Rastreamento de comportamento Larval de Drosophila em resposta à estimulação Optogenetic dos neurônios olfativos

Neuroscience

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Summary

Este protocolo analisa comportamento de navegação de larvas de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de seus neurônios olfativos. Luz de comprimento de onda de 630 nm é usada para ativar individuais neurônios olfativos expressando uma rodopsina canal avermelhado. Larval movimento simultaneamente é controlado digitalmente gravado e analisados utilizando o software personalizados.

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Clark, D. A., Kohler, D., Mathis, A., Slankster, E., Kafle, S., Odell, S. R., et al. Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons. J. Vis. Exp. (133), e57353, doi:10.3791/57353 (2018).

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Abstract

A capacidade de insetos para navegar em direção a fontes de odor baseia-se as atividades de seus neurônios olfactory do receptor de primeira ordem (ORNs). Gerou-se uma quantidade considerável de informações sobre ORN respostas a odorantes, o papel de ORNs específicas na condução de respostas comportamentais permanece mal compreendido. As complicações em análises de comportamento surgem devido a diferentes volatilidades dos odorantes que ativam ORNs individuais, vários ORNs ativados pelo único odorantes e da dificuldade em replicar naturalmente observadas variações temporais em estímulos olfactory usando métodos convencionais de odor-entrega no laboratório. Aqui, descrevemos um protocolo que analisa comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de suas ORNs. A tecnologia de optogenetic usada aqui permite a especificidade da ativação de ORN e controle preciso de padrões temporais de ativação ORN. Correspondente movimento larval é controlado digitalmente gravado e analisado usando personalizado escrito software. Substituindo a estímulos de odor com estímulos de luz, esse método permite que para um controle mais preciso da ativação de ORN individual a fim de estudar o seu impacto no comportamento larval. Nosso método para estudar o impacto de neurônios de projeção de segunda ordem (PNs) bem como neurônios locais (LNs) no comportamento larval poderia, ser novamente prorrogado. Este método permitirá, assim, uma dissecação completa da função olfativa circuito e complemento estudos sobre atividades de neurônio olfatório como traduzir em respostas de comportamento.

Introduction

Informação olfativa no ambiente da larva uma drosófila é detetada por apenas 21 ORNs funcionalmente distintos, as atividades de que, finalmente, determinar o comportamento larval1,2,3,4. No entanto, relativamente pouco é conhecido sobre a lógica pela qual informação sensorial é codificada nas atividades destas 21 ORNs. Assim, há uma necessidade de medir experimentalmente as contribuições funcionais de cada ORN larval de comportamento.

Embora o perfil de resposta sensorial do repertório inteiro de Drosophila ORNs larvas tem sido estudado em detalhe1,4,5, as contribuições de ORNs individuais para o circuito olfativo e, desse modo, para comportamento de navegação permanecem em grande parte desconhecidos. Em estudos de comportamento larval, até agora, dificuldades devido à incapacidade de espacial e temporalmente ativar ORNs único. Um painel de odores que ativam especificamente o 19. º as 21 ORNs larvas de Drosophila foi recentemente descrito1. Cada odorante no painel, em baixas concentrações, provoca uma resposta fisiológica apenas a partir de seu cognato ORN. No entanto, em altas concentrações que normalmente são usadas para os ensaios de comportamento convencional, cada odorant elicia respostas fisiológicas de múltiplos ORNs1,5,6. Além disso, odorantes neste painel têm variado volatilidades que complicam a interpretação dos estudos de comportamento que dependem de formação de odor estável gradientes7,8. Finalmente, naturalmente ocorrendo estímulos odor tem um componente temporal que é difícil de replicar em condições de laboratório. Portanto, é importante desenvolver um método que pode medir comportamento larval enquanto simultaneamente ativando ORNs individuais de uma forma espacial e temporal.

Aqui, vamos demonstrar um método que possui vantagens sobre rastreamento larval descrito anteriormente ensaios1,8. O ensaio de rastreamento descrito em Gershow et al usa válvulas eletronicamente controladas para manter um gradiente estável do odor no comportamento arena8. No entanto, devido ao nível de engenharia complexo envolvido para construir o odor estímulo de configuração, esse método é difícil de replicar em outros laboratórios. Além disso, os problemas relacionados ao uso de odorantes para ativar especificamente ORNs único continuam por resolver. O ensaio de rastreamento descrito na Mathew et al usa um sistema de entrega de odor mais simples, mas o gradiente de odor resultante depende da volatilidade do teste odorant e é instável para durações longas do ensaio1. Assim, substituindo a estímulos de odor com estímulos de luz, nosso método tem as vantagens da especificidade e um controle preciso da ativação de ORN temporal e não é dependente da formação de gradientes de odor de diferentes intensidades.

Nosso método é fácil de configurar e é apropriado para pesquisadores interessados em medir aspectos da navegação de larvas de Drosophila . Esta técnica poderia ser adaptada para outros sistemas modelo, desde que o pesquisador é capaz de dirigir a expressão de CsChrimson em neuron(s) seus favoritos do sistema de escolha. CsChrimson é uma versão avermelhado da rodopsina canal. Ele é ativado em comprimentos de onda que são invisíveis ao sistema de phototaxis da larva. Estamos, portanto, capazes de manipular a atividade de neurônios com especificidade, confiabilidade e reprodutibilidade9. Modificando o costume escrito software conta para alterações de tamanho dos indivíduos, esse método poderia ser facilmente adaptado para rastreamento larvas de outras espécies de insetos.

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Protocol

1. construção de uma Arena de comportamento e preparação de Hardware para habilitar Optogenetic estimulação na Arena de comportamento

  1. Para construir uma arena de comportamento privado de luz, construir uma caixa com uma dimensão de 89 x 61 x 66 cm3 (L 35" x 24" W x 26" H) feito de chapas de acrílico de acrílico colorido preto (espessura de 3 mm) (ver Tabela de materiais). Materiais para construir uma caixa tão grande devem estar disponíveis em lojas de ferragem locais. Coloque esta caixa em uma mesa na sala de comportamento (Figura 1A).
  2. Monte uma câmera USB 3.0 CCD monocromática equipada com um filtro de nm passe longo-830 IR e uma lente de montagem C f 1.4 de 8 mm (ver Tabela de materiais) para o centro do teto da caixa preta. Lugar dois LED infravermelho tiras (ver Tabela de materiais) sobre a mesa a fim de iluminar as larvas na arena escura (Figura 1A).
  3. Para construir a plataforma de LED, obter uma placa de alumínio quadrada 22 cm x 22 cm (de preferência pulverizador pintado com um acabamento em preto fosco para eliminar qualquer reflexão). No centro da placa, usando um cortador de metal, corte um buraco suficientemente grande para caber em torno da câmera do CCD.
  4. Cobrir a placa de metal com luzes de tira de LED vermelhas (ver Tabela de materiais). Solda arames de faixa de luz LED em série e alimentar os fios de strip-tease em um relé acoplador controlado por um microprocessador de 2B Raspberry Pi (ver Tabela de materiais) (Figura 1B e 2).
  5. Instalar e configurar o sistema operacional Ubuntu companheiro/Raspian Jesse/Linux baseado no processador Raspberry Pi antes de ligar o relé acoplador para as tiras de LED. Anexar uma fonte de alimentação para abastecer as tiras de LED e o acoplador (Figura 2) (ver Tabela de materiais). Monte a plataforma de LED em torno da câmera do CCD (Figura 1B).
    Nota: O sistema de operacional Ubuntu companheiro v16.04 está disponível gratuitamente. Um conjunto de comandos Python com base simples pode ser facilmente adaptado para os padrões do programa de estímulos de luz LED (consulte o arquivo de sintaxe).
  6. Certifique-se de irradiância homogênea em vários pontos da arena de comportamento. Medir a absoluta irradiância na superfície da arena, com a ajuda de um espectrômetro e determinar que seja ~1.3 W/m2 em toda a superfície da arena.
    Nota: Com esta intensidade, não foram observadas alterações significativas na temperatura ao longo dos experimentos. Outro estudo10 usado uma maior irradiância de ~1.9 W/m2 e não observada nenhuma alteração na temperatura ao longo dos experimentos.

