Paraffin inbäddning och tunn snittning av mikrobiell kolonin biofilmer för Mikroskopisk analys

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver fixering, paraffin inbäddning och tunn snittningen tekniker för mikrobiell kolonin biofilmer. I beredda prover, kan biofilm underkonstruktion och reporter uttrycksmönster visualiseras genom mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Snittning via paraffin inbäddning är en allmänt etablerad teknik i eukaryota system. Här tillhandahåller vi en metod för fixering, inbäddning, och snittning av intakt mikrobiell kolonin biofilmer med perfunderade paraffinvax. Anpassa denna metod för användning på kolonin biofilmer, vi utvecklat tekniker för att behålla varje prov på dess tillväxt substrat och laminering det med en agar overlayer och lagt till lysin till fixativ lösningen. Dessa optimeringar förbättra prov lagring och konservering av micromorphological funktioner. Prover beredd på detta sätt är mottagliga för tunn snittning och imaging med ljus, fluorescens och överföring elektronmikroskopi. Vi har tillämpat denna teknik till kolonin biofilmer av Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisoch Vibriocholerae. Den höga detaljnivån som syns i prover som genereras av denna metod, kombinerat med reporter stam konstruktion eller användning av vissa färgämnen, kan ge spännande insikter i fysiologi och utvecklingen av mikrobiella samhällen.

Introduction

De flesta mikrober har kapacitet att bilda biofilmer, hålls samhällen av cellerna samman av egenproducerade matriser. Biofilmer kan odlas i många typer av fysiska uppställningar, med olika regimer av näringsämnen och substrat bestämmelse. Specifika analyser för biofilm bildning tenderar att ge reproducerbara flercelliga strukturer, och vanliga arkitekturer observeras för fylogenetiskt olika arter till gemenskapen eller makroskopisk nivå. När mikrober odlas som kolonier på fast substrat under en atmosfär, makroskopisk morfologi förmedlar information om kapaciteten för matrix produktion och ofta korrelerar med andra drag 1,2,3. Den inre arkitekturen av mikrobiell kolonier kan också ge ledtrådar om biofilm-specifika kemi och fysiologi, men har varit svårt att karakterisera. Senaste program cryoembedding och kryosnitt tekniker till bakteriekolonier har aktiverat bildbehandling och visualisering av specifika funktioner på oöverträffad upplösning 4,5,6. Studier med animalisk vävnad har dock visat att paraffin inbäddning ger överlägsen bevarandet av morfologi jämfört med cryoembedding 7 och har använts för att visualisera bakterier i vävnaderna 8,9. Därför har vi utvecklat ett protokoll för fixering, paraffin inbäddning och tunn snittning av mikrobiell kolonin biofilmer. Här kommer vi att beskriva utarbetandet av Pseudomonas aeruginosa PA14 koloni-biofilm tunnslip 10,11, men vi har också framgångsrikt tillämpat denna teknik till biofilmer som bildas av bakterierna Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, och Vibriocholerae12.

Processen för paraffin-inbäddning och tunn-snittning biofilmer följer en enkel logik. Först, biofilmer är inneslutna i ett lager av agar att bevara morfologi under bearbetning. För det andra de inneslutna-biofilmer är nedsänkt i ett fixativ till crosslink makromolekyler och bevara micromorphology. Dessa är sedan uttorkad med alkohol, rensat med ett mer icke-polära lösningsmedel och sedan infiltrerade med flytande paraffin vax. När infiltrerat, är proverna inbäddade i vax block för snittning. Avsnitt är skär, monterad på bilderna och sedan uppblött för att återlämna dem till en mer ursprunglig stat. Från denna punkt, kan de färgas eller täckt av monteringsmedium för Mikroskopisk analys.

