Isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijke alveolaire beenvlies en effecten van vitamine D op Osteogenic activiteit van beenvlies-afgeleide cellen

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

We presenteren een protocol om te onderzoeken het mRNA uitdrukking biomarkers voor beenvlies-afgeleide cellen (PDC's) geïnduceerd door vitamine C (vitamine C) en 1,25-dihydroxy vitamine D [1,25-(OH)2D3]. Daarnaast evalueren we het vermogen van PDC's te differentiëren in osteocytes, chondrocyten en adipocytes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn aanwezig in een aantal weefsels en kan worden onderscheiden in vele celtypes, met inbegrip van botcellen. Onder de dental bronnen van MSCs is het beenvlies een gemakkelijk toegankelijke weefsel, dat MSCs bevatten in het cambium laag is geconstateerd. Echter, deze bron is niet nog veel onderzocht.

Vitamine D3 en 1,25-(OH)2D3 hebben aangetoond dat het stimuleren van in vitro differentiatie van MSCs in botcellen. Daarnaast is vitamine C vergemakkelijkt collageen vorming en bot celgroei. Geen enkele studie heeft echter nog onderzocht de effecten van vitamine D3 en vitamine C op MSCs.

Hier presenteren we een methode voor het isoleren van MSCs van menselijke alveolaire beenvlies en onderzoeken van de hypothese dat 1,25-(OH)2D3 een osteo-inductief effect op deze cellen kunnen uitoefenen. Wij onderzoeken de aanwezigheid van MSCs in de menselijke alveolaire beenvlies en evalueren van de hechting van de cel van de stam en proliferatie. Ter beoordeling van het vermogen van vitamine C (als een besturingselement) en verschillende concentraties van 1,25-(OH)2D3 (1010, 109108en 107 M) te wijzigen van belangrijke mRNA biomarkers in geïsoleerde MSCs mRNA uitdrukking van alkalische fosfatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core bindende factor alpha-1 (CBFA1), collageen-1 en osteocalcin (OCN) worden gemeten met behulp van real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR).

Introduction

Hoewel talrijke relevante technieken zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren, bone wederopbouw blijft beperkt door meerdere beperkingen, en het schatten van dat de omvang van de noodzakelijke wederopbouw is vaak niet onmogelijk. Harde-weefsel augmentatie is vereist om zowel esthetische als functionele doelen naast een gunstige succestarief voor lange termijn te bereiken. Methoden gebruikte voor dergelijke procedures omvatten Autogeen en allogene bottransplantaat, xenografting en alloplastic bottransplantaat. Onder de verschillende soorten bottransplantatie, autogene bottransplantaten worden beschouwd als de meest effectieve. Donor site morbiditeit, gecompromitteerde vasculariteit en beperkte weefsel beschikbaarheid1 zijn echter belangrijke nadelen voor Autogeen bottransplantaat geweest. Daarnaast zijn allogene bottransplantaten en xenografts geassocieerd met de overdracht van de ziekte. Op dit moment worden synthetische bottransplantaten veel gebruikt deze problemen op te lossen. Echter, met hun gebrek aan osteogenic mogelijkheden, klinische resultaten hebben sterk uiteen. Materialen zoals cellulose zijn en gekoppeld volume schommelingen, infectie, een gebrek aan kracht.

De vergroting van het bot met behulp van weefselengineering heeft veel belangstelling gegenereerd. Bij deze techniek, zijn mesenchymale stamcellen (MSCs) in eerste instantie gebruikt om osteoblast differentiatie, die vervolgens op de site van botverlies om bot reparatie worden getransplanteerd. Deze procedure wordt momenteel toegepast in celtherapie. Het bereiken van botreconstructie door het extraheren van een beperkte hoeveelheid weefsel is eenvoudiger en minder invasieve vergeleken met andere methoden.

De potentiële rol van MSCs als een hulpmiddel voor cel-gebaseerde therapieën gericht op tandheelkundige regeneratie is een opkomende belangstelling diverse onderzoeksgroepen. Studies hebben bevestigd dat MSCs kunnen worden onderscheiden van de volgende soorten weefsel: beenmerg, obesitas, synoviale membraan, pericyte, trabecular bot, menselijke navelstreng en tandheelkundige weefsels2,3. Gemeenschappelijke bronnen van MSCs omvatten het beenmerg, vetweefsel en tandheelkundige weefsels. Vergeleken met MSCs afgeleid van vetweefsel en het beenmerg, zijn de voordelen van tandheelkundige stamcellen gemakkelijke toegankelijkheid en minder morbiditeit na de oogst. Vergeleken met embryonale stamcellen, MSCs afgeleid van tandheelkundige weefsel nonimmunogenic verschijnen en niet zijn gekoppeld aan complexe ethische bezwaren3.

In 2006, de International Society for cellulaire therapie aanbevolen met behulp van de volgende normen te identificeren MSCs: ten eerste MSCs moet kunnen koppelen aan kunststof. Ten tweede, MSCs moet voor de oppervlakte antigenen, CD105, CD73 en CD90 positief en negatief voor de markeringen voor de B-cellen naast de hematopoietische antigenen CD45 en de CD344, monocyten en macrofagen. Als laatste criterium moet MSCs bekwaam om te onderscheiden in de volgende drie soorten cellen onder standaardvoorwaarden van in vitro differentiatie: botcellen, adipocytes en chondrocyten4. Tot op heden zijn zes soorten menselijke tandheelkundige stamcellen geïsoleerd en gekenmerkt. Het eerste type werd geïsoleerd uit menselijke pulp weefsel en postnatale tandmerg stamcellen5genoemd. Vervolgens drie aanvullende soorten tandheelkundige MSCs zijn geïsoleerd en gekenmerkt: stamcellen uit geëxpandeerd melkgebit6, de parodontale ligament7en de apicale Papil8. Meer recentelijk, tandheelkundige follikel afkomstige9, gingival weefsel afkomstige10en tandheelkundige bud stam cells(DBSCs)11periapical cyste MSCs (hPCy-MSCs)12 ook geconstateerd.

Nikolai was de eerste om te definiëren MSCs13. MSCs vertonen een potentiële hoge proliferatie en kunnen worden gemanipuleerd zodat u kunt onderscheiden voordat wordt getransplanteerd, die doen vermoeden dat zij ideale kandidaten voor regeneratieve procedures10 zijn.

Hoewel de meeste studies hebben het beenmerg gebruikt als een bron van stamcellen, beenvlies-afgeleide cellen (PDC's) zijn ook onlangs14gebruikt. Het beenvlies is meer bereikbaar dan het beenmerg is. Daarom in deze techniek gebruiken we alveolaire beenvlies elimineren de noodzaak voor extra incisies tijdens de operatie en het verminderen van postoperatieve morbiditeit bij patiënten. Het beenvlies is het bindweefsel die de buitenste bekleding van lange beenderen vormt en bestaat uit twee afzonderlijke lagen: de buitenste vezelige laag bestaat uit fibroblasten, collageen en elastische vezels15en de innerlijke cel-rijke cambium laag in rechtstreeks contact met het oppervlak van bot. De cambium-laag bevat een gemengde celpopulatie, voornamelijk fibroblasten16, botcellen17, pericytes18en een kritische subpopulatie geïdentificeerd als MSCs19,20,21. De meeste studies hebben gemeld dat PDC's vergelijkbaar zijn, zo niet superieur, aan het beenmerg-afgeleide cellen van de stam (bMSCs) in bone genezing en regeneratie22,23,24. Het beenvlies is gemakkelijk bereikbaar en uitstekende regeneratieve effectiviteit vertoont. Enkele studies hebben echter gericht op het beenvlies25,26,27.

Met betrekking tot bot reparatie houdt de huidige klinische praktijk de transplantatie van periosteal voorlopercellen versterkt binnen ondersteunende steigers. Recente studies hebben gericht op het verwerven van stamcellen gebreken regio en voorlopercellen voor weefsels regeneratie20in dienst. Tandartsen is ook anticiperen op toekomstige toepassing van parodontale bot regeneratie in parodontale behandelingen en implantaten. Met betrekking tot de donor-site, kan het beenvlies gemakkelijk worden geoogst door algemene tandheelkundige chirurgen. Dit steekt gunstig tegen beenmerg stromale cellen, zoals het beenvlies bereikbaar tijdens routinematige mondelinge chirurgie. Dus, het doel van deze studie is om een protocol voor het oogsten van PDC's en om te beoordelen van de morfologie, bijlage, levensvatbaarheid en proliferatie van cellen van de stam van het menselijke beenvlies.

Vitamine D metabolieten van invloed zijn op de in vivo bot-mineraal dynamisch evenwicht. Één studie gemeld dat de 24R,25-(OH)-2D3 actieve vorm van vitamine D essentieel voor de osteoblastic differentiatie van menselijke MSCs (hMSCs)28 is. Bot homeostase en reparatie worden geregeld door een netwerk van vitamine D3 metabolieten, van welke 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) de meest biologisch actieve en betrokken bij de regulering van de gezondheid van het been is. Vitamine D3 is essentieel voor verkalking29. In een studie met behulp van 2-d-oude Kunming witte muizen, de embryoid lichamen in de muizen aangegeven dat vitamine C en vitamine D supplementen effectief bevorderd de differentiatie van ESC-afgeleide botcellen30. Onder zijn andere biologische activiteit stimuleert 1,25-(OH)2D3 de in vitro differentiatie van hMSCs naar botcellen, die kunnen worden gecontroleerd op basis van de toename in alkalisch fosfatase (ALP) enzymactiviteit of OCN gen expressie.

Enkele studies hebben ontdekt een dosis-respons relatie van gecombineerde behandelingen met vitamine C en 1,25-(OH)2D3 in menselijke PDC's met een bijzondere focus op bot weefselengineering. Daarom in deze studie onderzoeken we de optimale concentratie voor afzonderlijke of gecombineerde behandeling van 1,25-(OH)2D3 en vitamine C voor inducerende osteogenic differentiatie van menselijke PDC's. Het doel van dit protocol is te bepalen of een celpopulatie geïsoleerd van de tandheelkundige alveolaire beenvlies cellen met een MSC fenotype en of deze cellen kunnen worden in cultuur (in vitro) uitgebreid en gedifferentieerd bevat tot het gewenste weefsel . Daarnaast evalueren we het vermogen van PDC's te differentiëren in osteocytes, chondrocyten en adipocytes. Het tweede deel van de studie evalueert de effecten van vitamine C en 1010, 109108en 107 M 1,25-(OH)2D3 op de osteogenic activiteit van PDC's. Het primaire doel van deze studie is om te beoordelen van de functies van vitamine C en 1,25-(OH)2D3 tijdens de osteoblastic differentiatie van PDC's door ALP activiteit, en pro-osteogenic genen, zoals ALP, collageen-1, OCN, BSP en CBFA1. Bovendien, bepaalt deze studie de osteo-inductief optimale voorwaarden voor menselijke PDC's op basis van deze bevindingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het studie-protocol werd goedgekeurd door de institutionele Review Board van Chang Gung Memorial Hospital. Alle deelnemers verstrekt schriftelijke geïnformeerde toestemming.

1. de weefsels voorbereiding

  1. Oogst de periosteal weefsels van patiënten tijdens tandheelkundige chirurgie (Figuur 1). Na de reflectie van de klep onder plaatselijke verdoving, een stuk van beenvlies weefsel van de alveolaire bot met behulp van een scheidingsteken voor periosteal31te nemen.
  2. Na de oogst, slaan de periosteal weefsels plakjes van ongeveer 5 mm × 2 mm in de Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) met 300 U/mL penicilline en 300 mg/mL streptomycine. Overdracht van de weefsels naar het laboratorium binnen de 24u.
  3. De fragmenten van de alveolaire periosteal weefsel met scalpels totdat goed gehakt en handhaven van de monsters in de passage 0 medium (bestaande uit 300 U/mL penicilline en 300 mg/mL streptomycine, α-MEM en 5% foetale runderserum [FBS]) gekweekt in een incubator bij 37 ° C met gehakt bevochtigde lucht (5% koolstofdioxide). In de incubator, een waterbassin om vochtigheid te bereiden.
  4. Wijzig het medium na 3 dagen en tweemaal per week daarna.
  5. Wanneer de cellen gekomen subconfluence (80%), laat de Adherente cellen met 200 µL van 0,25% trypsine in de incubator (37 ° C) gedurende 3 minuten en gebruik vervolgens 4.5 mL van medium tot beëindiging van de reactie.
  6. Plaat van de cellen opnieuw in verse passage 1 medium (α-MEM, 10% FBS, 100 eenheden/mL penicilline, en 100 μg/mL streptomycine). Plaat is 5 × 103 cellen (zoals geteld door een hemocytometer).
  7. Elke volgende passage uitvoeren nadat de cellen 80% samenvloeiing31 bereiken.
    Opmerking: In het begin kan het medium oranje rood. Na ongeveer drie dagen, moet de middellange kleur veranderen in een gelige tint. De verdubbeling tijd van de cellen is ongeveer 30-40 h, 7 dagen nodig voor 3 – 5 generaties.
  8. Cultuur de geïsoleerde PDC's in α-MEM aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL penicilline, en 100 mg/mL streptomycine in een incubator (37 ° C, 5% CO2).
  9. Celgroei dagelijks observeren en het groeimedium tweemaal per week vervangen. Derde tot vijfde-generatie cellen gebruiken voor alle verdere experimenten.

2. Stroom Cytometry

  1. Oogst 1 × 106 cellen via de spijsvertering van de trypsine:
    1. Voeg 200 µL van 0,25% trypsine. Na 3 min kunt 4.5 mL kweekmedium dat FBS beëindigen van de reactie van trypsine en verzamelen door middel van centrifugeren (1500 rpm, 5 min, 22 ° C).
    2. Wassen van de cel pellets driemaal met 1 x DPBS. Resuspendeer de cellen in 200 µL 1 x permeabilization buffer. Telt de cellen met een hemocytometer.
  2. Bestuderen van de geuite oppervlakte markers uitgedrukt voor de PDC's via stroom cytometry (fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren)32. Gebruiken van monoclonal antilichamen (MAb) tegen CD19 (fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) en HLA-DR (FITC)32.
    1. Voeg de antilichamen aan de monsters en de cultuur in het donker bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
    2. Spoel de cellen met 1 x DPBS driemaal.
    3. De cellen met behulp van 2% formaldehyde bevestigen en doorgaan met stroom cytometry analyse32.

3. cel bijlage en levensvatbaarheid met Osteogenic, Adipogenic, en Chondrogenic differentiatie

Differentiatie in de cellen te induceren osteogenic, adipogenic, en chondrogenic lineages door het kweken van de periosteal cellen in alle drie passages over zes-Wells-platen met specifieke differentiatie media.

  1. Cultuur voor osteogenic differentiatie, de cellen in α-MEM bij een dichtheid van 5000 cellen per putje op zes-well cultuur platen.
    1. Cultuur op het bereiken van 80% samenvloeiing, de cellen in de media met α-MEM, 5% FBS, β-glycerophosphate (10 mM), 10−7 M dexamethason (0.1 mM), en 5 mL van ascorbinezuur (100 uM). De negatieve controle in media bestaande uit α-MEM en 5% cultuur FBS.
    2. Wijzig de media tweemaal per week.
    3. Na 4 weken, beoordelen van het potentieel van de cellen om te onderscheiden in een osteogenic afstamming door kleuring van de cellen met behulp van een von Kossa assay, die de aanwezigheid van kalkhoudend deposito's in een cultuur33onderscheidt.
      1. Voeg toe 10% formaline voor bevestiging. Binnen 30 min, voeg 5% zilvernitraat en behandelen onder ultraviolet (UV) licht gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
      2. Toevoegen van 5% Na2zo4 vier keer, waardoor 3 min. voor elke reactie. Tot slot wassen de cellen tweemaal met gedestilleerd water.
        Opmerking: Von Kossa kleuring is een neerslag reactie waar zilver-ionen en fosfaat reageren in aanwezigheid van zuur materiaal; Deze kleuring techniek is niet specifiek voor calcium. In deze studie, wanneer de onderzochte cellen werden behandeld met zilvernitraat, oplossing, calcium — die wordt verminderd door de sterke UV-licht — werd vervangen door silver, die werd zichtbaar als behuizing van metallic zilver.
  2. Cultuur voor differentiatie van de adipogenic, de cellen bij een dichtheid van 5000 cellen per putje op zes-well cultuur platen met α-MEM.
    1. Cultuur op het bereiken van 80% samenvloeiing, de cellen in de media met α-MEM 5% FBS, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (100 mg/mL), 1% penicilline, 10−6 M dexamethason (1 mM), insuline (5 mg/mL) en indomethacin (60 mM).
    2. De negatieve controle in media bestaande uit α-MEM en 5% cultuur FBS.
    3. Na 6-9 weken, gebruik olie O van de rode vlek van de cellen te markeren lipide druppels, waardoor het bepalen van de aanwezigheid van adipogenic differentiatie33:
      1. Voeg toe 10% formaline voor bevestiging. Binnen 30 min, vlek de cellen met 0,5% olie rood O bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en daarna wassen de cellen drie keer met 60% isopropanol gedurende 3 minuten elke keer; tot slot wassen de cellen met gedestilleerd water.
        Opmerking: Olie red O een lysochrome (vetoplosbare) diazo kleurstof gebruikt is voor de kleuring van neutrale lipiden, voornamelijk lipoproteïne, triacylglycerol en cholesterol esters. De kleurstof lost op in de lipide druppels in de cel, de lipide druppels rode draaien.
  3. Voor de differentiatie van de chondrocyten, cultuur cellen op zes-well cultuur platen met elk putje met 5000 cellen.
    1. Het toevoegen van een differentiatie middellange met α-MEM, 5% FBS, 10−7 M dexamethason (0.1 mM), natrium pyruvaat (100 µg/mL), insuline-transferrine-selenium-A (1 × ITS), transformerende groeifactor-β (10 ng/mL) en 5 mL van ascorbinezuur (100 µM).
    2. De negatieve controle in media bestaande uit α-MEM en 5% cultuur FBS.
    3. Gebruik Alcian blauw kleuring nadruk wordt gelegd op de zure polysacchariden, zoals glycosaminoglycanen of bepaalde soorten mucopolysacchariden, in het kraakbeen van de cellen om te bepalen van de aanwezigheid van chondrocyten differentiatie33na 4-5 weken.
      1. Voeg toe 10% formaline voor bevestiging. Binnen 30 min, voeg van 3% azijnzuur en laat 2 min voor de reactie. Daarna wassen met gedestilleerd water drie keer, 1% Alcian blauwe 8GX 30 min ge¨ uncubeerd toevoegen en daarna wassen met gedestilleerd water. Ten slotte voeg 3% azijnzuur en wassen gedurende 3 minuten, en daarna wassen met gedestilleerd water tot finish.
        Opmerking: De onderdelen van de cel dat specifiek door deze kleurstof worden blauw aan blauw-groene vlekken na kleuring en heten "alcianophilic."

4. effecten van 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) op Osteogenesis

  1. De P3 aan P5 PDC's opgesplitst in zes groepen en cultuur op 6-Wells-platen met verschillende kweekmedia:
  2. negatieve groep (α-MEM en 5% FBS);
  3. Vitamine C groep (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate en 10−7 M dexamethason + 100 uM vitamine C);
  4. en 10−7 M 1,25-(OH)2D groep3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, en 10−7 M dexamethason + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
  5. Voeg 2 mL van het medium aan een incubator (37 ° C) in elk putje en wijzig het medium tweemaal per week.

5. omgekeerde transcriptie/kwantitatieve Real-Time polymerasekettingreactie

  1. Na 7 d osteoblast differentiatie, de totale RNA op ijs te isoleren met behulp van een commerciële reagens (Zie Tabel van materialen):
    1. Voeg 1 mL reagens isolatie aan elk putje. Voeg 200 µL van bromochloropropane en laat gedurende 10 minuten voor het genereren van gelaagde RNA en vervolgens Centrifugeer bij 10.000 rpm gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
    2. Na het centrifugeren, voeg toe 500 µL van 2-propanol aan 500 µL van het supernatant met RNA. Neerslaan van het RNA op het ijs en laat 15 min. voor de reactie.
    3. Na de ingreep, centrifugeer bij 12.000 rpm gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C, waarna het RNA gelegen aan de onderkant van de buis is. Vervolgens de bovendrijvende vloeistof verwijderen met behulp van 1 mL van 75% alcohol voor wassen en centrifugeer bij 7500 rpm voor 8 min in 4 ° C.
    4. Verwijder het supernatant en gebruik van een vacuüm concentrator te produceren van RNA vanaf de onderkant van de vloeistof. Herstellen met water.
  2. Omgekeerde transcriberen het RNA (1 μg) met behulp van aviaire myeloblastosis virus reverse-transcriptase. Instellen van de polymerase-kettingreactie (PCR) om uit te voeren bij 25 ° C gedurende 10 minuten, gevolgd door 50 ° C voor 60 min en vervolgens 85 ° C gedurende 5 minuten, voordat eindelijk handhaven bij 4 ° C.
  3. Synthetiseren eerste fronten cDNA (cDNA). Uitvoeren van kwantitatieve PCR (qPCR) met 5 μL van 1:10 verdund cDNA. Kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR) voeren gebruikend inleidingen voor ALP, BSP, OCN, CBFA1 en collageen-1.
    Opmerking: DNA om besmetting te voorkomen door de signalen, de voorwaartse en omgekeerde sequenties van elke primer werden ontworpen op verschillende exons.
  4. Uitvoeren van qPCR met behulp van een commerciële PCR Master Mix (Zie Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant. Instellen van de thermische cycler bij 50 ° C voor 2 min gevolgd door 95 ° C gedurende 10 minuten en vervolgens 40 cycli elk bij 95 ° C gedurende 15 s gevolgd door 60 ° C gedurende 60 s.
    Opmerking: Het SYBR-protocol vereist ook een smelt kromme fase, die wordt uitgevoerd bij 95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 60 s, waarna 95 ° C gedurende 15 s.
  5. Normaliseren van de cyclus-drempelwaarden voor ALP, BSP, CBFA1, collageen-1 en OCN met die van het huishouden gen GAPDH. 34
  6. Primerparen staan in de Tabel van materialen.

6. Alkalische fosfatase activiteit

  1. Beoordelen van de ALP enzymactiviteit van de cellen met behulp van de eerder beschreven techniek35, die p- nitrofenyl fosfaat wordt omgezet in p- nitrofenol; p- nitrofenyl fosfaat is een fosfatase substraat dat kleur omslaat naar geel wanneer gedefosforyleerd door ALP, zoals bepaald bij een golflengte van 405 nm. Normaliseren van de totaal p- nitrofenol gevormd op basis van de totale proteïne, zoals bepaald door de analyse van Bradford.
  2. Vergelijk de ALP-activiteiten van het besturingselement (α-MEM, 5% FBS), vitamine C (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethason + 100 uM vitamine C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, en 10−7 M Dexamethason + 10−8 M-1,25-(OH)-2D3), en vitamine C + 1,25-(OH)-2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethason + 100 uM vitamine C +1,25-(OH)2D3) groepen na 1, 2, 3 en 4 week van de cultuur.
  3. Een eiwit extractie procedure uitvoeren op ijs:
    1. Schrapen van de cellen van de 6-Wells-platen en voeg 50 µL van lysis buffer. Plaats vervolgens de cellen op het ijs voor 30 min te vernietigen de cellen en vrij van het eiwit.
    2. Na 30 min, centrifugeer bij 13000 rpm bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Na het centrifugeren, pak het supernatant voor opslag en gebruik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor alle kwantitatieve tests, worden de gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking (SD). Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van de Student t-test. In totaal werden 34 monsters verkregen met een gemiddelde deelnemer leeftijd van 48,1 ± 12.3 y. elf van deze monsters werden verkregen van de mannelijke patiënten en 23 van de vrouwelijke patiënten. Achtentwintig monsters werden verkregen van de molaire regio's en zes uit de voorste regio's; 26 werden verkregen van de maxilla en 8 van de onderkaak. De gemiddelde duur tussen de tandheelkundige procedure en de cultuur was 0,5 ± 0,1 h. Van de 34 onderzochte monsters leverde 20 succesvol MSC kolonies, met een succesvolle isolatie van 58,8%. Geen significante verschillen waargenomen in een van de parameters tussen het succes en de tevergeefs geïsoleerde PDC's (gemiddelde leeftijd: 48.8 ± 13,0 vs. 47.1 ± 11,5 y, seks: 7 mannen [35%] vs. 4 mannen [28,6%], locatie: 15 uit molaire gebieden [75%] vs. 13 [92,9%], en 15 van de maxilla [75%] vs. 11 [78,6%], respectievelijk).

Cel isolatie en morfologie: Osteogenic, chondrogenic, en adipogenic differentiatie

Van dagen 1-9, vormden PDC's kolonies en bolvormige clusters. De meeste cellen tentoongesteld van de verschijning van een spindel en waren homogene onder een microscoop met fase contrast (Figuur 2). Na 14 d van de cultuur verscheen de morfologie van de cel spindel-vormig zoals waargenomen onder de Microscoop fase contrast. Na de eerste generatie cellen, de cellen niet langer groeide in clusters, maar wijdverbreide en uniforme proliferatie tentoongesteld.

De MSCs waren spindel-vormig met onregelmatige processen en stevig is aangesloten op de cultuur schotel na 1-3 d van primaire cultuur (Figuur 2a). De oorspronkelijke cultuur tentoongesteld in de kleine, ronde cellen en cellen onder een optische Microscoop spindel-vormig. De gekweekte cellen tentoongesteld een homogene, fibroblast-achtige spindel vorm uit de eerste passage (Figuur 2a). De differentiatie-onderzoek is gebleken dat de PDC's kunnen worden subpassaged en in vitro in botcellen (Figuur 2b), chondrocyten (Figuur 2 c) en adipocytes (figuur 2d gedifferentieerde).

Von Kossa kleuring aangegeven aan het einde van de osteogenic differentiatie, de aanwezigheid van kalkaanslag en osteogenic differentiatie (Figuur 2b). Deze resultaten sterk aangegeven dat onder periosteal cel populaties, voorlopercellen bezit het potentieel om te differentiëren in osteogenic cellen.

Om te beoordelen van de productie van proteoglycans, Alcian, blauwe vlek werd gebruikt als indicatie voor het bepalen van de aanwezigheid van chondrocyten differentiatie (Figuur 2 c). De cellen onderscheiden met succes in de chondrocyten. Deze resultaten voorgesteld dat onder periosteal cel populaties, voorlopercellen bezit het potentieel om te differentiëren in chondrogenic cellen.

De cellen werden gekweekt in de eerder genoemde specifieke media om te activeren adipogenic differentiatie. Na 8 weken, olie red die o werd gebruikt voor het detecteren van het bestaan van intracellulaire lipiden. Volgende kleuring, intracellulaire microscopische vet druppels werden waargenomen in vijf gedifferentieerde monsters (figuur 2d).

Flow analyse van een oppervlakte marker expressie van het cytometrische voor PDC 's

Een flow cytometrische bepaling werd uitgevoerd om te bevestigen de expressie van de mesenchymale oppervlakte markeerdraad op het oppervlak van de cellen. MSC markeringen CD73, CD90, STRO-1 en CD44 waren sterk positief in de PDC's, terwijl hematopoietische lineage markeringen, CD19, CD34, CD45 en HLA-DR negatief waren.

Effecten van verschillende vitamine D 3 concentraties op osteogenesis

Hoewel de resultaten de positieve effecten van 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) op osteogenic activiteit bevestigen, werden statistisch significante verschillen waargenomen alleen onder sommige van de veranderingen van de vouw in het mRNA uitingen van de osteogenic enzymen. Deze analyse kan zijn beïnvloed door de hoge waarden van de SD, die kunnen worden toegeschreven aan de individuele afwijkingen tussen de hosts.

Messenger RNA uitdrukking van alkalische fosfatase

De fold-veranderingen in de uitdrukking van mRNA van ALP na 1 week van de cultuur 7.43 was (SD = 3.96) in de vitamine C groep en 7.15 (SD = 4.88), 9.30 (SD = 5,63), 12.92 (SD = 7,95), en 6,60 (SD = 6.33) in de 1010, 109, 108 , en 107 M 1,25-(OH)2D3 groepen, respectievelijk (figuur 4a). De mRNA niveaus van de expressie van ALP in vitamine C, 108 M 1,25-(OH)2D3en 109 M 1,25-(OH)2D3 groepen waren aanzienlijk hoger (p < 0.05) dan die in de andere groepen, die aangeeft verhoogd ALP mRNA uitdrukking in deze groepen. Het besturingselement is ingesteld op de waarde 1. De volgende vouwen verhogingen in de ALP mRNA-expressies in deze studie werden waargenomen: 7.43-fold in de vitamine C groep; 9.30-Fold in de 109 M 1,25-(OH)2D3 groep; en 12.92-fold in de groep van 108 M 1,25-(OH)2D3 .

Hoewel een grotere verandering van de vouw in de ALP mRNA expressies werd waargenomen in de groep van 108 M 1,25-(OH)2D3 , geen statistisch significante verschillen werden waargenomen met betrekking tot de niveaus van deze expressie tussen deze groep en de negatieven van afbeeldingen en vitamine C groepen (p = 0.20 en p = 0.52, respectievelijk).

ALP is een sterke indicator voor het bepalen van de vroege osteogenic differentiatie van cellen. ALP ook fungeert als een ectoenzyme voor de afbraak van anorganische pyrofosfaat en releases fosfaat tijdens mineralisatie36. De PDC's behandeld met vitamine C en 108 en 109 M 1,25-(OH)2D3 tentoongesteld significante verschillen in vergelijking met die van de andere fracties (figuur 4a).

Messenger RNA uitdrukking van bot sialoprotein

De fold-veranderingen in de uitingen van de mRNA van BSP na 1 week van de cultuur waren 3,21 (SD = 1,20) en 4.18 (SD = 2.55), 10.34 (SD = 10.31), 24.91 (SD = 23.44), en 5.24 (SD = 3.54) in de vitamine C en de 1010, 109, 108 , en 107 M 1,25-(OH)2D3 groepen, respectievelijk (figuur 4b). De BSP mRNA expressies waren hoger in de groep van 108 M 1,25-(OH)2D3 , maar met geen statistische significantie vergeleken met de corresponderende expressies in de andere fracties.

De BSP mRNA-expressies in de vitamine C en 1010 M 1,25-(OH)2D3 groepen waren aanzienlijk hoger (p < 0.05) dan die van de andere fracties, die aangeeft dat vitamine C en 1010 M 1,25-(OH) 2 D3 bevorderd BSP expressie. De controle was ingesteld op een waarde van 1. De vitamine C en de 1010 M 1,25-(OH)2D3 groepen tentoongesteld een 3,21 - en 4.18 keer verhoging van de BSP mRNA expressies, respectievelijk. De 109 M en 108 M 1,25-(OH)2D3 groepen tentoongesteld hogere expressies van de BSP mRNA dan deed de andere fracties. De 109 en 108 M 1,25-(OH)2D3 groepen tentoongesteld een 10.34 - en 24.91 keer verhoging van de BSP mRNA expressies, respectievelijk, maar deze stijging was niet statistisch significant (p > 0.05). Een mogelijke verklaring is dat de cellen van de stam niet alle verkregen uit eenzelfde deelnemer waren. Dus, de potentiaalverschillen misschien gestegen de SD en bijgevolg beïnvloed de statistische resultaten.

Messenger RNA uitdrukking van CBFA1

De fold-veranderingen in de CBFA1 mRNA expressies na 1 week van de cultuur waren 0.96 (SD = 0.10) en 0,90 (SD = 0.26), 1.01 (SD = 0,25), 1.31 (SD = 0.32), en 1.12 (SD = 0,35) in de vitamine C en de 1010, 109, 108 , en 107 M 1,25-(OH)2D3 groepen, respectievelijk (Figuur 4 c). De groep 108 M 1,25-(OH)2D3 tentoongesteld hogere CBFA1 mRNA expressies. Geen gemarkeerde wijzigingen werden waargenomen in de CBFA1 mRNA gene expressies in de behandeling in groepen of in de controlegroep. Bovendien werd geen significante toename waargenomen in de expressie van de markers van mRNA na toevoeging van vitamine C of 1,25-(OH)2D3. Bovendien werden geen significante verschillen van de interfractiewerkgroep waargenomen.

Messenger RNA uitdrukking van collageen-1

De fold-veranderingen in de uitdrukking van mRNA van collageen-1 na 1 week van de cultuur waren 0.98 (SD = 0.17) en 0,85 (SD = 0.16), 1.05 (SD = 0.16), 1,52 (SD = 0.36), en 1.01 (SD = 0,33) in de vitamine C en de 1010, 109, 108 , en 107 M 1,25-(OH)2D3 groepen, respectievelijk (Figuur 4 d). De collageen-1 mRNA expressies waren hoger in de groep van 108 M 1,25-(OH)2D3 maar met geen statistisch significante verschillen vergeleken met de corresponderende expressies in de andere fracties.

De 108 M 1,25-(OH)2D3 - en controlegroepen tentoongesteld statistisch significante verschillen in hun resultaten (p < 0,05). De controle was ingesteld op een waarde van 1. Een verhoging van de 1.52-fold in de collageen-1 mRNA expressies werd waargenomen. De 1010 M 1,25-(OH)2D3 en de 108 M 1,25-(OH)2D3 groepen tentoongesteld significante verschillen in hun resultaten (p < 0,05).

Messenger RNA uitdrukking van osteocalcin

De fold-veranderingen in de OCN mRNA expressies na 1 week van de cultuur waren 0,60 (SD = 0,1) en 0.78 (SD = 0.18), 1.13 (SD = 0,55), 2,59 (SD = 1,59), en 1.61 (SD = 0,73) in de vitamine C en de 1010, 109, 108 , en 107 M 1,25-(OH)2D3 groepen, respectievelijk (figuur 4e). De OCN mRNA expressies waren hoger in de groep van 108 M 1,25-(OH)2D3 maar met geen statistisch significante verschillen vergeleken met de corresponderende expressies in de andere fracties.

Geen significante toename werd waargenomen in de uitingen van de OCN mRNA markeertekens na toevoeging van vitamine C of 1,25-(OH)2D3. Echter de OCN mRNA expressies daalde na vitamine C behandeling. Het besturingselement is ingesteld op de waarde 1. De basale OCN expressies tentoongesteld een significante daling van de 0.6-fold (p < 0,05) tijdens osteoblastic differentiatie. De OCN mRNA expressies waren aanzienlijk hoger (p < 0.001) in de gekweekte in 108 M 1,25-(OH)2D3 cellen dan in de overeenkomstige uitdrukkingen van de andere fracties, die een gemiddelde vouw tentoongesteld verhogen van 2,59. deze resultaten werden echter niet statistisch significant (p > 0,05). Een mogelijke verklaring is dat de cellen van de stam niet alle verkregen uit eenzelfde deelnemer; Dus, de potentiaalverschillen misschien gestegen de SD en bijgevolg beïnvloed de statistische resultaten.

ALP activiteit assay

Een eerdere studie aangetoond dat 1,25-(OH)2D3 is het meest effectief bij een concentratie van 108 M; 108 M werd daarom gebruikt in de testgroep te vergelijken het osteogenic vermogen van 1,25-(OH)2D3 met dat van de negatieve, vitamine C en vitamine C + 1,25-(OH)2D3 groepen. Het osteogenic vermogen werd geuit door de ALP-activiteit. Na 1 week van de cultuur (figuur 5a), waren de wijzigingen van de vouw in ALP activiteit 1,00 (SD = 0,00), 1.92 (SD = 0,89), 3,77 (SD = 1,66), en 1,46 (SD = 0,49) in negatief, C, D, en C + D, respectievelijk. Tussen alle fracties, statistisch significante verschillen waren alleen waargenomen tussen de groepen D en negatief (p = 0,03; Figuur 5a). Na 2 weken van de cultuur, de veranderingen van de vouw in ALP activiteit (Figuur 5b) waren 1,00 (SD = 0,00), 2.32 (SD = 1,68), 4,98 (SD = 3.02), en 4.86 (SD = 2.73) in negatief, C, D, en C + D, respectievelijk. Geen statistisch significante verschillen werden waargenomen in een van de groepen. Na 3 weken van de cultuur, de veranderingen van de vouw in ALP activiteit (Figuur 5 c) waren 1,00 (SD = 0,00), 2,93 (SD = 2.15), 5,76 (SD = 3.60), en 5.61 (SD = 3,88) in negatief, C, D, en C + D, respectievelijk. Nogmaals, werden geen statistisch significante verschillen waargenomen in elk van de groepen (Figuur 5 c). Na 4 weken van de cultuur, de veranderingen van de vouw in ALP activiteit (Figuur 5 d) waren 1,00 (SD = 0,00), 2,83 (SD = 1.97), 3.79 (SD = 0.77), en 4.24 (SD = 2,87) in negatief, C, D, en C + D, respectievelijk. Hier, de groepen D en negatieve tentoongesteld statistisch significante verschillen (p = 0,00; Figuur 5 d).

In Week 1, alleen de 108 M 1,25-(OH)2D3 groep exposeerde significante verschillen in vergelijking met de controlegroep (p = 0,03). In Week 2, de 108 M 1,25-(OH)2D3 en vitamine C groepen tentoongesteld significante verschillen in vergelijking met de controlegroep (p = 0.0498). In Week 3 tentoongesteld geen van deze groepen verschillen in vergelijking met de controlegroep. In Week 4 tentoongesteld de groep 108 M 1,25-(OH)2D3 significante verschillen in vergelijking met de controlegroep. Hieruit bleek dat 108 M 1,25-(OH)2D3 bevorderd ALP activiteit.

Kortom, verhoogden de 102D3 groep van de8 M 1,25-(OH) tentoongesteld ALP en collageen-1 mRNA uitdrukking; de vitamine C groep tentoongesteld aanzienlijk verbeterde ALP en BSP mRNA uitdrukking; en de groep van 109 M 1,25-(OH)2D3 tentoongesteld aanzienlijk verbeterde ALP mRNA uitdrukking. In Week 1, werd verhoogde activiteit van de ALP waargenomen in de vitamine C en 1,25-(OH)2D3 groepen, maar met geen statistisch significante verschillen vergeleken met de bijbehorende expressie niveaus in de andere fracties. Van weken 2 tot 4 tentoongesteld zowel vitamine C en 1,25-(OH)2D3 groepen vergelijkbare resultaten. Dus, deze resultaten kunnen niet duidelijk verhelderen de synergetische effecten van vitamine C en 1,25-(OH)2D3 op de osteogenic differentiatie van de cellen (ALP activiteit).

Figure 1
Figuur 1: menselijke alveolaire beenvlies. Periosteal weefsels zijn geoogst tijdens tandheelkundige chirurgie. Het sterretje duidt de locatie van de alveolaire beenvlies.

Figure 2
Figuur 2: studie van de differentiatie. De MSCs waren spindel-vormig met onregelmatige processen en stevig is aangesloten op de cultuur schotel na 1-3 d van primaire cultuur (A; het sterretje duidt de locatie van de mesenchymale stamcellen). In vitro cultuur, de MSCs waren subpassaged en voorwaarden onderscheiden in botcellen (B, het zwarte sterretje geeft het gebied gekleurd door von Kossa), chondrocyten (C, het blauwe sterretje geeft het gebied gekleurd door Alcian blauw), en adipocytes (D, het roze sterretje geeft het gebied gekleurd door olie rood O). Figuur 2 wordt hergebruikt van biomedische Research International, Volume 2016, artikel ID 352956125. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: stroom cytometry. Oppervlakte markeringen uitgedrukt door MSCs waren CD73 (65.2%), CD90 (75.6%), STRO-1 (65.2%) en CD44 (88.1%) maar niet CD45 (1,34%), CD34 (1,61%), CD19 (2.18%), of HLA-DR (2,20%). "%" in de afbeelding geeft een positieve verhouding. De controlegroep (α-MEM en 5% FBS) wordt vertegenwoordigd door de rode lijn. De experimentele groep wordt vertegenwoordigd door de blauwe lijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: mRNA expressies. mRNA uitingen van osteoblast differentiatie voor Week 1. BSP ALP (B) de (A), (C) CBFA1, (D) COL-ik, en (E) OCN. p < 0.05 is *, p < 0,01 is **, p < 0.001 is ***. De verandering van de vouw mRNA is versus controle (α-MEM en 5% FBS). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: alkalische fosfatase activiteit. Alkalische fosfatase activiteit assay osteoblast differentiatie voor (A) Week 1, Week 2 van de (B), (C) Week 3, en (D) Week 4. p < 0.05 is *, p < 0,01 is **, p < 0.001 is ***. De verandering van de vouw is versus controle (α-MEM, 5% FBS). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een onlangs ontwikkelde therapeutische modaliteit, namelijk weefsel engineering inhoudt MSCs, heeft tal van voordelen. MSCs, die in verschillende weefseltypes (HLA) aanwezig zijn, zijn Multipotente cellen die in een scala aan functionele mesodermal weefsel cellen37 onderscheiden kunnen en andere cellen zoals botcellen.

Het beenvlies fungeert als een niche voor voorlopercellen en als een rijke therapieën voorziening voor het bot omhult het38. In onze studie, van de 34 onderzochte monsters, leverde 20 succesvol MSC kolonies, met een succesvolle isolatie van 58,8%. Afgeleid van het beenvlies MSCs werden geselecteerd in deze studie op basis van hun proliferatie en differentiatie van de osteogenic mogelijkheden. Het tarief van de proliferatie van de periosteal cellen was veel hoger dan die van het beenmerg stromale cellen22. Over het osteogenic vermogen van het beenvlies, Ousual24 betoogd dat het osteogenic vermogen van beenvlies-afgeleide cellen van de stam (PMSCs) werd inferieur aan die van BMSCs. Yoshimura blijkt echter dat het osteogenic vermogen van PMSCs presteerde beter dan die van BMSCs39. Hayashi et al. aangetoonde periosteal volwassen MSCs als ideale kandidaten voor bot weefsels regeneratie24. Daarnaast worden periosteal volwassen MSCs nuttig geacht in het verkorten van de cel cultuur periode, waardoor zowel kosten en het risico van besmetting22. Naar verluidt, veroudering ook van invloed op de mitogene activiteit van de osteoprogenitor cellen40. Een studie gemeld 1,25-(OH)2D3 veroorzaakte een hogere mate van stimulatie van in vitro osteoblast differentiatie in hMSCs van jongere deelnemers (leeftijd < 65 y)41. De huidige studie betrokken het gebruik van periosteal cellen verkregen uit jonge volwassenen (leeftijd < 65 y). Verdere studies moeten vergelijken de bot Regeneratie vermogen van periosteal cellen tussen de oude en jonge donoren.

In deze studie werd een celpopulatie geïsoleerd op basis van de eigenschap kunststof-aanhanger, zoals beschreven door Nikolai et al. 13. de PDC's geoogst hier vastgehouden aan de cel cultuur plastic. De esenchymal markers (CD 73, CD 90 STRO-1 en CD 44) van de oppervlakte antigenen van deze culturen van primaire cellen tentoongesteld belangrijke uitdrukkingen. Bovendien waren de hematopoietische markeringen (CD 45, CD 34 CD 19 en HLA-DR) afwezig, die aangeeft dat de gekweekte cellen van een mesenchymale oorsprong waren. De differentiatie van het osteogenic, chondrogenic en adipogenic van de PDC's kon worden opgewekt met behulp van specifieke differentiatie media, zoals beschreven in andere studies evalueren monsters gingival weefsel en het beenmerg42verkregen. De resultaten van de huidige studie voldoen de minimale normen voor de fenotypische en functionele definitie van menselijke MSCs aanvaard door de International Society for cellulaire therapie4. In de huidige studie, werden de MSCs van menselijke beenvlies geïsoleerd en uitgebreid, die geopenbaard eigenschappen die vergelijkbaar zijn met die meestal van BMSCs.

Studies hebben voorgesteld dat β-glycerophosphate, dexamethason en ascorbaat veroorzaken BMSCs osteogenic differentiatie43ondergaan. Een andere studie aangetoond dat 1α, 25-dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) in combinatie met ascorbinezuur bevorderd stamcel differentiatie44. Daarom, dexamethason, ascorbaat en β-glycerophosphate werden toegevoegd in deze studie ter bevordering van de differentiatie van de cel van de stam. De patronen die waargenomen waren vergelijkbaar in alle drie patiënten celsteekproeven. In deze studie werden MSCs met succes van de alveolaire beenvlies geïdentificeerd met een isolatie van 58,8%. Geen statistisch significante verschillen werden waargenomen in het slagingspercentage met betrekking tot leeftijd, geslacht en locatie.

De huidige experimentele studie onderzocht twee stoffen, namelijk 1,25-(OH)2D3 en vitamine C, die beide kunnen het stimuleren van de osteogenic differentiatie van stamcellen. Een studie van 200845 aangegeven dat 1,25-(OH)2D3 is van cruciaal belang voor het metabolisme van de botten en calcium-homeostase en is van invloed op het cardiovasculaire systeem via mechanismen nog moet volledig worden begrepen. In een eerdere studie46, 1,25-(OH)2D3 gestimuleerd in vitro differentiatie van menselijke MSCs in botcellen. Het vermogen van 1,25-(OH)2D3 voor het opwekken van de ongedifferentieerde BMSCs om te differentiëren in osteoblast-achtige cellen in vitro is aangetoond in verschillende studies verkennen van verschillende systemen46. Sommige studies hebben ook aangetoond dat, wanneer toegevoegd aan culturen van osteoblast-achtige cellen, 1,25-(OH)2D3 cellulaire proliferatie remt maar de expressie van osteoblastic markers zoals ALP, osteopontin, OCN en matrix Gla verhoogt eiwit47,48. Een eerdere studie gemeld dat 1,25-(OH)2D3 meestal cellulaire proliferatie remt en osteoblast differentiatie49 induceert. Een in vitro studie uitgevoerd op lymfkliertest cellen aangegeven dat 1,25-(OH)2D3 kan de bevordering van de vroege stadia van osteoblastogenesis9. Daarnaast stelde nog een in vitro studie dat, om zowel de vroege en de late MSCs,1,25-(OH)2D3 osteogenic differentiatie markers, met inbegrip van ALP, osteopontin, BSP en OCN43kan stimuleren.

Beide OCN — beschouwd als verantwoordelijk voor de controle van matrix synthese — en collageen 1A1 — de overvloedigste matrix eiwitten — zijn cruciale zure bot matrix eiwitten die cruciale rol in de synthese van de matrix spelen. Daarnaast zijn ze karakteristiek volwassen matrix-vormende botcellen. 50 een eerdere studie gemeld dat 1,25-(OH)2D3 behandeling gestimuleerd meer collageen 1A1 uitdrukking maar niet CBFA1 of ALP gen expressie34. Beoordeling van genen die betrokken zijn bij osteoblastic differentiatie is gebleken dat 1,25-(OH)2D3 behandeling steeg de expressie van OCN51,52,53. In ons onderzoek toonden de resultaten aan dat 1,25-(OH)2D3 positieve effecten op de osteogenic activiteit uitoefent. Vergeleken met de andere fracties, 10−8 M-1,25-(OH)-2D3 verhoogde mRNA uitdrukking van ALP, BSP, CBFA1, OCN en Kol1 aangetoond. Onder deze bereikt de resultaten voor de ALP en Kol1 statistische significantie. Daarom zijn optimale omstandigheden verkregen bij het gebruik van 10−8 M-1,25-(OH)-2D3. mRNA uitdrukking van BSP in de 10−10 M 1,25-(OH)2D3 groep aanzienlijk gestegen (p < 0,05). Echter werden geen statistisch significante verschillen waargenomen in de vouw veranderingen in het mRNA uitingen van CBFA1 en OCN. Bij de herziening van de genexpressie mRNA, vermeld de resultaten van het experiment in vitro osteogenic differentiatie. Op basis van deze bevindingen, de osteogenesis waargenomen in het negatieve, vitamine C en 10−10, 10,9, 10−7 M 1,25-(OH)2D3 groepen was zwakker dan die in de 10−8 M 1,25-(OH)23 D groep. Deze resultaten hebben geleid tot de speculatie dat 1,25-(OH)2D3 PDC's door upregulating priemgetallen de matrix eiwitten nodig voor mineralisatie (collageen 1A1).

Een eerdere studie gerapporteerd OCN als een belangrijk doelwit voor 1,25-(OH)2D3, die aanzienlijk verhoogd OCN expressie52. OCN afzetting kan worden gezien als een marker voor de osteogenic differentiatie van PDC's. Daarnaast is als een late osteogenic marker54OCN expressie geëvalueerd. OCN is een betrouwbare markering voor bot vorming en osteogenesis55. OCN expressie is daarom over het algemeen gerelateerd aan de capaciteiten van de mineralisatie van de cellen. OCN is een gevoelige biomarker van volwassen botcellen. Voor een in vitro osteogenic vergelijking, werd aanzienlijk verhoogde OCN mRNA uitdrukking waargenomen in de groep2D-3 voor 10−8 M 1,25-(OH).

Een studie gaf aan dat de ALP activiteit was geremd door transformeren groeifactor bèta (0.1-10 ng/mL) en bevorderd met 1,25-(OH)2D3 (50 nM)46. Deze resultaten impliceren dat 10−8 M 1,25-(OH)2D3 stamcel rijping en bot ontwikkeling bevordert. ALP activiteit bij de optimale waargenomen concentraties van 10−8 M 1,25-(OH)-2D3 werd vergeleken met die bij de overeenkomstige concentraties van vitamine C. De PDC's uitgedrukt ALP activiteit. Bovendien, de toevoeging van 1,25-(OH)2D3 verhoogd van de ALP-activiteit, en bevorderd de osteoblastic differentiatie in de PDC's. In alle drie instellingen, vitamine C, 10−8 M 1,25-(OH)2D3, en vitamine C + 10−8 M 1,25-(OH)2D verhoogde3 ALP activiteit bij weken 1 (figuur 4a), 2 (figuur 4b), 3 ( Figuur 4 c), en 4 (Figuur 4 d) met verschillende vouwen vergeleken met die van de negatieve controlegroep. In de weken 1 en 4, ALP activiteit steeg aanzienlijk in de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 groep. In Week 2, ALP activiteit steeg aanzienlijk in de vitamine C en 10−8 M 1,25-(OH)-2D3 groepen.

Door middel van een vergelijkende studie van verschillende menselijke MSCs bij passage 3, Sakaguchi et al. 56 gevonden dat BMSCs en PMSCs soortgelijke osteogenic capaciteiten bezitten. Daarom kan de cel cultuur periode waarschijnlijk worden verkort met behulp van periosteal cellen, die op zijn beurt zou het risico op kosten en verontreiniging. Het gebruik van vroege-passage hMSCs vermijdt de verouderend effecten van expansie in de cultuur. Ousual en Yoshimura gebruikt MSCs bij passage 3 en overgeënt voor 2 weken onder35voorwaarden osteogenic differentiatie. Daarom kan de tijd van de doorgang moet worden overwogen bij het vergelijken van de cellulaire activiteiten van verschillende bronnen van de cel. In deze studie werden de derde generatie PDC's gebruikt omdat het osteogenic potentieel van de cellen van de stam van latere generaties van PDC's lager dan die van de cellen van de stam van de derde generatie PDC's is.

Wanneer gekweekt in een menselijk serum medium, kan cellen van de stam van het beenvlies niet alleen behouden hun vorm, maar kunt ook hechten, onderhouden activiteit en celgroei bereiken. Kortom, op basis van deze resultaten, menselijke PDC's beschikken over het vermogen om te overleven, vermenigvuldigen, en onderscheid in de osteogenic afstamming in vitro, die is van cruciaal belang bij de evaluatie van werkzaamheid in vivo. Het beenvlies is rijk aan MSCs en is dus geschikt voor weefselengineering. Het beenvlies verkregen uit het tandvlees minder complicaties met zich meebrengt. De alveolaire bot is derhalve een ideale donor-site. De resultaten duidelijk de mogelijkheid om op dezelfde manier isoleren MSCs van het beenvlies en bereiken hun differentiatie in botcellen, chondrocyten en adipocytes. In deze studie werden de effecten van vitamine C op het osteogenic potentieel van PDC's vergeleken met die van 1,25-(OH)2D3 in verschillende concentraties. De meest effectieve concentratie was 10−8 M-1,25-(OH)-2D3. De 10−8 M 1,25-(OH)2D3 behandeling gedurende de cultuur was een efficiënte en economische methode van inducerende osteogenic differentiatie in PDC's. Kortom, bevorderen zowel vitamine C en 1,25-(OH)2D3 de osteogenic differentiatie van PDC's. Echter, deze tentoongesteld geen aanzienlijke synergie-effecten in de resultaten van de activiteit van de ALP. Gezien de grootte van de kleine steekproef zijn aanvullende monsters nodig voor verdere evaluatie. Dus, PDC's gekweekt onder osteogenic omstandigheden misschien nuttig voor weefselengineering van bot en bieden het voordeel van de hogere cellulaire proliferatie.

Kritische stappen van dit protocol opnemen stap 1.2 en 1.3 (het kweken procedure te starten binnen 24 uur na het oogsten en behoorlijk onderhouden daarna). Besmetting van het weefsel moet worden vermeden en gebruik van aseptische techniek is verplicht. Een beperking van dit protocol is dat, in vergelijking met de inkoop van stamcellen uit beenmerg of adipeus weefsel, sourcing van stamcellen uit tandheelkundige weefsel is beperkt in termen van het geringe aantal cellen die worden door deze techniek verkregen kan.

De identificatie en karakterisering van periosteal stamcellen bieden waardevolle informatie over de functies en regeneratieve potentieel van dit weefsel, alsmede de toepasbaarheid ervan in regeneratieve therapie. Een optimale conditie werd verkregen met behulp van 10−8 M-1,25-(OH)-2D3. Daarom bevordert de behandelingvan PDC's met 10−8 M 1,25-(OH)-2D3 osteogenic differentiatie. Toekomstige studies moeten behandelen in vivo van 10−8 M 1,25-(OH)2D3 voor weefselengineering van doeltreffend en economisch bot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het studie-protocol werd goedgekeurd door de institutionele Review Board voor klinisch onderzoek van Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B en 103-4223C). Deze studie werd ondersteund door Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 en NMRPG3C0151). Dit manuscript werd uitgegeven door Wallace academische bewerken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9, (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. Article ID 3529561 (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53, (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22, (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27, (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122, (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65, (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics