Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

* These authors contributed equally
Chemistry

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Summary

Un'analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l'efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L'applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.

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Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

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Abstract

La genetica incorporazione di aminoacidi non canonico (ncAAs) via soppressione di codone di arresto ambra è una tecnica potente per installare sonde spaziali e reattiva moiety su proteine direttamente nella cella dal vivo. Ogni ncAA è incorporato da una dedicato coppia ortogonale soppressore-/ amino-acil-tRNA-sintetasi del tRNA (AARS) che viene importata nell'organismo ospite. L'efficienza di incorporazione di ncAAs differenti possa notevolmente differiscono ed essere insoddisfacente in alcuni casi. Coppie ortogonali possono essere migliorate modificando le RAA o il tRNA. Tuttavia, la diretta evoluzione del tRNA o AARS utilizzando librerie di grandi dimensioni e metodi di selezione morti/vivi non sono fattibili in cellule di mammifero. Qui, è presentata un'analisi di fluorescenza-basata facile e robusta per valutare l'efficienza di coppie ortogonali in cellule di mammifero. Il dosaggio permette lo screening di decine o centinaia di varianti AARS/tRNA con uno sforzo moderato ed entro un termine ragionevole. Uso di questo test per generare nuove tRNAs che migliorano significativamente l'efficienza del sistema ortogonale Pirrolisina è descritto, insieme all'applicazione di ncAAs allo studio di proteine G accoppiate recettori (GPCR), che rappresentano una sfida oggetti per ncAA mutagenesi. In primo luogo, incorporando sistematicamente un foto-reticolazione ncAA su tutta la superficie extracellulare di un recettore, siti di legame di diversi ligandi del recettore intatto vengono mappati direttamente nella cella dal vivo. Secondo, incorporando ncAAs di ultima generazione in un GPCR, recettore privo di catalizzatore ultraveloce etichettatura con un colorante fluorescente è dimostrato, che sfrutta bioorthogonal ceppo-promosso inversa Diels Alder cicloaddizione (SPIEDAC) su cellule vive. Come ncAAs può essere generalmente applicato a qualsiasi proteina indipendentemente dalla sua dimensione, il metodo è di interesse generale per un numero di applicazioni. Inoltre, incorporazione di ncAA non richiede particolari attrezzature e viene facilmente eseguita nei laboratori di biochimica standard.

Introduction

L'incorporazione di genetica di sonde chimiche in proteine è un metodo potente per lo studio degli aspetti strutturali e dinamici di funzione della proteina direttamente nel contesto nativo della cella dal vivo. Al giorno d'oggi, centinaia di aminoacidi non canonico (ncAAs) equipaggiati con i più disparati gruppi chimici possa essere site-specifically incorporato nelle proteine di biosintesi1,2,3,4. Tra loro, si trova ncAAs fotosensibili come foto-reticolanti5, foto-messo in gabbia6,7,8,9 e foto-commutabile aminoacidi10, 11, aminoacidi cuscinetto sforzata alcheni o alchini per bioorthogonal privo di catalizzatore chimica2,12,13,14,15,16 ,17, aminoacidi che trasportano dansile18, cumarina9,19e fluorofori21 prodan20,e aminoacidi con altre sonde biofisiche come nonché con post traduzionale modifiche1,2,3,4,22,23,24,25.

La codifica genetica di un ncAA è attivata da una dedicato amino-acil-tRNA-sintetasi (AARS) abbinata ad un soppressore cognato-tRNA, che incorpora la ncAA in risposta ad un codone di arresto ambra durante la normale sintesi ribosomiale. coppie di ncAARS/tRNA sono progettate in modo da essere ortogonali nell'organismo ospitante, cioè non cross-talk con le coppie endogene. La tecnica è affermata sia in procarioti ed eucarioti padroni di casa e cellule facilmente applicabile ai mammiferi. Coppie per l'incorporazione di ncAA in cellule di mammifero si basano su tre principali sistemi ortogonali: il sistema di tyrosyl, che combina il TyrRS da e. coli26 con un soppressore di tyrosyl ambra da b. stearothermophilus27 (CE TyrRS / coppia YamBst), l'e. coli leucyl sistema (CELeuRS/tRNALeuCUA coppia)6,18,28 e il sistema di pyrrolysyl degli Archaea (PylRS/tRNA PYL coppia)3, per cui il tRNAPyl è un soppressore di ambra naturale. In generale, ogni ncAA è riconosciuto da un ncAARS specializzato. A seconda della struttura della ncAA, la ncAARS è ottenuta tramite diretta evoluzione di TyrRS, LeuRS o PylRS, anche se alcune sintetasi possono accettare più di un ncAA.

La coppia ortogonale viene importata nelle celle utilizzando semplicemente un vettore plasmidico. Plasmidi più comune ed efficiente sono sialophosphoprotein e codificano sia per la sintetasi e il tRNA che formano la coppia ortogonale29. Un secondo plasmide che codifica per la proteina di interesse tenendo un codone ambrato presso il sito designato per la modifica è co-trasfettata. La ncAA è semplicemente aggiunta al medium della crescita cellulare. Tuttavia, diversi gruppi specializzati usano spesso diverse varianti del plasmide costrutti anche per l'incorporazione della stessa ncAA. Costrutti differiscono nella disposizione dei geni in vettoriale, tipo della sintetasi, l'utilizzo di codone nel gene sintetasi, l'utilizzo del promotore, variante del tRNA e il numero di cassette di espressione di tRNA. Inoltre, l'efficienza di incorporazione di ncAAs differenti possa variare drasticamente a causa la diversa efficienza catalitica della sintetasi diversi, la qualità del tRNA e altri fattori30. Pertanto, è importante avere a portata di mano un metodo veloce e affidabile per valutare l'efficienza di una coppia ortogonale, di scegliere il sistema più adatto per un'applicazione desiderata sia per eseguire alcune operazioni di ottimizzazione che migliorare la complessiva espressione della proteina rendimenti.

Abbiamo stabilito un'analisi semplice e robusta fluorescenza-basata per valutare l'efficienza di coppie ortogonali29 (Figura 1). Nell'analisi, le cellule vengono co-trasfettate con il plasmide che codifica per la coppia ortogonale, insieme con un plasmide del reporter sialophosphoprotein codifica per la proteina fluorescente verde recante un codone di stop ambra in una posizione permissiva (EGFPTAG) e il mCherry gene. Fluorescenza rossa e verde di lisati di cellule intere vengono lette in canali separati su un lettore di piastra in una piastra a 96 pozzetti. L'intensità della fluorescenza verde direttamente correla con l'efficienza di ambra soppressione, considerando che l'intensità di fluorescenza rossa dà una stima diretta delle dimensioni del campione misurato e l'efficienza di trasfezione. Rispetto a simili saggi basati sulla fluorescenza assistita cella ordinamento (FACS) leggere31,32, il test fornisce una valutazione immediata e approfondita dell'espressione della proteina nella popolazione intera cellula, che è più rappresentativo delle usuali condizioni sperimentali e offre una più facile acquisizione ed elaborazione dati con software standard. Nel complesso, il vantaggio principale dell'analisi è che un mezzo per un gran numero di campioni possa essere analizzato in parallelo. Usando questa analisi, abbiamo selezionato una libreria razionalmente progettata del soppressore-tRNAs per migliorare l'efficienza del sistema ortogonale Pyl30. Quest'opera descrive il protocollo sperimentale per eseguire questo test e mostrare esempi della sua applicazione, tra cui l'ottimizzazione della coppia ortogonale per l'incorporazione della foto-reticolazione ncAA p-azido-L-fenilalanina (Azi) e il confronto delle efficienze di incorporazione degli aminoacidi diversi (Figura 2).

Negli ultimi anni, strumenti ncAA si sono dimostrati molto potente per studiare strutturali e gli aspetti funzionali di proteine G accoppiate recettori (GPCR)33,34,35,36,37 , 38. in esseri umani, GPCR formano una grande famiglia di recettori di membrana (800 membri) e rappresentano i principali bersagli per farmaci terapeutici. Caratterizzazione strutturale diretto dei GPCR è comunque impegnativo e complementari metodi biochimici altamente sono necessari per le indagini. Abbiamo sperimentato l'uso di foto-reticolazione ncAAs per mappare le superfici GPCR e scoprire ligand binding tasche34. Utilizzando il nostro sistema ottimizzato per l'incorporazione di Azi, abbiamo incorporato sistematicamente Azi in tutto il dominio di juxtamembrane tutta di un GPCR direttamente in streaming in cellule di mammifero. All'irradiazione UV, Azi forma una specie di nitrene altamente reattivo che cattura covalentemente molecole vicine. Quando il ligando viene aggiunto al sistema, Azi funge da una sonda di prossimità per rivelare quali posizioni del recettore si avvicina il ligando associato. In questo modo, la modalità di associazione dell'ormone neuropeptide urocortina (Ucn1) sul ricevitore di classe B GPCR corticotropin-releasing-factor tipo 1 (CRF1R)33 in primo luogo è stata presentata. Ultimamente, abbiamo divulgato modelli distinti associazione di agonisti ed antagonisti sullo stesso recettore38. Un approccio simile è stato applicato da altri per rivelare ortosterici e siti di legame allosterico di altri peptidi e ligandi di piccola molecola altri GPCR39,40,41,42. Questo manoscritto descrive il protocollo sperimentale applicato nel nostro laboratorio per foto-reticolazione mappatura delle superfici GPCR. Il metodo è relativamente veloce, semplice e non richiede particolari attrezzature, cosicché è applicabile nei laboratori di biochimica standard. D'importanza, l'approccio fornisce un valido strumento non solo di identificare siti di legame del ligando dove scarseggiano i dati strutturali 3D, ma anche per integrare i dati esistenti in vitro con informazioni da recettori completamente traduzionalmente modificati nella ambiente fisiologico della cellula dal vivo.

Il recente sviluppo del romanzo ncAAs cuscinetto sul lato catena gruppi chimici adatti per ultraveloce privo di catalizzatore bioorthogonal chimica ha aperto la possibilità di installare fluorofori di ultima generazione per l'imaging di Super-risoluzione nelle proteine direttamente su live cellule2,43. Tali ancoranti chimici includono sforzata cyclooctyne SCOK14, biciclo [6.1.0] nonyne in BCNK12,17e trans-cyclooctenes in TCO * K13,15,17 tra altri ncAAs che harboring un norbornene16,17,44 o Ciclopropene45,46 frazione. Ingombranti ncAAs per la bioorthogonal chimica sono incorporati da una variante di PylRS solitamente indicato come PylRSAF (che indica la mutazione Y271A e Y349F in M. barkeri PylRS), così come da altri ad hoc si è evoluto ncAARSs17 , 44. le ancore bioorthogonal reagiscono con tetrazine reagenti47 via cicloaddizione di Diels-Alder inversa elettrone-domanda di dare rendimenti elevati d'etichettatura entro pochi minuti43,48. Tuttavia, applicazione di questo approccio potente etichetta GPCR è stato impegnativo a causa di una bassa efficienza complessiva del sistema ortogonale di incorporazione ncAA. Utilizzando il nostro avanzato sistema di Pyl, recentemente abbiamo dimostrato ad alto rendimento incorporazione di tali aminoacidi GPCR e ultraveloce GPCR etichettatura sulla superficie delle cellule di mammiferi dal vivo30. Ricevitori con etichettati erano ancora funzionali, come hanno interiorizzato fisiologicamente attivando il recettore con un agonista. Il protocollo sperimentale per l'incorporazione di bioorthogonal ancore in GPCR e le seguenti operazioni di etichettatura sono descritti qui. Dotare i GPCR con fluorofori luminoso piccolo è il primo passo fondamentale verso lo studio delle dinamiche strutturali GPCR nella cella dal vivo tramite tecniche di microscopia avanzata.

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Protocol

1. selezione basata sulla fluorescenza delle efficienze di incorporazione (Figura 1)

  1. Mantenere le cellule HEK293 nel mezzo dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM; alto glucosio, glutamina 4mm, piruvato) completati con 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO2.
  2. Le cellule del seme il giorno prima di transfezione.
    1. Staccare le cellule per 5 min a 37 ° C in 0.05% tripsina/PBS completati con 0,5 mM EDTA. Usare 1 mL di tripsina/EDTA per un piatto di 10 cm. Dissetare con 10 volumi di terreno completo e risospendere le cellule pipettando. Contare il numero di cellule in sospensione utilizzando un emocitometro49.
    2. Cellule di seme 6.0 x 105 HEK293 per pozzetto di piastre da 6 pozzetti in 2 mL di terreno di crescita completa. Preparare come molti pozzi come il numero di campioni e due ulteriori pozzi per il selvaggio-tipo EGFP e un campione mock-transfettate, rispettivamente.
  3. Controllare la confluenza (area occupata dalle cellule) sotto un microscopio. Transfect cellule alla confluenza di ~ 70% di un reagente polyethyleneimine (PEI).
    1. 1h prima della trasfezione, aggiungere la quantità appropriata di soluzione stock ncAA preparata in tutti i pozzetti per una concentrazione finale di ncAA di 0.25-0.5 mM. Aggiungere la ncAA in tutti i pozzetti, tra cui il selvaggio-tipo controllo positivo e mock-transfettati, per evitare che le differenze nei segnali di fluorescenza che possono essere causati dagli effetti della ncAA sulla crescita cellulare.
      Nota: Per preparare le soluzioni di riserva, sciogliere la ncAA a 0,1-0,5 M utilizzando 0.2-0.5 M NaOH. Tuttavia, alcuni ncAAs può richiedere iniziale solubilizzazione in DMSO e/o neutralizzazione di quattro volumi di 1m HEPES (pH 7.4) prima dell'uso. Comunemente, il produttore raccomanda un protocollo per preparare una soluzione di riserva.
    2. In un tubo del microcentrifuge, mescolare 1 µ g di plasmide DNA codifica per la coppia ncAARS/tRNA essere testato con 1 µ g di plasmide del reporter del DNA (pcDNA3.0-EGFP183TAG- mCherry). In provette separate, preparare un'identica transfezione utilizzando il riferimento di selvaggio-tipo EGFP e una finta transfezione.
      Nota: Numero di copie della cassetta tRNA incorporato nel plasmide che codifica per la coppia ncAARS/tRNA dipende dall'applicazione. Per facilitare la clonazione, 1 copia di tRNA è consigliato quando screening tRNAs diversi, considerando che 4 copie sono raccomandate (anche se non strettamente necessario) quando ncAARS diversi test o l'incorporazione di ncAAs diverso dalla stessa coppia ortogonale.
    3. Per ogni provetta contenente il DNA aggiungere 100 µ l di soluzione salina tamponata (LBS) contenenti lattato di sodio di 20 mM a pH 4.0 e 150 mM NaCl lattato. Mescolare brevemente.
    4. Ogni provetta contenente il DNA in LBS aggiungere 6 µ l di 1 µ g / µ l PEI in LBS (rapporto PEI/DNA = 3/1 w/w) e vortex immediatamente. Incubare a temperatura ambiente per 10-15 min.
    5. Prendete mezzo di 400 µ l cellulare da ciascun pozzetto e aggiungerlo al composto di DNA-PEI per neutralizzare il pH. Dribblare la miscela di DNA sulle celle.
      Nota: DMEM contiene solitamente rosso fenolo come indicatore di pH. Durante la fase di neutralizzazione, il colore della miscela aggiunto nel tubo cambierà da giallo (acida) al rosso (neutro). Anche se formando i complessi di DNA in libbre a pH acido dà il più alto di rendimenti transfezione50, complessi DNA-PEI possono essere formate in alternativa direttamente a pH 7,4 (per esempio in DMEM privo di siero). Se si utilizza DMEM per formare complessi di DNA, ignorare il passaggio di neutralizzazione 1.3.5. In ogni caso, è essenziale che nessun siero è presente nella miscela quando si formano i complessi.
  4. Vendemmia post-transfezione 48 h di cellule.
    1. Aspirare il mezzo e sciacquare le cellule una volta con 2 mL di PBS preriscaldata (37 ° C). Aggiungere 800 µ l di PBS completati con 0,5 mM EDTA e incubare per 20 min a 37 ° C. Staccare e sospendere le cellule pipettando su e giù.
    2. Trasferire la sospensione cellulare in provette da 1,5 mL contenente 200 µ l PBS, completati con 5 mM MgCl2.
    3. Centrifugare per 2 min a 800 x g e scartare il surnatante.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. In questo caso, flash-freeze il pellet contenuto nel liquido N2 e conservare a-80 ° C fino ad un mese. Indossare sempre occhiali di protezione degli occhi.
  5. Aggiungere 100 µ l tampone di lisi Tris (50 mM Tris-HCl a pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA e appena aggiunto PMSF) per il pellet cellulare e incubare in ghiaccio per 30 min. Per facilitare la lisi, vortice ogni 5 min.
  6. Rotazione verso il basso i detriti cellulari per 10 min a 4 ° C e 14.000 x g e trasferire 90 µ l del surnatante in nere piastre da 96 pozzetti. Misurare la fluorescenza EGFP e mCherry utilizzando un lettore di piastra dotato di un modulo di fluorescenza.
    Nota: Utilizzare filtri di eccitazione e di emissione appropriati per EGFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) e mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm). I valori misurati di EGFP si estendono in un intervallo tra il valore minimo ottenuti da cellule mock-transfettate e un valore massimo, che è solitamente ottenuto dal selvaggio-tipo EGFP. Prendersi cura di impostare la finestra di misurazione corretta dello strumento.
  7. L'efficienza dell'incorporazione di ncAA è calcolato come rapporto tra la fluorescenza del campione e la fluorescenza ottenuti dall'espressione di EGFP selvaggio-tipo. Tutti i valori sono normalizzati a mCherry fluorescenza.
    Equation 1

2. genetica incorporazione di ncAAs in GPCR per foto-reticolazione Mapping di ligando-GPCR interazioni (Figura 3)

  1. Mantenere le cellule HEK293T in DMEM supplementato con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO2(v/v).
  2. Cellule di seme il giorno prima di transfezione.
    1. Staccare le cellule per 5 min a 37 ° C in 0.05% tripsina/PBS completati con 0,5 mM EDTA. Usare 1 mL di tripsina/EDTA per un piatto di 10 cm. Dissetare con 10 volumi di terreno completo e risospendere le cellule pipettando su e giù. Contare il numero di cellule in sospensione utilizzando un emocitometro49.
    2. 5 293T cellule di seme 5,0 x 10 per pozzetto in 2 mL di terreno di crescita completa in piastre da 6 pozzetti. Per ogni posizione da sottoporre a screening, preparare 1 bene al ligando più un pozzetto per il controllo di associazione33,38. Un pozzo supplementare a trasfettate con il recettore di selvaggio-tipo (peso) può essere incluso per controllare il livello di espressione del mutante.
  3. Il giorno dopo, controllare la confluenza (area occupata dalle cellule) sotto un microscopio. Transfect cellule alla confluenza di ~ 70% usando PEI.
    1. 1h prima della trasfezione, aggiungere Azi in tutti i pozzetti a una concentrazione finale di 0,5 mM.
      1. Preparare una soluzione 0,5 M di Azi. Per piastra 6-pozzetti, pesare 1,2 mg Azi in una provetta e dissolverlo in 15 µ l 0,5 M NaOH. Diluire la soluzione di riserva in 1,2 mL di terreno completo e aggiungere 200 µ l della miscela in ciascun pozzetto.
        Nota: Preparare una soluzione stock fresca di Azi per ogni esperimento. La frazione di azide ha una breve emivita in soluzione acquosa, soprattutto a pH di base, e la AziRS incorpora l'intatta, ma anche la forma degradata.
    2. Transfect un importo totale di 2 µ g di DNA per pozzetto: 1 µ g di plasmide codifica per il Bandierina-etichettate GPCR recanti un codone di TAG alla posizione desiderata e 1 µ g del plasmide codificante per la coppia ortogonale dedicata a Azi (E2AziRS51 e 4 copie delle cognate soppressore-tRNA BstYam)33,38.
      Nota: Quando si include un confronto wt per controllare i livelli di espressione, transfect una quantità inferiore di DNA del plasmide per il recettore wt. A seconda dei GPCR, 0.2-0.5 µ g del plasmide che codifica i livelli simili di wt recettore resa come 1,0 µ g del plasmide mutante. Transfect la stessa quantità di DNA in tutti i pozzetti, riempiendo il DNA manca con un mock (per esempio un vettore vuoto).
    3. Procedere come descritto in 1.3.3-1.3.5.
    4. 48 ore post-transfezione, procedere con passo 2.4 per foto-reticolazione dei ligandi o andare al punto 2.5 per la raccolta diretta e analisi per verificare l'espressione del ricevitore.
  4. Foto-reticolazione del ligando.
    1. Preparare una soluzione di riserva del ligando 1.000 x. Sciogliere il ligando di peptide ad una concentrazione di 100 µM in DMSO.
      Nota: La concentrazione del ligando dipende la costante di dissociazione KD dell'interazione ligando-GPCR. Una concentrazione finale di 100 x KD è raccomandabile. Se il ligando del peptide è un sale di acido trifluoroacetico (TFA), considerare il peso della TFA quando si calcola il peso molecolare (1 x TFA a base dell'amminoacido nel peptide). Inoltre, considera che i peptidi sono in generale igroscopico. Evitare il congelamento ripetuto di polvere del peptide e mai aprire un contenitore di peptide fino a quando non abbia raggiunto la temperatura ambiente.
    2. Diluire il 1:1,000 di soluzione stock di ligando nel buffer di associazione composto da 0.1% BSA, 0,01% Triton-X100, 5 mM MgCl2 in tampone HEPES dissociazione (HDB) contenenti 12,5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES)-HCl pH 7.4, 140 mM NaCl e 5 mM KCl. preparare 1 mL / mutante Azi-GPCR. Sostituire il mezzo di cella con 1 mL della soluzione di ligando. Incubare per 10 min a RT.
      Nota: Regolare il tempo di incubazione per le specifiche GPCR, contabilità per internalizzazione di cinetica e recettore ligando. Prolungando il tempo di incubazione non migliora i rendimenti di reticolazione.
    3. Irradiare i campioni per 20 min in un reticolante UV 365 nm con 5 x 8 W tubi e ~ 5 cm di distanza per le cellule. Staccare le cellule pipettando e trasferirli in una provetta di reazione da 1,5 mL. Agglomerare le cellule per 3 min a 800 x g e scartare il surnatante.
    4. Sciogliere una compressa di inibitore della proteasi (PI) cocktail in 1 mL 25 mM EDTA/H2O per ottenere una soluzione stock di 50x. Aliquotare il PI soluzione e conservare a-20 ° C. Diluire il brodo 50 x 01:25 in HDB e risospendere il pellet di cellule in 50 µ l di 2 x PI in HDB. Flash-congelare le cellule nel liquido N2.
      Nota: Occhiali di protezione degli occhi. A questo punto, i campioni possono essere conservati a-80 ° C fino ad un mese. Procedere con il passaggio 2.6.
  5. Raccolta diretta delle cellule.
    1. Aspirare il mezzo. Aggiungere 800 µ l di 0,5 mM EDTA in HDB. Incubare per 10 min a RT o su ghiaccio.
    2. Staccare le cellule pipettando su e giù e trasferirli in una provetta di reazione da 1,5 mL. Aggiungere 200 µ l di 5 mM MgCl2 in HDB. Agglomerare le cellule per 3 min a 800 x g e scartare il surnatante.
    3. Risospendere il pellet di cellule in 50 µ l di 2 x PI in HDB e congelamento flash liquido N2. Occhiali di protezione degli occhi.
      Nota: A questo punto, i campioni possono essere conservati a-80 ° C per 1 mese.
  6. Lisi delle cellule.
    1. Scongelare le cellule in un bagno di acqua a 37 ° C per 30-45 s e vortex brevemente. I campioni possono essere freddo d'ora in poi. Membrane di pellet a 2.500 x g e a 4 ° C per 10 min. eliminare il supernatante, che contiene la maggior parte delle proteine citosoliche.
    2. Risospendere il pellet in tampone di lisi di 50 µ l HEPES contenente 50 mM HEPES-HCl a pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glicerolo, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 millimetro DTT e appena aggiunto 2 x cocktail di PI. Mescolare accuratamente. Lisare le cellule 30 min in ghiaccio e vortice ogni 5 min.
    3. Rotazione verso il basso i detriti cellulari per 10 min a 14.000 x g a 4 ° C. Immediatamente trasferire il surnatante in una provetta di reazione fresco.
      Nota: Procedere con l'analisi fin da subito. I lisati possono essere conservati a-20 ° C, tuttavia, ogni ciclo di congelamento-scongelamento altera la qualità dei risultati.
  7. Analisi Western blot.
    1. Per preparare il campione, prendere 3-5 µ l lisato e riempirlo fino a 7 µ l con H2O. aggiungere 2 µ l 1 M DTT e 3 µ l 4 x sample buffer contenente 63 mM Tris-HCl a pH 6.8, SDS 2%, 10% glicerolo e 0,04% bromofenolo Blu. Incubare per 30 min a 37 ° C.
    2. Quando i GPCR è glicosilata e fasce deboli o macchiate sono un problema, campioni di deglycosylate con PNGasi F per aumentare l'intensità del segnale e affinare le bande. Utilizzare 3-5 µ l di lisato e deglycosylate in un volume totale di 10 µ l seguendo il protocollo del fornitore. Aggiungere 3 µ l 4 x tampone del campione.
      Nota: Proteine di membrana sono spesso glicosilata in più siti e Stati, che altera la qualità della risoluzione in analisi SDS-PAGE. Tuttavia, non non deglycosylate i campioni per l'analisi del livello di espressione dei mutanti Azi-GPCR usando gli anticorpi anti-FLAG, perché è rilevante valutare la parte di completamente glicosilata, maturo recettore sulla superficie cellulare.
    3. Risolvere i campioni tramite standard SDS-PAGE e macchia proteine di trasferimento ad una membrana PVDF.
      Attenzione: L'acrilammide è neurotossica. Indossare guanti e occhiali di protezione.
    4. Bloccare la membrana per 1h a RT o durante la notte a 4 ° C in 5% di latte scremato in TBS-T contenente 20 mM Tris-HCl a pH 7.4, 0,15 M di NaCl e 0.1% Tween 20.
    5. La membrana della sonda con un anticorpo anti-ligando seguito dall'anticorpo secondario coniugato HRP. Lavare in mezzo con TBS-T. Per rilevare il livello di espressione di Azi-GPCR, sonda la membrana con un anticorpo HRP commerciale (Vedi Tabella materiali).
    6. Eseguire la reazione di chemiluminescenza (ECL) fatti in casa di un reagente ECL e rilevare i segnali per 5 min al buio.

3. ultraveloci Bioorthogonal etichettatura dei GPCR sulle cellule di mammiferi dal vivo

Nota: Il protocollo è ottimizzato per 4-pozzetti Vetrini coprioggetti chambered (zona ben = 2,2 cm2). Per diverse dimensioni di ben, il protocollo deve essere scalato di conseguenza.

  1. Rivestimento superficiale di vetrini da microscopio. Svolgere l'intera procedura sotto una cappa sterile.
    1. Preparare un poli-D-lisina hydrobromide (MW = 500-550 kDa) soluzione di riserva (PDL) ad una concentrazione di 1 mg/mL in tampone borato di 50 mM (pH 8.5). Conservare a 4 ° C fino a 6 mesi. Non congelare.
    2. Diluire il PDL soluzione stock 01:40 in acqua ultrapura sterile ad una concentrazione finale di 25 µ g/mL (soluzione di lavoro), poi filtrare la soluzione attraverso un filtro sterile da 0,22 µm.
      Nota: La soluzione di lavoro può essere conservata a 4 ° C fino a 3 mesi.
    3. Completamente coprire il fondo dei pozzetti della diapositiva microscopia con 500 µ l di soluzione di lavoro del PDL. Incubare per 20 min a RT ed aspirare la soluzione di lavoro del PDL.
      Nota: La soluzione di lavoro del PDL può essere utilizzata fino a tre volte. Se la soluzione deve essere riutilizzato, trasferire la soluzione usata dalle guide di scorrimento rivestite in una nuova provetta sterile ed etichetta di conseguenza il tubo. Non mescolare mai la soluzione riciclata con soluzione fresca.
    4. Sciacquare ogni x ben 3 con ~ 700 µ l acqua ultra-pura per sterile e lasciare asciugare per almeno 1 h.
      Nota: È molto importante lavare i pozzetti con precisione, come residui della soluzione PDL sono tossici per le cellule. Le diapositive rivestite possono essere utilizzate immediatamente per microscopia o memorizzate fino ad una settimana a 4 ° C.
  2. Mantenere le cellule HEK293T in DMEM supplementato con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO2(v/v).
  3. Cellule di seme il giorno prima di transfezione.
    1. Staccare le cellule per 5 min a 37 ° C in 0.05% tripsina/PBS completati con 0,5 mM EDTA. Usare 1 mL di tripsina/EDTA per un piatto di 10 cm. Dissetare con 10 volumi di terreno completo e risospendere le cellule pipettando. Contare il numero di cellule in sospensione utilizzando un emocitometro49.
    2. Seme 1.0 x 105 HEK293T cellule per pozzetto (zona 2,2 cm ²) a 600 µ l colorante libero DMEM completo.
      Nota: Per scopi di imaging, è molto comodo lavorare fin dall'inizio in un mezzo che non contiene alcun colorante. Colorante libero DMEM formulazioni sono disponibili in commercio.
  4. Controllare la confluenza (area occupata dalle cellule) sotto un microscopio e transfect le cellule alla confluenza di ~ 70% utilizzando un reagente di transfezione basata sui lipidi.
    1. 1 h prima della trasfezione, preparare una soluzione stock di fresco 100 mM di TCO * K in 0.2 M NaOH e DMSO 15% (v/v).
    2. Ogni pozzetto, mescolare 3 µ l del TCO * K soluzione madre con 12 µ l di 1 M HEPES, pH 7,4. Aggiungere delicatamente la soluzione ai pozzetti per un TCO finale * K concentrazione di 0,5 mM.
    3. Preparare una quantità totale di 500 ng DNA per pozzetto. In un tubo del microcentrifuge, diluire 200 ng di pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng di plasmide codifica per il MbPylRSAF/tRNAPyl coppia ortogonale (quattro cassette di tRNAM15) e 100 ng di pcDNA3.1_Arrestin3 plasmide nel mezzo di 50 µ l (colorante libero, privo di siero, antibiotico gratuito).
      Nota: In generale, co-transfezione di Arrestin non è necessaria osservare interiorizzazione dei GPCR. Tuttavia, Arrestin3 co-trasfettando accelera interiorizzazione dei CRF1R, che è molto comodo quando si analizzano interiorizzazione dei molti mutanti.
    4. Diluire 1.25 µ l del reagente trasfezione basata sui lipidi (2,5 µ l a 1 µ g di DNA) nel mezzo di 50 µ l (colorante libero, privo di siero, antibiotico gratuito) ed aggiungere la soluzione per la miscela di DNA. Immediatamente Vortex e incubare per 5-10 minuti a complessi di DNA RT. Add-lipidico alle cellule.
      Nota: Nella nostra esperienza, la morfologia delle cellule trasfettate mediante trasfezione basata sui lipidi sembra più fisiologica rispetto a quello delle cellule trasfettate con PEI. Come PEI dà una maggiore efficienza di trasfezione, PEI dovrebbe essere preferito per applicazioni a valle come Western blot, mentre trasfezione basata sui lipidi è una scelta migliore a transfect cellule per esperimenti di imaging.
  5. etichetta di 24h post-transfezione, il recettore con coloranti fluorescenti.
    1. Preparare una soluzione di riserva di tintura-tetrazine 0,5 mM in DMSO e un 10 mg/mL di DNA che macchia soluzione di riserva di tintura in ultra-puro H2O.
    2. Trasferimento medio di 100 µ l da ciascun pozzetto in una provetta di reazione di 1,5 mL. Aggiungere 1,8 µ l di soluzione di riserva della tintura-tetrazine e 0,3 µ l di DNA macchiatura di soluzione colorante. Trasferire il supporto contenente i coloranti torna al pozzo e incubare per 5 min a 37 ° C.
      Nota: Tetrazine-arancio-fluorescente tintura ha una concentrazione finale di 1,5 µM.
    3. Aspirare il mezzo e sciacquare delicatamente le cellule due volte con PBS per rimuovere l'eccesso di colorante. Aggiungere 600 µ l di colorante completa libera crescita medio preriscaldato a 37 ° C.
  6. Interiorizzazione di microscopia e recettore di fluorescenza.
    1. Visualizzare i recettori con etichettati sotto 63 x (o simili) ingrandimento utilizzando filtri adeguati per GFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), colorante arancio-fluorescente (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) e DNA che macchia di tintura (λ ABS: 350 nm; Λem: 461 nm). Scattare una foto con ogni filtro prima di attivare il recettore.
    2. Promuovere l'internalizzazione dei recettori utilizzando 200 nM di Ucn1.
      1. Preparare una soluzione stock di 1.000 x Ucn1 di 200 µM in DMSO.
        Nota: A seconda della solubilità del peptide, si può essere in grado di preparare il brodo in acqua pura o buffer.
      2. Transfer 100 µ l medio da un pozzo in una provetta di reazione di 1,5 mL e aggiungere 0,6 µ l di soluzione madre peptide agonista. Trasferire il medium retro nel pozzo.
      3. Osservare l'interiorizzazione sotto il microscopio. Scattare foto dopo l'avvenimento chiaramente rilevabile di internalizzazione (10-15 minuti a ore, a seconda del recettore e la sovraespressione di Arrestins) utilizzando i filtri menzionati in precedenza.

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Representative Results

Il contorno del dosaggio di fluorescenza è raffigurato nella Figura 1. Il dosaggio è impiegato in tre applicazioni. In primo luogo, un numero di varianti di tRNA per l'incorporazione di Lys(Boc) dalla coppia ortogonale Pyl vengono proiettato. Lys(BOC) è un amminoacido stericamente simile a Pyl. Come Pyl non è commercialmente disponibile, Lys(Boc) è comunemente usato come substrato standard per la PylRS. I tRNAs schermato si basano sul tRNAPyl. Ogni variante di tRNA contiene mutazioni di singole basi o di coppie di basi nel loop e steli razionalmente progettati per migliorare tRNA stabilità e compatibilità con i macchinari traslazionali eucariotici. Tutti i dettagli sulla progettazione di tRNA sono descritti nel nostro recente lavoro30. I risultati tipici sono descritti nella Figura 2A: diversi tRNAs dare efficienza soppressione differenti, che si riflette chiaramente nella quantità di fluorescenza misurata. Le barre di errore piccolo di triplici copie biologici mostrano che i valori sono altamente riproducibili. In secondo luogo, due varianti del gene della E2AziRS26,51, che incorpora il foto-reticolante p-azido-Phe (Azi), vengono valutate. E2AziRS è derivato dal TyrRS di e. coli . Una variante del gene impiegato nativo Escherichia coli l'utilizzo di codone, mentre il secondo era codone-ottimizzato per l'utilizzo in H. sapiens. L'analisi di fluorescenza mostra che la variante ottimizzata per codone dà rendimenti più elevati di proteina (Figura 2B). Infine, il tasso di incorporazione degli aminoacidi diversi per bioorthogonal clic chimica sono confrontati (Figura 2). Tutte le ncAAs qui presentato (BCNK, TCO * K e SCOK) sono incorporate per la stessa coppia di MbPylRSAF/tRNAPyl ortogonale. Lys(Z) è anche incorporato da questa coppia ed è stato usato come controllo positivo. Per illustrare l'affidabilità del test di fluorescenza, parallelo ncAA incorporazione esperimenti sono stati eseguiti su un GPCR, il CRF1R. L'analisi Western blot è stato effettuato per valutare l'espressione di GPCR (Figura 2B, C). Le stesse tendenze osservate con EGFP nell'analisi della fluorescenza sono state osservate con il CRF1R. In particolare, incorporazione Azi CRF1R altamente è stata migliorata quando si utilizza il gene E2AziRS codone-ottimizzato rispetto al gene nativo, mostrando che può avere anche un moderato miglioramento di 1,5-2 volte per una proteina solubile (EGFP) secondo l'analisi di fluorescenza di una maggiore impatto sul livello di espressione più impegnativi delle proteine di membrana (Figura 2B). Come nota generale, rispetto al numero di cassette di tRNA da utilizzare per ogni applicazione, solo una cassetta di tRNA è consigliata quando lo screening tRNAs differenti al fine di facilitare le procedure di clonazione. Durante il filtraggio o diversi ncAARS o l'efficienza di incorporazione di ncAAs diverso dalla stessa coppia ortogonale, ripetizioni in tandem quattro del tRNA cassetta sono preferiti per ottenere il massimo rendimento dell'incorporazione di ncAA.

Il sistema ottimizzato per l'incorporazione di Azi compreso il gene E2AziRS umanizzato è stato distribuito per mappare la tasca di associazione del CRF1R e definire percorsi di binding di 5 diversi ligandi: gli agonisti di due peptidi Ucn1 e CRF e i tre antagonisti del peptide Ucn1(8-40), CRF (9-41) e dFXCRF(12-41) (Figura 3). Mentre l'efficienza di Azi incorporazione precedentemente è stato indicato per fare diminuire quando si avvicina il GPCR C-terminus33,34, il nostro sistema ottimizzato per l'incorporazione di Azi consente livelli di espressione paragonabile di Azi-mutanti con TAG-siti in diverse parti del gene di GPCR (Figura 4A). I risultati in Figura 4B mostrano la proiezione del ciclo extracellulare 2 (ECL2) e helix V di CRF1R come una parte rappresentativa della tasca ligand-legantesi. Una band con le dimensioni corrette del prodotto reticolazione rivela che la posizione si trova nella prossimità del ligando all'interno del complesso ligando-recettore, cioè è parte della associazione tasca. Colpi di reticolazione multipli sono stati trovati con tutti i ligandi testati, rivelare modelli di binding distinti per gli agonisti del peptide e gli antagonisti. In particolare, il modello di reticolazione hits fornisce informazioni sugli elementi strutturali del recettore. Un numero di colpi successivi, come osservato in ECL2 (F260-R263 le posizioni in combinazione con gli antagonisti) suggerisce una regione ciclo flessibile. Un modello di hits ogni tre o quattro residui come trovati in sentori di V (D269/Y270, Y272/Q273, I277) elica verso una struttura elicoidale. Lo schermo può essere esteso a tutti i domini pertinenti dei GPCR. Se esiste una struttura 3D o un modello molecolare del recettore, impronte di ligando possono essere visualizzate mettendo in evidenza i colpi di reticolazione per ogni ligando (Figura 5).

Entrambe la fluorescenza e Western blot dati (Figura 2) suggeriscono che TCO * K è la ncAA per chimica bioorthogonal che ottiene incorporato con la massima efficienza per il MbPylRSAF. Diversi PylRS mutanti potrebbero dare rendimenti più elevati di incorporazione di altri clic ncAAs17, ma essi non sono stati testati in questo studio. TCO * K è stato incorporato in una proteina di fusione CRF1R-EGFP e abilitato l'installazione via chimica SPIEDAC (Figura 6A) un piccolo fluoroforo brillante sul recettore (Figura 6B). Come prova di etichettatura specifico, la fluorescenza dell'etichetta deve essere visibile solo in cellule che esprimono il recettore (cellule verde in Figura 6B) e non in cellule scure, che forniscono così un controllo interno negativo in ogni esperimento. Recettori etichettati usando ultraveloce SPIEDAC chimica sono ancora funzionali. Dopo l'aggiunta di un agonista del peptide, fluorescente scomparti sono stati osservati durante il citosol, rivelando il fisiologico processo di internalizzazione dei GPCR (Figura 6). I segnali del fuso EGFP co-localizzati con il colorante fluorescente in ogni momento, confermando l'etichettatura biortogonali selettiva dei GPCR.

Figure 1
Figura 1: analisi di fluorescenza-basata per valutare l'efficienza di soppressione di codone di arresto. Cellule HEK293 sono co-trasfettate con due plasmidi in presenza di ncAA. Un plasmide codifica per la ncAARS desiderata e soppressore-tRNA. Il plasmide secondo codifica per il gene EGFP recante un codone di arresto di TAG in un sito permissivo insieme con un controllo mCherry. Due giorni dopo la trasfezione, la fluorescenza verde e rossa di lisati di cellule intere sono misurati in un lettore di piastra. Come il EGFP N-segmento a Monte che del codone di arresto (grigio) non è fluorescente, la resa del full-length EGFP (verde) direttamente correla all'efficienza dell'incorporazione di ncAA, mentre mCherry (rosso) fornisce un riferimento indipendente per la normalizzazione. L'efficienza del sistema ortogonale è dato dal rapporto tra la quantità di EGFP ottenuti tramite soppressione di codone di arresto e la quantità di selvaggio-tipo EGFP ottenuti da regolari traduzione (nessuna soppressione ambra). La figura è stata modificata da Serfling, R. & Coin, I; Incorporazione di amminoacidi non naturali proteine espresse nelle cellule di mammifero, metodi in Enzymology, 2016, 580, 89-107. 29 la riproduzione era consentita dal Copyright Clearance Center di Elsevier. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Applicazioni rappresentative del dosaggio di fluorescenza. (A) proiezione del tRNAPyl varianti30. Cellule HEK293 sono state co-trasfettate con il plasmide del reporter del e plasmidi che codifica per la coppia di PylRS/tRNA Mb(una copia del tRNA). Barre rappresentano la relativa fluorescenza di EGFP ottenuti dall'incorporazione di Lys(Boc) rispetto al selvaggio-tipo EGFP. (B) valutare l'influenza di codone-utilizzo per i geni di ncAARS. (pannello di sinistra) Analisi di fluorescenza di cellule trasfettate con due varianti differenti del gene di E2AziRS. (1) l'utilizzo di codone da e. coli e gene (2) umanizzato. (pannello di destra) Analisi di Western blot di CRF1R95Azi-FLAG. Il recettore full-length viene rilevato da un anticorpo anti-FLAG. Actina β è stato usato come controllo di carico. (C) valutare l'efficacia di incorporazione di tre ncAAs progettato per bioorthogonal chimica. (pannello di sinistra) Strutture di ncAAs utilizzati in questo esperimento. (1) LysZ, che è stato usato come controllo positivo, (2) BCNK, (3) TCO * K e SCOK (4). (pannello centrale) Analisi di fluorescenza di cellule HEK293 transfettate con un plasmide codifica per MbPylRSAF e quattro copie di tRNA15 da (A) per incorporare (1), (2), (3) e (4). (pannello di destra) Western blot analisi di un mutante di CRF1R-bandiera uno dei quattro ncAAs del cuscinetto alla posizione 95. Actina β è stato usato come controllo di carico. Pannello A è stato adattato da Serfling, R. et al. Designer tRNAs per efficiente incorporazione degli aminoacidi non canonico dal sistema Pirrolisina in cellule di mammiferi ricerca degli acidi nucleici 46 (1), 1-10 (2018) e vengono riprodotti secondo la Creative Commons Licenza di attribuzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Rappresentazione schematica della mappatura foto-reticolazione mediata Azi. Una funzione di foto-activatable azido (stella gialla) viene inserita in una posizione definita all'interno del recettore (grigio). Quando il gruppo azido si trova prossimale per il ligando associato (rosso), un prodotto di reticolazione covalente è formato su irradiazione UV (cerchio giallo indica il sito di reticolazione). L'incorporazione del gruppo azido in diverse posizioni del recettore rivela (viola) la superficie di legame del ligando, che rappresenta la tasca di associazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Incorporazione di Azi in tutta CRF1R per foto-reticolazione mappatura della tasca associazione. (A) confronto dei livelli di espressione dei mutanti di Azi-CRF1R-bandiera verso il recettore di tipo selvatico. I siti di incorporazione di Azi sono distribuiti in tutto il recettore intero come indicato nella riga superiore. Anti-FLAG Western Blot di lisati di cellule intere sono mostrati. Actina β è stato usato come controllo di carico. (B) le macchie occidentali sondato con entrambi anti-CRF o gli anticorpi anti-Ucn1 sono indicati. I residui sostituiti da Azi sono indicati nella riga superiore. Le cellule sono state incubate con i ligandi elencati a destra, seguita da irradiazione UV a 365 nm e Lisi. I campioni sono stati risolti su 10% SDS-PAGE, deglicosilata utilizzando PNGase F e analizzati mediante Western blotting. Il complesso ligando-CRF1R deglicosilata viene eseguito con un apparente MW ~ 40 kDa33. Il ligando non reticolato non è riconosciuto (kDa MW ~ 3-4). Entrambi i pannelli di questa figura sono stati modificati da Seidel, spaccato L. et al. Structural l'attivazione di un recettore di G-proteina-accoppiato di classe B di ormoni peptidici in cellule umane dal vivo. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 e vengono riprodotti secondo la licenza Creative Commons Attribuzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Orme di peptidi agonisti e antagonisti sulla classe B GPCR CRF1R. Rappresentazione della superficie del dominio transmembrana CRF1R. Posizioni di CRF1R quel reticolato il ligando quando sostituito da Azi sono evidenziati. Impronte degli agonisti del peptide CRF e Ucn1 sono evidenziate in magenta, orme degli antagonisti CRF (9-41) e Ucn1(8-40) in blu. L'impronta del antagonista dFXCRF(12-41) è evidenziato in arancione. I sette eliche transmembrana I-VII sono indicati da numeri romani. (A, B) Vista laterale della tasca associazione dal piano della membrana. (C) vista nella tasca associazione dal lato extracellulare superiore. Ristampato da Seidel, spaccato L. et al. Structural l'attivazione di un recettore di G-proteina-accoppiato di classe B di ormoni peptidici in cellule umane dal vivo. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 e vengono riprodotti secondo la licenza Creative Commons Attribuzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : SPIEDAC etichettatura dei CRF1R su cellule vive. (A) schema di reazione di cicloaddizione di Diels-Alder il ceppo-promosso inversa elettrone-domanda (SPIEDAC): il gruppo trans-cyclo-2-ottene della ncAA TCO * K reagisce con il gruppo tetrazine collegato al fluoroforo Cy3. (B, C) HEK293t cellule che esprimono CRF1R95TCO * K- EGFP. Immagini rappresentative del canale verde, rosso e blu. La dimensione della barra della scala è 10 µm. (B) le cellule sono state trattate con tetrazine-Cy3 (1,5 µM) per 5 min. Solo le cellule che esprimono il recettore (verde) mostrano la ricorrenza dell'etichettatura (rosso). (C) le cellule sono state trattate con 200 nM Ucn1 e ripreso dopo 15 min. di vescicole intracellulari corrispondono al recettore interiorizzato. Pannelli B e C vengono modificati da Serfling, R. et al. Designer tRNAs per efficiente incorporazione degli aminoacidi non canonico dal sistema Pirrolisina in cellule di mammiferi Dell'acido nucleico res. 1-10 di 46 (1) (2018) (Oxford University Press) e vengono riprodotti secondo la licenza Creative Commons Attribuzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo descrive un'analisi semplice e affidabile per valutare l'efficienza di coppie ortogonali per l'incorporazione di ncAAs in proteine espresse nelle cellule di mammifero. Il principale vantaggio di questo metodo rispetto al diffusi saggi basati sulla FACS è che permette la preparazione simultanea e la misurazione di un più grande numero di campioni e fornisce i dati che sono facilmente analizzati utilizzando un software ordinario. La disponibilità di un metodo di media-velocità di trasmissione per analizzare coppie ortogonali in cellule di mammifero è molto importante per lo sviluppo di nuove coppie ortogonali e il miglioramento di quelli esistenti. Infatti, non è possibile eseguire diretta evoluzione delle coppie ortogonali tramite la generazione di grandi biblioteche casuali e selezione morti/vivi nei sistemi mammiferi. L'analisi consente alle librerie lo screening di piccole dimensioni (centinaia di membri) investendo un ragionevole sforzo sperimentale in un tempo relativamente breve. Da razionalmente progettato tRNA set tramite questo test di screening, ci potremmo generare tRNAs romanzo che aumentare significativamente l'efficienza del sistema Pirrolisina30. La classica combinazione EGFP/mCherry viene utilizzata per la lettura fluorescente, per cui EGFP serve come reporter di efficienza di incorporazione e mCherry come controllo interno. Il reporter EGFP e il controllo di mCherry sono harbored nel plasmide stesso ma sono incorporati in due cassette di espressione separata due promotori indipendenti del cuscinetto. In questo modo, mCherry espressione riguarda l'efficienza di trasfezione e conteggio delle cellule, ma è indipendente di espressione di EGFP, affinché la fluorescenza verde misurata possa essere normalizzata in fluorescenza rossa. Questo non è esattamente il caso di altri reporter costruito come un tandem di due proteine come EGFP-TAG-mCherry7 e iRFP-GFPY39TAG (con iRFP che denota la proteina fluorescente a raggi infrarossi)52. In tali costrutti, entrambe le proteine sono la trascrizione di mRNA stesso. Negli eucarioti, mRNAs cuscinetto codoni di stop prematuri sottoposti a sorveglianza e degradazione dal meccanismo di deperimento assurdità-mediato (NMD)53. Pertanto, la sequenza di reporter e il controllo sono contemporaneamente degradati sia espressione dei due geni non è rigorosamente indipendente. Simili saggi basati su un reporter di luciferase invece di un reporter di fluorescenza sono stati descritti da altri54,55. Mentre enzimatica luminescenza offre maggiore sensibilità rispetto a misure di fluorescenza, quest'ultimo ha mostrato maggiore riproducibilità tra lotti differenti delle cellule.

Sistemi robusti per l'incorporazione di ncAA in cellule di mammifero sono assolutamente necessari quando si lavora con impegnativi obiettivi di proteine come le proteine di membrana e proteine abbondanti bassi. Vi abbiamo mostrato qui una coppia ortogonale ottimizzata per incorporazione robusto della ncAA foto-activatable Azi in GPCR. Il sistema fornisce tassi di incorporazione Azi omogenei in tutto l'intero recettore che consente la mappatura di foto-reticolazione sistematica di intere superfici GPCR e identificazione dei siti di legame del ligando. I due principali punti di forza del metodo sono che possono essere analizzati diversi ligandi del recettore stesso in parallelo e che i dati sono derivati dal recettore in cellule vive, che integra le informazioni ottenute dagli approcci in vitro . Il metodo è in linea di principio applicabile a qualsiasi proteina bersaglio ed è adatto anche per mappare le topologie delle interazioni proteina-proteina. Inoltre, il sottoinsieme identificato di reticolato posizioni possa essere analizzato ulteriormente con reticolazione 2D al pin-point intermolecolari coppie di aminoacidi prossimale nel complesso associato33,38. Tali coppie di aminoacidi forniscono vincoli spaziali che vengono applicati agli esperimenti in silico per creare modelli accurati molecolari dell'interazione33,38. Dal punto di vista metodico, vale la pena di remarking che dovrebbero essere considerati solo positivi risultati dagli esperimenti di reticolazione. Una posizione che ha fatto non crosslink può ancora essere entro il raggio critico dal ligando. Falsi negativi possono verificarsi quando la mutazione introdotta dal reticolante ostacola l'interazione nativo, ma può verificarsi anche quando la frazione di reticolazione o punti lontano dal ligando, o è spenta mediante il solvente o subisce intramolecolare reticolazione. Una parte cruciale del metodo è come rilevare l'occorrenza di reticolazione. In primo luogo, lisati di cellule intere vengono risolti su SDS-PAGE per separare qualsiasi ligando non covalentemente associato al recettore. In secondo luogo, il complesso covalente ligando-recettore viene rilevato tramite Western blotting usando un anticorpo anti-ligando. Per ligandi peptidici, gli anticorpi policlonali sollevati contro il ligando ad alta affinità sono la scelta ottimale. In alternativa, ligandi peptidici possono essere dotati di un tag di bandiera a una posizione permissiva, purché il tag viene reso accessibile per l'anticorpo anti-FLAG attraverso un distanziale adatto. Tag di biotina inoltre possono essere utilizzati, anche se i risultati possono essere difficili da interpretare a causa dello sfondo da proteine biotinilate endogeno. Ligandi di piccola molecola solitamente sono radioattivi, sebbene tag-etichettatura può anche essere possibile56,57. Protocolli per incorporazione Azi GPCR sono stati pubblicati anche da altri57,58,59. Tuttavia, questi protocolli prevedono l'utilizzo di tre plasmidi per l'incorporazione di Azi, considerando che usiamo un sistema più semplice di due-plasmide, compreso un gene umanizzato per E2AziRS, che dà il risultato migliore per quanto riguarda il non codone-ottimizzato (Figura 2B).

Tecniche di microscopia moderne richiedono l'installazione di fluorofori molto brillante ed efficiente nella proteina di interesse, come proteina geneticamente codificato fluorofori come il classico EGFP non sono adatti per applicazioni high-end. Di conseguenza, c'è una continua ricerca di metodi che consentono l'installazione di fluorofori organici su proteine, che ha portato allo sviluppo del popolare SNAP60 e Halo61 tag, tra gli altri. Tuttavia, tali tag ancora hanno una dimensione di kDa diversi, che può perturbare la funzione della proteina dell'obiettivo e lasciare una bel grande incertezza circa l'esatta posizione del fluoroforo. Con una dimensione minima di alcuni aminoacidi, il motivo di tetracysteine rappresenta un'alternativa più piccola per l'etichettatura più precisi utilizzando fluoresceina o Resorufina composti arsenicali (FlAsH, ReAsH)62,63. Anche se questo approccio è stato applicato con successo anche a GPCR studi64,65,66, richiede passaggi del vasto lavaggio con tioli, soffre spesso di alta priorità bassa, e in ogni caso, non consente l'etichetta con risoluzione singolo residuo di posizionamento. Invece, ncAAs dotato di ancore bioorthogonal offrono la possibilità di installare etichette fluorescenti a una posizione di singolo amminoacido, riducendo così al minimo il rischio di interferire con la conformazione nativa e la funzionalità della proteina bersaglio. NcAAs di ultima generazione per la bioorthogonal chimica, piace il TCO * K13 impiegati qui, hanno permesso a contrassegno della proteina direttamente su cellule vive17,43. Il metodo è applicabile per obiettivi di proteine sulla superficie delle cellule, ma anche su bersagli intracellulari, purché adatti cellula-permeabile coloranti sono disponibili17,67,68. SPIEDAC chimica è diversi ordini di grandezza più veloce rispetto al ceppo-promosso azido-alchino cicloaddizione (SPAAC) e legature Staudinger Bertozzi su azide ancore2,13. Infatti, sono stati pubblicati diversi protocolli per GPCR etichettatura su geneticamente incorporata Azi, ma sono applicabili solo a isolato GPCR in vitro37,59,69. Invece, abbiamo dimostrato qui liscio bioorthogonal etichettatura dei GPCR funzionali su cellule vive. Il nostro protocollo è simile ai protocolli esistenti utilizzando la stessa chimica43,48,70, ma il nostro sistema di incorporazione di ncAA ottimizzato si espande il campo di applicazione del metodo agli studi GPCR. Un passaggio fondamentale nella procedura sperimentale è la scelta della posizione per essere scambiati con TCO * K, come non tutte le posizioni all'interno del recettore sono permissivi per una sostituzione o accessibile alla tintura fluorescente. Pertanto, le diverse posizioni devono essere testati in una schermata preliminare per trovare quello più adatto.

In conclusione, questo lavoro presenta strumenti per l'applicazione generale del ncAAs, tra cui l'applicazione di impegnativi obiettivi di proteine quali GPCR. Anticipiamo che foto-reticolazione mappatura e bioorthogonal etichettatura, al giorno d'oggi le principali applicazioni di ncAAs agli studi GPCR, troverà molte applicazioni future sia per svelare le topologie delle interazioni di GPCR con ligandi o altre proteine e per studiare GPCR dinamica strutturale nella cella dal vivo.

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Disclosures

Gli autori non hanno nessun conflitto di dichiarare.

Acknowledgments

Quest'opera è stata fondata dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) sotto sovvenzioni CO822/2-1 (programma di Emmy Noether) e CO822/3-1 a I.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

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