IDLVTKSB 和 IDLVrtTA2S-M2 进行 qRT pcr 检测。(B)原发性角质形成细胞与 IDLVT2 转和 IDLVs 的联合转导, 转表达在 dox 的存在或缺失。在 Y 轴上,%GFP+单元格 5dpt/%GFP+单元格2百白破 * 100 (两个实验的平均± SEM)。** 显示显著不同的值 (P < 0.05)。(图修改自 Cocchiarella, F. et al., 201618)。请单击此处查看此图的较大版本.

描述 引用
pCCL-TetOTKSB 转移质粒用于生成 IDLVTKSB 载体。本质粒来源于 pTetOTKSB, 克隆后 TetOTKSB 在 pCCL 慢骨干。 18, 20
pCCL-PGKrtTA2S-M2 转移质粒用于生成 IDLVrtTA2 的s-M2 向量。 由 Prof. 五 Zappavigna 提供
pCCL-T2GFP 转移质粒用于生成 IDLVT2 载体。该质粒来源于 pT2GFP, 克隆后的 GFP 在 T2-transposon 国税局的 pCCL 慢骨干。 18, 20
Lg/pRRE D64VInt 包装质粒生成 IDLV 载体。 19
pMD2 VSV-G 包络的质粒编码生成慢向量。 20
pRSV-启 转速质粒生成慢载体。 20
矢量 描述
IDLVTKSB 集成缺陷的慢向量, 表达的 SB100X 在春节响应的 TK 启动子的控制下。
IDLVrtTA2s-M2 在 PGK 启动子控制下, rtTA2s-M2 调制器的表达式有缺陷的慢向量积分。
IDLVT2 集成缺陷慢向量的表达的印度 T2-transposon 国税局克隆。

表 1: 本协议中使用的质粒和载体.提供了说明和参考。

向量 HeLa (2x105单元格) 角质形成细胞 (1.6x105单元格)
IDLVTKSB 2600 ng p24 1.3万 ng p24
IDLVrtTA2s-M2 9600 ng p24 4.8万 ng p24
IDLVT2 9160 ng p24

表 2: 用于 HeLa 细胞和人原发性角质形成的转导的最佳载体剂量。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

在这里, 我们描述一个广泛的方法, 以稳定地整合到目标细胞的基因组通过睡美人介导的转位。尽管 SB 系统的开发是为了提供一种病毒的基因组编辑方法, 但有效地交付集成机械 (转和 T2 转) 是强制性的。因此, 使用 sb 系统在几乎不 transfectable 的主要细胞, 病毒交付 sb 组分在最近几年被追求10,12,15。然而, 目前使用的病毒载体都没有涉及转的本构表达问题, 这可能导致转的不可控 rehopping 的风险。

为了转录调节转表达式, 我们利用了一个修改过的春节系统16。最小 TK 启动器融合到 TetO 元素, 在绑定到 rtTA2sM2 调制器的存在 dox, 授予 fine-tuning 的转激活的背景 (态, 在没有 dox)。调控性能取决于适当的 IDLVs (IDLVTKSB 和 IDLVrtTA2s-M2) 向量剂量组合和细胞类型 (如 HeLa 细胞和人原发角质形成)。独立于靶细胞, 向量剂量必须确保目标细胞的最高水平, 而不影响细胞的生存能力, 因此在 HeLa 细胞 (或其他细胞系) 的剂量组合实验, 以确定最佳剂量,半定量 rt-pcr, 强烈建议。

在原发性细胞中对印度的转位进行评估。人类原发角质形成细胞在致命辐照 3T3 J2 饲养层转与 3 IDLVs (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 和 IDLVT2) 在实验确定的剂量。qRT-PCR 技术证实了转的明显 dox 依赖性活化。此外, 转在 dox 存在或缺席的情况下, cytofluorimetric 分析了 GFP 在细胞中的表达, 表明有可能利用 IDLV 平台对车辆进行转录管制。组件的主要细胞, 并成功地整合到目标细胞的基因组。