Detta protokoll producerar tunnslip av mikrobiell biofilmer lämplig för histologisk analys. Kolonin biofilm på nationell nivå är synliga när tunnslip tillagas med denna metod är fotograferad av ljusmikroskop. Biofilmer kan också odlas på media innehållande fluorescerande fläckar som är specifika för enskilda funktioner eller målat på steget rehydrering, omedelbart före montering (steg 9,5-9,6). Slutligen, mikrober kan vara konstruerad för att producera fluorescerande proteiner i en konstitutiv eller reglerade mode möjliggör i situ rapportering av cell distribution eller gen uttryck inom dessa samhällen. Vi har använt dessa metoder för att bestämma kolonin biofilm djup, cell distribution, matrix distribution, växtmönster och spatiotemporal genuttryck.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tillväxt av Pseudomonas aeruginosa kolonin biofilmer

  1. Beredning av Medium-lipidens plattor
    1. Förbereda ett 10 g/L trypton, 10 g/L agar (se Tabell för material) lösning i avjoniserat vatten.
    2. Autoklav för 20 min. Cool till 50-60 ° C i ett vattenbad.
    3. Häll 45 mL agar-trypton lösning i en 100 x 100 mm fyrkantig maträtt (se Tabell för material) med en 50 mL konisk slang. Tillåt agar stelnar (~ 20-30 min). Häll en andra, 15 mL lager ovanpå första lagret. Låt stelna över natten, ta bort kondens från Lock om det behövs genom att torka av med en luddfri vävnad.
  2. Spotting kolonin biofilmer
    1. Strimma stammar av intresse från frys bestånd på LB agar plattor13 och inkubera i mörkret för 12-16 h vid 37 ° C och 80-100% relativ luftfuktighet.
    2. För varje stam eller replikera, använda en enda koloni att Inokulera 2 mL LB och inkubera i mörkret för 12-16 h vid 37 ° C med skakningar vid 250 rpm.
    3. Sub kultur genom spädning 1: 100 i färska LB och ruvar i mörkret för 2,5-3 h vid 37 ° C med skakningar vid 250 rpm.
    4. Mäta optisk densitet med en spektrofotometer och justera med steril LB att uppnå en cellsuspension med en OD500 nm ~ 0,5.
    5. Beroende på önskad kolonin storlek, Pipettera 2,5-10 µL cellsuspension på medium-lipidens plåt (bereddes i steg 1.1) och tillåta plats torka för ~ 20 min. lämnar petri locket på glänt nära öppen eld kan underlätta torkning.
    6. Inkubera spot kolonier vid 25 ° C och 80-100% relativ luftfuktighet, i mörker i upp till 4 dagar.

2. beredning av fixativ

  1. Bered den fästande dag prov skörd. Späd 37% formaldehyd (FA) i 1 x PBS till en slutlig koncentration på 4% FA.
    FÖRSIKTIGHET: FA är flyktiga och giftigt. Skyddsutrustning och arbeta i ett väl ventilerat dragskåp.
  2. Omedelbart före användning, upplösa L-lysin hydroklorid i 4% FA (bereddes i steg 2.1) vid rumstemperatur till en slutkoncentration av 50 mM L-lysine HCl.

3. direkta tillämpning av fixativ på den kolonin biofilmen [valfritt]

Obs: Vi har funnit att biofilm morfologi bevaras bäst när överlägget agar läggs före fixering. Detta steg utgör också en förändring i miljöförhållanden som kan påverka genuttryck. Fluorescerande reporter uttrycksmönster bör därför kontrolleras med ett separat protokoll där steget fixering utförs före tillsats av överlägget agar, som beskrivs här.

  1. På dagen för fixering, och arbetar i ett väl ventilerat dragskåp, pipett fixeringsvätskan bereddes i steg 2 direkt till agar ytan runt kolonins kanten, gör det möjligt att nå kolonins periferin utan att dränka den. Endast som mycket fixativ som behövs för att helt omger kolonin, cirka 500 µL. Låt fixeringsvätskan att diffundera in i kolonin och omgivande ägarn tillämpas.
  2. När fixeringsvätskan har varit helt absorberad in i kolonin och omgivande media, ca 20-30 min, och resterande FA är inte längre synlig på plattan, upprepa steg 3.1. Låt detta fixativ för diffusa i kolonin och de omgivande agar.
  3. När fixeringsvätskan har varit helt absorberad i kolonin och omgivande media Upprepa steg 3.1, denna tid tillämpa fixativ till ytan av kolonin direkt. Tillåt detta fixativ för diffusa i kolonin och de omgivande agar, vidare till steg 4 endast efter alla fixativ har absorberats och är inte längre synlig på plattan.

4. överdra kolonier med Agar

  1. På dagen för fixering, Bered en 10 g/L agar i avjoniserat vatten och autoklav för 10-20 minuter att lösa upp. Kyl i vattenbad till 50 ˚C.
  2. Häll försiktigt 15 mL agar lösningen över odlingsmedium och koloni. Låt agar bildar en gel i rumstemperatur i 5 min (figur 1B).
  3. Använd ett vasst rakblad för att skära en fyrkantig, 3-lagers chuck med kolonin laminerat mellan de översta två lagrarna. Om förbereda flera prover, se till att varje chuck är skära till en jämförbar storlek.
  4. Ta försiktigt bort överflödigt agar från kolonin-innehållande chucken.
  5. För att lyfta de två övre skikten av agar (innehållande kolonin) från nedre lagret av chucken (figur 1 c), våt platta huvudet av en spatel i 1 x PBS eller vatten och försiktigt in mellan övre och undre skikten. Laminerade kolonin bör separat från det nedersta lagret. Var försiktig med att snedvrida eller böja laminerade kolonin när du lyfter den från dess bas.

5. fixering

  1. Arbeta i väl ventilerat-dragskåp, omedelbart överföra laminerade kolonin (dvs 2-lagers chuck) till en inbäddning kassett (se Tabell för material), märkt med en kemiskt resistenta märkning penna. Placera inbäddning kassetten i en glas bild mailer (se tabell material) som innehåller den fixativ som förberett i steg 2.1-2.2. Kontrollera att det finns inga luftbubblor instängd inbäddning kassett.
  2. Inkubera provet i fixativ övernattning i mörker vid rumstemperatur.

6. prov bearbetning: Buffert Wash, uttorkning, Clearing och Infiltration

  1. Efter övernattning fixering, tvätta provet två gånger i 1 x PBS för 1 h varje. För bästa resultat, automatisera reagens homogenisering använder spin en automatisk vävnadsprocessor (se tabell material) inställd på en låg inställning. Om det finns ingen processor kan bearbetning köras manuellt.
  2. Följ den buffert tvätten av uttorkning genom en graderad serie av etanol (EtOH) utspädningar i 1 x PBS (25%, 50%, 70%, 95%) för 1 h varje vid rumstemperatur.
  3. Torka i tre tvättar 100% EtOH för 1 h varje vid rumstemperatur.
  4. Rensa uttorkad provet i tre tvättar av 100% orange oljebaserade clearing agent (se tabell material) för 1 h varje vid rumstemperatur.
  5. Infiltrera clearade provet två gånger med smält paraffin vax (se Tabell för material), uppvärmd till 55˚C, för 2 h varje.

7. prov inbäddning

  1. Fyll en vax mögel med smält paraffin vax uppvärmd till 55 ˚C. Använd en uppvärmd, platt spatel att snabbt överföra den infiltrerade chucken från inbäddning kassett i vax mögel, säkerställa att chucken vilar parallellt med basen av mögel. Undvik att applicera överdrivet tryck på chucken. Vax mögel kan vara anpassade 3-D tryckt eller kommersiellt tillgängliga (se Tabell för material).
  2. Låt vaxet stelna över natten vid 4 ˚C. Prover som gjuten i fast vax kan lagras på obestämd tid vid 4 ˚C.
  3. När vaxet stelnat, punktskatter provet från mögel och trimma överflödigt vax från runt provet med ett rakblad. Lämna överflödigt vax som sträcker sig från ena änden av provet, parallellt med planet för snittning, som kan användas för att klämma det in mikrotomen (se Tabell för material). Också lämna ett hölje av vax, ca 1 mm tjock, runt provet och släta sina ansikten.

8. snittning

  1. Värm ett vattenbad till 42 ˚C. Fast provet i mikrotomen med ytan av kolonin orienterade vinkelrätt till kanten av bladet (se Tabell för material).
  2. Trimma provet i 50 µm mellanrum tills önskad planet av kolonin har uppnåtts, från vilka sektioner kommer att samlas in.
  3. Skär ett band av önskat antal 10 µm tjocka sektioner med en mikrotom inställd på en snittningen hastighet av 75-80 rpm och en släppningsvinkel av 6-10˚. Använda en spetsig pensel för att lossa menyfliken från bladet.
  4. Använda en droppe vatten på spetsen av en Pasteur-pipett (föredras) eller en pincett, försiktigt överföra menyfliksområdet till vattenbadet. Var noga med att undvika svällning luftbubblor under avsnittet.
  5. Omedelbart infoga en diabild i vattenbad och placera det under menyfliken i 45º vinkel.
  6. Tryck den smala kanten av menyfliksområdet i bilden, precis nedanför frostat etiketten. Menyfliksområdet ska följa.
  7. Dra ut bilden ur vattenbadet, justering av vinkeln att bli vinkelrätt mot ytan av vattnet och låter bandet att ligga platt mot bilden längs dess längd. Undvika svällning överflödigt vatten under menyfliken.
  8. Försiktigt utmärker bilden på en luddfri läskpapper, fuktspridande överflödigt vatten från avsnittet.
  9. Lägg bilden på hushållspapper och låt det torka i rumstemperatur över natten i mörkret. Bilder kan lagras på obestämd tid på 4 ° c i mörker.

9. värme-fastställande, rehydrering och montering

  1. Värm en planat värmeplatta till 45 ° c. Värme i bilden i 30-60 min. Vaxet blir halvsmälta och platta mot bilden.
  2. Försiktigt lyfta bilden från värmeplattan och lägga den platt på en slät, planat, rumstemperatur yta, använder försiktighetsåtgärder för att säkerställa att smält vax inte tar emot på endera sidan av bilden, tills vaxet stelnar (~ 1 min).
  3. Använder en glas bild mailer, de-vax diabilder i fyra tvättar clearing agent för 5 min varje, med en Büchner hygienfilter ta bort lösning mellan tvättarna.
  4. Tvätta bilderna tre gånger i 100% EtOH för 1 min varje.
  5. Rehydrera objektglasen i en graderad serie av etanol i omvänd ordning av bearbetning (95%, 70%, 50% och 25%) för 1 min varje följt av två 1-min tvättar i 1 x PBS.
  6. Omedelbart montera avsnitten i en Tris-buffrat monteringsmedium (se Tabell av material) och Lägg på ett täckglas, undvika införandet av luftbubblor. Tillåta monteringsmedium att polymerisera över natten i rumstemperatur.
  7. När polymeriserat, försegla täckglaset till bild med genomskinligt nagellack. Förseglade bilder kan lagras på obestämd tid i mörker vid 4 ° c.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoden genererar biofilm tunna-snitt vari distinkta morfologiska egenskaper och zoner av genuttryck kan avbildas av DIC, fluorescensmikroskopi och TEM. DIC bildåtergivning med en 40 X oljeimmersionsobjektivet kan vara tillräckligt för att visa vissa morfologiska egenskaper (figur 2E), har vi funnit att fluorescence mikroskopi av stammar konstruerad att konstitutivt express fluorescerande protein ger förbättrad visualisering av cell distribution inom provet (figur 2D). Bilder av enskilda delar kan vara ihopsydda att generera ett tvärsnitt av hela kolonin (figur 2B) och att ge sammanhang för lokalisering av strukturella funktioner inom den övergripande morfologin på makroskopisk nivå (jämför Figur 2A, B, och C). Morfologiska egenskaper och fluorescerande signaler kan mätas med bildbehandling programvara14. Strukturer inom biofilm eller övergångar mellan zoner av genuttryck kan sedan korreleras med fördelningor av metaboliter eller kemiska gradienter11 .

Detta protokoll kan ändras och anpassas på flera sätt. Användning av en stam som konstruerad att uttrycka fluorescerande protein under kontroll av en särskild promotor möjliggör visualisering av fördelningen av genuttryck (figur 3A). Kolonierna kan odlas på medium som innehåller färgämnen, eller färgämnen kan läggas efter snittning, för att färga specifika polysackarider (diagram 3B och C). Slutligen, prover som tillagas i en modifierad version av detta protokoll kan granskas av TEM (figur 3D) som möjliggör visualisering med högre upplösning än som aktiverats av DIC eller fluorescensmikroskopi.

Figure 1
Figur 1: Schematisk föreställande setup för kolonin tillväxt före fixering.
(A) kolonier odlas ovanpå två lager av agar-stelnat odlingsmedium (topp och botten) och (B) överdras sedan med ytterligare ett lager (overlay), som bevarar kolonin morfologi. (C) kolonin inklämt mellan överlägg och översta lagret separeras därefter från det nedersta lagret för vidare bearbetning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Micromorphological funktioner och YFP fluorescens i tvärsnitt av paraffin-inbäddat kolonier.
Representativa uppgifter för en Pseudomonas aeruginosa PA14 Δphz kolonin15 konstitutivt uttrycker YFP och odlas för 3 dagar på 1% trypton, 1% agar som innehåller kongorött och Coomassie blå. (A) top-view, fluorescens bilden visar hälften av en koloni före fixering. (B) tvärsnitt av hela kolonin efter paraffin-inbäddning. Det inramade området fotograferades med en 10 X objektiv (C). Det inramade området i (C) fotograferades sedan med 40 X objektiv för nedsänkning av olja med hjälp av fluorescens (D) och DIC (E). Skala staplarna representerar 2 mm (A), 500 µm (B) och 100 µm (C-E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Reporter uttryck, före och efter färgning av biofilm funktioner och TEM avbildning av paraffin-inbäddat kolonin biofilm prover.
(A) mexGPr-GFP reporter fluorescens i en P. aeruginosa PA14 koloni odlas i 3 dagar på 1% trypton, 1% agar. (B) fluorescens av bundna kongorött i en P. synxantha koloni odlas för 5 dagar på ett medium som innehåller färgämnet. (C) fluorescens av Wisteria floribunda lektin fläcken för Pel polysackarid i en P. aeruginosa PA14 Δphz koloni (odlas för 2 dagar på 1% trypton, 1% agar innehållande kongorött och Coomassie blå), tillämpas efter snittning. (D) TEM bild av en P. aeruginosa PA14 Δphz koloni (odlas för 3 dagar på 1% trypton, 1% agar som innehåller kongorött och Coomassie blå), och bearbetas för snittning via paraffin inbäddning *. Skalstapeln representerar 40 µm (A-B), 20 µm (C) och 5 µm (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

* Detta prov var bearbetas för snittning via paraffin-inbäddning genom Steg4 i ovannämnda protokoll, utelämna steg 4.1-4.3, och sedan behandlas separat för TEM analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Paraffin-inbäddning och tunn-snittning av vävnadsprover är en klassisk histologiska teknik som möjliggör avbildning av mikro-morfologiska strukturer och används ofta på eukaryota vävnader har tillämpats med framgång på mikrobiell prover8 ,9. Medan cryoembedding möjliggör en stark retention av endogena och Immunofluorescerande signal, är paraffin inbäddning generellt att föredra eftersom det ger bättre bevarande av morfologi16. Anpassa denna metod för ansökan till mikrobiell biofilmer, fokuserade vi på egenskaper som är unika för vårt system. Matris av vävnaderna och cellerna hålls ofta tillsammans relativt kraftfullt, medan biofilmer tenderar att vara mer känsliga; Vi optimerat därför rutinmässigt fixering och vax inbäddning protokoll för att maximera kvarhållandet av provet. Att upprätthålla provet på dess tillväxt substrat och överliggande kolonin med agar omedelbart före fixering garanterar att provet inte är förlorad från toppen eller basen. Överliggande kolonier med agar som är för varmt kan dock skada kolonierna, så bör vara extra försiktig under detta steg.

Fixering är ett viktigt steg för att behålla struktur genom hård uttorkning, clearing, och infiltration steg krävs för paraffin inbäddning. Vi hittade att lysin-formaldehyd fixering bästa bevarar integriteten för provet. Lösliga lysin, en diamine, kan reagera med aldehydes att bilda tvärbunden polymerer och har föreslagits att förstärka exopolymeric ämne (EPS) mot mekanisk nedbrytning17,18.

Vi har observerat att bakgrunden fluorescensen minskar med successiva tvättar i orange oljebaserade clearing agent, eller genom långvarig exponering, under provet rehydrering (steg 9,3). Överdriven behandling med clearing agent kan dock resultera i spröda prover som är svåra att avsnitt19. Det kan vara nödvändigt att justera volymen eller antalet tvättar motsvarar mängden vax närvarande under varje rehydrering. Ökad bakgrund fluorescens kan uppstå på samma sätt från kontaminering av vävnad bearbetning reagenser, där vaxet, vilket är något autofluorescent, är antingen helt eller delvis blandbar i clearing lösningsmedel eller etanol som används i dessa steg (steg 6.1-6.4). Dessutom har vi funnit att etanol minskar reporter signal, och det är viktigt att åter utgör fluorophore i två tvättar PBS före montering (steg 9,5-9,6).

Denna metod möjliggör också localizationen av konstituerande och arrangören-driven fluorescens med upplösning av celler. Men rekommenderar vi försiktighet när du använder denna metod för att tolka genuttryck. Det överlägg steget infördes i detta protokoll (steg 4.2), som gällde före fixering vid 50 ˚C, presenterar en betydande miljöförändringar i förhållande till villkoren initial tillväxt som kan påverka gen uttrycksmönster. Det kan vara användbart att kontrollera uttrycksmönster genom att tillämpa fixativ till kolonin direkt, omedelbart före hälla overlay, men till en kostnad på morfologi (valfritt steg 3.1-3.3).

En annan faktor som påverkar tolkningen av fluorescens är topografin av avsnittet själv. Olika regioner av biofilmen kan uppvisar varierande grad av strukturell integritet och vara mer eller mindre mottagliga för bevarande via fixering, beroende på vilka eventuella funktionella grupper dessa komponenter finns kunna bidra till fixativ cross-linking 20. som ett resultat, sektioner kan förlora biomassa oproportionerligt från avsnitt ytan när övergår från en morfologisk eller metabolisk zon till en annan längs kolonins z-axeln. Detta kan åtgärdas genom imaging ett intakt fokal segment i avsnittet med en confocal Mikroskop.

Förutom att använda denna teknik till stammar konstruerad att uttrycka fluorescerande proteiner, har vi undersökt micromorphological funktioner av transmissionselektronmikroskopi (TEM) och i biofilm prover färgas med specifika fluorescerande färgämnen (figur 3A ). Jennings et al. nyligen beskrivit en dye specifikt för Pel, den stora polysackarid som produceras av P. aeruginosa PA14 biofilmer 21. Som beskrivs i protokollet och representant resultaten ovan, kan tillämpningen av denna färg till avsnitten för visualisering av Pel distribution i PA14 koloni biofilmer på hög upplösning (figur 3 c) 3. Omvänt, fluorescerande färger såsom kongorött kan läggas till odlingsmedium och avbildas efter snittning (figur 3B). Tillämpningen av ett överlägg bevarar också koloni biofilm morfologi och cell struktur under hela behandlingen för TEM (figur 3D).

Den optimera metod som beskrivs här möjliggör utarbetandet av kolonin biofilmer för snittning via paraffin inbäddning, vari endogena signal och funktioner eller komplex färgämnen kan vara lokaliserade i vivo med överlägsen upplösning samtidigt minimera prov förlust och bevara infödda kolonin makro - och micro-morfologier. Vi erkänner att det krävs betydande ansträngningar, tid och reagens används för denna metod. Vi känner emellertid dessa nackdelar motverkas av graden av morfologiska bevarande, upplösning i situ fluorescens och föredragandens förfaranden före och efter färgning eller alternativa bearbetning strategier (såsom förberedelse för TEM) ges av denna teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av NSF karriär AWARD 1553023 och NIH/NIAID award R01AI103369.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
  2. Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51, (3), 675-690 (2004).
  3. Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, (26), E5236-E5245 (2017).
  4. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, (7), 945-953 (2008).
  5. Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4, (2), e00103-e00113 (2013).
  6. Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195, (24), 5540-5554 (2013).
  7. McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
  8. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
  9. James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. 31-44 (2014).
  10. Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81, (24), 8414-8426 (2015).
  11. Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. 171538 (2017).
  12. Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
  13. Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186, (3), 595-600 (2004).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  15. Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321, (5893), 1203-1206 (2008).
  16. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. (2017).
  17. Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68, (3), 577-587 (2007).
  18. Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33, (11), 1116-1128 (1985).
  19. Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
  20. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290, (44), 26404-26411 (2015).
  21. Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, (36), 11353-11358 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics