Een verbeterde methode voor de verzameling van de cerebrospinale vloeistof van narcose muizen

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Dit protocol beschrijft een verbeterde techniek voor de overvloedige hoeveelheid cerebrospinale vloeistof (CSF) met geen besmetting uit bloed. Met grotere sample collectie en zuiverheid, kunnen meer analyses worden uitgevoerd met behulp van CSF om ons begrip van ziekten die de hersenen en het ruggenmerg beïnvloeden.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lim, N. K., Moestrup, V., Zhang, X., Wang, W. A., Møller, A., Huang, F. D. An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice. J. Vis. Exp. (133), e56774, doi:10.3791/56774 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De cerebrospinale vloeistof (CSF) is een waardevolle lichaamsvloeistof p.a. in onderzoek neurowetenschap. Het is een van de vloeistoffen in de dichtstbijzijnde contact met het centrale zenuwstelsel en zo kan worden gebruikt voor het analyseren van de zieke staat van de hersenen of ruggenmerg zonder direct toegang tot deze weefsels. Echter bij muizen is het moeilijk te verkrijgen van de cisterna magna als gevolg van de nabijheid van bloedvaten, besmetten die vaak monsters. Het gebied voor CSF collectie in muizen is ook moeilijk te ontleden en vaak alleen kleine steekproeven worden verkregen (maximaal 5-7 µL of minder). Dit protocol beschrijft in detail een techniek die verbetert op de huidige methoden van collectie Minimaliseer verontreiniging van bloed te voorzien in de overvloedige collectie van CB (gemiddeld die 10-15 µL kan worden geïnd). Deze techniek kan worden gebruikt met andere methoden van de dissectie voor weefsel collectie van muizen, zoals het geen voor alle weefsels tijdens de CSF extractie gevolgen heeft. Dus, de hersenen en het ruggenmerg ondervinden geen problemen met deze techniek en intact blijven. Met grotere CSF sample collectie en zuiverheid, meer analyses kunnen worden gebruikt met dit onderzoek van de neurowetenschappen vloeistof verder steun en ziekten van de hersenen en het ruggenmerg beter te begrijpen.

Introduction

Het CB is een waardevolle lichaamsvloeistof p.a. in onderzoek neurowetenschap. Het CB bestaat voornamelijk uit bloedplasma, met enkele cellen (geen rode bloedcellen en slechts een paar witte bloedcellen) en is bijna op eiwit-vrij. Het is een van de vloeistoffen in nauw contact met het centrale zenuwstelsel (CNS) en het vele elektrolyten uit vanuit de hersenen en het ruggenmerg aan de perifere systeem kan doorgeven. Bij de mens, CSF monsters kan worden verzameld om te helpen bij de diagnose van de ziekte of voor onderzoeksdoeleinden in klinische proeven, als een spinal tap (of de Lumbaalpunctie) is een kleine, invasieve procedure: de CSF vloeistof kan wijzigingen in het VNV zonder voor directe toegang tot deze weefsels. Dus, in de afgelopen jaren, voor onderzoeksdoeleinden in de kliniek, CSF monsters zijn verkregen van patiënten van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer en andere dementie1,2,3. Er zijn vele biomerker-tests die zijn ontwikkeld met behulp van CSF monsters te kunnen helpen bij de diagnose van de ziekten in de kliniek2,3. Er is echter veel discussie over de betrouwbaarheid van deze tests te produceren consistente, gevoelige resultaten specifiek diagnose ziekte4,5. Dus, is er een grote behoefte aan de ontwikkeling van betere tests en doelstellingen, die kunnen worden gevonden in het CB, steun bij het opstellen van een standaard techniek aan het diagnosticeren van neurodegeneratieve ziekten met grotere gevoeligheid en specificiteit. Vanwege het potentiële belang van menselijke CSF monsters in ziekte is de collectie van CB van knaagdieren in onderzoek neurowetenschap ook van belang.

Muizen zijn belangrijke dieren in biologische en medisch onderzoek en zorgen voor het testen van potentiële therapeutische stoffen en proof-of-concept studies voor menselijke klinische proeven. Bij muizen is het echter moeilijk te verkrijgen van CSF monsters als gevolg van de nabijheid van de hersenen in een klein dier, zoals de gebruikelijke methode van CSF collectie in muizen is te verkrijgen via de cisterna magna, een opening tussen het cerebellum en de dorsale oppervlak van het verlengde merg. Dit veroorzaakt problemen in het verzamelen van CSF monsters zoals dit gebied moeilijk is te ontleden om en in de directe nabijheid van bloedvaten, waardoor het risico van besmetting van bloedcellen. Als gevolg van deze moeilijkheden, de meeste onderzoekers kunnen uitsluitend worden verkregen door een kleine hoeveelheid van CB p.a. (meestal vermeld als 5-7 µL) en de besmetting van CSF monsters door bloedcellen is een primaire zorg voor analyses6,7,8 , 9. bloed besmetting kan obscure resultaten en niet echt overeen met de staat van het centraal zenuwstelsel. Bovendien beperkt monster kan invloed hebben op onderzoek zoals het gebruikelijke bedrag verzameld van muizen voldoende voor slechts één meting (in tweevoud of drievoud is) met behulp van de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA). Dus, CSF monsters meestal uit meerdere muizen zijn samengevoegd om genoeg monster meerdere tests uitvoeren. Ontwikkeling van een protocol voor de overvloedige, onbesmette collectie van CB van muizen is zeer gewenst en bij het verbeteren van de neurowetenschappen onderzoek met behulp van knaagdieren gunstig zal zijn.

In dit protocol, een techniek voor het overvloedige (gemiddeld 10-15 µL) collectie van CB van narcose muizen wordt in detail beschreven en verbetert op een op dit moment bekende methode van CSF-collectie om te minimaliseren van verontreiniging van bloed10. Een robuust protocol voor CSF collectie zal helpen in de ontwikkeling van CSF gebaseerde biomerker tests, die kan worden gebruikt om steun in de diagnose van de ziekte, evenals het verbeteren van onderzoek in de mechanismen die ten grondslag liggen aan ziekten van de CNS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd overeenkomstig het beleid van de vereniging voor Neurowetenschappen (USA) en ethische commissies van de Fudan Universiteit (Shanghai, China). Deze procedure is voor een niet-survival-chirurgie.

1. installatie van CB collectie apparatuur

  1. Trek de glazen capillaire (binnendiameter 0,75 mm, buitendiameter 1,0 mm) met een trekker van de micropipet (zoals in Liu et al. 10; scherp capillair is afgebeeld in Figuur 1).
  2. Plaats een aangescherpte glazen capillaire in de capillaire houder stevig gemonteerd op een micromanipulator (figuur 1A).
  3. Breken van de tip van het aangescherpte capillair met een rechte Tang onder een Microscoop ontleden, zodat de binnendiameter van de gebroken tip gaat over 10-20 µm (Figuur 1 c).
  4. Een dunne buis en een spuit koppelen aan het andere uiteinde van de capillaire houder en sluit de dunne buis en de spuit met een drie-weg klep.
  5. Verschuiving van de drie-weg klep om te openen en duik de spuit te blazen lucht uit de spuit via de buis aan het glas capillaire te verdrijven van eventuele verontreinigingen en creëren positieve druk in het capillair.
  6. Herhaal dit een paar keer door DIS sluiten en opnieuw aansluiten van de injectiespuit op de drie-weg klep, en opstelling van de spuit van ~ 100-200 µL voordat de laatste opnieuw verbinding van de spuit met de drie-weg klep (figuur 1B).
  7. De micromanipulator met de glazen capillaire verplaatsen naar de kant om schade te voorkomen tijdens de dissectie van de muis.

Figure 1
Figuur 1. Microscoop, micromanipulator en capillaire setup. (A) Microscoop en micromanipulator met capillaire aangesloten setup, alsmede een nauwere beeld van (B) de aangesloten spuit en drie-weg ventiel te openen (zie hier) of sluit de leidingen, en (C) een ongebroken (rechts) en gebroken (links) capillaire tip klaar voor CSF-collectie. Zodra gebroken, de tip van het capillair moeten een inwendige diameter van 0,75 mm, buitendiameter van 1,0 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. muis dissectie

  1. Anesthetize de muis.
    Opmerking: voor dit protocol, C57BL/6 en amyloid precursor eiwit/presenilin 1 (APP/PS1) transgene muizen (model van de muis van de ziekte van Alzheimer) werden gebruikt en verdoofd met 4% Chloraalhydraat (in dH20) bij 10 µL/g van muis gewicht via intraperitoneaal injectie.
  2. Wanneer volledig verdoofd, ervoor zorgen dat de muis voldoende is verdoofd. De reactie van de terugtrekking tot teen snuifje, door iets uit te breiden van de achterste ledematen en knijpen van de tenen en kijken voor een terugtrekking reactie, is uitgevoerd om te verzekeren van voldoende verdoving. Controleren door te knijpen alle vier ledematen; Als er geen reactie is de muis goed verdoofd. Snijden en knippen van de haren op de achterkant van het hoofd van de muis boven de ogen, tussen de oren aan de onderkant van de nek met behulp van ontleden schaar (figuur 2A). Als alternatief, tondeuse of ontharende room kan worden gebruikt om te helpen bij de verwijdering van het haar.
  3. Het hoofd van de muis met een muis adapter veilig (achterkant van het hoofd naar boven met de neus wees neer op ~ 45 °, figuur 2A). Oor balken tussen de oren en de ogen van de muis los en draai. Zorg ervoor dat het hoofd niet verplaatsen en strak in de adapter is beveiligd door zachtjes duwen naar beneden aan het hoofd van de muis.
  4. Gecontroleerd of er terugtrekking antwoord teen snuifje alvorens chirurgische incisies en op gezette tijden daarna te verzekeren van chirurgische vliegtuig van de verdoving. Visueel Opmerking eventuele wijzigingen in de ademhaling tijdens de procedure om aan te geven van de veranderingen in de vliegtuigen van de verdoving. Een schone, niet-aseptische, techniek kan worden gebruikt voor deze korte niet-survival-chirurgie. Met behulp van schaar en pincet gebogen, doorsnijden de huid en de eerste laag van spier totdat de onderkant van de schedel met slechts een dun laagje van de spier wordt blootgesteld.
    Opmerking: Via de huid van de muis dwars door de achterkant van de nek en dan snijd de huid in het midden van de schedel tussen de oren en de ogen van de muis. Huid en weefsel kunnen dan worden getrokken uit elkaar en uit het gebied over de cisterna magna.
  5. Terwijl bekijken door het ontleden Microscoop, ontleden zorgvuldig weg de laatste dunne lagen van spier over de basis van de schedel met pincet en verplaatsen van deze lagen van de spier aan de zijkant en uit het gebied van belang. Als er is bloeden, wattenstaafjes gebruiken verwijderen te helpen stoppen met het bloeden.
  6. Zodra de dura over de cisterna magna is blootgesteld (driehoekige vorm met meestal 1-2 grote bloedvaten loopt door het gebied; beide zijden of tussen de bloedvaten is optimaal voor de capillaire inbrengen en CSF collectie, figuur 2B), gebruik maken van een NAT wattenstaafje aan veeg het membraan schoon en droog het gebied met een droge wattenstaafje.

Figure 2
Figuur 2. Muis en dissectie setup met representatieve beelden van capillaire plaatsingskosten voor CSF collectie. Installatie van muis klaar voor CSF extractie met (A) geschoren hoofd geklemd in plaats voor dissectie en (B) gedetailleerde foto (10 x weergave) van een ontleed muis dura die betrekking hebben op de cisterna magna (onderbroken pijl toont een bloedvat loopt door het gebied en gevulde pijl geeft gebied optimaal voor capillaire invoegpositie). Gedetailleerde beelden (10 x weergave) van (C) geslepen tip van glazen capillaire uitgelijnd tegen dura van cisterna magna, (D) het punt waarop het capillair puncties bijna de dura, met enige weerstand van dura en (E) de capillaire tip getikt via de dura voor het verzamelen van CSF. CSF moet een heldere vloeistof verzameld in de glazen capillaire (gestippelde pijl). Alle schaal staven op de rechterbenedenhoek van elke afbeelding Microscoop geven 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

3. CB collectie van narcose muis

  1. De glazen viscometerbuizen aan de achterkant van het hoofd van de muis uitlijnen zodat het scherp punt is net achter het membraan op een ~ 30-45 ° hoek (figuur 2C).
  2. Duik de spuit eens of een paar keer en het opstellen van de spuit ~ 100-200 µL (zodat zeker dat er geen verontreinigingen en er is negatieve druk in de glazen capillaire).
  3. Met behulp van de micromanipulator, het verplaatsen van het capillair tip dichter bij het membraan tot weerstand kan worden gezien, maar niet prikken het (figuur 2D).
  4. Zodra weerstand wordt gezien tussen het uiteinde van het capillair en de membraan, zachtjes het capillair via het membraan te onttrekken door het kloppen op de micromanipulator-besturingselementen. Gebruik de Microscoop te zien het scherp punt van de capillaire punctie in de cisterna magna. CSF moet automatisch worden getrokken in het capillair zodra de opening heeft zijn doorboord (figuur 2E).
  5. Laat het capillair langzaam verzamelen CSF. Als het CB heeft gestopt tekening uit, trekken de injectiespuit omhoog een weinig langzaam (~ 50 µL) maken meer negatieve druk in het capillair uitpakken uit het CB.
    Opmerking: U kunt ook de capillaire kan worden voorzichtig en langzaam getrokken uit de hersenen met de fijne micromanipulator besturingselementen toe CSF te stromen in het capillair opnieuw. Een totaalbedrag van ~ 10-15 µL van CB (~ 3-4 cm in het capillair) duurt ~ 10-30 min, en af en toe 20 µL of meer kunnen worden verzameld. Hoewel niet strikt noodzakelijk is, is het aanbevolen om het gebruik van een warmte-pad tijdens CSF-collectie. CSF collectie werd uitgevoerd bij kamertemperatuur (~ 23 ° C).
  6. Zodra het bedrag van gewenste CB wordt verzameld, sluit u de slang door een verschuiving van de drie-weg klep te sluiten (als u wilt stoppen met tekenen uit het CB).
  7. Neem de spuit aangesloten op de buis, en opent en sluit de slang (als u wilt maken genivelleerde druk in de capillaire buis en het gebied buiten het capillair). Sluit de spuit met de drie-weg klep, maar niet de spuit storten.
  8. Verwijder voorzichtig de glazen viscometerbuizen uit de muis met behulp van de micromanipulator.
  9. Plaats de collectie buis (1,5 mL slangen met 1 µL van 20 x proteaseinhibitor) onder het scherp punt van de glazen capillaire.
  10. Open de buis en zachtjes duik de spuit: het CB moet vloeien uit het capillair en in de buis van de collectie.
  11. Na het verzamelen, snel centrifugeren (pulse spin voor 5 s met maximale snelheid met behulp van een mini centrifuge) het CB om te mengen van het monster met de proteaseinhibitor aan de onderkant van de buis van de collectie.
    Opmerking: CSF monsters kunnen worden aliquoted en vervolgens opgeslagen voor verdere analyse bij-80 ° C. De rest van de muis kan worden ontleed voor andere weefsels, zoals de hersenen en het ruggenmerg. De muis in dit stadium nog in leven is en dus bloed kan ook worden verzameld, indien nodig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van de procedure die hier beschreven (Figuur 1 en Figuur 2), moet het CB onmiddellijk verzameld in het capillair duidelijk (figuur 2E), niet roze of rood. Als er een roze tot rode tint aan de vloeistof in het capillair verzameld, dan was er verontreiniging met bloed.

Een voorbeeld van de toepassing van het CSF-monster verzameld met deze methode, werd de niveaus van het eiwit amyloid-bèta (Aβ) gemeten met behulp van ELISA. Niveaus van Aβ in CB wordt doorgaans gemeten in de ziekte van Alzheimer onderzoek7. CSF is meestal eiwit-vrij. In een muismodel van Alzheimer (APP/PS1 muizen), zijn niveaus van menselijke Aβ42 flink verhoogd, zoals deze muizen overexpress menselijke APP. Dit kan worden waargenomen met de monsters van CB verzameld van 12-maand oude muizen met behulp van de hier beschreven methoden (0 pg/mL in het CB van wild-type (WT) muizen in vergelijking met 1,303 pg/mL in het CB van APP/PS1-muizen, Figuur 3).

Figure 3
Figuur 3. Representatieve resultaten voor CSF monster verzameld. ELISA analyse van CSF monster verzameld. In een muismodel van Alzheimer (APP/PS1) is er een aanzienlijke toename van de niveaus van menselijke Aβ42 in het CB, zoals deze muizen overexpress menselijke Aβ42 (1,303 pg/mL). Bij wild-type (WT) moet de muizen er geen menselijke Aβ42 gedetecteerd (0 pg/mL). Een ongepaard t-test werd gebruikt voor het meten van betekenis, ** p < 0,01, foutbalken weergegeven als SEM, n = 3 en 4 muizen op 12 maanden leeftijd respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft in detail een techniek die verbetert op huidige methoden10 van CSF collectie Minimaliseer verontreiniging van bloed te voorzien in de overvloedige collectie van CB (gemiddeld ~ 10-15 µL kan worden verkregen) van muizen. Bij het afbreken van de capillaire tip, de tip van het capillair mag niet te klein (als toen het CB worden uitgepakt heel langzaam) of te groot (zal niet fijn genoeg om te verzamelen van het CB en het weefsel kan worden ingediend in het capillair). Zorg moet worden genomen wanneer de ontrafeling van het gebied voor CSF collectie: elke bloeden moet worden gestopt en het gebied voor het inbrengen van de glazen capillaire gereinigd uit bloed met dH20 om te voorkomen dat besmetting met het monster. De anatomie van elke muis is anders, maar de meeste muizen hebben 1-2 grote bloedvaten loopt door het gebied waar het capillair moet worden ingevoegd voor CSF collectie. Het kiezen van dat de juiste plaats voor het inbrengen van het capillair is belangrijk, als het invoegen van te dicht bij zal grote bloedvaten vervuilen het CB met bloed. Zoals afgebeeld in Figuur 2, is een gebied dat vrij is van bloedvaten, als tussen of aan beide zijden van de grote bloedvaten, optimaal voor capillaire inbrengen om verontreiniging te voorkomen. Als het CB niet stroomt uit bij een constante snelheid en stopt na enige tijd, drawing de spuit een beetje (~ 50 µL) kan helpen om opnieuw van de stroom van CB in het capillair. Anderzijds het capillair zelf verrijdbaar is voorzichtig en langzaam in of buiten de muis met de micromanipulator opnieuw op te starten van de stroom van CSF extractie. Wees voorzichtig bij het doen van deze stappen als bloed kan stromen in het capillair ook. Deze techniek werkt goed als gevolg van de verschillen in druk van de hersenen en de glazen capillaire te trekken uit CSF uit de muis. Dus, de muis kan alleen worden doorboord ooit, zoals na het capillair is de muis ingevoegd en eruit gehaald, er een verlies van druk in de hersenen is en CSF zal niet meer meeslepen in het capillair automatisch als het opnieuw wordt ingevoegd. Dus, de praktijk deze techniek om te produceren geen bloed contaminanten en verkrijgen van voldoende CSF collectie op de eerste invoeging van het capillair in de muis zal perfect (uit ervaring, 10-20 praktijk muizen zal volstaan om dit stadium te bereiken).

Dit protocol is een betere en efficiënte methode voor de extractie van CSF van muizen en indien correct gedaan, minimaliseert besmetting uit bloed (afbeelding 1, afbeelding 2, Figuur 3). Deze techniek wordt beperkt door de tijd die nodig is voor CB te verzamelen. Normaal, 30 min is moesten verzamelen ~ 15 µL of meer van CB bij kamertemperatuur (~ 23 ° C). Gedurende deze tijd, de muis warm met katoen, wol of weefsel kan worden gehouden, maar zonder een bedekkings- of warmte pad, CSF kan nog steeds worden met succes verzameld. Toevoeging van een warmte-pad of de opwarming van de aarde de muis voordat de procedure kan deze techniek verbeteren door de stroom van CB uit de hersenen te verhogen en de tijd die nodig is voor het verzamelen, verminderen zoals beschreven in andere methoden10,11. Maar in het protocol beschreven hier, geen warmte pad of opwarming van de aarde van de muis werd gebruikt en tussen muizen was er geen moeite in het bedrag van CSF die kan worden ingezameld. Als voorbeeld van de toepassing die deze techniek kan worden gebruikt voor werden menselijke Aβ42 gemeten met behulp van ELISA. Aβ is bekend om zijn kleverig en kan houden aan het glas en de collectie buizen. In dit protocol, werden borosilicaatglas haarvaten en polypropyleen buizen gebruikt voor het verzamelen van het CB van muizen. Terwijl sommige Aβ aan de glazen capillaire en de wanden van de buizen van de collectie vasthouden kan, de ELISA resultaten tonen aan dat Aβ niveaus kunnen worden gemeten (Figuur 3). Het is echter een mogelijkheid dat Aβ niveaus gemeten vanaf het CB verzameld in dit protocol minder dan die beschreven door andere studies zijn, maar de haarvaten glas nodig zijn om te doorprikken via de dura van de muis om te verzamelen van het CB. Naast het meten van Aβ, kunnen ook andere proteïnen van belang worden gemeten met behulp van het CB verzameld.

Terwijl de eerder gepubliceerde methode van CSF collectie van Liu et al. 10 was bedoeld voor de permanente collectie van CB van levende muizen, de hier beschreven methode is voor het verzamelen van CB van muizen worden opgeofferd voor weefsel verzameling en analyse. Dus, deze techniek kan worden gebruikt samen met andere methoden van de dissectie voor muis weefsel collectie zoals het heeft geen invloed op de hersenen en het ruggenmerg, en na CSF-collectie (dat wil zeggen, na 10-30 min. voor ~ 10-15 µL van CB), de muis moet nog steeds worden ademhalen en onder verdoving. Daarom zijn de andere weefsels zoals bloed, hersenen, ruggenmerg en lever nog levensvatbaar voor verzameling en biochemische analyse. Hoewel de Liu et al. methode verzameld CSF zeer snel (10 min per muis voor 3-7 µL van CB), de hier beschreven methode vergt een langere tijd maar kan verzamelen meer CSF10. Een andere methode voor CSF collectie is ook beschreven door Maia et al. 11 beide de Liu et al. en Maia et al. methoden beschrijven verzamelen van CSF van muizen door hand-holding glas haarvaten of de uiteinden van de lader van het gel en prikken in de cisterna magna. De hier beschreven methode verschilt door het capillair aan een micromanipulator op te lossen. Dit zorgt ervoor dat het capillair immobiel blijft en besmetting uit bloed tijdens CSF-collectie vermindert. De micromanipulator staat ook voor meer precisie en nauwkeurigheid in de cisterna magna prikken te verkrijgen van CSF. Hoewel de methode van Maia et al. kon ook verkrijgen van 15-20 µL van CB per muis, vereist de cisterna magna herhaaldelijk prikken met de hand met de uiteinden van de gel loader, die het risico van besmetting van bloed of weefsel kan verhogen. Bovendien, de Maia et al. methode kan de druk in de hersenen met elke opeenvolgende prikken van de cisterna magna, zodat er minder en minder afnemen CSF verzameld over elke keer. De hier beschreven methode omvat slechts één punctie en het verlaten van het capillair in de cisterna magna CSF verder te verzamelen als het vullingen met CSF, terwijl de muis onder verdoving is. Dus het protocol beschreven hier voortdurend verzamelt CSF en minimaliseert de mogelijke besmetting van herhaalde lekke banden in de cisterna magna, alsmede de verstoring van het omringende weefsel.

Met grotere CSF sample collectie en zuiverheid, kunnen meer analyses worden gebruikt met deze vloeistof op verdere steun in onderzoek neurowetenschap. Het is bekend onder de onderzoekers dat de collectie van CB van muizen vervelend en alleen worden kan een beperkte steekproef kan worden verkregen (meestal vermeld als een maximum van 5-7 µL6,7,8,9). In de literatuur zijn er niet vele gedetailleerde protocollen voor CSF extractie gepubliceerd en dit protocol verbetert op een eerder gepubliceerde methode10 tot een minimum beperken van verontreiniging uit bloed, met behoud van de rijke collectie van CB. CSF kent vele toepassingen in onderzoek neurowetenschap en als één van de dichtstbijzijnde vocht naar de weefsels van het centraal zenuwstelsel, het is een waardevolle steekproef voor onderzoek. Het is eerder geconstateerd dat een volwassen muis een totaal volume van 40 µL van CSF12 heeft. Dit protocol is dus kunnen verkrijgen van 25%, zo niet meer van het totale bedrag van CB in een volwassen muis. Naast de ingeteelde stammen C57BL/6 en APP/PS1 muizen, hebben de outbred stam inprenting controle regio (ICR) muizen ook gebruikt met succes verzamelen CSF met behulp van dit protocol. CSF van muizen van verschillende leeftijden (4 tot en met 18 maanden) heeft met succes zijn verzameld met behulp van dit protocol. Dus moet er moet geen bezwaar in het CSF te verzamelen uit verschillende stammen of leeftijden van muizen met deze methode. Dit gedetailleerde protocol zal hopelijk door velen worden gebruikt ter verbetering van de ontwikkeling van CSF testen en andere analysetechnieken om te helpen bij onderzoek te begrijpen van neurodegeneratieve ziekten die invloed hebben op de hersenen en het ruggenmerg.

Het is essentieel dat het hoofd van de muis worden vastgemaakt strak, zodat het niet tijdens de dissectie en CSF-collectie (punt 3 van het Protocol verschuift). De site voor de eerste lekke band in de cisterna magna is belangrijk voor het verkrijgen van de overvloedige, niet-verontreinigde CSF. Het capillair moet niet te dicht aan alle bloedvaten te voorkomen van het monster verzameld worden ingevoegd. Aanpassing van het capillair is bovendien essentieel voor optimale CSF-collectie. Het gebruik van de micromanipulator zorgt voor fijne aanpassingen worden gemaakt zonder sterk verstoren van het omliggende weefsel en verontreiniging van het CB. Met behulp van de fijne controle van de micromanipulator, het capillair langzaam verrijdbaar is in- of uitzoomen om voor CB te stromen uit de muis en in het capillair voor collectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81650110527, 81371400) en nationale sleutel Basic Research programma van China (2013CB530900).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic) Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. 30037517 CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors 66 vision technology 54002
Dissecting curved forceps 66 vision technology 53072
Dissecting straight forceps 66 vision technology 53070
Mouse adapter (with ear bars) Made in-house. N/A Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope Meiji Labax Model 15381
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Magnetic base for micromanipulator Kanetec MB-K
Glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Sutter Instruments Model P-1000
Syringes (1ml) Tansoole 02024692 For 1ml.
Microtubes (1.5ml) Axygen MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free Calbiochem 539134
Human Aβ42 ELISA kit Invitrogen KHB3441
Piping (teflon tubing) World Precision Instruments MMP-KIT Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge Tiangen Biotech OSE-MC8
Cotton buds Obtained from any household store/pharmacy. N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
  2. Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6, (3), 131-144 (2010).
  3. Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78, (1), 47-54 (2012).
  4. Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer's Dement. 10, (6), 808-817 (2014).
  5. Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
  6. Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404, (10), 2895-2900 (2012).
  7. Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17, (3), 516-523 (2004).
  8. Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer's Dement. (2016).
  9. You, J. -S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5, (1), 290-296 (2005).
  10. Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
  11. Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5, (194), 194re2 (2013).
  12. Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics