Vivo에서 Murine 좌 골 신경의 모델 Perineural 내 습

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Cancer Research

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Summary

좌 골 신경으로 syngeneic 췌장암 세포를 주입 하 여는 vivo에서 murine 모델 perineural 내 습의 설명 합니다. 모델 신경 내 습의 넓이의 부 량과 perineural 내 습의 세포 및 분자 메커니즘의 조사를 지원 합니다.

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Deborde, S., Yu, Y., Marcadis, A., Chen, C. H., Fan, N., Bakst, R. L., Wong, R. J. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. J. Vis. Exp. (134), e56857, doi:10.3791/56857 (2018).

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Abstract

암 세포 나 perineural 내 습 (PNI)는 암에서 세포 증식 및 신경 microenvironment에서 마이그레이션 프로세스를 통해 신경 침공. 이 침공의 다양 한 암 종류에 의해 전시 유형과 매우 자주 췌장암에서 발견 된다. 마우스 췌 장 내 신경 섬유의 미세한 크기 orthotopic murine 모델에 어려운 PNI의 연구를 렌더링합니다. 여기, 우리가 PNI, 어디 우리가 주입 syngeneic 췌장암 세포 라인 Panc02 H7 murine 좌 골 신경의 모델 heterotopic vivo에서 설명 합니다. 이 모델에서 좌 골 신경 마 취 쥐의 노출 하 고 암 세포를 주입. 암 세포 주입의 지점에서 척수를 향해 proximally 신경에 침입 한다. 침공된 좌 골 신경 다음 추출 하 고 10 월 냉동 단면에 대 한 처리. H & E와이 섹션의 면역 형광 염색 단백질 표정에 침입과 변경의 두 학위의 정량화를 허용 합니다. PNI 주어진 그 다양성에 대 한 연구의 다양 한에이 모델을 적용할 수 있습니다. 다른 유전 수정 또는 다른 종류의 암 세포를 마우스를 사용 하 여 다른 암 종류 및 PNI의 세포 및 분자 메커니즘의 조사에 대 한 수 있습니다. 또한, 신경 침공에 대 한 치료제의 효과이 쥐를 치료를 적용 하 여 공부 될 수 있다.

Introduction

신경 자극 암 성장 및 마이그레이션1,2,3특정 종양 microenvironment를 형성 한다. Perineural 내 습 (PNI)는 암 통해 세포 및 신경 주위에 침략 하는 과정입니다. 그것은 신경 따라 원본 사이트에서 확장 암 침공 이후 전이의 유일한 노선으로 고려할 수 있습니다. PNI는 발생률이 22%에서 1001,2에 이르기까지 췌 장, 전립선, 머리 및 목, 침, 자 궁, 대 장 암 등 여러 암 종류에서 발견 된다. PNI 통증 연관 이며 더 생존 요금1,2, 빈약한 예 지와 연관 시킵니다.

Perineural 내 습의 모델 개발이 과정의 세포 및 분자 메커니즘을 명료 하 고 후보 치료제 PNI를 감소 테스트에 필수적 이다. 암과 신경 사이 상호 작용을 공부 방법은 시험관에 암 세포 신경 explants4, 느 루트 절5,6,7, 또는 특정 셀의 공동 문화를 포함 신경에서 microenvironment 같은 Schwann 세포7. 그러나 Vivo에서 접근,, 더 순수 관련, 암 마우스 모델에서 암 유발 되거나 이식의 사용을 포함 되며 전체 신경 microenvironment에 대 한 회계의 이점이 있다. Orthotopic에서 췌 장 또는 전립선 암, PNI 모델 보고8,,910 고 PNI의 발생률, 기록 될 수 있습니다 되었지만 그 기관에서 신경의 작은 크기 때문에 그것은 어려운 볼 수 전체 신경 따라서 PNI의 정도 계량 하기. 우리는 여기에 설명 하는 모델 PNI는 암 세포는11간단한 수술 통해 쥐의 좌 골 신경에 주입의 비보에 모델이입니다. Heterotopic 이식으로 척수 신경 내의 침공. 척수 주사의 사이트에서 신경 침공의 길이 신경 내 암의 볼륨 뿐만 아니라, 측정 될 수 있습니다. 중요 한 것은, 침략된 신경 분석 현미경, 분자 분석을 포함 한 다양 한도 수집할 수 있습니다. 암 세포의 다양 한 시험 될 수 있다, 그리고 호스트 쥐 유전자 수정 되거나 특정 화합물으로 치료도 사용 될 수 있습니다. 이 강력한 분석 결과 암 세포 및 호스트 microenvironment PNI의 메커니즘에 조사에 대 한 수정할 수 있습니다.

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Protocol

동물 주제와 절차의 모든 기관 동물 관리 및 사용 위원회 기념 슬로 안 Kettering 암 센터에 의해 승인 되었다.

1입니다. 암 세포의 준비

  1. 37 ° c.에 5 분 동안 0.25 %trypsin 수확 하위 confluent Panc02 h 7 셀 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포를 수집 합니다.
    참고: 셀에서에서 재배 되 고 T-225 플라스 크, 포함 약 12 x 10 80 %confluency 및 4 mL trypsin에 플라스 크 당6 셀/플라스 크를 사용 합니다.
  2. 5 분 세척 resuspending 셀에 의해 셀 펠 렛의 1 mL의 PBS에 pipetting 아래로 두 번), (여 고 전송 현 탁 액 1.5 mL microcentrifuge 튜브 얼음에 4 ° C에서 900 g x에서 셀 원심
  3. 5 분 동안 4 ° C에 900 g x에서 다시 셀 원심 고는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 삭제. 사출까지 얼음에 수송과 셀을 계속.

2입니다. 마우스 및 수술 준비

참고: 8 주 오래 된, 남성 및 여성 C57BL/6J 쥐가이 연구에 사용 됩니다. 수술 조건 우리의 기관의 IACUC 규칙을 따릅니다. 악기 소독, 수술 작업 표면 소독 동물 소독 하 고 외과 의사 멸 균 장갑 착용.

  1. 수술 전날에 2 %isoflurane 사용 하 여 마우스를 anesthetize 하 고 얇은 면도칼 또는 화학 머리 제거 에이전트 등 쪽 측에 대 퇴 골의 길이 따라 모피를 제거 합니다.
  2. 수술 당일, 유도 실에서 2 %isofluorane 사용 하 여 마우스를 anesthetize. 발가락 꼬집어 자극과 응답의 부족에 의해 anesthetization를 확인 합니다.
  3. 수 의사 연 고 마 취 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
  4. 그것의 복 부 측에 마 취 마우스를 놓고 부드럽게 주입을 다리에 가벼운 긴장을 만들 저자 극성 테이프와 각 다리를 확보 합니다. 마 취 isoflurane 정밀 기화와 원뿔 통해 전달 사용 하 여 유지 됩니다.
  5. 70% 알코올로 Betadine, 사출 사이트를 다시 청소 하십시오. 이 프로세스를 두 번 더 반복 합니다. 느슨한 머리카락 수술 필드에 남아 있는지 확인 합니다.
  6. 작은 위 아래 및 대 퇴 골에 병렬 약 2 m m 1 cm 절 개를 확인 합니다. 피부 아래 근육을 노출 하는 옆 집게와 철회.
  7. 좌 골 신경은 대 둔 근과 팔 뚝 femoris 근육에 깊은 실행 됩니다. 작은 위 fascial 비행기에 따라이 두 근육을 분리 하 고 노출 아래 좌 골 신경. 무뚝뚝한 절 개를 사용 하 여 주변 근육에서 신경 무료.
  8. 10 μ 주사기로 펠 릿에서 암 세포 (약 5만 셀)의 3 μ를 그립니다.
    참고: 컨트롤 또는 PBS의 3 μ를 그립니다.
  9. 지원에 대 한 주입 시점에서 신경 아래 작은 금속 주걱을 놓습니다. 해 현미경으로 시각화, 아래 바늘 삽입 시 가능한 신경에 평행으로 유지 하는 금속 베이스에 대 한 신경에 바늘을 삽입 합니다. 신경의 뒷면을 통해 펑크를 주의 해야 합니다. 이 과정을 통해 가능한 한 많은 신경의 처리를 최소화 합니다.
  10. 이상 5 신경으로를 천천히 주입 s. 주입 영역에서 전구 형성 좋은 주사를 나타냅니다. 다음 3 자리에 바늘을 두고 바늘을 부드럽게 제거 하기 전에 s. 3 장소에 바늘을 유지에서 신경 세포의 역류를 최소화 하는 s.
    참고: 주입은 말 초 신경이 나 척수 쪽으로 수행할 수 있습니다. 그것은 실험의 집합 내에서 일관성을 유지 해야 합니다. 세포 밖으로 유출, 동물 실험의 분석에 포함 되지 해야 합니다. 경험, 이러한 이벤트는 매우 드문.
  11. 신경을 원래 위치로 돌아갑니다. 커버 overlying 근육 신경. 적절 한 진통으로 쥐를 처리 한 다음 5-0 나일론 봉합 피부를 닫습니다.
  12. 그것은 완전히 마 취에서 깨어난다 때까지 마우스를 복구 하는 동안 관찰에 대 한 깨끗 한 장에 혼자 놓습니다.
    참고: 그것은 완전 한 의식 회복을 동물에 대 한 5-15 분 걸립니다. 동물 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 때까지 무인 왼쪽입니다. 동물 다른 동물을 완벽 하 게 복구 될 때까지 회사에 반환 되지 않습니다. 그 후, 복구 적어도 한 번 모든 24 h 72 h에 대 한 평가.

3. 좌 골 신경 추출

  1. Postop 날 #7, CO2마우스를 안락사. 그것의 복 부 측에 마우스를 놓고 핀을 사용 하 여 원심 사지를 안정화 합니다.
  2. 주입 된 사지 및 몸통의 등 쪽 측에 피부를 제거 합니다.
  3. 무뚝뚝한 절 개를 사용 하 여, 좌 골 신경은 근육에 깊은 노출.
  4. 장 골과 천 골 사이 신경 과정. 척수 영역에서 신경에 액세스 하려면, 두 개의 뼈를 구분 합니다. 좌 골 신경은 좁은 지역에 폐쇄가 위를 먼저 삽입 한 다음 마우스를 잡고가 위를 엽니다. 섬세 한 수 고 해 부 동안 좌 골 신경의 무결성을 유지 합니다.
  5. 조심 스럽게 좌 골 신경 distally, 대 퇴 골의 끝을 proximally 척수 해 부.
  6. 참고: 침공된 신경은 매우 연 약하고 긴장 아래 속보 또는 강력한 처리 하는 경향이 있다.
  7. 신경의 선단부를 절단 하 여 수확. 인접 한 조직에서 그것을 해방 하는 동안 신경을 조심 스럽게 들어올립니다. 척추에서 그것의 출구에 최대한 가깝게 인접 끝에 신경을 잘라.
  8. 기록 후 버 니 어 캘리퍼스를 사용 하 여 침략의 총 길이. 이 거시적인 추정만 나타내는 것입니다.

4. 신경 처리 및 정량화

  1. 10 월 복합에 해 부 신경을 포함 합니다. 경도 신경을 확실 하 고 가능한 몰드의 바닥에 평평.
  2. 편지 P 및 d.를 표시 하 여 신경의 근 위 및 원심 측 카세트에 표시
  3. 그들은 하지 즉시 sectioned 하는 경우 드라이 아이스, 위에 포함 된 신경을 배치 합니다. 샘플 몇 주 동안-80 ° C에서 보존 될 수 있습니다.
  4. 섹션 샘플 Cryostat 톰을 사용 하 여 유리 슬라이드에 5 μ m 두께 장소 섹션에서. 만약에 가능 하다 면, 슬라이드 당 2 신경 섹션 적합. 신경의 근 위 쪽을 나타냅니다.
  5. H & E12얼룩을 사용 하 여 슬라이드를 얼룩.
  6. 디지털 고해상도 디지털 데이터를 제공 하는 슬라이드 스캐너로 얼룩진된 신경 섹션을 검색 합니다.
  7. 측정 거리 버튼을 클릭 하 여 침략의 길이 계량 이미징 소프트웨어를 사용 하 여, 침입, 또는 다른 영역 매개 변수를 원하는. 침략의 길이의 좋은 의견에 대 한 동일한 신경의 여러 부분 (2 ~ 4)를 사용 합니다.

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Representative Results

이 방법은 같지는 신경의 비보에 모델을 만드는 murine 좌 골 신경으로 췌장암 세포의 외과 이식을 설명 합니다. 그림 1 좌 골 신경의 해 부 위치 및 주사의 사이트를 보여 줍니다. 그림 2 는 누드 마우스의 두 좌 골 신경. 주입 하는 PBS 신경 (왼쪽) MiaPaCa-2 암 세포 (오른쪽)와 함께 주입 하는 신경에 비교 될 수 있습니다. 암 세포를 주입 하는 신경 종양에 의해 침투 되 고 두꺼운 고 PBS를 주입 하는 신경 보다 나타납니다.

그림 3 야생 유형 및 보안 코 쥐에서 췌장암 세포 Panc02H7에 의해 좌 골 신경의 정량 차이 보여준다. 여 코 마우스는 마우스는 접착 분자 신경 세포 접착 분자 1은 결핍13. 길이 침입의 영역 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 측정할 되어 있다. 침공 여 코 쥐7에서 크게 감소 발견 됐다.

Figure 1
그림 1 : 마우스 좌 골 신경 및 사출 사이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 두 마우스의 좌 골 신경 해 부. PBS 주입 신경 (왼쪽)와 신경 주사 MiaPaCa 2 암 세포 (오른쪽)이 표시 됩니다. 검은 화살표 주사의 사이트를 표시합니다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : Panc02H7 야생 유형 및 보안 코 쥐에 암 세포를 주입 하는 좌 골 신경의 H & E 경도 섹션. 흰색 화살표는 주입 및 척수의 근 위 측의 사이트를 나타냅니다. 검정색 화살표는 해당 값 (mm)의 길이 나타냅니다. 눈금 막대: 5mm (상단 이미지)와 0.2 m m (아래 이미지). 신경 침공, 길이 침입의 영역에 의해 측정 된 부 량이 고 데이터 대표 평균 ± sd. n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (NCAM1 KO), * * P < 0.005, * * * P < 0.0005 t 검정을 사용 하 여. (Deborde 에서 유래한 다. 2016,7). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 프로토콜에서 우리는 vivo에서 murine 모델 췌장암 세포에 의해 좌 골 신경의 정량화에 대 한 있도록 perineural 내 습의 기술. 이 모델에는 신경의 분자 메커니즘의 연구 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여 성공적인 실험 과정에서 3 개의 중요 한 단계에 대 한 신중 접근 필요: 1)의 주입 암 세포 (2.7, 2.8), 단계 2) 침공된 신경 (3.4 단계)의 추출 및 수확된 신경 (4.1 단계)의 3) 처리.

주입을 피하기 위해 암 세포의 손실에 지도 하는 신경의 뒤 벽을 통해 puncturing 위대한 주의 함께 이루어져야 합니다. 일단 바늘 장소에 주입 할 수 느리고 꾸준한 속도로 이상 5 암 추진에서 유압 힘을 방지 하기 위해 s 세포 주입의 지점에서 너무 멀리 앞으로. 추가 3 주사 후 신경에 바늘을 두고 s 다시 흐름 및 암 세포 누설을 극소화 할 것 이다. 침공된 좌 골 신경은 매우 깨지기 쉬운 좌 골 신경 추출 중 절 개는 매우 부드러운 되어야 합니다. 암 내 습 좌 골 신경의 정상적인 세포 조직 방해. 침공된 신경 표시 하더라도 직경 비 주입에 비해 진하게 또는 침공 비 신경, 그들은 더 사소한 스트레칭 및 조작 깨는 경향이 있다. 처리를 위해 10 월에 삭제 신경의 포함, 동안 신경 금형에 완전히 평면 계획은 확실히 하기 위하여 매우 중요 하다. 이 단계는 샘플의 단면에 대 한 적절 한 분석에 대 한 신경의 전체 길이 캡처할 수 있습니다. 단단한 종양은 신경에 자주 모금 금형의 바닥에서 신경에서 종양을 근 신경 세그먼트를 방지 하기 위해 손질 해야 합니다. 금형에 대 한 신경의 전체 길이 완전히 평평 누워 해야 합니다.

많은 수정이이 프로토콜을 사용 하는 동안 간주 될 수 있습니다. 작은 금속 주걱, 좌 골 신경에 따라 배치를 사용할 수 없을 때 넓은 집게의 쌍의 표면 대신 사용할 수 있습니다. 하지만이 방법의 단점이 주입 및 과도 한 무력을 사용 하는 경우는 신경 부 수 기 위해서는 잠재력의 저하 보기 삽입, 후에 바늘을 개최 하는 집게를 사용할 수 있습니다. 또 다른 방법은 해제 다음 신경 스트레칭 겸 여 신경 미세 집게를 사용 하는 것입니다. 이 방법은 쉽게 실행 하는 긴장 및 주입, 동안 안정화를 제공 하지만 신경의 과도 한 스트레칭과 함께 신경 손상 될 수 있습니다. 주입 중 근 또는 원심 방향에서 할 수 있습니다 하지만 우리는 두 경우 모두, 암 침입의 방향은 일반적으로 척수 쪽으로 나타났습니다. 따라서, 우리는 더 암 세포는 척수 쪽으로 밀어 나중 침공의 길이 측정을 혼동 수 있는 유압 힘을 최소화 하기 위해 distally 주입 선호 한다. 주입 실험 집합 내에서 방향 선택에 일치 하는 것이 중요 하는 것이 좋습니다.

우리는 syngeneic 접목의 모델 제시, 비록 비슷한 기법만 약간 변이 가진 immunodeficient 쥐로 xenografts 인간 암 세포에 대 한 사용할 수 있습니다. 누드 마우스에 xenografts syngeneic 모델에서 신경의 유사한 길이를 암 침공의 필요한 긴 기간 수 있습니다. 다른 암 세포 라인도 사용할 수 있습니다. PNI은 머리와 목, 전립선, 및 피부 암 뿐만 아니라, 췌 장의 암에. 우리 연구소는 인간 췌장암 세포 라인 MiaPaCa-2 좌 골 신경에 누드 마우스 및 Panc17,,1415주입 하는 것이 성공적으로.

가능한 부작용 쥐 때때로 씹는 여 상처의 결과로 그들의 바늘으로 상처 dehiscence를 포함 됩니다. 이 경우, 상처는 다시 봉합 될 해야 합니다. 우리 먼저 3 수술 일 동안 매일 상처를 확인합니다. 쥐 수 있습니다 또한 도보 약간 다리를 저는 postoperatively, 가능성이 모두는 수술으로 암 그들의 좌 골 신경의 침공에서 통증 때문. 이것은 보통 충분히 심각한 아픔 약물 치료를 필요로 하지입니다.

이 모델에는 제한이 있습니다. 절차 동안 신경의 곤란 하 게 스트레칭의 일부 금액은 신경에 손해를 만들 수 있습니다. 또한, 세포는 신경으로가 정확한 수를 제어 하기 어렵습니다. 또한,이 모델은 이미 침공 신경 세포 연구 제한 됩니다. 기본 종양에 있는 암 세포와 신경의 상호 작용을 공부 하는 모델이 아니다. 사용 하 여 위장의 신경 및 좌 골 신경의 주요 단점은 좌 골 신경 췌장암의 전이성 사이트 아니에요. 구성과 신경 섬유의 특성 차이 침공에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 접근성 및 췌 장 신경의 매우 작은 크기에 이러한 연구를 허용 하지 것 이다.

초보자를 위한 주요 제안 우리의 랜드마크는 쉽게 확인 될 수 있도록 계획 된 절 개 사이트 주변 넓은 지역에 머리를 제거 하 고 주입을 시작 하기 전에 꾸준한 위치를가지고 있는지 확인 것입니다. 많은 주사 후 수행자 신경 침공과 동물의 100%를 얻을 수 있어야 합니다.

이 모델은 연구에 대 한 암 동물 모델에서 신경 사이 상호 작용 수 있습니다. 그것은 유전자 변형된 마우스, 암 세포, 또는 둘 다를 사용 하 여 종양 연구의 넓은 범위에 적용할 수 있습니다. 신경 따라 종양 침입에 대 한 약리 치료 기간과 치료 및 제어 그룹 사이 침략의 영역을 비교 하 여 테스트할 수 있습니다. 이러한 다른 가능한 응용 프로그램 모델 PNI 공부는 매우 다양 하 고 강력한 도구가 확인 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

저자는 분자 세포학 시설 및 기념 슬로 안 Kettering 암 센터의 동물 시설에서 제공 하는 기술 서비스를 인정 합니다. 이 작품 (R.J. 웡)에 NIH 교부 금 CA157686 및 P30 CA008748에 의해 지원 되었다 (기념 슬로 안 Kettering 암 센터 지원 그랜트).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS) Any Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL Falcon 352098 Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL Axygen MCT-150-C-S Step 1.2
Electric razor WAHL 9962 Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL Baxter 1001936060 Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape 3M Blenderm 70200419342 Step 2.3
Betadine Swapsticks PDI SKU 41350 Step 2.4
Webcol Alcohol Preps Covidien 5110 Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps) Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe Hamilton 80308 Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula Fisher Scientific S50823 Step 2.7
Dissecting microscope Step 2.7
Bupivacine, 1 g Enzo Life Sciences BML-NA139-0001 Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture Ethicon 698H Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound VWR 25608-930 Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds VWR 25608-916 Step 4.1

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References

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