Ex Vivo Инфекции половых слизистой лимфоидной ткани человека и женщин с вирусом иммунодефицита человека 1 и Histoculture

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Инфекция тканях человека с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) ex vivo обеспечивает ценный 3D модель патогенеза вирусов. Здесь мы описываем протокол для обработки и заразить пробах тканей человека миндалин и женских половых mucosae с ВИЧ-1 и поддерживать их в культуре в интерфейсе жидкости воздух.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. J. Vis. Exp. (140), e57013, doi:10.3791/57013 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Histocultures позволяют изучать межклеточных взаимодействий в тканях человека, и они могут быть использованы для модели взаимодействия хост возбудитель контролируемых лабораторных условиях. Ex vivo инфекции человека тканей с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), среди других вирусов, успешно используется для расследования ранних патогенеза заболеваний, а также платформу для тестирования эффективности и токсичности противовирусных препаратов. В настоящем протоколе мы объясним, как обрабатывать и заразить эксплантов ткани ВИЧ-1 от человека миндалин и шейки матки mucosae и поддерживать их в культуре на вершине желатин губки на интерфейсе жидкости воздуха около двух недель. Этот параметр-поляризованных культуры увеличивает доступ к питательных веществ в питательной среды и кислорода, хотя прогрессирующая потеря целостности тканей и функциональной архитектуры остается основным ограничением. Этот метод позволяет мониторинга репликации ВИЧ-1 и патогенез, используя несколько методов, в том числе immunoassays, ПЦР и проточной цитометрии. Значение физиологическое изменчивость между донорами ткани, а также между эксплантов из разных областей же образца, может существенно повлиять на результаты экспериментов. Для обеспечения воспроизводимости результатов, важно использовать достаточное количество эксплантов, технические реплицирует и доноров соответствием контроля условий для нормализации результаты экспериментального лечения при компиляции данных из нескольких экспериментов (т.е. ., проведенные с помощью ткани от различных доноров) для статистического анализа.

Introduction

Монотипические Би мерного клеточных культур, здесь упоминаемые как обычных, не учитывают пространственная и функциональная связь между большим разнообразием типов клеток, которые составляют ткани и органы. Этот аспект имеет первостепенное значение для экспериментальных моделях болезней, как вмешательство в гомеостатических межклеточных взаимодействий является движущим фактором всех патологий. Ткани эксплантов предлагают преимущества для моделирования здоровья и болезни среди людей, поскольку они сохраняют cytoarchitecture и многие важные аспекты функциональных органов, как они находятся в естественных условиях, хотя за ограниченное количество времени1. Например после ex vivo вызов с антигенами напомнить, например, дифтерии анатоксином или столбняка, миндалин ткани реагирует с энергичной производства антиген специфические антитела2. Как и любой другой ex vivo модели, histoculture имеет свои собственные ограничения: изменчивость между донорами, ткань поляризации, выживание ограничены ткани и сложности в мониторинге клетки за пределы глубины confocal микроскопии1. Тем не менее эксплантов тканей человека остаются модель выбора для изучения гомеостаза и патогенных иммунологические процессы в организме человека, в том числе хост возбудитель взаимодействий и потенциальных терапевтических вмешательств3.

Критические события патогенеза ВИЧ-1, имели место в тканях. Инфицирования слизистой оболочки половых органов приходится большинство всех ВИЧ-1 передачи события во всем мире4. Лимфоидной ткани является основной сайт репликации вируса во время острой инфекции и гаваней значительный пул латентно инфицированных клеток5, и их сохранение представляет собой основное препятствие для достижения лечения6. Культура и ex vivo вызов человека лимфоидных и слизистых тканей обеспечивают ряд преимуществ перед обычными системами на основе изолированных клеток для изучения ВИЧ-1. Например клетки ткани резидент может поддерживать инфекции ВИЧ-1 в отсутствие внешних активации, в отличие от мононуклеаров периферической крови1. Использование эксплантов лимфоидной ткани позволило лучше понять некоторые ключевые механизмы, лежащие в основе CD4 T клеток истощениет.е., прохожий эффект7, который является отличительной чертой острой инфекции. Сохранение структуры как B клеток фолликулов в лимфоидной ткани8 и эпителия в женских половых слизистой эксплантов9 предлагает уникальную возможность интегрировать пространственные и функциональные особенности ВИЧ-1 инфекции на этих сайтах. Наконец histocultures были успешно использованы модели и исследования герпеса и ВИЧ-1 инфекции10,11, а также для Доклинические испытания антиретровирусных препаратов и multitarget бактерицидные12, 13 , 14 , 15.

Здесь мы описываем подробный протокол для культуры тканей человека эксплантов, полученные из миндалин и слизистых тканей от нижней женских половых органов (матки), охватывающих рассечение тканей в explant вызов с ВИЧ-1-поляризованных способом. Культура ткани эксплантов в жидкость воздуха интерфейс, с помощью губки желатин в качестве поддержки, максимизирует воздействие воздуха кислорода, обеспечивая доступ к питательной среды питательные вещества через Губка капилляров, затягивая тем самым их естественного распада. Наиболее непосредственным способом оценки репликации ВИЧ-1 в нашей системе заключается в том, чтобы измерить количество вируса, выпущенное в среде культуры экспланта со временем иммуноанализа или ПЦР. Инфекции ВИЧ-1 и патогенез (например., CD4 T клеток истощения) могут также быть оценены в ткани эксплантов путем массового извлечения РНК/ДНК и ПЦР, в situ пятнать или единого анализа клеток после переваривания ткани проточной цитометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол для коллекции ткани человека может потребовать этические утверждения местными компетентными органами. В случае указанной операции как удаление миндалин и гистерэктомия образцы не являются собранные специально для цели исследования и исследования не считается человеческих субъектов исследования (национальные институты здравоохранения. Исследования на человеке. HTTPS://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-investigator#tabpanel11). Однако, получение личной и медицинской данных доноров ткани (например., пол, возраст, текущего употребления наркотиков, история инфекции, и т.п.) которые могут помочь интерпретировать результаты экспериментов, позы обеспокоенность осознанного согласия и конфиденциальности, которые должны быть обратился в протоколе для коллекции тканей.

Предупреждение: Вся процедура должна осуществляться в биологической безопасности кабинета. Все образцы человека, в том числе от «здоровый» лиц, может гавани инфекционных агентов. Оператор должен получить подготовку для работы с кровью патогенов безопасно обрабатывать образцов тканей, даже если эксперименты не связаны с использованием ВИЧ. Оценку риска процедура рассечение тканей и инфекции с ВИЧ должны осуществляться квалифицированного персонала для обеспечения безопасности оператора и coworkers. Для использования инфекционных ВИЧ требуется выделенный биобезопасности сред уровня 2 или 3 в зависимости от страны и Института конкретных правил опасных биологических и патогенов.

1. Подготовка желатин губки

Примечание: Хотя это не строго необходимо подготовить желатин губки до рассечение тканей, это более удобно следовать порядку, изложенные здесь, особенно при обработке большого объема ткани и/или от многих доноров.

  1. Подготовка питательной среды (CM) и дополнить его с антибиотик раствор (Tircacillin клавуланат микс) перед использованием, чтобы сделать CMT (Таблица материалов). Отменить любые остатки антибиотиков решение.
    Примечание: Ticarcillin и клавуланата в CMT плохо стабильной. Если необходимо, повторно дополнить CMT Антибиотик раствор после около 24 h от подготовки. Он не требуется для добавления Антибиотик раствор для explant среднего каждые 24 часа во время культуры.
  2. Заполните 100 мм х 20 мм Петри с около 20 – 30 мл CMT.
    Примечание: Этот параметр является оптимальным подготовить достаточно желатин губки для двух пластин 6-ну или один 12-ну пластины в то время. Если требуются многие плиты, используйте широкий Петри и больший объем CMT ускорить подготовку.
  3. Передача sponge(s) желатин в Петри с помощью стерильный пинцет. Влажные губки с обеих сторон и позволяют губки понежиться средний 1 мин пресс губки против нижней части Петри для около 2 мин, с использованием стерильных шпателем.
    Примечание: Этот шаг имеет решающее значение, потому что наличие воздушных пузырей в Губка будет блокировать капилляров, через которые культуры среднего питательных веществ достичь ткани. Желатин губки являются чрезвычайно хрупким, когда обезвоженной. Аккуратно надавите на губку с лопаткой, особенно в начале, чтобы избежать нарушения губки.
  4. Использование стерильными ножницами вырезать Регидратированные желатин губки на куски одинакового размера около 1 см2. Передача 1 кусок губки с помощью щипцов в каждой скважине плиты культуры. Добавьте 3 – 4 мл CMT в каждой скважине 6-ну плиты (миндалины) и 1 мл на колодец в 12-ну плиту (шейка матки). Поместите пластины в инкубаторе, задать при 37 ° C, 5% CO2, ≥ 90% влажности, до тех пор, пока ткань эксплантов готовы быть загружены на губки.
    Примечание: Объем CMT для добавления в пластину следует скорректировать до толщины Губка держать эксплантов в интерфейсе жидкости воздух.

2. рассечение тканей человека миндалин

Примечание: Миндалин должны быть обработаны как можно скорее после операции, в идеале в тот же день операции. Кроме того образцы можно оставить на ночь погруженным в CMT при 4 ° C.

  1. Разрешить см достаточно времени, чтобы достичь комнатной температуры (RT) или положить его в водяной бане предварительно нагревают при 37 ° C. Дополнить см раствором антибиотиков (CMT) перед использованием. Отменить любой антибиотик раствор, осталось. Залейте раствор 70% этанола в чистый контейнер замочить щипцы и скальпеля всякий раз, когда требуется во время процедуры вскрытия. Очистите инструменты и измените лезвие скальпеля между Анатомирование образцов от различных доноров.
  2. Передача миндалин от транспортировки контейнера в 100 мм Петри блюдо, содержащих 10-20 мл CMT, с использованием стерильный пинцет.
    Примечание: Образцы с широкой области прижигание, кровавый, или некротических тканей должны быть отброшены.
  3. Используйте крышку Петри блюдо как поверхность резки для рассечения тканей. Проведение ткани аккуратно пинцетом, нарезать каждый миндалин несколько большой помощью стерильным скальпель и лезвие.
    Предупреждение: Острые инструменты обработки для того чтобы рассечь человеческих образцов увеличивает риск повреждения и загрязнения. Оператор должен рассмотреть носить металла, сетка, порезам перчаток в качестве дополнительной защиты.
  4. Обезболивающий укол, кровавый, удалить и миомы ткани и любой части содержащие tonsilloliths (кальцинированные материалы) и/или с Грин коричневого цвета с помощью щипцов и скальпеля.
    Примечание: Во время работы на один кусок ткани, важно сохранить остальной части ткани, погруженной в среде, чтобы избежать высыхания ткани.
  5. Каждый кусок ткани нарежьте ломтиками около 2 мм в толщину. Удалите любые нежелательные части как в предыдущем шаге. Порезать кусочками ткани на 2 мм толстой полоски. Нарежьте полосками ткани 2 мм толстой блоков. Это должно привести к ткани эксплантов примерно 8 мм3.
  6. Перенесите эксплантов в новой 100 мм Петри, содержащих 10 – 20 мл во избежание высыхания ткани во время разбирательства с рассечение. В конце рассечение вихрем пластину в случайном порядке распределения экспланта. 9 место ткани эксплантах на вершине каждой желатин Губка в 6-ну пластине с помощью щипцов, позволяя пространства между ними. Возвращение пластины в инкубаторе.
    Примечание: Как правило, эксплантов культивируемых на ночь и прививка культур с ВИЧ-1 выполняется следующий день. Это чтобы убедиться, что нет бактериальной или грибковой загрязнение развивается в культуре. Кроме того клетки, как правило, выход ткани миндалин эксплантов после вскрытия. Во многом этот процесс завершается в течение первых 24 ч культуры1.
  7. Удаление всех биологических отходов в подходящих контейнерах согласно правилам Института на обработку опасных биологических и оценки конкретных рисков.

3. инфекции миндалин ткани эксплантах с ВИЧ-1

Примечание: Чтобы уменьшить результат изменчивости между независимыми эксперименты, же вирус подготовки должно использоваться для всего исследования. Вирус может распространяться в экзогенно активированные периферической крови мононуклеаров и затем супернатанта культуры может быть aliquoted для хранения при температуре-80 ° C избегать повторного замораживания и оттаивания (Таблица материалов).

  1. Положите см в ванне с водой, предварительно нагревают при 37 ° C. Дополнить см раствором антибиотиков (CMT) перед использованием. Отменить любые остатки антибиотиков решение.
  2. Аспирационная среднего в знаке 6-колодец с пипетки и отменить его в контейнер с дезинфицирующим раствором. Наклона пластины и аккуратно вставьте желатин губки в верхней части колодца разрешить средне-собрать на дне и аспирационная и выбросьте его. Добавьте 3-4 мл CMT в каждой скважине.
  3. Оттепель подготовка вирус ВИЧ-1 в водяной бане при температуре 37 ° C. При необходимости разбавьте запасов вируса с см (Таблица 1).
    Примечание: Вирус запас следует разбавить таким образом, чтобы выбранные посевным материалом содержится в объеме 5-8 мкл (Таблица 1). Для эффективной инфекции важно использовать минимальное время, необходимое между оттаивания подготовка ВИЧ-1 и заражая эксплантов ткани.
  4. Пипетка посевным материалом вируса непосредственно поверх каждого из 9 эксплантов на губку желатина. Возвращение знаке в инкубатор, как только инфекция будет завершена. Отменить любые остаточные вирус подготовки. Далее в разделе 5.
    Примечание: Точно доставить вирус посевные оператор следует с использованием обратного дозирования техники и изменение подсказки для каждой скважины. Это предполагает, что толкает поршень пипетку до продувки позиции (вторая остановка) разработать вирус посевным материалом, и толкает к первой остановки доставить посевным материалом, который помогает минимизировать образование пузыря и ошибки связанные с повторных проб малых тома, то есть, 5 – 8 мкл.

4. Вскрытие и инфекции слизистой оболочки шейки матки

Примечание: Для получения оптимальных результатов, эксплантов шейки матки mucosae следует обработать и инфицированных как можно скорее после операции, в идеале в тот же день операции. Кроме того образцы можно хранить погруженным в CMT на 4 ° C на ночь и инфицированных сразу после вскрытия.

  1. Разрешить см достаточно времени, чтобы достичь RT или положить его в водяной бане предварительно нагревают при 37 ° C. Дополнить см раствором антибиотиков (CMT) перед использованием. Отменить любые остатки антибиотиков решение. Залейте раствор 70% этанола в чистый контейнер замочить щипцы и скальпеля всякий раз, когда требуется во время процедуры вскрытия. Очистите инструменты и измените лезвие скальпеля между Анатомирование образцов от нескольких доноров.
  2. С помощью стерильный пинцет, передача образца от транспортировки контейнера в 100 мм Петри, содержащих 10 – 20 мл CMT.
  3. Используйте крышку Петри блюдо как поверхность резки для рассечения тканей. Проведение ткани аккуратно пинцетом, отделить слизистой оболочки ectocervix и/или эндоцервикса от под стромы и мышечной ткани (подслизистой) с скальпель и лезвие для получения полосы слизистой.
    Примечание: Во время работы на один кусок ткани, важно сохранить остальной части ткани, погруженной в среде, чтобы избежать высыхания ткани.
  4. Нарезать полоски 2 мм шириной слизистой оболочки, снимите и выбросьте столько подслизистой как можно, оставив только 2 мм толщиной слоя ткани. Вырежьте полосы в 2 мм толстой блоков. Это должно привести к ткани эксплантов примерно 8 мм3.
    Предупреждение: Острые инструменты обработки для того чтобы рассечь человеческих образцов увеличивает риск повреждения и загрязнения. Оператор должен рассмотреть носить металла, сетка, порезам перчаток в качестве дополнительной защиты.
  5. Передача ткани эксплантов в новой 100 мм Петри, содержащих 10 – 20 мл во избежание высыхания ткани во время разбирательства с рассечение. В конце рассечение вихрем пластину в случайном порядке распределения экспланта.
  6. Стерильным пинцетом передачи эксплантов в стерильных 1,5 мл Конические трубки (максимум 16 эксплантов в трубу). Удалите любые средства в трубе с помощью пипетки.
  7. Оттепель ВИЧ-1 подготовки в водяной бане при температуре 37 ° C. При необходимости разбавьте запасов вируса с см. Передача вируса в трубки, содержащие эксплантов. Отменить любые остаточные вирус подготовки.
    Примечание: Вирус запас следует разбавить таким образом, чтобы выбранные посевным материалом содержится в объеме минимум 0,5 мл (Таблица 1). Чтобы уменьшить результат изменчивости между независимыми эксперименты, же вирус подготовки должны использоваться для всего исследования (Таблица материалов).
  8. Передача трубы в термо шейкер и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C, покачиваясь на 300 об/мин. Аккуратно переворачивают трубы несколько раз каждые 30 – 60 мин.
    Примечание: Для эффективного инфекции, важно использовать минимальное время, необходимое между оттаивания ВИЧ-1 подготовки и передачи трубы до 37 ° C.
  9. Заполните 6-ну тарелку с 3 – 4 мл на хорошо стерильных фосфатный буфер (PBS). При инкубации с ВИЧ-1, отбросить все вирус подготовки в трубки в контейнер с дезинфицирующим раствором с помощью пипетки. Передача эксплантов в пластину 6-а, содержащий PBS с помощью щипцов.
  10. Разрешить эксплантов отдых в PBS 1 мин на RT и затем промойте их, мягко закупорить прихваченного PBS в колодец 2 - 3 раза. Выбросите PBS в контейнер с дезинфицирующим раствором с помощью пипетки. Добавьте 3 – 4 мл новой PBS в каждой скважине. Повторите еще два раза в общей сложности три автомойки. Выбросите PBS просто перед передачей эксплантов губки, чтобы избежать высыхания ткани.
    Примечание: Эксплантов слизистой оболочки шейки матки и в частности эндоцервикса, освободить большое количество слизи во время инфекции. Важно, чтобы вымыть и удалить столько слизь как можно скорее, потому, что неспецифические удержания на эксплантов и последующего выпуска в надосадке культуры вируса может маскировать репликации вируса.
  11. С помощью щипцов, передачи 5-8 эксплантов поверх каждого желатин Губка в пластине 12-хорошо. Возвращение пластину в инкубаторе.
  12. Удаление всех биологических отходов в подходящих контейнерах согласно правилам Института на обработку опасных биологических и оценки конкретных рисков.

5. Histoculture

  1. Измените см каждые 3 дня, начиная с момента заражения до дня 12 – 15 послеоперационные инфекции. СМ и/или эксплантов можно отведать на регулярной основе на протяжении всего времени культуры оценки репликации ВИЧ-1 среди других параметров.
  2. Положите см в ванне с водой, предварительно нагревают при 37 ° C.
    Примечание: Это не требуется для дополнения см с антибиотиком решение на данном этапе.
  3. Собрать образец см с пипетки и перевести его в стерильных 1,5 или 2 мл колпачок трубки для хранения при температуре-80 ° C.
    Примечание: См от реплицировать скважин объединяются в коллекции.
  4. Урожай ткани эксплантов стерильным пинцетом, удалить избыток среды на эксплантов, поместив их на листе бумаги (опционально) и передачи эксплантов в стерильных 1,5 или 2 мл трубки колпачок. Обрабатывать или хранить образцы тканей как предусмотрено эксперимент.
    Примечание: Для проточной цитометрии, эксплантов немедленно усваиваются с ферментативной коктейль для получения одной ячейки подвеска (для более подробную информацию см. ссылки 1, 9, 16 и 17). Для извлечения РНК эксплантов хранятся в РНК стабилизации раствор при температуре 4 ° C на ночь перед их сохранением в-80 ° C. Для экстракции ДНК или в situ окрашивание (шейка матки) эксплантов может оснастки замороженные в жидкого азота или сухого льда/этанол пульпы и хранится при температуре-80 ° C. В качестве альтернативы миндалин эксплантов может устанавливаться путем погружения в раствор PBS и 4% параформальдегида для пятнать в situ .
  5. Аспирационная остаточного см в скважины с дозатор и отменить его в контейнер с дезинфицирующим раствором. Наклона пластины и осторожно надавите желатин губки в верхней части колодца разрешить средне-собрать на дне и затем аспирационная и отменить его.
  6. Добавьте мл 3 – 4 см к каждой скважины. С помощью стерильный пинцет, возвращаемое любой ткани эксплантах, упал в средне-Губка желатина. Возвращение пластину в инкубаторе.
  7. В конце культуры распоряжаться всех биологических отходов в подходящих контейнерах согласно правилам Института на обработку опасных биологических и оценки конкретных рисков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Некоторые методы могут использоваться для оценки репликации ВИЧ-1 в эксплантов ткани. Наши стандартные считывания необходимо измерить количество ВИЧ-1 p24gag выпущен в см с течением времени с иммуноанализа18.

Эксплантов ткани от различных доноров, инфицированных же посевные тот же запас ВИЧ-1, может принести различное количество вируса (Таблица 1). Это объясняется рядом факторов, таких как число и состояние клеток-мишеней ВИЧ-1 и наличие совместно заражения патогенами в ткани16,19. На рисунке 1мы предоставляем пример продуктивной и несостоявшимися ВИЧ-1 инфекции шейки матки слизистой эксплантов как определено количество p24gag выпущен в см, по сравнению с соответствием доноров эксплантов, получавших антиретровирусные наркотиков ламивудин (3ТС) Это полностью подавляет репликации ВИЧ-1. Хотя этот элемент управления появляется излишним для инфекции эксплантов тканей от донора в A, он помогает в дискриминацию путем прерывания (B) от продуктивной инфекции (C) в эксплантов, которые дают низкий уровень репликации ВИЧ-1.

Использование антиретровирусных препаратов как условие управления может быть полезным для изучения инфекции ВИЧ-1 в тканях, которые гавани низкое количество клеток-мишеней, как слизистую оболочку шейки матки и при использовании медленно репликации ВИЧ-1 варианты, такие как некоторые первичных изолятов. Кроме того для тканей, такие вирусы, важно рассмотреть вопрос об использовании более чувствительных методов обнаружения, например ПЦР.

Figure 1
Рисунок 1 : Репликации ВИЧ-1 в слизистую оболочку шейки матки эксплантах от трех различных тканей доноров. Пробы ткани шейки матки эксплантов были инфицированы же посевные ВИЧ-1Бал погружение в наличии вируса и культивировали на 15 дней в наличие или отсутствие антиретровирусного препарата ламивудином (3TC) в концентрации 10 мкм. питательной среды каждые 3 дня и образцы из реплицировать скважин были объединены в коллекцию для анализа репликации ВИЧ-1 ВИЧ-1 p24gag иммуноанализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Тип ткани Вирус Посевным материалом на эксплант (pg ВИЧ-1 p24gag) LOL эксплантов Культура средний объем (мл) LOL скважин (технические репликация) ВИЧ-1 p24gag производство (нг/мл)
Миндалин ВИЧ-1Бал 350 – 500 9 3-4 2-3 1 – 10
ВИЧ-1LAI.04 9 3-4 2-3 1-100
Шейки матки ВИЧ-1Бал 1500 – 2000 8 1 2 1-5
ВИЧ-1LAI.04 8 1 2 неопределяемого

Таблица 1: ссылаться на значения посевным материалом ВИЧ-1 инфекции вирус производства и ткани эксплантов. Значение посевным материалом ВИЧ-1 в отдельных тканях экспланта относится к запасам вируса в концентрации 50 – 70 нг/мл: объем 7 мкл акций неразбавленном вирус используется для заразить каждый миндалин экспланта верхней губкой желатина; объем 500 мкл акций неразбавленном вирус используется для заразить 16 шейки матки эксплантов погружение в 1,5 мл. Шейки матки эксплантов широко промывают в PBS перед передачей их на желатин губки. Значение ВИЧ-1 производства ткани эксплантов ссылается на совокупное количество p24gag выпущенное 8 эксплантов в 1 мл (шейка матки), или 9 эксплантов в 3-4 мл (миндалины) культуры среднего (см) пробы каждые 3 дня более 12-15 дней культуры. СМ от реплицировать скважин объединили в коллекции для каждой точки время перед его заменой с свежими см. Значение p24gag концентрация измеряется в день 3 был исключен из анализа, потому что она частично счетов за поглощение вируса на эксплантов и последующего выпуска в см, т.е., перенос посевным материалом. Обычно инфекций ткани шейки матки с ВИЧ-1LAI.04 не приводит к обнаружению репликации ВИЧ-1 в нашей экспериментальной системы16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Использование тканей человека эксплантах для изучения инфекции ВИЧ-1 обеспечивает преимущества над традиционными Би мерной и съедобные экспериментальных систем, таких как главные ячейки или клеточных линий, из-за их высокая способность воспроизводить межклеточных взаимодействий и Сотовые функции (например, производство цитокинов), как они находятся в естественных условиях. Тем не менее миндалин и шейки матки ткани отличаются во многих аспектах, включая число и фенотипические и функциональные характеристики ВИЧ целевые клетки1,16. По той же причине ВИЧ-1 варианты с различными ко-рецептор тропизм (например, CCR5-Тропик ВИЧ-1Бал против CXCR4-Тропик ВИЧ-1LAI.04) выполняют по-разному в миндалин и шейки матки (Таблица 1). Распространение ВИЧ coreceptors на клетки-мишени на иммунной индуктивный и эффекторных сайтов только частично счетов для местных восприимчивость к инфекции: ткани миндалин, таким образом более обильные, чем CCR5-выражая клеток CD4 Т-клеток, перевозящих CXCR4 объясняя более высокие уровни репликации ВИЧ-1LAI.04 , чем ВИЧ-1Бал, но рецепторы в равной степени представлены в слизистую оболочку шейки матки16. Тем не менее мы редко обнаружено репликации производственной вируса в ткани шейки матки, оспаривается с ВИЧ-1LAI.04, который соответствует преференциальной передачи отдельных вариантов ВИЧ-1 CCR5-Тропик, наблюдается в vivo20 . Это свидетельствует о том, что дифференциация и активации статус клеток-мишеней ВИЧ-1 может в конечном итоге определить их способность поддерживать репликации ВИЧ-116.

Желатин губки являются гемостаза устройства, полученные из очищенного свиной кожи (коллаген), которые призваны быть полностью усваивается организмом человека через несколько недель. Мы рекомендуем использовать продукты, которые показывают степень медленной деградации в культуре, как они лучше костюм с целью поддержания тканей эксплантов в интерфейсе жидкости воздух на 2-3 недели. Мы также рекомендуем тестирование различных партий того же продукта для оценки последовательную работу в культуре экспланта.

Аналогично тип и много плода бычьим сывороточным (ФБС) может повлиять на уровнях репликации ВИЧ-1. Мы советуем тестирования несколько партий FBS для оптимизации см и использовать же много FBS для всего исследования. Мы регулярно тест FBS на ткани эксплантов 10 доноров и выберите много, что дает высокий репликации ВИЧ-1.

Для большинства экспериментов мы объединим эксплантов из эндоцервикса и ectocervix для максимального числа экспериментальных условий. Можно считать, что держать их разделены из-за их различные структурные и иммунологические особенности21. Кроме того эндоцервикальных эксплантах релиз и продолжают производить большое количество слизи в культуре, которая может мешать течению анализа. Видя, как района, охватываемого эндоцервикса гораздо меньше, чем ectocervix, это сложно проводить эксперименты инфекции ВИЧ исключительно на слизистой оболочке эндоцервикса с помощью надлежащего количества эксплантов и технические реплицирует.

Выполнение инфекции ВИЧ-1 погружение шейки матки эксплантов повышает шансы получения продуктивной инфекции из-за меньшее количество CD4 Т-клеток в слизистой оболочке, по сравнению с лимфоидной ткани. По той же причине ткани шейки матки более чувствителен к ночи хранения и урожайность выше репликации ВИЧ-1 при инфицированных вскоре после операции и сразу же после вскрытия. Хотя инфекции путем погружения в наличии вируса может также выполняться для миндалин тканей для обеспечения единообразного воздействия эксплантов вирус, такой подход влечет за собой более высокие потери манипуляции и клеток ткани чем инфекции эксплантов на желатин губки как описано в протоколе.

Поляризованные системы проблемы ВИЧ-1 и культуры слизистых тканей существуют и в настоящее время используются в других лабораториях3,,2223,24,25. Хотя эти системы являются ценным модель въезд ВИЧ-1 и проникновение в слизистую оболочку, их настройка обычно требует больше времени и может потребовать растяжение тканей манипуляции. Non поляризованных модели передачи/патогенеза слизистой оболочки по-прежнему предлагают действительный платформу для изучения регуляции репликации ВИЧ-1 и местном бассейне ВИЧ инфицированных клеток эндогенных и экзогенных факторов9,17 , 26, включая препараты12,13,14,15.

Изменчивость между донорами могут представлять серьезной проблемой для воспроизводимости результатов между независимыми эксперименты проводились с использованием образцов из нескольких доноров. Изменчивость в клеточный состав может также повлиять на районы внутри же образца, то есть, интра доноров изменчивости. Чтобы снизить изменчивость и правильно интерпретировать результаты, важно создать все условия в рамках одного эксперимента с использованием достаточное количество эксплантов, полученные из тот же донор (доноров соответствие условий). Результаты могут быть нормированы внутреннего контроля при компиляции данных из нескольких экспериментов для статистического анализа. Чтобы снизить изменчивость интра доноров, мы рекомендуем, включая по крайней мере 2 технических репликация для каждого экспериментальные условия, для в общей сложности 18 эксплантов ткани миндалин (9/а) и 10-16 эксплантов слизистой шейки матки (5-8/а) (Таблица 1). Доступность медицинских записей и включение дополнительного анализа пациента материала и/или экспериментальных условиях, например в адрес воспалительные состояния образца, могут значительно улучшить результат толкования (см. ссылку 9 для пример).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана гранты от Фонда Blanceflor Бонкомпаньи Ludovisi урожденная Бильдт (http://blanceflor.se/), Фонд шведских врачей против СПИДа (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) и Андреа Fondazione e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) к Андреа Introini.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge  Pfizer NDC:  0009-0315-08 Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge Ferrosan Medical Devices MS0002 Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
RPMI 1640 with phenol red and glutamine ThermoFisher Scientific 21875034 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) ThermoFisher Scientific 11140035 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Sodium pyruvate, 100 mM (100x)  ThermoFisher Scientific 11360070 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Gentamicin 50 mg/mL (1000x)  ThermoFisher Scientific 15750037 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Amphotericin B 250 μg/mL (100x)  ThermoFisher Scientific 15290018 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Fetal bovine serum (FBS)  To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Ticarcillin disodium salt Sigma-Aldrich T5639-1G Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Potassium clavulanate Sigma-Aldrich 33454-100MG Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. 
Sterile cell culture grade water
Sterile transportation container
70% ethanol solution
Disinfectant solution for biological waste disposal
Sterile metal forceps or tweezers
Sterile metal scissors
Sterile flat weighing metal spatula
Sterile scalpels and blades
6-well cell culture plates
12-well cell culture plates
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL NIH AIDS Reagent Program 510 The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 NIH AIDS Reagent Program 2522 The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Lamivudine (3TC) NIH AIDS Reagent Program 8146 Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Biological safety cabinet
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity
Water bath set at 37 °C
Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes
Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4, (2), 256-269 (2009).
  2. Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4, (2), 346-349 (1998).
  3. Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18, (1), 20301 (2015).
  4. Global epidemic Update 2016. UNAIDS. Available from: http://www.unaids.org/en/resources/documents/2016/Global-AIDS-update-2016 (2016).
  5. Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20, (3), 187-195 (2008).
  6. Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16, (6), 584-589 (2015).
  7. Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111, (2), 699-704 (2008).
  8. Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171, (3), 917-927 (2007).
  9. Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13, (5), 1006402 (2017).
  10. Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7, (11), 1232-1235 (2001).
  11. Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7, (5), 1165-1174 (2014).
  12. Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4, (3), 260-270 (2008).
  13. Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31, (11), 1519-1528 (2017).
  14. Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10, (4), 379-389 (2011).
  15. Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74, (12), 5577-5586 (2012).
  16. Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3, (3), 280-290 (2010).
  17. Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9, (2), 1003148 (2013).
  18. Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157, (1), 98-101 (2009).
  19. Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6, (5), 403-408 (2009).
  20. Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (21), 7552-7557 (2008).
  21. Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73, (6), 1253-1263 (2005).
  22. Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3, (5), 506-522 (2010).
  23. Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5, (5), 776-794 (2013).
  24. Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51, (5), 1770-1779 (2007).
  25. Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192, (9), 1545-1556 (2005).
  26. Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6, (6), 1081-1090 (2013).

Comments

2 Comments

  1. Hello, I want to make a Timentin solution (Ticarcillin sodium and potassium clavulanate) for use it in cell culture. I see that you prepare it in sterile cell culture grade water BUT the safety information of the product for Potassium clavulanate says: "Reacts violently with water., Risk of explosion if heated under confinement." So How can I make the solution? Your indications are: To resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Did you have some problems with the Potassium clavulanate and the water?
    Thank you so much. Paula

    Reply
    Posted by: Paula L.
    October 29, 2018 - 3:22 PM
  2. Dear Paula
    Thank you for bringing this up. As you mentioned in your comment Timentin is the trademark name of a mixture of tircacillin disodium and potassium clavulanate that is reconstituted in water as per manufacturer instructions. This mix has been the antibiotic of choice for tonsil culture in the Margolis’ lab for many years, and it was also used by reconstituting individual antibiotics in water, as indicated in the material table, at the Karolinska Institutet to effectively control bacterial contamination in culture. I recommend that you check with the manufacturer about specific instructions for reconstituting potassium clavulanate, although I have never experienced a problem by preparing a solution of tircacillin disodium in water and then using that to reconstitute potassium clavulanate.
    In general, you may want to optimize your explant culture system by testing a number of antibiotics and select that is more convenient to use and works well for your specimens, depending on their nature, e.g. tonsillectomy for recurrent infection vs obstructive pathology, how clean the specimen is handled after surgery, etc. Be aware that you may experience seasonal variations in the rate of culture contamination through the year, especially with specimens from kids. Good luck!
    Andrea Introini

    Reply
    Posted by: Andrea I.
    November 2, 2018 - 12:53 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics