Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Bioengineering

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Summary

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um die mRNA Ausdruck Biomarker der Knochenhaut-abgeleitete Zellen (PDCs) durch Vitamin C (Vitamin C) und 1,25-Dihydroxy Vitamin D [1,25-(OH)2D3] induzierte untersuchen. Darüber hinaus bewerten wir die Fähigkeit des PDCs, in Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten differenzieren.

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Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

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Abstract

Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind in einer Vielzahl von Geweben und in zahlreichen Zelltypen, einschließlich Osteoblasten differenzieren. Unter den dental Quellen von MSCs ist der Knochenhaut eine leicht zugängliche Gewebe, die MSCs im Kambium Layer enthalten identifiziert wurde. Allerdings hat diese Quelle noch nicht umfassend untersucht.

Vitamin D3 und 1,25-(OH)2D3 wurden nachgewiesen in Vitro Differenzierung von MSCs in Osteoblasten stimulieren. Darüber hinaus fördert Vitamin C Kollagen-Bildung und Knochen Zellwachstum. Jedoch ist keine Studie die Wirkung von Vitamin D3 und Vitamin C auf MSCs noch untersucht.

Hier präsentieren wir eine Methode der MSCs aus menschlichen alveoläre Periost zu isolieren und untersuchen die Hypothese, dass 1,25-(OH)2D3 Osteoinduktiv Auswirkungen auf diese Zellen ausüben kann. Wir untersuchen das Vorhandensein von MSCs in der menschlichen alveoläre Knochenhaut und Stammzell-Adhäsion und Verbreitung zu bewerten. Zu beurteilen, die Fähigkeit von Vitamin C (als Kontrolle) und verschiedenen Konzentrationen von 1,25-(OH)2D3 (1010, 109108und 107 M), wichtige mRNA Biomarker in zu ändern isolierte MSCs mRNA Expression der alkalischen Phosphatase (ALP), bone Sialoprotein (BSP), Kern-bindende Faktor Alpha-1 (CBFA1), Kollagen-1 und Osteocalcin (OCN) sind mit Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gemessen.

Introduction

Obwohl zahlreiche relevante Techniken in den letzten Jahren entwickelt wurden, Knochen Sie Wiederaufbau bleibt durch mehrere Einschränkungen begrenzt, und schätzen, dass das Ausmaß des notwendigen Wiederaufbaus oft unmöglich ist. Hartgewebe Augmentation ist erforderlich, um ästhetische und funktionelle Ziele zusätzlich eine günstige langfristige Erfolgsquote zu erreichen. Üblichen Methoden für solche Verfahren gehören autologen und allogenen Knochentransplantation, Xenografting und alloplastischer Knochentransplantation. Unter den verschiedenen Arten von Knochentransplantat gelten autogene Knochentransplantate am effektivsten. Jedoch wurden Spender Website Morbidität, kompromittierte Vaskularität und begrenzte Gewebe Verfügbarkeit1 wesentliche Nachteile für autogene Knochentransplantation. Darüber hinaus wurden allogene Knochentransplantate und Xenotransplantate mit Übertragung von Krankheiten in Verbindung gebracht. Derzeit sind synthetische Knochentransplantate verbreitet, diese Probleme zu lösen. Jedoch mit ihrer mangelnden osteogene Potenzial, haben klinische Ergebnisse unterschiedlich. Materialien wie Zellulose sind verbunden mit Volumen Fluktuation, Infektion und ein Mangel an Stärke.

Knochenaugmentation mit Gewebetechnik hat großes Interesse hervorgerufen. In dieser Technik werden mesenchymaler Stammzellen (MSCs) zunächst zur Osteoblasten Differenzierung fördern die sind dann auf der Website der Verlust von Knochen zu Knochen Reparatur verpflanzt. Dieses Verfahren ist derzeit in der Zelltherapie. Knochenaufbau zu erreichen, indem Sie eine begrenzte Menge an Gewebe zu extrahieren ist einfacher und weniger invasiv im Vergleich mit anderen Methoden.

Die potenzielle Rolle von MSCs als Werkzeug für zellbasierte Therapien, die darauf abzielen, dental Regeneration ist das aufkommende Interesse unter verschiedenen Forschungsgruppen. Studien haben bestätigt, dass MSCs aus den folgenden Arten von Gewebe unterschieden werden können: Knochenmark, adipös, synovial Membrane, Pericyte, trabekulären Knochen, menschlichen Nabelschnur und zahngewebe2,3. Häufige Quellen von MSCs sind Knochenmark und Fettgewebe zahngewebe. Verglichen mit MSCs aus Fettgewebe und Knochenmark abgeleitet, sind die Vorteile von zahnärztlichen Stammzellen leichte Erreichbarkeit und weniger Morbidität nach der Ernte. Im Vergleich zu embryonalen Stammzellen, MSCs aus zahngewebe abgeleitet erscheinen nonimmunogenic und komplexe ethische Bedenken3zugeordnet sind.

Im Jahr 2006, der internationalen Gesellschaft für zelluläre Therapie empfohlen mit folgenden Normen zu MSCs identifizieren: Erstens MSCs muß Befestigung an Kunststoff. Zweitens müssen MSCs für den Oberflächenantigenen CD105, CD73 und CD90 positiv und negativ für die Marker für Monozyten, Makrophagen und B-Zellen neben der hämatopoetischen Antigene CD45 und CD344sein. Als letzte Kriterium, MSCs muss in der Lage, sich in die folgenden drei Arten von Zellen unter normalen Bedingungen in Vitro Differenzierung differenzieren: Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten4. Bisher haben sechs Typen von humanen zahnmedizinische Stammzellen isoliert und charakterisiert. Die erste Art wurde isoliert aus menschlichen Pulpagewebe und postnatale Zahnpulpa Stammzellen5bezeichnet. Anschließend drei weitere Arten von dental MSCs wurden isoliert und charakterisiert: Stammzellen aus abgestoßene Milchzähne6, die Wurzelhaut7und der apikalen Papille8. Vor kurzem wurden auch zahnmedizinische Follikel abgeleitet9, gingival Gewebe abgeleitet10, dental Knospe Stamm cells(DBSCs)11und periapikalen Zyste MSCs (hPCy-MSCs)12 festgestellt.

Friedenstein war der erste, MSCs13zu definieren. MSCs weisen eine hohe Verbreitung potenzieller und manipuliert werden, um vor verpflanzt wird, zu unterscheiden was darauf hindeutet, dass sie ideale Kandidaten für regenerative Verfahren10sind.

Obwohl die meisten Studien als eine Quelle von Stammzellen des Knochenmarks verwendet, Periost-abgeleitete Zellen (PDCs) wurden ebenfalls vor kurzem14verwendet. Das Periost ist leichter zugänglich als Knochenmark ist. Deshalb verwenden wir bei dieser Technik, alveoläre Periost, weitere Einschnitte bei der Operation überflüssig und postoperativen Morbidität bei Patienten zu reduzieren. Das Periost ist das Bindegewebe, das bildet die äußeren Auskleidung der langen Knochen und besteht aus zwei unterschiedlichen Schichten: die äußere Faserschicht bestehend aus Fibroblasten, Kollagen und elastischen Fasern15, und die innere Zelle-reiche Kambium Schicht in direktem Kontakt mit der Knochenoberfläche. Die Kambium Schicht enthält eine gemischten Zellpopulation in erster Linie Fibroblasten16, Osteoblasten17, perizyten18und einer kritischen Subpopulation identifiziert als MSCs19,20,21. Die meisten Studien haben berichtet, dass PDCs sind vergleichbar, wenn nicht überlegen, Knochenmark-Stammzellen (bMSCs) im Knochen Heilung und Regeneration22,23,24. Das Periost ist leicht zugänglich und zeigt hervorragende regenerative Wirkung. Jedoch haben einige Studien auf die Knochenhaut25,26,27konzentriert.

Über Knochen-Reparatur beinhaltet die aktuelle klinische Praxis die Transplantation von periostalen Vorläuferzellen in unterstützende Gerüste verstärkt. Neuere Studien konzentrierten sich auf Erwerb von Stammzellen in defekten Regionen und Vorläuferzellen für Tissue Regeneration20beschäftigt. Zahnärzte rechnen auch zukünftige Anwendung der parodontalen Knochenregeneration in parodontale Behandlungen und Zahnimplantate. Bezüglich der Entnahmestelle der Knochenhaut leicht durch allgemeine Zahnärzte geerntet werden kann. Günstig im Vergleich gegen Stromazellen Knochenmarkzellen, wie das Periost während routinemäßiger Oralchirurgie zugegriffen werden kann. Somit ist das Ziel dieser Studie, ein Protokoll für die Ernte PDCs zu etablieren und zur Beurteilung der Morphologie, Anlage, Rentabilität und Proliferation von Stammzellen menschlichen Periost.

Vitamin D-Metaboliten der in Vivo Knochen-Mineral dynamischen Gleichgewicht beeinträchtigen. Eine Studie berichtete, dass die 24R,25-(OH)2D3 aktive Form von Vitamin D für die osteoblastischen Differenzierung der menschlichen MSCs (hMSCs)28unerlässlich. Knochen-Homöostase und Reparatur sind durch ein Netz von Vitamin D3 Metaboliten geregelt welche, die 1,25-(Oh)2D3 (Calcitriol) das biologisch aktive und relevant bei der Regulierung der Knochengesundheit ist. Vitamin D3 ist essentiell für Verkalkung29. In einer Studie mit 2-d-alte Kunming weiße Mäuse Embryoid Körper in den Mäusen gezeigt, dass Vitamin C und Vitamin D-Präparate wirksam die Differenzierung der Osteoblasten ESC abgeleitet30gefördert. Unter seinen anderen biologischen Aktivitäten stimuliert 1,25-(OH)2D3 die in Vitro Differenzierung von hMSCs zu Osteoblasten, die überwacht werden können, basierend auf dem Vormarsch in Enzym-Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) oder OCN gen Ausdruck.

Einige Studien haben eine Dosis-Wirkungs-Beziehung von kombinierten Behandlungen mit Vitamin C und 1,25-(OH)2D3 im menschlichen PDCs mit besonderem Schwerpunkt auf Knochen Gewebe-Engineering entdeckt. In dieser Studie untersuchen wir daher die optimalen Konzentrationen für die einzelnen oder kombinierten Behandlung von 1,25-(OH)2D3 und Vitamin C zur Induktion osteogene Differenzierung der menschlichen PDCs. Das Ziel dieses Protokolls ist es, festzustellen, ob eine Zellpopulation, die isoliert von der zahnärztlichen alveoläre Knochenhaut Zellen mit einer MSC-Phänotyp und ob diese Zellen in Kultur (in Vitro) erweitert und differenziert enthält, um das gewünschte Gewebe bilden . Darüber hinaus bewerten wir die Fähigkeit des PDCs, in Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten differenzieren. Der zweite Teil der Studie bewertet die Auswirkungen von Vitamin C und 1010, 109, 108und 107 M 1,25-(OH)2D3 auf die knochenbildenden Aktivität des PDCs. Das primäre Ziel dieser Studie ist es, die Funktionen von Vitamin C und 1,25-(OH)2D3 zu bewerten, während die osteoblastischen Differenzierung des PDCs nach ALP Aktivität und Pro-osteogene Gene, wie ALP, Kollagen-1, OCN, BSP und CBFA1. Darüber hinaus bestimmt dieser Studie die optimale Osteoinduktiv Bedingungen für menschliche PDCs aufbauend auf diesen Erkenntnissen.

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Protocol

Das Studienprotokoll wurde von der institutionellen Review Board der Chang Gung Memorial Hospital genehmigt. Allen Teilnehmern zur Verfügung gestellt schriftliche Einwilligungserklärung.

(1) Gewebe-Vorbereitung

  1. Ernten Sie die periostalen Gewebe von Patienten während der zahnärztlichen Chirurgie (Abbildung 1). Nehmen Sie nach der Klappe Reflexion unter örtlicher Betäubung ein Stück Knochenhaut Gewebe aus der Alveolarknochen mit einer periostalen Separator-31.
  2. Nach der Ernte Lagern der periostalen Gewebe Scheiben von ca. 5 mm × 2 mm in Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) mit 300 U/mL Penicillin und 300 mg/mL Streptomycin. Übertragen Sie das Gewebe im Labor innerhalb von 24 h.
  3. Die alveoläre periostalen gewebefragmente mit Skalpellen bis gut gehackt und die Beispiele in Abschnitt 0 Medium pflegen (bestehend aus 300 U/mL Penicillin und 300 mg/mL Streptomycin, α-MEM und 5 % fötalen Rinderserum [FBS]) kultiviert in einem Inkubator bei 37 ° C mit Hackfleisch befeuchtete Luft (5 % Kohlendioxid). Bereiten Sie im Inkubator ein Wasserbecken, Luftfeuchtigkeit beizubehalten.
  4. Ändern Sie das Medium, nach 3 Tagen und zweimal die Woche danach.
  5. Wenn die Zellen Subconfluence (80 %) erreicht haben, lassen Sie die adhärenten Zellen mit 200 µL 0.25 % Trypsin im Inkubator (37 ° C) für 3 min und dann verwenden Sie 4,5 mL Medium, um die Reaktion zu beenden.
  6. Die Zellen wieder in frischen Durchgang 1 mittlere Platte (α-MEM, 10 % FBS, 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin). Platte ist 5 × 103 Zellen (wie von einem Hemocytometer gezählt).
  7. Durchführen Sie jeder nachfolgende Passage nach der Zellen 80 % Zusammenfluss31 erreichen.
    Hinweis: Am Anfang wird das Medium Orange-rot sein. Nach etwa drei Tagen sollte die mittlere Farbe zu einem gelblichen Farbton ändern. Die Verdopplungszeit der Zellen ist ungefähr 30 – 40 h, 7 Tage für 3 – 5 Generationen benötigen.
  8. Kultur der isolierten PDCs in α-MEM ergänzt mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL von Streptomycin in einem Inkubator (37 ° C, 5 % CO2).
  9. Zellwachstum täglich beobachten und das Wachstumsmedium zweimal pro Woche zu ersetzen. Verwenden Sie dritten bis fünften Generation Zellen für alle weiteren Experimente.

2. die Durchflusszytometrie

  1. Ernte 1 × 106 Zellen durch Trypsin-Verdauung:
    1. Fügen Sie 200 µL 0.25 % Trypsin. Verwenden Sie nach 3 min 4,5 mL Kulturmedium mit FBS kündigen die Reaktion von Trypsin und sammeln durch Zentrifugation (1500 u/min, 5 min, 22 ° C).
    2. Waschen Sie die Zelle Pellets dreimal mit 1 X DPBS. Die Zellen in 200 µL 1 X Permeabilisierung Pufferaufzuwirbeln. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
  2. Untersuchen Sie die ausdrückliche oberflächenmarker ausgedrückt des PDCs durch Flow Cytometry (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung)32. Verwenden Sie monoklonaler Antikörper (MAb) gegen CD19 (Fluorescein erfolgt (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (Allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) und HLA-DR (FITC)32.
    1. Fügen Sie die Antikörper zu den Proben und Kultur im Dunkeln bei 4 ° C für 30 Minuten.
    2. Waschen Sie die Zellen mit 1 X DPBS dreimal.
    3. Die Zellen unter Verwendung von 2 % Formaldehyd zu beheben und mit Flow Cytometry Analyse32fortfahren.

3. Handy-Anlage und Rentabilität mit knochenbildenden, Adipogenen und Chondrogenic Differenzierung

Differenzierung in den Zellen zu induzieren osteogene, adipogenen und Chondrogenic Linien durch Kultivierung der periostalen Zellen in allen drei Durchgängen auf sechs-Well-Platten mit spezifischen Differenzierung Medien.

  1. Osteogene Differenzierung Kulturzellen Sie der in α-MEM bei einer Dichte von 5000 Zellen pro Bohrloch auf sechs Brunnen Kultur Platten.
    1. Am Zusammenfluss von 80 % zu erreichen, die Kulturzellen in Medien mit α-MEM, 5 % FBS, β-glycerophosphat (10 mM), 10−7 M Dexamethason (0,1 mM) und 5 mL Ascorbinsäure (100 Umm). Kultur die negative Kontrolle in Medien, bestehend aus α-MEM und 5 % FBS.
    2. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche.
    3. Bewerten Sie nach 4 Wochen das Potential der Zellen zu differenzieren in eine osteogene Abstammung durch Färbung der Zellen mittels einen von Kossa-Assay, der das Vorhandensein von verkalkten Ablagerungen in einer Kultur33auszeichnet.
      1. Fügen Sie 10 % Formalin zur Befestigung. Innerhalb von 30 Minuten fügen Sie 5 % Silbernitrat und behandeln unter ultraviolettem (UV) Licht für 1 h bei Raumtemperatur.
      2. Fügen Sie 5 % Na2SO4 vier Zeiten, so dass 3 min für jede Reaktion. Schließlich waschen Sie die Zellen zweimal mit destilliertem Wasser.
        Hinweis: Von Kossa Färbung ist ein Niederschlag Reaktion wo Silberionen und Phosphat reagieren in Gegenwart von sauren Material; Diese Färbung Technik ist nicht spezifisch für Kalzium. In dieser Studie, wenn die untersuchten Zellen mit Silbernitratlösung, Kalzium behandelt wurden – die sinkt bei starkem UV-Licht – wurde ersetzt durch Silber, die als metallisches Silber sichtbar wurde.
  2. Zur adipogenen Differenzierung Kultur der Zellen bei einer Dichte von 5000 Zellen pro Bohrloch auf sechs Brunnen Kultur Platten mit α-MEM.
    1. Am Zusammenfluss von 80 % zu erreichen, die Kulturzellen in Medien mit α-MEM, 5 % FBS, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (100 mg/mL), 1 % Penicillin, 10−6 M Dexamethason (1 mM), Insulin (5 mg/mL) und Indometacin (60 mM).
    2. Kultur die negative Kontrolle in Medien, bestehend aus α-MEM und 5 % FBS.
    3. Nach 6 – 9 Wochen verwenden Öl Rot O zu beflecken Zellen und Lipid-Tropfen, wodurch die Bestimmung der Anwesenheit von adipogenen Differenzierung33markieren:
      1. Fügen Sie 10 % Formalin zur Befestigung. Innerhalb von 30 min, färben die Zellen mit 0,5 % Öl Rot O bei Raumtemperatur für 10 min und dann waschen die Zellen dreimal mit 60 % Isopropanol für 3 min jedes Mal; Schließlich waschen Sie die Zellen mit destilliertem Wasser.
        Hinweis: Öl Rot O ein Lysochrome (fettlöslichen) diazo Farbstoff verwendet ist für die Färbung von neutralen Lipiden, in erster Linie Triacylglycerol und Lipoprotein-Cholesterin Ester. Der Farbstoff löst sich in den Lipid-Tröpfchen in der Zelle, die Lipid-Tropfen rot zu drehen.
  3. Für eine Knorpelzelltransplantation Differenzierung, Zellkulturen auf sechs Brunnen Kultur Platten mit jeweils gut 5000 Zellen.
    1. Fügen Sie eine Differenzierung mittlere enthaltende α-MEM, 5 % FBS 10−7 M Dexamethason (0,1 mM), Natrium Pyruvat (100 µg/mL), Insulin-Transferrin-Selen-A (1 × ITS), transformierende Wachstumsfaktor-β (10 ng/mL) und 5 mL Ascorbinsäure (100 µM).
    2. Kultur die negative Kontrolle in Medien, bestehend aus α-MEM und 5 % FBS.
    3. Verwenden Sie nach 4 – 5 Wochen Alcian Blau Färbung um den sauren Polysacchariden wie Glykosaminoglykane oder bestimmte Arten von mucopolysacchariden im Knorpel der Zellen, um das Vorhandensein von Knorpelzelltransplantation Differenzierung33bestimmen zu markieren.
      1. Fügen Sie 10 % Formalin zur Befestigung. Innerhalb von 30 min 3 % Essigsäure und 2 min für die Reaktion. Anschließend mit destilliertem Wasser waschen Sie dreimal, fügen Sie 1 % Alcian blau 8GX für 30 min inkubiert und dann mit destilliertem Wasser waschen. Zu guter Letzt fügen Sie 3 % Essigsäure und Wäsche für 3 min, und waschen Sie anschließend mit destilliertem Wasser zu beenden.
        Hinweis: Die Teile der Zelle, die speziell durch diese Farbe blau zu blau-grünen Fleck, nach Färbung und nennt man "Alcianophilic."

4. Auswirkungen von 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) auf Osteogenesis

  1. P3, P5 PDCs in sechs Gruppen und Kultur auf 6-Well-Platten mit verschiedenen Nährmedien aufgeteilt:
  2. negative Gruppe (α-MEM und 5 % FBS);
  3. Vitamin C-Gruppe (α-MEM, 5 % FBS 10 mM β-glycerophosphat und 10−7 M Dexamethason + 100 Umm Vitamin C);
  4. und 10−7 M 1,25-(OH)2D3 Gruppe (α-MEM, 5 % FBS, 10 mM β-glycerophosphat und 10−7 M Dexamethason + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
  5. Inkubator (37 ° C) in jede Vertiefung 2 mL des Mediums hinzu, und ändern Sie das Medium zweimal wöchentlich.

(5) reverse Transkription/Quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion

  1. Nach 7 d der Osteoblasten Differenzierung, Isolieren der gesamte-RNS auf Eis mit einem kommerziellen Reagens (siehe Tabelle der Materialien):
    1. Fügen Sie 1 mL Reagenz isoliert, in jede Vertiefung. Fügen Sie 200 µL des Bromochloropropane und lassen Sie für 10 min, geschichtete RNA zu generieren und anschließend Zentrifugieren bei 10.000 u/min für 15 min bei 4 ° c
    2. Fügen Sie nach Zentrifugation 500 µL 2-Propanol 500 µL überstand enthaltende RNA hinzu. Überstürzen Sie sich die RNA auf dem Eis und ermöglichen Sie 15 min für die Reaktion zu.
    3. Zentrifugieren Sie nach dem Eingriff bei 12.000 u/min für 15 min bei 4 ° C, nach denen die RNA am unteren Ende der Röhre befindet. Anschließend entfernen Sie überstand mit 1 mL 75 % Alkohol zum Waschen und Zentrifugieren bei 7.500 u/min für 8 min bei 4 ° C.
    4. Nehmen Sie den überstand und einen Vakuum Konzentrator RNA von der Unterseite der Flüssigkeit produzieren. Erholen Sie sich mit Wasser.
  2. Reverse Transkription die RNA (1 μg) mit avian Myeloblastosis Virus Reverse Transkriptase. Vorgesetzt der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) laufen bei 25 ° C für 10 min, gefolgt von 50 ° C für 60 min und dann 85 ° C für 5 min, Aufrechterhaltung schließlich bei 4 ° c
  3. Erste-Strang komplementären DNA (cDNA) zu synthetisieren. Führen Sie quantitative PCR (qPCR) mit 5 μL von 01:10 verdünnt cDNA. Durchführung von quantitativen RT-PCR (qRT-PCR) unter Verwendung der Zündkapseln für ALP, BSP, OCN, CBFA1 und Kollagen-1.
    Hinweis: Um DNA-Kontaminationen von Signalen zu vermeiden, wurden die vorwärts- und Sequenzen jede Grundierung auf verschiedenen Exons entwickelt.
  4. Mit einem kommerziellen PCR-Meister ausführen qPCR mischen (siehe Tabelle der Materialien), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Legen Sie die Thermocycler bei 50 ° C für 2 min von 95 ° C für 10 min gefolgt und dann 40 jeweils bei 95 ° C für 15 Zyklen s gefolgt von 60 ° C für 60 s.
    Hinweis: Das SYBR-Protokoll erfordert auch eine Schmelze Kurve Bühne, verlaufenden bei 95 ° C für 15 s, 60 ° C für 60 s, und dann 95 ° C für 15 s.
  5. Normalisieren die Zyklus-Schwellenwerte für ALP, BSP, CBFA1, Kollagen-1 und OCN, dass das Zimmermädchen gen GAPDH. 34
  6. Primer-Paare sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

(6) alkalische Phosphatase-Aktivität

  1. Die ALP-Enzym-Aktivität der Zellen mit den zuvor beschriebenen Technik35, die p- Nitrophenyl Phosphat in p- Nitrophenol konvertiert zu beurteilen; p- Nitrophenyl Phosphat ist ein Phosphatase-Substrat, das gelb, wenn von ALP, rezeptorsignals, wie bei einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt wird. Normalisieren die Summe p- Nitrophenol gebildet basierend auf die Gesamt-Protein, wie von der Bradford-Test bestimmt.
  2. Vergleichen Sie die ALP-Aktivitäten des Steuerelements (α-MEM, 5 % FBS), Vitamin C (α-MEM, 5 % FBS, 10 mM β-glycerophosphat, 10−7 M Dexamethason + 100 Umm Vitamin C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 % FBS 10 mM β-glycerophosphat und 10−7 M Dexamethason + 10−8 M 1,25-(OH)2D3), und Vitamin C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 % FBS, 10 mM β-glycerophosphat, 10−7 M Dexamethason + 100 Umm Vitamin C +1,25-(OH)2D3) Gruppen nach 1, 2, 3 und 4 Woche der Kultur.
  3. Führen Sie ein Protein Extraktionsverfahren auf Eis:
    1. Schaben Sie die Zellen von den 6-Well-Platten und 50 µL Lyse Puffer. Anschließend legen Sie die Zellen auf dem Eis für 30 min zu zerstören die Zellen und das Protein frei.
    2. Zentrifugieren Sie nach 30 min bei 13000 u/min bei 4 ° C für 15 Minuten. Nach Zentrifugation den überstand für die Lagerung zu extrahieren und zu verwenden.

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Representative Results

Für alle quantitativen Assays werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Alle statistischen Analysen wurden durchgeführt mit der Student t-test. Insgesamt 34 Proben stammen, wobei das Durchschnittsalter der Teilnehmer von 48,1 ± 12,3 y. elf dieser Proben wurden von männlichen Patienten und 23 von weiblichen Patienten erhalten. Achtundzwanzig Proben stammen aus den Molaren Regionen und sechs aus den vorderen Regionen; 26 wurden von den Oberkiefer und 8 aus dem Unterkiefer entnommen. Die mittlere Dauer zwischen der zahnärztlichen Behandlung und der Kultur betrug 0,5 ± 0,1 h. Der 34 untersuchten Proben ergab 20 erfolgreich MSC Kolonien, mit einer erfolgreichen Isolierung von 58,8 %. Keine signifikanten Unterschiede beobachtet an den Parametern zwischen den erfolgreich und erfolglos isoliert PDCs (Mittleres Alter: 48,8 ± 13,0 vs. 47,1 11,5 ± y, Sex: 7 Männer [35 %] vs. 4 Männer [28,6 %], Standort: 15 von molaren Regionen [75 %] vs. 13 [92,9 %] und 15 aus der Oberkiefer [75 %] vs. 11 [78,6 %], beziehungsweise).

Handy-Isolation und Morphologie: osteogene, Chondrogenic und adipogenen Differenzierung

Von 1 bis 9 Tagen gebildet PDCs Kolonien und sphärische Cluster. Die meisten Zellen stellte eine Spindel Aussehen und waren homogen unter dem Phasenkontrast-Mikroskop (Abbildung 2). Nach 14 d Kultur erschien die Zellmorphologie spindelförmig, wie unter dem Phasenkontrast-Mikroskop beobachtet. Nach der ersten Generation Zellen die Zellen nicht mehr wuchs in Clustern aber weit verbreitet und gleichmäßige Verbreitung ausgestellt.

Die MSCs waren spindelförmig mit unregelmäßigen Prozesse und fest an der Kulturschale nach 1-3 d der Primärkultur (Abbildung 2a). Die erste Kultur ausgestellt kleine, Runde und spindelförmige Zellen unter dem Lichtmikroskop. Die kultivierten Zellen zeigten eine homogene, Fibroblasten-wie Spindel Form aus der ersten Passage (Abbildung 2a). Die Differenzierung-Studie ergab, dass die PDCs subpassaged könnte und in Vitro in Osteoblasten (Abb. 2 b), Chondrozyten (Abbildung 2 c) und Adipozyten (Abb. 2d differenziert).

Am Ende der osteogene Differenzierung gekennzeichnet von Kossa Färbung das Vorhandensein von Kalkablagerungen und osteogene Differenzierung (Abb. 2 b). Diesen Ergebnissen zufolge stark unter periostalen Zellpopulationen Vorläuferzellen besitzen das Potenzial, in knochenbildenden Zellen zu differenzieren.

Um die Produktion von Proteoglykanen zu beurteilen, wurde Alcian blau Fleck als Indikator für das Vorhandensein der Knorpelzelltransplantation Differenzierung (Abbildung 2 c) verwendet. Die Zellen erfolgreich in Chondrozyten differenzieren. Diesen Ergebnissen zufolge unter periostalen Zellpopulationen Vorläuferzellen besitzen das Potenzial, in Chondrogenic Zellen zu differenzieren.

Die Zellen wurden in den zuvor erwähnten spezifischen Medien adipogenen Differenzierung auslösen kultiviert. Nach 8 Wochen Öl Rot O verwendet wurde, um das Vorhandensein der intrazellulären Lipide zu erkennen. Folgenden Färbung, intrazelluläre mikroskopische Fett Tropfen in fünf differenzierte Proben (Abb. 2d) beobachtet wurden.

Durchflusszytometrischen Oberfläche Marker Ausdruck Analyse für PDCs

Eine Fluss durchflusszytometrischen Test wurde durchgeführt, um die Expression von mesenchymalen Oberfläche Marker auf der Oberfläche der Zellen zu bestätigen. MSC-Marker CD73, CD90, STRO-1 und CD44 waren stark positiv in die PDCs hämatopoetischen Linie Marker CD19, CD34, CD45 und HLA-DR negativ waren.

Auswirkungen der verschiedenen Vitamin D 3 Konzentrationen auf osteogenesis

Obwohl die Ergebnisse die positive Wirkung von 1,25-(OH)2D3 (Calcitriol) auf knochenbildenden Aktivität bestätigen, wurden statistisch signifikante Unterschiede nur bei einigen der Falte Veränderungen in der mRNA Ausdruck der knochenbildenden beobachtet. Enzyme. Diese Analyse könnte durch den hohen SD-Werten vorgespannt wurden die individuellen Abweichungen zwischen den Hosts zugeordnet werden können.

Boten-RNA-Expression der alkalischen phosphatase

Die Falte Änderungen in der mRNA Expression von ALP nach 1 Woche der Kultur 7.43 war (SD = 3,96) in der Vitamin-C-Gruppe und 7.15 (SD = 4.88), 9.30 (SD = 5,63), 12.92 (SD = 7,95), und 6,60 (SD = 6,33) in den 1010, 109, 108 , und 107 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen, bzw. (Abb. 4a). Die mRNA Ausdruck Niveaus der ALP in das Vitamin C, 108 M 1,25-(OH)2D3und 109 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen waren signifikant höher (p < 0,05) als die in den anderen Gruppen, zeigt erhöhte ALP mRNA Ausdruck in diesen Gruppen. Die Steuerung wurde auf den Wert 1 festgelegt. Der folgende Falte Zunahme der ALP mRNA-Ausdrücke wurden in dieser Studie beobachtet: 7.43-fold in der Vitamin-C-Gruppe; 9.30-Fold in der 109 M 1,25-(OH)2D3 Gruppe; und 12.92-fold in der 108 M 1,25-(OH)2D-3 -Gruppe.

Obwohl eine größere Veränderung der Falte in der ALP mRNA-Ausdrücke in der 108 M 1,25-(OH)2D-3 -Gruppe beobachtet wurde, wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede bezüglich dieser Ausdruck zwischen dieser Gruppe beobachtet und die negativ und Vitamin-C-Gruppen (p = 0,20 und p = 0,52, beziehungsweise).

ALP ist ein starker Indikator für die Bestimmung der frühen osteogene Differenzierung der Zellen. ALP dient auch als ein Ectoenzyme für den Abbau von anorganischem Pyrophosphat und Phosphat während Mineralisierung36veröffentlicht. Die PDCs behandelt mit Vitamin C und 108 und 109 M 1,25-(OH)2D3 zeigte signifikante Unterschiede im Vergleich mit denen der anderen Fraktionen (Abb. 4a).

Boten-RNA-Expression von Bone-sialoprotein

Die Falte Änderungen in der mRNA Ausdruck der BSP nach 1 Woche der Kultur waren 3.21 (SD = 1,20) und 4,18 (SD = 2,55), 10,34 (SD = 10,31), 24.91 (SD = 23.44), und 5,24 (SD = 3,54) in das Vitamin C und die 1010, 109, 108 , und 107 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen, bzw. (Abbildung 4 b). Die BSP-mRNA Ausdrücke waren höher in der 108 M 1,25-(OH)2D3 Gruppe, aber keine statistische Signifikanz im Vergleich mit den entsprechenden Ausdrücke in den anderen Gruppen.

Die BSP-mRNA-Ausdrücke in das Vitamin C und 1010 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen waren signifikant höher (p < 0,05) als die in den anderen Gruppen, die darauf hinweist, dass Vitamin C und 1010 M 1,25-(OH) 2 D3 gefördert BSP Ausdruck. Die Steuerung wurde auf einen Wert von 1 festgelegt. Das Vitamin C und die 1010 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen ausgestellt bzw. eine 3.21 und 4.18 - fache Steigerung in der BSP-mRNA Ausdrücken. Die 109 M und 108 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen ausgestellt höhere BSP mRNA Ausdrücke als die anderen Gruppen haben. 109 und 108 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen eine 10,34 und 24.91 - fache Steigerung in der BSP-mRNA Ausdrücken bzw. ausgestellt, aber dieser Anstieg ist nicht statistisch signifikant (p) > 0,05). Eine mögliche Erklärung ist, dass die Stammzellen nicht alle aus der gleichen Teilnehmer gewonnen wurden. Damit die möglichen Unterschiede könnte die SD erhöht haben und folglich beeinflusst die statistischen Ergebnisse.

Boten-RNA-Expression von CBFA1

Die Falte Änderungen in den CBFA1 mRNA Ausdrücken nach 1 Woche der Kultur waren 0.96 (SD = 0,10) und 0,90 (SD = 0,26), 1,01 (SD = 0.25), 1,31 (SD = 0,32), und 1.12 (SD = 0.35) in das Vitamin C und 1010, 109, 108 , und 107 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen, bzw. (Abb. 4 c). Die 108 M 1,25-(OH)2D3 ausgestellt und höhere CBFA1 mRNA Ausdrücke. Keine deutlichen Änderungen wurden in den CBFA1 mRNA gen Ausdrücken in den Behandlungsgruppen oder in der Kontrollgruppe beobachtet. Darüber hinaus wurde keine signifikante Erhöhung in der Expression der mRNA-Marker nach der Zugabe von Vitamin C oder 1,25-(OH)2D3beobachtet. Darüber hinaus wurden keine signifikanten Unterschiede der interfraktionellen Arbeitsgruppe "beobachtet.

Boten-RNA-Expression von Kollagen-1

Die Falte Änderungen in der mRNA Expression von Kollagen-1 nach 1 Woche der Kultur waren 0,98 (SD = 0,17) und 0,85 (SD = 0,16), 1,05 (SD = 0,16), 1,52 (SD = 0,36), und 1,01 (SD = 0,33) in das Vitamin C und die 1010, 109, 108 , und 107 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen, bzw. (Abbildung 4D). Die Kollagen-1 mRNA Ausdrücke lagen in Gruppe 108 M 1,25-(OH)2D3 , aber mit keine statistisch signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den entsprechenden Ausdrücke in den anderen Gruppen.

Die 108 M 1,25-(OH)2D3 und Kontrollgruppen zeigte statistisch signifikante Unterschiede in ihren Ergebnissen (p < 0,05). Die Steuerung wurde auf einen Wert von 1 festgelegt. Eine 1.52-fold Zunahme der Kollagen-1 mRNA Ausdrücke wurde beobachtet. Die 1010 M 1,25-(OH)2D3 und 108 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen signifikante Unterschiede in ihren Ergebnissen (p < 0,05) ausgestellt.

Boten-RNA-Expression von Osteocalcin

Die Falte Änderungen in den OCN mRNA Ausdrücken nach 1 Woche der Kultur waren 0,60 (SD = 0,1) und 0,78 (SD = 0,18), 1.13 (SD = 0,55), 2,59 (SD = 1,59), und 1,61 (SD = 0,73) in das Vitamin C und 1010, 109, 108 , und 107 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen, bzw. (Abb. 4e). Die OCN mRNA Ausdrücke lagen in Gruppe 108 M 1,25-(OH)2D3 , aber mit keine statistisch signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den entsprechenden Ausdrücke in den anderen Gruppen.

Keine signifikante Erhöhung wurde in den Ausdrücken der OCN mRNA Marker nach der Zugabe von Vitamin C oder 1,25-(OH)2D3beobachtet. Verringerte sich jedoch die OCN mRNA Ausdrücke nach Vitamin-C-Behandlung. Die Steuerung wurde auf den Wert 1 festgelegt. Die basalen OCN Ausdrücke ausgestellt bei osteoblastischen Differenzierung eine signifikante Abnahme der 0.6-fold (p < 0,05). Die OCN-mRNA, die Ausdrücke waren signifikant höher (p < 0,001) in den Zellen kultiviert in 108 M 1,25-(OH)2D3 als in die korrespondierende Willenserklärungen der anderen Fraktionen, die eine durchschnittliche Falten ausgestellt zu erhöhen, der 2,59 jedoch diese Ergebnisse waren statistisch nicht signifikant (p > 0.05). Eine mögliche Erklärung ist, dass die Stammzellen nicht alle aus der gleichen Teilnehmer gewonnen wurden; damit die möglichen Unterschiede könnte die SD erhöht haben und folglich beeinflusst die statistischen Ergebnisse.

ALP-Aktivität-assay

Eine frühere Studie gezeigt, dass 1,25-(OH)2D3 am effektivsten in einer Konzentration von 108 M ist; Daher wurde 108 M in der Testgruppe zur osteogene Fähigkeit von 1,25-(OH)2D3 mit der negativen, Vitamin C und Vitamin C + 1,25-(OH)2D3 Gruppen zu vergleichen. Osteogene Fähigkeit wurde von der ALP-Aktivität zum Ausdruck gebracht. Nach 1 Woche der Kultur (Abb. 5a), wurden die Falte Veränderungen in ALP Aktivität 1,00 (SD = 0.00), 1,92 (SD = 0,89), 3,77 (SD = 1,66), und 1,46 (SD = 0,49) negativ, C, D, und C + D, beziehungsweise. Zwischen den Gruppen wurden statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen D und Negative nur beobachtet (p = 0,03; ( Abb. 5a). Nach 2 Wochen der Kultur, die Falte Änderungen in ALP Aktivität (Abb. 5 b) waren 1,00 (SD = 0.00), 2,32 (SD = 1,68), 4,98 (SD = 3.02), und 4.86 (SD = 2,73) negativ, C, D, und C + D, beziehungsweise. Keine statistisch signifikanten Unterschiede wurden in keiner der Gruppen beobachtet. Nach 3 Wochen der Kultur waren die Falte Veränderungen in ALP Aktivität (Abbildung 5 c) 1,00 (SD = 0.00), 2,93 (SD = 2,15), 5,76 (SD = 3,60), und 5,61 (SD = 3,88) negativ, C, D, und C + D, beziehungsweise. Auch hier wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede in keiner der Gruppen (Abbildung 5 c) beobachtet. Nach 4 Wochen der Kultur, die Falte Änderungen in ALP Aktivität (Abb. 5D) waren 1,00 (SD = 0.00), 2,83 (SD = 1,97), 3,79 (SD = 0,77), und 4.24 (SD = 2,87) negativ, C, D, und C + D, beziehungsweise. Hier die Gruppen D und negativ zeigte statistisch signifikante Unterschiede (p = 0,00; Abbildung 5-d).

In Woche 1, nur die 108 M 1,25-(OH)2D3 ausgestellt und signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe (p = 0,03). In Woche 2, 108 M 1,25-(OH)2D3 und Vitamin C Gruppen zeigte signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe (p = 0.0498). In Woche 3 stellte keine der Gruppen signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe. In der 4. Woche stellte die 108 M 1,25-(OH)2D3 Gruppe signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe. Darauf hingewiesen, dass diese 108 M 1,25-(OH)2D3 ALP Aktivität gefördert.

Kurz gesagt, steigerte die 108 M 1,25-(OH)2D3 Gruppe ausgestellt ALP und Kollagen-1 mRNA Expression; die Vitamin-C-Gruppe signifikant erhöhte ALP ausgestellt und BSP-mRNA Expression; und die 109 M 1,25-(OH)2D3 Gruppe signifikant erhöhte ALP mRNA Ausdruck. In Woche 1 wurde erhöhter ALP-Aktivität in den Vitamin C und 1,25-(OH)2D3 Gruppen, wobei keine statistisch signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den entsprechenden Ausdruck in den anderen Gruppen beobachtet. Wochen 2 bis 4 zeigte Vitamin C und 1,25-(OH)2D3 Gruppen ähnliche Ergebnisse. Daher konnten diese Ergebnisse nicht eindeutig die synergistische Effekte von Vitamin C und 1,25-(OH)2D3 auf die osteogene Differenzierung der Zellen (ALP-Aktivität) aufzuklären.

Figure 1
Abbildung 1: menschlichen alveoläre Periost. Periostalen Gewebe wurden während der zahnärztlichen Chirurgie geerntet. Das Sternchen kennzeichnet die Lage der alveolären Knochenhaut.

Figure 2
Abbildung 2: Differenzierung Studie. Die MSCs waren spindelförmig mit unregelmäßigen Prozesse und fest in der Kulturschale nach 1-3 d der Primärkultur (A; das Sternchen kennzeichnet die Position der mesenchymalen Stammzellen). Unter in-vitro- Kultur-Bedingungen waren die MSCs subpassaged und differenziert in Osteoblasten (B, der schwarze Stern zeigt den Bereich von von Kossa gebeizt), Chondrozyten (C, das blaue Sternchen zeigt den Bereich von gebeizt Alcian-blau), und Adipozyten (D, das Rosa Sternchen zeigt den Bereich befleckt durch Öl Rot O). Abbildung 2 wird von Biomedical Research International, Volumen 2016, Artikel-ID 352956125wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Flow Cytometry. Oberflächenmarker MSCs zum Ausdruck gebrachten waren CD73 (65,2 %), CD90 (75,6 %), STRO-1 (65,2 %) und CD44 (88,1 %) aber nicht CD45 (1,34 %), CD34 (1,61 %), CD19 (2.18 %) oder HLA-DR (2,20 %). "%" in der Abbildung steht für ein positives Verhältnis. Die Kontrollgruppe (α-MEM und 5 % FBS) wird durch die rote Linie dargestellt. Die experimentelle Gruppe wird durch die blaue Linie dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: mRNA Ausdrücke. mRNA Ausdrücke der Osteoblasten Differenzierung für 1 Woche. (A) (B) ALP BSP, (C) CBFA1, (D)-COL-ich und (E) OCN. p < 0,05 ist *, p < 0,01 ist **, p < 0,001 ist ***. Die mRNA-Falte-Änderung ist im Vergleich zu Kontrolle (α-MEM und 5 % FBS). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: alkalische Phosphatase-Aktivität. Alkalische Phosphatase-Aktivität der Osteoblasten Differenzierung für (A) assay Woche 1, (B) Woche 2, (C) 3 und 4. Woche (D). p < 0,05 ist *, p < 0,01 ist **, p < 0,001 ist ***. Die Falte Änderung ist im Vergleich zu Kontrolle (α-MEM, 5 % FBS). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Eine neu entwickelte therapeutische Modalität, nämlich Gewebetechnik mit MSCs, hat zahlreiche Vorteile. MSCs, die in verschiedenen Gewebetypen vorhanden sind, sind multipotente Zellen, die in einer Vielzahl von Funktionsgewebe mesodermalen Zellen37 differenzieren können und andere Zellen wie Osteoblasten.

Das Periost dient als eine Nische für Vorläuferzellen und als reiche Gefäßsystem Lieferung für die Knochen umhüllt es38. In unserer Studie der 34 untersuchten Proben ergab 20 erfolgreich MSC Kolonien, mit einer erfolgreichen Isolierung von 58,8 %. Abgeleitet von der Knochenhaut MSCs wurden in dieser Studie aufgrund ihrer Verbreitung und osteogene Differenzierung Fähigkeiten ausgewählt. Die proliferationsrate der periostalen Zellen war viel höher als die der Knochenmark Stromazellen Zellen22. Hinsichtlich der knochenbildenden Fähigkeit der Knochenhaut behauptete Ousual24 , die knochenbildenden Fähigkeit des Periost Stammzellen (PMSC) schlechter als die von BMSCs war. Yoshimura ist jedoch festzustellen, dass die knochenbildenden Fähigkeit des PMSC, die von BMSCs39 übertroffen. Hayashi Et Al. periostalen Erwachsenen MSCs als ideale Kandidaten für Knochen Tissue Regeneration24gezeigt. Darüber hinaus periostalen Erwachsenen MSCs nützlich bei der Verkürzung der Zelle kulturdauer gelten wodurch Kosten und das Risiko einer Kontamination22. Wie berichtet, Alterung wirkt sich auch auf die Mitogene Aktivität der Osteoprogenitor Zellen40. Eine Studie berichtet, dass 1,25-(OH)2D3 einen höheren Grad der Stimulation von in-vitro- Differenzierung der Osteoblasten in hMSCs von jüngeren Teilnehmer (65 Jahre < y)41induziert. Die vorliegende Studie beinhaltete die Anwendung der periostalen Zellen aus jungen Erwachsenen (Alter von 65 Jahren < y). Weitere Studien sind erforderlich, um die Knochen Regenerationsfähigkeit des periostalen Zellen zwischen alt und jung Spender zu vergleichen.

In dieser Studie wurde eine Zellpopulation isoliert anhand seiner Kunststoff-anhaftende Eigenschaft, wie von Friedenstein Et al.beschrieben. 13. die PDCs geerntet hier eingehalten der Zelle Kultur Kunststoff. Die Esenchymal-Marker (CD-73, CD 90, STRO-1 und CD 44) von Oberflächenantigenen dieser Zellen Primärkulturen ausgestellt bedeutende Ausdrücke. Darüber hinaus fehlten hämatopoetischen Marker (CD 45, CD 34 CD 19 und HLA-DR), darauf hinweist, dass die kultivierten Zellen mesenchymalen Ursprungs waren. Die osteogene, Chondrogenic und adipogenen Differenzierung die PDCs könnte induziert werden mit spezifischen Differenzierung Medien, wie in anderen Studien, die Auswertung von Proben aus gingival Gewebe und Knochenmark42beschrieben. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie erfüllen die Mindeststandards für die phänotypische und funktionelle Definition der menschlichen MSCs von der internationalen Gesellschaft für Zelltherapie4akzeptiert. In der vorliegenden Studie wurden die MSCs aus menschlichen Periost isoliert und ausgebaut, offenbart die Eigenschaften ähnlich denen in der Regel von BMSCs beschrieben.

Studien haben vorgeschlagen, dass Dexamethason, Ascorbat und β-glycerophosphat verursachen BMSCs osteogene Differenzierung43zu unterziehen. Eine andere Studie zeigte, dass 1α, 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) in Kombination mit Ascorbinsäure gefördert Stammzell-Differenzierung44. Daher wurden in dieser Studie zur Förderung der stammzelldifferenzierung Dexamethason, Ascorbat und β-glycerophosphat hinzugefügt. Die beobachteten Mustern waren ähnlich in allen drei Patienten Zellproben. In dieser Studie wurden MSCs erfolgreich aus der alveolären Knochenhaut mit einer Isolierung von 58,8 % identifiziert. Keine statistisch signifikanten Unterschiede wurden in die Erfolgsrate in Bezug auf Alter, Geschlecht und Ort beobachtet.

Die vorliegende experimentellen Studie untersuchte zwei Substanzen, nämlich 1,25-(OH)2D3 und Vitamin C, die die osteogene Differenzierung von Stammzellen stimulieren können. Eine 2008 Studie45 darauf hingewiesen, dass 1,25-(OH)2D3 entscheidend für den Knochenstoffwechsel und Kalzium-Homöostase ist und wirkt sich auf das Herz-Kreislauf-System durch Mechanismen noch nicht in vollem Umfang verstanden werden. In einer anderen früheren Studie46stimuliert 1,25-(OH)2D3 die in-vitro- Differenzierung der menschlichen MSCs in Osteoblasten. Die Fähigkeit von 1,25-(OH)2D3 , undifferenzierte BMSCs in Osteoblasten-wie Zellen in Vitro unterscheiden induzieren wurde in mehreren Studien erforschen verschiedene Systeme46nachgewiesen. Einige Studien haben auch gezeigt, dass wenn Kulturen der Osteoblasten-wie Zellen hinzugefügt, 1,25-(OH)2D3 Zellproliferation hemmt sondern den Ausdruck von osteoblastischen Markern wie ALP, Osteopontin, OCN und Matrix Gla erhöht Protein-47,-48. Eine frühere Studie berichtet, dass 1,25-(OH)2D3 in der Regel Zellproliferation hemmt und Osteoblasten Differenzierung49induziert. Eine in-vitro- Studie auf murinen Zellen darauf hingewiesen, dass die frühen Stadien der Osteoblastogenesis91,25-(OH)2D3 gefördert werden können. Darüber hinaus eine weitere in-vitro- Studie vorgeschlagen, dass für frühe und späte MSCs,1,25-(OH)2D3 osteogene Differenzierung Markierungen, einschließlich ALP, Osteopontin, BSP und OCN43anregen kann.

Beide OCN – verantwortlich für die Kontrolle der Matrix Synthese — und Kollagen 1A1 — das am häufigsten vorkommende Protein Matrix – sind entscheidende sauren Knochen matrixproteine, die entscheidende Rolle in der Matrix Synthese zu spielen. Darüber hinaus sind sie charakteristische Reife Matrix bilden Osteoblasten. 50 eine frühere Studie berichtet, dass 1,25-(OH)2D3 Behandlung erhöhte Kollagen 1A1 Ausdruck aber nicht CBFA1 oder ALP Gen Ausdruck34angeregt. Bewertungen von Genen, die bei osteoblastischen Differenzierung haben gezeigt, dass 1,25-(OH)2D3 Behandlung die Expression von OCN51,52,53 erhöht. In unserer Studie zeigten die Ergebnisse, dass 1,25-(OH)2D3 positive Auswirkungen auf die knochenbildenden Aktivität ausübt. Im Vergleich mit den anderen Fraktionen, bewiesen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 erhöhte mRNA Expression von ALP, BSP, CBFA1, OCN und Col1. Unter diesen erreicht die Ergebnisse für die ALP und Col1 statistischen Signifikanz. Daher wurden optimale Bedingungen bei der Verwendung 10−8 M 1,25-(OH)2D3. mRNA Expression von BSP in der 10−10 M 1,25-(OH)2D3 -Gruppe signifikant erhöht (p < 0,05). Allerdings wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Falte der mRNA Ausdruck von CBFA1 und OCN beobachtet. Bei der Überprüfung von mRNA Genexpression, zeigten die Ergebnisse des Experiments in Vitro osteogene Differenzierung. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, die Osteogenesis beobachtet in den negativen, Vitamin C und 10−10, 10−9, 10−7 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen war schwächer als in den 10−8 M 1,25-(OH)2D3 Gruppe. Diese Ergebnisse führten zu der Vermutung, dass 1,25-(OH)2D3 PDCs von heraufregulierende Primzahlen die matrixproteine erforderlich für die Mineralisierung (Kollagen 1A1).

Eine frühere Studie berichtet OCN als ein bevorzugtes Ziel von 1,25-(OH)2D3, die OCN Ausdruck52deutlich zugenommen. OCN Ablagerung kann als Marker für die osteogene Differenzierung des PDCs gesehen werden. Darüber hinaus wurde als eine späte osteogene Marker54OCN Ausdruck ausgewertet. OCN ist ein verlässlicher Marker für Knochen Bildung und Osteogenesis55. Daher bezieht sich OCN Ausdruck in der Regel auf die Mineralisierung Fähigkeiten der Zellen. OCN ist ein empfindlicher Biomarker der Reife Osteoblasten. Für eine in-vitro- osteogene Vergleich wurde deutlich erhöhte OCN mRNA Expression in der 10−8 M 1,25-(OH)2D-3 -Gruppe beobachtet.

Eine Studie zeigte, dass ALP Aktivität gehemmt durch die Umwandlung der Wachstumsfaktor Beta (0,1-10 ng/mL) und mit 1,25-(OH)2D3 befördert (50 nM)46. Diese Ergebnisse legen nahe, dass 10−8 M 1,25-(OH)2D3 Stammzell-Reifung und Knochen Entwicklung fördert. ALP-Aktivität in den optimalen beobachteten Konzentrationen von 10−8 M 1,25-(OH)2D3 wurde mit in den entsprechenden Konzentrationen von Vitamin c verglichen. Die PDCs ausgedrückt ALP Aktivität. Darüber hinaus die Zugabe von 1,25-(OH)2D3 erhöht die ALP-Aktivität und die osteoblastischen Differenzierung in die PDCs gefördert. In allen drei Einstellungen, Vitamin C, 10−8 M 1,25-(OH)2D3, und Vitamin C + 10−8 M 1,25-(OH)2D erhöhte3 ALP Aktivität bei Wochen 1 (Abb. 4a), 2 (Abbildung 4 b), 3 ( Abbildung 4 c), und 4 (Abbildung 4D) durch mehrere Falten mit derjenigen der negativen Kontrollgruppe verglichen. In den Wochen 1 und 4 ALP Aktivität deutlich erhöht in der 10−8 M 1,25-(OH)2D-3 -Gruppe. In Woche 2 ALP Aktivität deutlich erhöht in das Vitamin C und 10−8 M 1,25-(OH)2D3 Gruppen.

Durch eine vergleichende Studie der verschiedenen menschlichen MSCs in der Passage 3 Sakaguchi Et Al. 56 fand, dass BMSCs und PMSC ähnliche osteogene Fähigkeiten besitzen. Daher kann die Zelle kulturdauer wahrscheinlich gekürzt werden, mithilfe von periostalen Zellen, die was wiederum die Kosten und Kontamination Risiko reduzieren würde. Die Verwendung von frühe Passage hMSCs vermeidet die alternde Auswirkungen der Erweiterung in der Kultur. Ousual und Yoshimura verwendet MSCs in der Passage 3 und subkultiviert für 2 Wochen unter osteogene Differenzierung Bedingungen35. Daher sollte die Passage Zeit bei ZELLAKTIVITÄTEN der Zelle Quellen vergleichen berücksichtigt werden. In dieser Studie wurden dritterzeugung PDCs verwendet, da das osteogene Potenzial der Stammzellen von späteren Generationen des PDCs geringer als die von den Stammzellen der dritten Generation PDCs ist.

Wenn in einem menschlichen Serum-Medium kultiviert, können Periost Stammzellen nicht nur formbeständig, aber können auch befestigen, Aktivität zu erhalten und Zelle Wachstum erreichen. Zusammenfassend lässt sich sagen basierend auf diesen Ergebnissen, menschliche PDCs besitzen die Fähigkeit zu überleben, vermehren sich und das osteogene Abstammung, in Vitro, zu unterscheiden, das ist entscheidend bei der Bewertung von Wirksamkeit in Vivo. Das Periost ist reich an MSCs und eignet sich somit für das Tissue Engineering. Der Knochenhaut entnommen der Gingiva stellt weniger Komplikationen. Daher gilt der Alveolarknochen ein idealer Entnahmestelle. Die Ergebnisse zeigten deutlich die Möglichkeit ebenso MSCs aus der Knochenhaut zu isolieren und ihre Differenzierung in Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten zu erzielen. In dieser Studie wurden die Auswirkungen von Vitamin C auf das osteogene Potenzial des PDCs mit 1,25-(OH)2D3 bei verschiedenen Konzentrationen verglichen. Die wirksamste Konzentration war 10−8 M 1,25-(OH)2D3. Die 10−8 M 1,25-(OH)2D3 Behandlung während der gesamten Kultur war eine effektive und kostengünstige Methode der Induktion osteogene Differenzierung in PDCs. Zusammenfassend, fördern Vitamin C und 1,25-(OH)2D3 die osteogene Differenzierung des PDCs. Jedoch stellte diese keine deutliche Synergieeffekte in ALP Ergebnisse. In Anbetracht der geringen Stichprobenumfangs sind weitere Beispiele für die weitere Beurteilung erforderlich. So könnte PDCs osteogene Bedingungen kultiviert werden nützlich für das Bone Tissue Engineering und bieten den Vorteil einer höheren Zellproliferation.

Wichtige Schritte dieses Protokolls enthalten Schritte 1.2 und 1.3 (die Kultivierung Verfahren innerhalb von 24 Stunden nach der Ernte beginnen und richtige Pflege danach). Kontamination des Gewebes vermieden werden und aseptische Technik ist obligatorisch. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist, dass, verglichen mit der Beschaffung von Stammzellen aus dem Knochenmark oder Fettgewebe, Stammzellen aus zahngewebe Beschaffung ist begrenzt im Hinblick auf die geringe Anzahl von Zellen, die durch diese Technik erreicht werden kann.

Die Identifizierung und Charakterisierung der periostalen Stammzellen liefern wertvolle Informationen über die Funktionen und regenerative Potenzial dieses Gewebe sowie die Anwendbarkeit in der regenerativen Therapie. Eine optimale Kondition wurde mit 10−8 M 1,25-(OH)2D3erhalten. Daher fördert die Behandlung des PDCs mit 10−8 M 1,25-(OH)2D3 osteogene Differenzierung. Zukünftige Studien sollten die in-Vivo -Anwendung der 10−8 M 1,25-(OH)2D3 für das effektive und kostengünstige Bone Tissue Engineering untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Das Studienprotokoll wurde von Institutional Review Board für klinische Forschung der Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019 C 99-3814B, 102-1619 C, 101-4728B und 103-4223 C) zugelassen. Diese Studie wurde unterstützt durch Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 und NMRPG3C0151). Dieses Manuskript wurde von Wallace wissenschaftliche Bearbeitung bearbeitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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