2. preparação de larvas de Drosophila para análises de comportamento

  1. Manter as moscas no padrão alimentar de voar (ver Tabela de materiais) a 25 ° C, 50-60% RH e um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h.
  2. Para expressar a CsChrimson em um único par de ORNs, cruzar fêmeas virgens de uma linha UAS-IVS-CsChrimson para machos de uma linha de OrX-Gal4 ('X' corresponde a um dos receptores de odor larval 21 (ou) os genes que são expressos com exclusividade em cada um de 21 pares de ORNs)9,11.
    1. Alternadamente, para expressar a CsChrimson em todos os 21 ORNs larvas, Cruz fêmeas virgens de um UAS-IVS-CsChrimson linha de machos de uma linha de Orco-Gal4 ('Orco' é o receptor co que é expresso em todos os 21 ORNs).
    2. Use linha UAS-IVS-CsChrimson por si só como um controle nesses experimentos.
      Nota: Os estoques voar listados aqui estão disponíveis no centro de estoque de Drosophila Bloomington (ver Tabela de materiais).
  3. Assim moscas machos e fêmeas em uma cruz são permitidas para acasalar e botar ovos por 48 h, transferência de adultos para um frasco de doce.
    1. À superfície do frasco de alimentos que contenham ovos, adicione 400 µ l de uma mistura contendo 400 retinal todo-trans µM (ATR) dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) e 89 mM de sacarose dissolvida em água destilada.
      Nota: A pequena quantidade de sacarose promove alimentação larval da solução ATR. ATR é um cofator necessário para estrogenos de CsChrimson expressão9,10. ATR é sensível à luz.
    2. Se adicionarmos ATR os frascos de alimentos que contêm ovos, incube os frascos no escuro para um adicional 72 h.
      Nota: Enquanto este estudo e os dois estudos acima não observaram efeitos no comportamento larval devido a alimentação de ATR, é recomendável controlar para os efeitos do ATR alimentação sujeitando linhas de teste para a mesma quantidade de mistura acima que não contenha ATR.
  4. Extrai larvas de terceiro instar (~ 120 h após a postura de ovos) da superfície do alimento voar por flutuante-los usando uma solução de sacarose (15%) de alta densidade. Usando um P1000 micropipeta separar as larvas flutuando na superfície da solução de sacarose para um copo de vidro de 1000 mL.
  5. Lave as larvas 3 – 4 vezes trocando 800 mL de água destilada fresca no copo de vidro de cada vez. Permitir que as larvas descansar por 10 min antes de submetê-los para o ensaio de comportamento.

3. comportamento ensaio

  1. Manter uma temperatura consistente (entre 22 e 25 ° C) e umidade (entre 50 e 60% RH) na sala de comportamento.
  2. Prepare-se larvas rastejante médio derramando 150ml de agarose derretido (1,5%) em um quadrado de 22 cm x 22 cm placa de Petri. Uma placa de Petri é derramado para cada julgamento do ensaio, 8 – 10 ensaios por experiência. Permitir que a agarose solidificar e arrefecer durante 1 a 2 h nos pratos de Petri antes de usá-los no ensaio de comportamento.
    1. Transferência de não mais que 20 das larvas de terceiro instar preparadas para o centro do prato de Petri (Figura 1C). Cubra o prato de Petri com a tampa. Coloque o prato de Petri na arena de comportamento sob a câmera do CCD.
      Nota: Dependendo do experimento, ensaios de comportamento são normalmente efectuados por 3 – 5 min. Se um odorante é usado no ensaio para fornecer dicas de orientação, foi observado que o gradiente de odor resultante permanece estável por aproximadamente 5 min1. Tempos mais longos de ensaio não são recomendados. Não foram observados efeitos deletérios sobre as larvas, devido à desidratação ou de 630 nm luz vermelha a exposição prolongada a esses pontos de tempo.
  3. Vire ON the 850 nm infravermelho fonte de luz LED para visualizar as larvas no vídeo. Inicie a câmera CCD para gravar movimento larval.
  4. Usando o software associado com o processador de Raspberry Pi, programa o procedimento para administrar adequados padrões de estimulação de luz vermelha.
    Nota: Um conjunto de comandos Python com base simples pode ser facilmente adaptado para os padrões do programa de estímulos de luz LED (consulte o arquivo de sintaxe).

4. processamento de dados e análise

  1. Importe o vídeo gravado de cada julgamento em qualquer software de programação disponível como Matlab.
  2. Obter coordenadas XY de cada larva em um filme como uma função do tempo. Com base em limites do software de rastreamento, larvas de terceiro instar 15 – 20 podem ser seguidas em um único filme1,8.
    Nota: Um conjunto de códigos simples Matlab ('Tracklarva') que podem ser facilmente adaptadas às condições apropriadas (veja arquivo de sintaxe) é fornecido. Este programa combina todos os testes em um experimento e saídas as coordenadas XY de cada larva para toda a duração do ensaio (consulte Sintaxe de código abaixo). Alternadamente, um pode usar vários programas de código aberto baseados livremente disponíveis para pesquisadores. Por exemplo JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.
  3. Use as coordenadas XY geradas para traçar trajetórias larvas e analisar mais locomoção larval.
    1. Para análises de comportamento, use estatísticas de navegação como velocidade, curvatura de caminho, ângulo de posição, para segmentar individuais trajetórias larvas em alternando sequências de corridas e voltas.
    2. Execuções são definidas como períodos contínuos de movimento para a frente. Parece que separa execuções sucessivas. Curvas são sinalizadas quando mudanças de ângulos de orientação de trajetória foram > 45° (ver arquivo de sintaxe).
  4. Calcule os valores médios para a velocidade de execução, executar comprimento, direção de execução e outros parâmetros conforme necessário.
    Nota: Um conjunto de sintaxe simples para extrair 'roda' e 'Para' de trajetórias larvas é fornecido (consulte o arquivo de sintaxe). Simples Matlab ou Excel baseado em funções podem ser aplicadas a dados extraídos para calcular valores para 'executar velocidade', 'executar comprimento' etc.
  5. Representar dados para cada métrica comportamental como média ± SEM.

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Representative Results

Para demonstrar a especificidade da ativação de ORN, nosso método foi aplicado com sucesso para determinar o impacto de duas diferentes ORN (ORN::7a & ORN::42a) ativação (ORNs expressando ou Or7a ou Or42a) sobre o comportamento de larva (Figura 3). Consistente com estudos recentes daquele indivíduo ORNs larvas são funcionalmente distintos1,10,13, nossos dados representativos demonstram que quando ORN::7a expressando CsChrimson foi estimulada pela luz, havia uma redução significativa no comprimento de execução em comparação com animais controle. Inversamente, quando ORN::42a expressando CsChrimson foi estimulada pela luz, houve um aumento significativo na execução comprimento comparado aos animais controle (Figura 3). Os coletivos dados analisados de ~ 100-120 faixas larvas foram obtidas (n = 8) ensaios realizados para cada genótipo. As barras de erro representam SEM. Enquanto aqui descrevemos apenas um parâmetro de comportamento único (comprimento de execução), notamos que cada faixa larval pode ser mais analisada para calcular parâmetros de velocidade, curvatura do caminho, e o corpo se dobra1,8,13, 14,15. Mais parâmetros relacionados a direcionalidade tais como ângulo de posição, comprimento e executar velocidade em direção e longe de odores podem ser obtidos se uma fonte de odor é fornecida em um lado da arena1,8,13.

Para demonstrar a capacidade do nosso método para alterar os padrões temporais de ativação de ORN, variamos o nosso estímulo para alternar entre as luzes e desligar. Estamos sujeitos as larvas expressando UAS -CsChrimson em ORN::42a de três diferentes padrões temporais de estímulos de luz durante o período de ON de luzes (0,04 Hz, 1Hz e constante). Em seguida medimos mudanças nos parâmetros comportamentais que ocorrem na fase luzes OFF → ON e durante as luzes na fase OFF →. Nós achamos que, para ORN::42a, diferentes padrões temporais de estimulação luminosa suscitou respostas comportamentais diferentes (Figura 4). Tais alterações não foram observadas em larvas de controle que não expressam UAS-CsChrimson em qualquer ORNs. Estes resultados de destaque a importância de compreender como temporais padrões de ativação ORN contribuem para o comportamento animal.

Figure 1
Figura 1 : Arena de comportamento e meio de rastreamento larval. (A) vista da arena caixa preta comportamento frontal. Porta aberta da arena revela uma câmera CCD suspendida do teto da caixa. (B) vista inferior de uma plataforma de metal contendo vermelhas tiras de LED de luz usadas para optogenetic estímulos é montada em torno da câmera do CCD. (C) vista superior do meio rastreamento larval usado no ensaio. Antes do início da gravação de movimento larval, ~ 20 larvas lavadas são dispostas ao longo do centro de um 22 cm x 22 cm placa de Petri com camadas de agarose 1,5%. A placa de Petri contendo larvas é colocado no centro da arena sob a câmera do CCD e entre as duas infravermelho LED luz tiras que são usadas como uma fonte de luz para a câmera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Instalação de Optogenetics. Um infográfico mostrando o arranjo eletrônico para a instalação de optogenetics. Brevemente, diodo emissor de luz (630 nm) tiras são ligadas em série e fios das tiras são alimentados em um acoplador conectado a um microprocessador de 2B PI framboesa. Tanto as tiras de luz LED e o acoplador são alimentados por uma fonte de alimentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Impacto de acionamento do refletor de ORNs individuais no comportamento larval. Execute o comprimento de larvas expressando CsChrimson em ORN::7a e ORN::42a foram afetados de forma diferente em comparação para controlar as larvas após a ativação de luz. Cada barra representa a média do RI ± SEM (n = 8). Execução de larvas quando ORN::7a foi ativado era significativamente inferior ao controle. Execução de larvas quando ORN::42a foi ativado era significativamente maior do que o controle. Barras representam a média ± SEM (n = 8, teste-t de Student; "*" é p < 0.05, "* *" é p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Impacto de diferentes padrões temporais de ativação ORN no comportamento larval. (A) três padrões temporais de estímulos utilizados para ativar ORNs. R: estímulo constante de 1min luz durante, estímulo b: 0,04 Hz luz estimulação, estimulação luminosa de estímulo c: 1 Hz durante o período de LED ON no minuto 2. (B) as larvas foram submetidas a três diferentes padrões de estímulos de luz descritos na. Cada ponto representa a mudança no comportamento larval, sob cada padrão de estímulos de luz, quando o acionamento do refletor é alternado de ON para OFF. Mudar em 'executar comprimento' (AV. comprimento (OFF) - AV. executar o comprimento (em)) é plotado no eixo x. Mudar em 'executar velocidade' (AV. executar velocidade (OFF) - AV. executar velocidade (ON)) é plotada no eixo y. O gráfico à esquerda (pontos cinzas) representa medições de larvas de controle e o gráfico certo (pontos vermelhos) representa medições de larvas expressando CsChrimson em ORN::42a. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Final Code PDF
Arquivo suplementar de sintaxe: um conjunto de códigos simples Matlab ('Tracklarva') que podem ser facilmente adaptadas às condições adequadas de. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Aqui, descrevemos um método que permite a medição do comportamento larval de Drosophila em resposta à ativação simultânea optogenetic dos neurônios olfativos. Descrito anteriormente larval de rastreamento métodos1,8 usar tecnologia de entrega de odor diferente para ativar ORNs. No entanto, esses métodos não podem controlar para a especificidade ou padrões temporais de ativação ORN. Nosso método supera esses défices usando estímulos de luz em vez de estímulos de odor para um controle mais preciso da ativação de ORN.

Os materiais necessários para construir a arena de comportamento podem ser facilmente obtidos na loja de ferragem local e requer o mínimo de esforço na Assembleia. Os componentes eletrônicos necessários para preparar o módulo optogenetics também estão facilmente disponíveis e construído. O método descrito aqui usa luz vermelha para ativar uma rodopsina canal avermelhado (CsChrimson) expressos em neurônios específicos. O comportamento resultante larval em resposta à ativação ORN correspondente é gravado usando uma câmera CCD e medido usando software escrito personalizado que é fornecido aqui. Nosso método permite que os pesquisadores de respostas a várias perguntas que não eram possíveis antes de perguntar: 1) qual é o impacto de padrões diferentes de estímulo olfativo na capacidade do animal para navegar em direção a um odor? 2) semelhantes ao ON-centro e células ganglionares de OFF-centro na retina de mamíferos16, existem ORNs que respondem especificamente a uma diminuição de estímulos olfactory além ORNs que respondem ao aumento de estímulos olfativos? Finalmente, nosso método permite que uma variedade de aplicações futuras, incluindo a medição do impacto dos neurônios a jusante do circuito olfativo (PNs e LNs) para navegação larval.

Embora existam várias vantagens ao nosso método, reconhecemos certas limitações. Não está claro se os efeitos de concentração observados com odores podem ser facilmente replicados usando este sistema. Enquanto nossa configuração atual não permite isso, o módulo de optogenetics pode ser facilmente modificado para acomodar aumenta ou diminui a intensidade do estímulo luz. No futuro, vamos verificar para ver se mudando a intensidade do estímulo de luz imita os efeitos da concentração de odores. Técnicas genéticas moscas simples podem ser usadas para expressar a CsChrimson em qualquer todos os 21 pares de ORNs (usando o Orco-Gal4) ou em um único par de ORNs (usando individuais ou-Gal4s). No entanto, complicada genética seria necessário para expressar CsChrimson em 1 < n < 21' neurônios. Devido a isso, seria difícil replicar os efeitos observados com misturas de odor onde componentes individuais da mistura eliciam respostas de mais de um ORN. Mesmo que o comportamento de navegação larval é considerado um comportamento dimensional baixo, reconhecemos que nosso programa de rastreamento larval poderia ser melhorado no futuro pelo considerando adicionais descritores comportamentais baseados na postura animal (por exemplo, probabilidade de cabeça gira, corpo curvas etc)8,17. Nosso estudo limitou-se a neurônios sensoriais de primeira ordem a larva. Investigação adicional é necessária antes de nosso método pode ser aplicado a segunda sequência de neurônios de projeção e neurônios locais que são incorporados na região do lóbulo cerebral do cérebro18.

Em resumo, nosso método oferece a capacidade de dissecar a função de cada ORN no circuito simples, tractable olfativo da drosófila larva. Ao fazer isso, nosso método permitirá o desenvolvimento de modelos computacionais mais precisos que descrevem como sinais de odor são convertidos em saídas comportamentais diferentes.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização da Universidade de Nevada, Reno e pelo NIGMS do Instituto Nacional de saúde, sob número de concessão GM103650 P20.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Video camera to capture larval movement
CCD Camera  Edmund Optics 106215
M52 to M55 Filter Thread Adapter Edmund Optics 59-446
2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses  Edmund Optics 59-445
RG-715, 2" Sq. Longpass Filter Edmund Optics 46-066
Electronics for optogenetic setup
Raspberry Pi 2B RASPBERRY-PI.org RPI2-MODB-V1.2
3 Channel programmable power supply newegg.com 9SIA3C62037092
8 Channel optocoupler relay amazon.com 6454319
630nm Quad-row LED strip lights environmentallights.com red3528-450-reel
850nm LED strips environmentallights.com wp-4000K-CC5050-60x2-kit
Software 
Matlab Mathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04 Nubuntu https://github.com/yslo/nubuntu
Other items
Plexiglass black acrylic Home Depot MC1184848bl
Fly food and other reagents
Nutrifly fly food Genesee Scientific 66-112
Agarose powder Genesee Scientific 20-102
22cm X 22cm square petri-dish VWR Inc. 25382-327
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
All trans-retinal Sigma-Aldrich R2500
Flies
UAS-IVS-CsChrimson  Bloomington Drosophila Stock Center 55134
Orco-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 26818
Or42a-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 9970
Or7a-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 23907

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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