该协议的关键步骤是 IDLV 向量生成和目标细胞在最佳效率和载体剂量组合的转导。HEK293T 细胞的低转染效率可能导致低的媒介产量。IDLVTKSB 和 IDLVrtTA2 的剂量的定义, M2 是必要的, 以避免不平衡的春节-对组件, 可能导致高泄漏在没有调制器或低倍诱导 TetOTK 启动后, dox 治疗.这些关键步骤可以通过稍加修改来解决。例如, 转染协议可以使用商业化的转染试剂进行标准化。转导协议应根据细胞类型的兴趣, 特别是考虑是否 spinoculation 提高转导效率, 而不影响细胞的生存能力。载体和凝聚可以添加到目标细胞的培养基中, 并在6小时或夜间孵化后用新鲜培养基取代。还值得注意的是, 在转导后5天, GFP+细胞的百分比可能受到 IDLVs 的背景积分的影响。

这种方法的一个小的限制是, IDLV 载体产生瞬时通过转染的 HEK293T 细胞。根据所使用的矢量剂量, 需要重复的矢量制作。第二个限制与印度的长度有关, 因为 IDLV 向量的货物容量大约是 8 kb。

总之, 这一方法可以通过转录的方式将一个人融入到 IDLV 载体中, 在现有的提供给 sb 系统的方法中, 显示出广泛的取向性和高的转导效率。此外, 修改过的 SB100X 的系统允许转录调节的表达, 一个相关的问题, 转 re-hopping 或在多个串行换位事件, 如果他们需要的风险。这种方法的可能应用包括细胞系 (如 HeLa 细胞、HEK293 细胞) 的基因组工程, 建立稳定的病毒载体的包装细胞, 并将治疗基因整合到临床相关的主要细胞中。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢 Prof. Zappavigna, 摩德纳大学和雷焦艾米利亚, 摩德纳, 意大利为我们提供了 pCCL-PGKrtTA2SM2 质粒。我们也承认 z 伊维西 (保罗 Ehlrich 研究所, 兰, 德国) 和 Prof. z Izvak (马克斯汗分子医学中心, 德国柏林) pCMVSB100X 和 pT2/BH 质粒。这项工作得到了黛布拉国际和意大利大学和研究部的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine Lonza BE12-614F Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized GE Healthcare Life Sciences SH30071.03 Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml Lonza DE17-602E Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM Lonza BE17-605E Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline Lonza BE17-737E Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5% Merck 106580 Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl) Sigma-Aldrich 320331 Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection Fresenius Kabi - Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter Whatman 10462100 Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes Beckman Coulter 326823 Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg Lonza BE17-516F Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 (Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit Perkin Elmer NEK50001KT Kit for IDLV particle titration.
Polybrene Sigma-Aldrich 107689 Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg GIBCO BE17-160E Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) 100938B AnalaR BDH Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X) GIBCO 15400-054 Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin GIBCO 16030-074 Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media GIBCO 21765 Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum Lonza DE14-801F Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin GIBCO 10099-141 Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I5500 Reagents for keratinocyte growth.
Adenine VWR 1152-25 Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone VWR 3867-1 Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Sigma-Aldrich C8052 Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T5516 Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF Austral Biological GF-010-9 Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody Miltenyi Biotech 130-096-099 To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase Life Technologies 18080051 Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP) Sigma-Aldrich D7295 Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water (any) - Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase Promega M740B Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology Sigma-Aldrich A9539 Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X Invitrogen 15581028 Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510 Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline Sigma-Aldrich D-9891 drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystem 4304437 TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon Corning 352096 Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile Falcon Corning 353025 Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile Falcon Corning 353046 Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL Eppendorf 0030 120.086 Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL Eppendorf 0030 120.094 Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free (any) - Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL Applied Biosystem 4346906 96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap BD Falcon 352052 Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes) (any) - Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes) (any) - Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter (any) - Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler (any) - Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment (any) - Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2 BD - Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 7900HT Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets. (any) - Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor Beckman Coulter - Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41, (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36, (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28, (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41, (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9, (11), e112712 (2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18, (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137, (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8, (10), e75344 (2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8, (10), e76771 (2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16, (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39, (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19, (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12, (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72, (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1, (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. 4th edition, (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics