Immunophenotyping के Orthotopic Homograft (Syngeneic) के Murine प्राथमिक KPC अग्नाशय वाहिनीई ग्रंथिकर्कटता द्वारा प्रवाह Cytometry

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

murine orthotopic PDAC homografts के immunophenotyping पर प्रयोगात्मक प्रक्रिया ट्यूमर इंयूनो-microenvironment की रूपरेखा पर करना है । ट्यूमर सर्जरी के जरिए प्रत्यारोपित orthotopically हैं. 200 के ट्यूमर – 600 मिमी आकार में3 काटा और एकल सेल निलंबन तैयार करने के लिए असंबद्ध थे, बहु प्रतिरक्षा मार्कर FACS विश्लेषण द्वारा अलग फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी का उपयोग कर के बाद.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

An, X., Ouyang, X., Zhang, H., Li, T., Huang, Y. y., Li, Z., Zhou, D., Li, Q. X. Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (140), e57460, doi:10.3791/57460 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Homograft (syngeneic) ट्यूमर आज के इंयूनो-ऑन्कोलॉजी (आई. ओ.) के workhorse नैदानिक अनुसंधान कर रहे हैं । ट्यूमर microenvironment (टीएमई), विशेष रूप से अपनी प्रतिरक्षा घटकों, रोग का निदान और उपचार के परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से उन immunotherapy के । टीएमई प्रतिरक्षा-घटक बहु-रंग FACS द्वारा assessable ट्यूमर-घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट से बना रहे हैं. अग्नाशय डक्टर ग्रंथिकर्कटता (PDAC) घातक अच्छे उपचार के विकल्प की कमी द्रोह के बीच है, इस प्रकार एक तत्काल और unmet चिकित्सा की जरूरत है । अपनी गैर विभिंन चिकित्सा के लिए जवाबदेही के लिए एक महत्वपूर्ण कारण (chemo-, लक्षित, मैं/ओ) अपने प्रचुर मात्रा में टीएमई, fibroblasts और ल्यूकोसाइट्स है कि इन उपचारों से ट्यूमर कोशिकाओं की रक्षा से मिलकर किया गया है । Orthotopically प्रत्यारोपित PDAC और अधिक सही पारंपरिक चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) मॉडल की तुलना में मानव अग्नाशय के कैंसर के टीएमई पर कब्जा करने के लिए माना जाता है ।

Homograft ट्यूमर (KPC) का प्रत्यारोपण कर रहे हैं माउस सहज PDAC से उद्भव अनुवांशिक इंजीनियर KPC-चूहों (KrasG12D/+/P५३-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). प्राथमिक ट्यूमर ऊतक छोटे टुकड़ों (~ 2 मिमी3) में कटौती और syngeneic प्राप्तकर्ताओं (C57BL/6, 7-9 सप्ताह पुरानी) के लिए (एससी) चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित है । homografts तो शल्य चिकित्सा orthotopically नए C57BL के अग्ंयाशय पर प्रत्यारोपित किया गया/6 चूहों, साथ अनुसूचित जाति-आरोपण, जो के ट्यूमर मात्रा तक पहुंच 300-1000 मिमी3 द्वारा 17 दिन । केवल 400 के ट्यूमर-600 मिमी3 अनुमोदित शव परीक्षण प्रक्रिया के अनुसार काटा गया और आसंन गैर ट्यूमर ऊतकों को दूर करने के लिए साफ किया । वे एक एकल सेल निलंबन में dissociator ऊतक का उपयोग कर प्रोटोकॉल प्रति असंबद्ध थे, फ्लोरोसेंट के निर्दिष्ट पैनलों के साथ धुंधला-अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिंन मार्करों के लिए लेबल एंटीबॉडी (लसीकावत्, माइलॉयड और NK, dc) के बाद । सना हुआ नमूनों बहु रंग FACS का उपयोग करने के लिए विभिन्न वंश की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया गया, साथ ही ट्यूमर के भीतर अपने रिश्तेदार प्रतिशत. orthotopic ट्यूमर की प्रतिरक्षा प्रोफाइल तो अनुसूचित जाति के ट्यूमर की तुलना में थे । प्रारंभिक डेटा अग्ंयाशय पर ट्यूमर में TILs/TAMs घुसपैठ में काफी ऊंचा प्रदर्शन किया, और एससी ट्यूमर के बजाय orthotopic में उच्च बी-सेल घुसपैठ ।

Introduction

अग्नाशय डक्टर ग्रंथिकर्कटता (PDAC) लगभग साढ़े दस लाख मृत्युदर दुनिया चौड़ा प्रतिवर्ष, शीर्ष 5 कैंसर हत्यारों में से एक का कारण बनता है । वहां कुछ प्रभावी उपचार के विकल्प और कोई अनुमोदित immunotherapies हैं; इसलिए, नए उपचार की सख्त जरूरत है । कैंसर तेजी से आज ज्ञात के रूप में आनुवंशिक रोगों के अलावा, PDAC सहित प्रतिरक्षा रोगों के रूप में मांयता प्राप्त किया जा रहा है । प्रतिरक्षा और आनुवंशिक कारकों की संभावना रोग का निदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपचार परिणामों का निर्धारण करेगा । ट्यूमर मेजबान प्रतिरक्षा निगरानी से बचने और अंततः मौत का कारण अग्रिम । इन प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं के कई ट्यूमर microenvironment के भीतर होते हैं (टीएमई)1,2,3,4 जहां प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के ट्यूमर कोशिकाओं के साथ बातचीत, एक दूसरे के साथ और अन्य ट्यूमर के साथ stromal अवयव, प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से साइटोकिंस जो अंततः रोग के परिणाम का निर्धारण । इसलिए, टीएमई, या ट्यूमर immunophenotyping के ट्यूमर प्रतिरक्षा घटकों के लक्षण वर्णन, उपलेखन सहित, numeration और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न प्रजातियों के स्थानीयकरण, विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. PDAC के मामले में, यह प्रस्तावित किया गया है कि ऊंचा ट्यूमर घुसपैठ दमन मैक्रोफेज (टैम) और बी कोशिकाओं टी सेल घुसपैठ और/या सक्रियण और फाइब्रोसिस5,6के उच्च स्तर की रोकथाम के लिए नेतृत्व किया है ।

प्रतिरक्षा TMEs की जांच करने के लिए आम दृष्टिकोण प्रयोग सरोगेट ट्यूमर नैदानिक पशु मॉडल का उपयोग किया जाएगा, मुख्य रूप से प्रासंगिक माउस ट्यूमर मॉडल7, विशेष रूप से माउस syngeneic (homograft) या आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMM) कैंसर के, माउस और ट्यूमर और प्रतिरक्षा के लिए मानव के ग्रहण समानता पर8,9। यह वास्तविकता में समझा जाता है कि दो प्रजातियों के बीच निहित मतभेद हैं10,11.

प्रत्यारोपित माउस ट्यूमर सहज ट्यूमर7, अर्थात् सिंक्रनाइज़ ट्यूमर विकास, पैतृक GEMM सहज ट्यूमर विकास के विपरीत में महत्वपूर्ण परिचालन लाभ है । सहज murine ट्यूमर के Homografts प्राथमिक इन विट्रो मेंहेरफेर किया गया है कभी नहीं ट्यूमर माना जाता है, और मूल माउस ट्यूमर histo-/molecular पैथोलॉजी7, साथ ही संभव प्रतिरक्षा प्रोफाइल दर्पण । इन murine homografts को प्रायः "रोगी के एक माउस संस्करण-व्युत्पन्न xenografts (PDXs)" माना जाता है. वे इसलिए की संभावना पारंपरिक syngeneic सेल लाइन से एक बेहतर अनुवाद-प्राप्त माउस ट्यूमर12है । विशेष रूप से, कई homografts विशिष्ट GEMM से प्राप्त कर रहे हैं, जहां विशिष्ट मानव रोग तंत्र, उदाहरण के लिए oncogenic चालक उत्परिवर्तनों, इंजीनियर हैं, और इन homografts इसलिए उनके नैदानिक प्रासंगिकता के लिए लाभ होना चाहिए । विशेष रूप से, KPC GEMM 15 के भीतर माउस PDAC का विकास-उंर के 20 सप्ताह है, जो recapitulates अच्छी तरह से मामूली विभेदित predominately वास्तुकला और अत्यधिक समृद्ध ग्रंथियों के साथ मानव रोग आकृति विज्ञान स्ट्रोमा । यह मॉडल भी मानव PDAC की सबसे आम आनुवंशिक सुविधाओं recapitulates, अर्थात् उत्परिवर्तन और P53 नुकसान की-समारोह है, जो ९०% और मानव PDAC के ७५% में होते हैं, क्रमशः5,6सक्रिय Kras ।

प्रत्यारोपण की साइटों को भी मॉडल अनुवाद में एक भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है । इस तरह के एक इसी orthotopic वातावरण के रूप में विशिष्ट आसपास के ऊतकों पर्यावरण, विशिष्ट ट्यूमर के लिए प्रगति के लिए एक जगह हो सकता है, के रूप में आमतौर पर प्रत्यारोपण ट्यूमर के लिए वर्दी चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) वातावरण का विरोध किया । यह विशेष ब्याज की होगी, और/या, क्या अंतर दो प्रत्यारोपण साइटों के बीच मौजूद है, प्रतिरक्षा-microenvironment के मामले में, और मानव कैंसर के लिए प्रासंगिकता, उदा। PDAC के मामले में ।

प्रतिरक्षा रूपरेखा, या immunophenotyping का सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक, ट्यूमर का निर्धारण करने के लिए है, विभिन्न वंश की प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ, संख्या, ट्यूमर के भीतर सापेक्ष प्रतिशत, साथ ही उनके सक्रियण राज्यों, और स्थानों. यह ट्यूमर-infiltratrating lymphoctyes (TILs, दोनों टी और बी-), ट्यूमर घुसपैठ मैक्रोफेज (TAMs), ट्यूमर-प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (NKs) और ट्यूमर-निवासी वृक्ष कोशिकाओं3,13,14 घुसपैठ शामिल , 15 , 16 , 17, और कुछ कोशिकाओं के सेलुलर स्थानीयकरण18,19,20, आदि। प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) या प्रवाह cytometry एक एकल-कक्ष पहचान तकनीक है जो सामान्यतः किसी कक्ष के विशिष्ट पैरामीटर्स को मापने के लिए उपयोग की जाती है. बहु रंग प्रवाह cytometry एक एकल सेल3,4,21 पर कई मार्करों उपाय और संख्या और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट के सापेक्ष प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है, ट्यूमर के भीतर उन सहित ।

इस रिपोर्ट में ट्यूमर घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की रूपरेखा के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है: 1) orthotopic PDAC माउस ट्यूमर homografts के आरोपण, साथ अनुसूचित जाति आरोपण; 2) ट्यूमर ऊतक फसल और ट्यूमर पृथक्करण के माध्यम से एकल सेल तैयारी; 3) एक आधार रेखा के रूप में ट्यूमर से प्राप्त कोशिकाओं के सभी का प्रवाह cytometry विश्लेषण; 4) दोनों ट्रांसप्लांटेशन दृष्टिकोण की आधारभूत प्रोफाइल की तुलना ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रोटोकॉल और संशोधन (ओं) या देखभाल और पशुओं के उपयोग को शामिल प्रक्रियाओं की समीक्षा की जाएगी और क्राउन विज्ञान संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित अध्ययन के संचालन से पहले । जानवरों की देखभाल और उपयोग आमतौर पर AAALAC के अनुसार आयोजित किया जाएगा (आकलन और प्रयोगशाला पशु देखभाल के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन) अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के रूप में देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड में रिपोर्ट, राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद (२०११) । सभी पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं SPF (विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त) सुविधाओं में बाँझ शर्तों के तहत किया जाएगा और देखभाल और विभिन्न सरकारी संस्थानों से प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के साथ सख्त अनुसार आयोजित (उदा. राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान) । प्रोटोकॉल के लिए सुविधा संस्था (जैसे संस्थागत IACUC समिति) में पशु प्रयोगों की नैतिकता पर समिति द्वारा अनुमोदित किए जाने की आवश्यकता होगी.

1. ट्यूमर प्रत्यारोपण के लिए तैयारी

  1. पशु आवास
    1. एक वाणिज्यिक प्रजनन विक्रेता से जेनेरिक C57BL/6 चूहे प्राप्त करें ।
    2. घर चूहों (5) व्यक्तिगत हवादार पिंजरों में निम्नलिखित स्थितियों में: तापमान: 20 – 26 ° c; आर्द्रता 30 – 70%; प्रकाश चक्र: 12 एच प्रकाश और 12 एच डार्क ।
    3. मकई सिल बिस्तर है कि साप्ताहिक बदल जाता है का प्रयोग करें ।
    4. आहार के लिए, पूरे अध्ययन अवधि के दौरान विकिरण निष्फल सूखी दाना भोजन प्रदान करते हैं ।
    5. पानी के लिए, पशुओं को बाँझ पीने के पानी के लिए मुफ्त पहुंच प्रदान करते हैं ।
  2. दाता ट्यूमर टुकड़ा तैयारी
    1. शरीर के वजन की निगरानी द्वारा शुरू (BW), एक संतुलन का उपयोग कर तौल के माध्यम से, और ट्यूमर की मात्रा (टीवी), कैलिपर माप द्वारा, ट्यूमर असर दाता चूहों की.
    2. जब टीवी 500-1200 मिमी3तक पहुंचता है, प्रोटोकॉल के अनुसार एक euthanize के रूप में एक खतरा डाकू में पशु ।
    3. iodophor झाड़ू का उपयोग ट्यूमर के आसपास त्वचा को निष्फल ।
    4. सर्जिकल ट्यूमर (खंड 3 में वर्णित विवरण: Necropsy और ट्यूमर फसल) को हटा दें और पंजाब के 20 मिलीलीटर (पूर्व ठंडा मीडिया या euthanizing जानवरों से पहले 4 ° c करने के लिए बफर) युक्त एक पेट्री डिश में ट्यूमर जगह है ।
    5. अगर वहां रक्त दूषित है, ट्यूमर एक और पेट्री डिश में स्थानांतरण और पंजाब के साथ ट्यूमर धो लो ।
    6. आधे में ट्यूमर काट, किसी भी अतिरिक्त त्वचा को हटाने, जहाजों, पत्थराना और/
    7. ट्यूमर की ही बरकरार टुकड़े चुनें और उन्हें एक बाँझ ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में जगह है और फिर पंजाब के 20 मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक अलग पशु कक्ष के लिए ट्यूब परिवहन औषध विज्ञान अध्ययन.

2. Orthotopic और चमड़े के नीचे (SC) Engraftment

  1. अजा टीका
    1. एक स्केलपेल का उपयोग कर 2 मिमी व्यास टुकड़े में ट्यूमर में कटौती, प्रत्येक trocar में 1 हिस्सा डाल, अनुसूचित जाति आरोपण के लिए या बाद में orthotopic आरोपण के लिए (नीचे देखें).
    2. Anesthetize 5% isoflurane के साथ प्राप्तकर्ता पशु, जो 1% पर एक नाक शंकु द्वारा बनाए रखा है । पशु आराम करने के लिए शुरू हो जाएगा, उनके लेकन पलटा खोने और अंततः मोबाइल बन जाते हैं । संज्ञाहरण के इस गहराई में वे आसानी से दर्दनाक उत्तेजनाओं द्वारा जगी जा सकता है; संज्ञाहरण को गहरा करने की अनुमति दें जब तक दर्द के लिए ऐसी प्रतिक्रियाओं अनुपस्थित रहे हैं ।
    3. एक बार anesthetized, सही पार्श्व स्थिति में एक प्रयोग बोर्ड पर चूहों को ठीक. iodophor झाड़ू का उपयोग कर माउस को निष्फल, विशेष रूप से ट्यूमर आसपास के क्षेत्रों ।
    4. एक स्केलपेल के साथ, बाईं ओर एक ०.५ करने के लिए १.० सेमी त्वचा चीरा बनाने के लिए, सिर्फ कूल्हे को कपाल ।
    5. forelimb की ओर त्वचा के नीचे सुरंग, दो से तीन सेंटीमीटर, कुंद संदंश के साथ ।
    6. Aseptically माध्यम से ट्यूमर के एक घन हस्तांतरण और उपचर्म सुरंग के अंदर गहरी जगह है ।
    7. नेत्रहीन की पुष्टि करें कि ट्यूमर सुरंग में गहरी है (और त्वचा चीरा नहीं) ।
    8. घाव क्लिप के साथ घाव बंद करें ।
    9. मॉनिटर जानवरों के बाद टीका जब तक वे पर्याप्त चेतना पाने के लिए स्टर्नल recumbence बनाए रखने के । वापस पशुओं उनके पिंजरे में केवल संज्ञाहरण से अपनी पूरी वसूली के बाद । संज्ञाहरण लॉग पूरा करें, और पशु स्वास्थ्य चार्ट शुरू करते हैं । तीन दिनों के लिए दैनिक प्राप्तकर्ता जानवरों तौलना
    10. एक मानक प्रक्रिया के लिए, inoculate 5-10 प्रति समूह ट्यूमर वृद्धि की निगरानी के लिए चूहों ।
  2. अग्नाशय orthotopic आरोपण
    1. संज्ञाहरण और Analgesia
      1. एक 2 मिलीलीटर ketamine इंजेक्शन और ०.४२ मिलीलीटर xylazine इंजेक्शन का प्रयोग करें (20 मिलीग्राम/एमएल) 0.06 की एक खुराक मात्रा में ५.९१ बाँझ इंजेक्शन पानी या खारा में मिश्रित – 0.1 ml/
        ध्यान दें: पशु कल्याण के अनुसार, analgesia दोनों पूर्व और बाद आपरेशन आवश्यक है । 0.05 – 0.1 मिलीग्राम buprenorphine/kg, SC. पहली खुराक पूर्व आपरेशन है और फिर लगातार 3 बार हर 4 घंटे बाद आपरेशन खुराक.
    2. orthotopic आरोपण के लिए शल्य चिकित्सा संचालन
      1. इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के माध्यम से Anesthetize चूहों कदम 2.2.1 प्रति (IM) ।
      2. जानवरों को पूरी तरह से anesthetized के बाद, सही पार्श्व स्थिति में एक प्रयोग बोर्ड पर चूहों को ठीक.
      3. चूहों सही पार्श्व स्थिति में रखें । आयोडीन के साथ तिल्ली के आसपास त्वचा को संक्रमित तो de-७५% एथिल शराब के साथ iodinate ।
      4. तिल्ली के मध्यम बिंदु का पता लगाएं और तिल्ली का पर्दाफाश करने के लिए पेट पर एक 1 सेमी ऊर्ध्वाधर चीरा बनाते हैं ।
      5. बाहर की तिल्ली के तहत अग्न्याशय के ऊतकों का एक हिस्सा बाहर ड्रा सपाट टिप चिमटी के साथ धीरे, और टांका माउस के अग्ंयाशय पर बीज माउस से एक माउस homograft ट्यूमर टुकड़ा सीवन 9-0 अवशोषित सर्जिकल सीवन ।
      6. डबल सीवन द्वारा एक 6-0 रेशम सीवन के साथ पेट बंद करो । संपीड़न द्वारा homeostasis प्राप्त करना.
      7. ट्यूमर आरोपण परिष्करण के बाद, अगर न तो खून बह रहा है और न ही ट्यूमर ऊतक रिसाव होता है, एक गर्म पिंजरे में पशुओं रखें ।
      8. पशु निगरानी जब तक यह पर्याप्त चेतना को प्राप्त करने के लिए स्टर्नल recumbency बनाए रखने; संज्ञाहरण से पूरी वसूली के बाद पशु जानवर कमरे में लौटें । तिल्ली के पास पेट टटोलने द्वारा ट्यूमर असर चूहों की निगरानी और बाहर orthotopic ट्यूमर असर चूहों का चयन करें.
  3. ट्यूमर-असर चूहों स्वास्थ्य निगरानी
    1. प्रतिदिन पानी व भोजन की खपत की जांच करें ।
    2. एक ungroom बाल कोट, गांठ, पतली, असामान्य सांस या जलोदर के लिए माउस उपस्थिति की जांच करें ।
    3. टटोलना पेट की जाँच करने के लिए यदि जिगर या तिल्ली पर सहज ट्यूमर हैं.
    4. एक संतुलन का उपयोग कर साप्ताहिक चूहों वजन ।
    5. निम्नलिखित नैदानिक लक्षण के किसी भी मनाया जाता है, तो चूहों नमूना संग्रह और necropsy के लिए बलिदान कर रहे हैं: BW हानि > 20%; बिगड़ा गतिशीलता (खाने या पीने के लिए सक्षम नहीं); महत्वपूर्ण जलोदर और बढ़े हुए पेट के कारण सामान्य रूप से स्थानांतरित करने में असमर्थ; संवेदनाएं में प्रयास ।

3. Necropsy और ट्यूमर फसल

  1. नेत्रहीन निरीक्षण और टटोलने का कार्य समाप्ति से पहले स्पष्ट ट्यूमर की उपस्थिति के लिए ।
  2. समाप्ति के लिए, पहले अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों euthanize, और पेट खुला और नेत्रहीन ट्यूमर के लिए अग्ंयाशय की जांच ।
  3. पोस्ट नश्वर सर्जरी से ट्यूमर कट और ठंडे पंजाबियों के लिए इसे जोड़ने । इस्तेमाल किया जा करने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड की डिलीवरी के लिए एक बंदरगाह के साथ एक विशेष ढक्कन के साथ एक साफ, unchargeed, पारदर्शी इच्छामृत्यु चैंबर में सभी जानवरों प्लेस ।
  4. एक प्रवाह दर है कि पशु को ंयूनतम संकट के साथ तेजी से बेहोशी पैदा पर चैंबर में गैस का निर्वहन । 2 सह के लिए इष्टतम प्रवाह दर 2 के आसपास होना चाहिए-2.5 L/
  5. नेत्रहीन सभी पशुओं पर्याप्त गैस सांद्रता प्राप्त करने और euthanize प्रक्रिया के दौरान चेतना हासिल नहीं है आश्वासन देने के लिए इच्छामृत्यु प्रक्रिया के दौरान प्रत्येक जानवर का पालन करें ।
  6. इस संभावना है कि एक जानवर (यदि apneic लेकिन मृत नहीं) ठीक हो सकता है कम से कम 1 मिनट स्पष्ट नैदानिक मौत के बाद के लिए गैस प्रवाह बनाए रखें ।
  7. आसंन गैर ट्यूमर ऊतकों को हटा दें । जरुर ट्यूमर की फोटो जल्दी की जा सकती है ।
    RPMI-१६४० में ट्यूमर के ऊतकों रखो और पृथक्करण से पहले बर्फ पर रखो ।
    नोट: पशु लावे और सामान को हटाने का इंतजार करने के लिए उपयुक्त फ्रीजर में संग्रहीत हैं ।

4. ट्यूमर ऊतक पृथक्करण और एकल सेल तैयारी

  1. एजेंट तैयारी
    नोट: ट्यूमर पृथक्करण किट एंजाइम डी (lyophilized पाउडर) की 2 शीशियों, एंजाइम आर (lyophilized पाउडर) की 1 शीशी, एंजाइम एक (lyophilized पाउडर) के 1 शीशी और बफर ए के 1 मिलीलीटर शामिल हैं ।
    1. RPMI-१६४० के 3 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक शीशी में lyophilized पाउडर का पुनर्गठन करके एंजाइम डी तैयार करें । दोहराया रुक-गल-चक्र से बचने के लिए एक उचित मात्रा के aliquots तैयार करें ।
    2. RPMI १६४० की २.७ मिलीलीटर के साथ शीशी में lyophilized पाउडर को गठित करके एंजाइम आर तैयार करें । दोहराया रुक-गल-चक्र से बचने के लिए एक उचित मात्रा के aliquots तैयार करें ।
    3. एक किट के साथ आपूर्ति की बफर के 1 मिलीलीटर के साथ शीशी में lyophilized पाउडर को गठित करके एंजाइम ए तैयार करें । भंवर मत करो । दोहराया मुक्त-गल-चक्र से बचने के लिए एक उचित मात्रा के aliquots तैयार करें ।
    4. एंजाइम डी के २.३५ मिलीलीटर RPMI-१६४०, १०० µ एल के एंजाइम का मिश्रण को जोड़कर तैयार, ५० एंजाइम आर के µ एल और प्रत्येक gentleMACS सी ट्यूब में एक एंजाइम के १२.५ µ एल ।
  2. ट्यूमर पृथक्करण
    1. प्रत्येक ट्यूमर के लिए ट्यूमर पाचन मिश्रण के साथ एक सी ट्यूब तैयार, पाचन बफर कमजोर पड़ने और तैयारी के लिए अनुभाग ४.१ का उल्लेख करें ।
    2. ट्यूमर टुकड़ों के लिए 3 मिलीलीटर पाचन बफर का प्रयोग करें < 0.8 g, और यह सुनिश्चित करे की ट्यूमर पूरी तरह से पचता है ।
    3. अध्ययन कोड, ट्यूमर, माउस आईडी, उपचार समूह, और ट्यूमर वजन के साथ लेबल ।
    4. माउस से ट्यूमर ले लीजिए, ठंडे पंजाब में ट्यूमर धोने और ट्यूमर (जैसे रक्त वाहिकाओं, वसा, प्रावरणी, आदि) पर संलग्न ऊतक साफ ।
    5. पाचन मीडिया में एक बाँझ 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुआं में ट्यूमर रखो ।
    6. एक स्केलपेल के साथ बाँझ चिमटी/संदंश और टुकड़ा के साथ जगह में ट्यूमर पकड़ो । ट्यूमर को अच्छी तरह से छोटे टुकड़ों (~ 1 मिमी3) में तोड़ने के लिए पर्याप्त स्लाइस ।
    7. ट्यूमर के टुकड़ों को सी-ट्यूब में वापस रखें और प्लेट धोने के लिए बचे हुए पाचन बफर का इस्तेमाल करें और फिर द्रव को सी-ट्यूब में ट्रांसफर कर दें जो पाचन तक बर्फ पर रखा जाता है ।
    8. हीटर के साथ dissociator पर स्विच करें ।
    9. जगह ट्यूमर पृथक्करण सी-ट्यूबों खाली पदों की आस्तीन में उल्टा और चयनित करने के लिए स्वतंत्र से ट्यूब पदों की स्थिति को समायोजित । कोई पृथक्करण प्रोग्राम (37_c_m_TDK_1) चुनें, जिसके बाद आवश्यक फ़ोल्डर का चयन करें, जहां प्रोग्रांस की सूची प्रदर्शित की गई है ।
    10. कार्यक्रम की समाप्ति के बाद, dissociator से सी ट्यूब ले लो और संक्षेप में स्पिन (३०० एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए नमूना गोली ।
    11. फिर से नमूने निलंबित और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के ऊपर एक सेल छलनी में डाल दिया । सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को धोने बफर के 10 मिलीलीटर के साथ एक एकल सेल निलंबन प्रदान करते हैं ।
    12. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक, supernatant त्यागें और फिर से धोने बफर के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को निलंबित, trypan नीले और/या सेल काउंटर का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं को गिनती और 1 एक्स के लिए सेल concentraton समायोजित 106 ट्यूब या प्रति नमूना कोशिकाओं । सही isotype नियंत्रण एंटीबॉडी शामिल दाग सुनिश्चित करने के लिए विशिष्ट है

5. प्रतिरक्षा पैनल डिजाइन और प्रवाह डेटा अधिग्रहण

  1. पैनल डिजाइन
    1. कृपया 1 तालिकादेखें ।
  2. Immunostaining
    1. एफसी-ब्लॉक नमूना सेल: 1 µ जी के साथ धुंधला बफर के २०० µ एल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित/एमएल एफसी-ब्लॉक, बर्फ या 4 ° c प्रशीतन के लिए अंधेरे में 15 मिनट के लिए पर गर्मी के बाद ।
    2. दाग कोशिकाओं वांछित एंटीबॉडी/प्रतिदीप्ति पैनलों का उपयोग (उदा टी सेल पैनल, मैक्रोफेज पैनल, आदि): एंटीबॉडी एफसी में पतला प्रत्येक नमूने के लिए बफर अवरुद्ध मिश्रण जोड़ने के लिए, अंधेरे में बर्फ पर ंयूनतम 30 मिनट के लिए दाग ।
    3. प्रत्येक ट्यूब के लिए बर्फ ठंडा पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें और फिर से कोशिकाओं को धीरे से निलंबित, 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया । परिणामी supernatant को छोड़ें ।
      1. कोशिकाओं को दो बार धोने के लिए दोहराएँ ।
    4. intracellular मार्करों के लिए दाग यदि आवश्यक हो, 6-10 चरणों का पालन, अंयथा 10 कदम के लिए कूद ।
    5. पुनः निलंबित पल्स भंवर द्वारा सेल गोली और तैयार निर्धारण के २०० µ एल जोड़ने/Permeabilization प्रत्येक नमूने के लिए काम कर समाधान । पल्स भंवर फिर, और फिर 4 ° c रात भर में गर्मी (पसंदीदा) या अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट ।
    6. कोशिकाओं के नीचे स्पिन और supernatant हटा दें ।
    7. 1x Permeabilization बफर के 1 मिलीलीटर (10x Permeabilization बफर से बनाया, आसुत एच2ओ के साथ पतला) के केंद्रापसारक और supernatant की खिचड़ी भाषा के बाद जोड़कर दो बार धो लो ।
    8. 1x Permeabilization बफर में intracellular मार्कर एंटीबॉडी जोड़ें और अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    9. 1x Permeabilization बफर की 1 मिलीलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें । केंद्रापसारक और खिचड़ी भाषा supernatant ।
    10. धुंधला बफर के १५० µ एल में कोशिकाओं resuspend और एक cytometer पर विश्लेषण । निर्धारण और permeabilization प्रक्रिया के कारण सेल की जनसंख्या का FSC (फॉरवर्ड-लाइट स्कैटर)/SSC (sidelight कैटरिंग) का वितरण सजीव कोशिकाओं के लिए अलग होगा. इसलिए गेट व वोल्टेज को संशोधित करने की जरूरत होगी ।
  3. FMO नियंत्रण (प्रतिदीप्ति ऋण एक नियंत्रण)
    नोट: बहु रंग प्रवाह विश्लेषण ट्यूमर घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । इसलिए, किसी दिए गए पैनल में एकाधिक fluorochromes के कारण डेटा के संदर्भ में पहचान करने और gate कक्षों के लिए एक तरीका ढूंढने की आवश्यकता है । FMO (प्रतिदीप्ति ऋण एक) नियंत्रण इस प्रयोजन के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण है ।
    1. इस अंत करने के लिए, FMO नियंत्रण के लिए प्रत्येक समूह में अतिरिक्त चूहों को शामिल करें (Rx प्रति कम 2) और प्रत्येक ऊतक के लिए व्यक्तिगत रूप से प्रक्रिया. पृथक्करण के बाद, पूल ऊतक । उदाहरण के लिए, 4 Rx समूहों के साथ एक अध्ययन में, 8 अतिरिक्त ट्यूमर व्यक्तिगत रूप से संसाधित किया जाना चाहिए और फिर FMOs के लिए एक नमूने में परित.
  4. प्रवाह साधन सेटअप
    1. क्षतिपूर्ति मोती बनाने जबकि मशीन ऊपर वार्मिंग है (कम से 20 मिनट) ।
    2. प्रदर्शन की जांच करने के लिए सीएस और टी मोतियों का प्रयोग करें ।
    3. वोल्टेज और मुआवजा सेटिंग्स: उपयोग UltraComp मोती, भंवर Comp मोतियों अच्छी तरह से पहले का उपयोग करें ।
    4. प्रत्येक fluorochrome-संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए एक अलग 12 x ७५ mm2 नमूना ट्यूब लेबल ।
    5. प्रत्येक ट्यूब के लिए धुंधला बफर के १०० µ एल जोड़ें । प्रत्येक ट्यूब के लिए मोतियों की 1 पूर्ण ड्रॉप (लगभग ६० µ एल) जोड़ें ।
    6. एंटीबॉडी जोड़ें और बिल्कुल नमूना प्रक्रिया के रूप में धुंधला प्रक्रिया प्रदर्शन धारा 4 में कहा गया है ।
    7. धुंधला बफर प्रत्येक के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें, पूरी तरह से फिर से भंवर के माध्यम से मनका छर्रों को निलंबित करने के लिए ।
    8. सेट प्रवाह cytometer PMT वोल्टेज लक्ष्य ऊतक प्रति दिए गए प्रयोग के लिए.
    9. डेटा प्राप्ति के लिए प्रवाह cytometer के माध्यम से भागो, FSC और एसएससी रीडिंग प्रति स्वेटर मनका जनसंख्या पर गेटिंग द्वारा ।
    10. सेट प्रवाह की दर के आसपास 200 – 300 घटनाओं/
    11. किसी दिए गए fluorescein [FITC]-संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए उचित क्षतिपूर्ति निर्धारित करें, एक FL1 बनाम FL2 डॉट प्लॉट का उपयोग करते हैं ।
    12. एक वृत्त का चक्र गेट इतना है कि नकारात्मक मोती कम बाएँ चक्र के भीतर हैं प्लेस और सकारात्मक मोतियों ऊपरी या निचले सही वृत्त का चक्र में हैं । प्रत्येक जनसंख्या के माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) जब तक क्षतिपूर्ति मूल्यों को समायोजित (जैसा कि वृत्त का चक्र आंकड़े विंडो में दिखाया गया है) लगभग बराबर है (FL2 के लिएअर्थात् -% FL1, दोनों मोतियों की FL2 MFI समान होना चाहिए) ।
    13. दोहराएँ कदम 5.4.11 और सभी ट्यूबों के लिए 5.4.12.
    14. वास्तविक दाग नमूने प्राप्त करने के लिए आगे बढ़ें । मुआवजा जादूगर भागो और प्रारूप "तिथि प्रयोग अपने प्रथमाक्षर" के साथ सेटिंग्स को बचाने के ।

6. प्रवाह डेटा विश्लेषण और प्रस्तुति

  1. Flowjo और/या Kaluza द्वारा डेटा का विश्लेषण करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PDAC के Orthotopic आरोपण के परिणामस्वरूप तेजी से ट्यूमर विकास के समान है कि अनुसूचित जाति आरोपण के लिए देखा । दाता ट्यूमर टुकड़े के बाद प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया गया, दोनों चमड़े के नीचे और orthotopically चरणों में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार २.१ और २.२, प्रत्यारोपित KPC homograft ट्यूमर समान तेजी से विकास का प्रदर्शन के रूप में चित्र 1a में दिखाया गया . KPC homograft ट्यूमर अलग समय अंक पर काटा चित्रा 1b में दिखाया गया है और प्रतिनिधि एच एंड ई छवियों चित्रा 1Cदिखाया जाता है । हमारे डेटा अनुसूचित जाति और orthotopic प्रत्यारोपण के समान विकास का प्रदर्शन किया ।

व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं और टीएमई में कोशिकाओं, ट्यूमर सहित प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ, या तो orthotopic या अनुसूचित जाति आरोपण से उद्भव, कुशलतापूर्वक बरामद किया जा सकता है । ट्यूमर काटा और एक वाणिज्यिक dissociator (चित्रा 2a) का उपयोग कर बाद FACS विश्लेषण के लिए एक सेल निलंबन तैयार करने के लिए पचा लिया गया प्रोटोकॉल के अनुसार चरण 4 में वर्णित है । हम आमतौर पर आरोपण के दोनों प्रकार के ट्यूमर के नमूनों से काफी उच्च व्यवहार्य सेल पैदावार प्राप्त (~ ८०% व्यवहार्यता Trypan नीले रंग के आधार पर); प्रतिनिधि FACS भूखंड ट्यूमर से व्यवहार्य कोशिकाओं से पता चलता है, मृत कोशिकाओं से अलग/

ट्यूमर-विभिन्न उपसमुच्चय की प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ दोनों orthotopic और अनुसूचित जाति प्रत्यारोपित ट्यूमर में पहचान की गई है, जबकि उनके प्रोफाइल मतभेद है । एकल सेल निलंबन ४.२ कदम में वर्णित विधि का उपयोग करके ट्यूमर ऊतकों से तैयार FACS विश्लेषण के अधीन थे 1 तालिकामें दिखाया मार्करों के एक 16 रंग पैनल के साथ धुंधला, जो महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में विभिन्न प्रजातियों को शामिल किया गया अच्छी तरह से ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में । गेटिंग रणनीति या प्रतिनिधि प्रवाह भूखंडों के साथ प्रतिरक्षा वंश पदानुक्रम चित्र 3ए में दिखाए जाते हैं । CD45, सभी परिपक्व प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए एक मार्कर, ट्यूमर कोशिकाओं और ट्यूमर घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं भेद के लिए इस्तेमाल किया गया था । सभी प्रतिरक्षा वंश बाद में CD45 से विश्लेषण किया गया+ के रूप में पैनल (तालिका 1) द्वारा प्रदर्शित आबादी ।

इसके अलावा मार्करों, सेल आकार भी टी, बी लिम्फोसाइटों, मैक्रोफेज और MDSCs, आदि सहित सेल उपसमुच्चय, मात्रा के लिए विभिन्न उपआबादी (चित्र बाएँ) अंतर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अग्नाशय के कैंसर के अनुसूचित जाति बनाम orthotopic homografts की प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल तुलना घुसपैठ ट्यूमर । प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ट्यूमर घुसपैठ के कई प्रमुख सबसेट के प्रमुख गणना सेल आबादी 3सी दिखाया जाता है । डेटा स्पष्ट रूप से पता चलता है कि ट्यूमर काफी स्वस्थ चूहों के अग्ंयाशय के साथ तुलना में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ बढ़ गई है । इसके अलावा, ट्यूमर के सबसेट के विभिंन प्रतिशत प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ orthotopic बनाममें पाया गया । अजा homografts, उदा. अनुसूचित जाति की तुलना में orthotopic में काफी अधिक बी-सेल ।

मार्कर प्रतिरक्षा कोशिका जनसंख्या
CD45 कुल ल्यूकोसाइट्स
CD3 कुल T कक्ष
CD4 CD4 + टी सहायक कोशिकाओं
सीडी 8 सीडी 8 + साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं
CD44/CD62L * भोली, स्मृति और प्रभाव टी कोशिकाओं
CD69/CD44/OX40/CD25 * सक्रियण मार्कर
CD4 + CD25 + FoxP3 + विनियामक टी सेल
CD11b + Ly6c/Ly6g जी-MDSC और M-MDSC
CD11b + F4 80/ Macrophages
IA/IE/CD206 M1 और M2 मैक्रोफेज
CD3-CD335 + NK कक्ष
CD3 + CD335 + NKT कक्ष
CD19 बी कोशिकाओं
TNF-a/IFN-r/il-7/il-3 आदि* साइटोकिन्स
पीडी-1/pd-L1/CTLA-4/टिम-3 आदि* चेकपॉइंट अवरोधकों
Granzym ख आहद* सामांयतः अनुरोधित मार्करों
KI67/बीआरडी उ/PNCA आदि प्रसार
जीवित/मृत (fixable) जीवित/
* नोट: आगे मार्करों आवश्यकतानुसार जोड़ा जा सकता है

तालिका 1:16-ट्यूमर घुसपैठ माउस प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए डिजाइन रंग का प्रवाह पैनलों ।

Figure 1
चित्रा 1: दोनों orthotopic और अनुसूचित जाति (subQ) C57BL में PDAC homograft ट्यूमर प्रत्यारोपित/6 चूहों के साथ या gemcitabine उपचार के बिना इसी तरह की वृद्धि का प्रदर्शन किया । () वृद्धि वक्र: अनुसूचित जाति-वाम, और orthotopic-सही । नीला: वाहन; गोल्ड: Gemcitabine (10 दिन के बाद शुरू टीका जब औसत अनुसूचित जाति के ट्यूमर की मात्रा २०० mm3) तक पहुंच गया । () विभिन्न समय बिंदुओं पर ट्यूमर के ऊतकों । () homografts के दोनों प्रकारों के प्रतिनिधि एच एंड ई धुंधलान (४० एक्स १०). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ट्यूमर ऊतक पृथक्करण व्यवहार्य एकल सेल निलंबन तैयार करने के लिए । () असंबद्धता का उपयोग; () व्यवहार्य कोशिकाओं, मृत कोशिकाओं से अलग, के रूप में प्रवाह विश्लेषण द्वारा दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ट्यूमर-दोनों orthotopic और अनुसूचित जाति PDAC homografts की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ की बहु रंग प्रवाह विश्लेषण । प्रत्येक ट्यूमर के नमूने से कच्चे डेटा प्रवाह cytometry साधन, Flowjo FACS विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण के बाद से प्राप्त कर रहे थे । () विश्लेषण के लिए मानक गेटिंग कार्यनीति, एक उदाहरण के रूप में प्रदर्शित की गई है; () मानक गेटिंग कार्यनीति का उपयोग करते हुए प्रतिनिधि प्रवाह गेटिंग और विश्लेषण डेटा; () प्रतिनिधि ट्यूमर-घुसपैठ प्रतिरक्षा cellsare बी कोशिकाओं, Treg और मैक्रोफेज शामिल करने के लिए प्रदर्शित किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हालांकि अनुसूचित जाति ट्यूमर का उपयोग कर अध्ययन अधिक आसानी से आयोजित कर रहे हैं, orthotopically प्रत्यारोपित ट्यूमर मॉडल संभावित नैदानिक औषध विज्ञान अध्ययन के लिए अधिक प्रासंगिक हो सकता है (विशेष रूप से मैं/ इस रिपोर्ट में रुचि पाठकों/दर्शकों की मदद करने के लिए सीधे तकनीकी प्रक्रियाओं है कि उनके संबंधित अनुसंधान में इस्तेमाल किया जा सकता है कल्पना करने में सक्षम हो । हमारे प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है कि PDAC के orthotopic आरोपण कुशल ट्यूमर विकास, अनुसूचित जाति आरोपण के समान में परिणाम कर सकते हैं । हमारी टिप्पणियों के विभिंन प्रत्यारोपण से TMEs के विभिंन प्रतिरक्षा प्रोफाइल की उपस्थिति का सुझाव भी लगता है । प्रमुख चुनौतियों orthotopic अनुकूलन करने के लिए, के रूप में अनुसूचित जाति के आरोपण की तुलना में, कर रहे है कि जटिल कौशल की आवश्यकता है, प्रक्रिया समय लगता है, आरोपण के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं है और भी orthotopic ट्यूमर की निगरानी में कठिनाई जीवन में वृद्धि ।

यह सुनिश्चित करने के लिए चार महत्वपूर्ण कदम हैं कि orthotopic अग्नाशय के ट्यूमर प्रयोगों सफलतापूर्वक प्रदर्शन कर रहे हैं: 1) प्रत्यारोपण के सर्जिकल प्रक्रिया; 2) ट्यूमर के विकास के लिए सावधान और समय पर निगरानी; 3) पूर्व प्रयोग प्रदर्शन के महत्व प्रक्रिया के साथ परिचित और दर और ट्यूमर वृद्धि दर का आकलन करने के लिए पहले परीक्षण; 4) एक वैकल्पिक engraftment विधि के रूप में असंबद्ध ट्यूमर के एकल सेल निलंबन का उपयोग करना । इस रिपोर्ट प्रक्रिया इस विशिष्ट homograft, साथ ही अंय अग्नाशय orthotopic मॉडल का उपयोग कर अनुसंधान प्रदर्शन के लिए पाठकों के लिए उपयोगी है, और यहां तक कि अंय orthotopic मॉडल पेट खोलने सर्जरी शामिल ।

प्रवाह cytometry या FACS वर्तमान में immunoprofiling प्रदर्शन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण उपकरण है । FACS द्वारा ट्यूमर का Immunophenotyping विभिन्न अंगों से कोशिकाओं की है कि से अलग है, इस तरह के परिधीय रक्त, तिल्ली, लिम्फ नोड और निम्न तरीकों से अस्थि मज्जा के रूप में. आम तौर पर, वहाँ प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक बहुत छोटा प्रतिशत ट्यूमर में मौजूद है (छोटे नमूना आकार). ट्यूमर के चरम विविधता और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की छोटी संख्या में मौजूद व्यवहार्य दुर्लभ प्रतिरक्षा कोशिकाओं को तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण ठीक कर, कस्टम विकसित ट्यूमर ऊतक पृथक्करण मशीनों को शामिल करने की आवश्यकता है । दोनों पिछले अंक बहु रंग प्रवाह cytometry आवश्यक का उपयोग कर एक साथ बहु-पैरामीटर माप बनाते हैं । बहु रंग प्रवाह जटिल मार्कर पैनल डिजाइन, मुआवजा, और गेटिंग रणनीतियों, प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय ओवरलैप के कारण की आवश्यकता है । इस रिपोर्ट में भी दिलचस्पी पाठकों के लिए प्रदर्शित करने का प्रयास/परिभाषित ट्यूमर ऊतक पृथक्करण और बहु रंग प्रवाह cytometry विश्लेषण के माध्यम से ट्यूमर प्रतिरक्षा रूपरेखा की प्रक्रिया ।

तीन महत्वपूर्ण कदम विशेष रूप से उत्पादक तिल विश्लेषण उपज महत्वपूर्ण हो सकता है: पहला, व्यवहार्य कोशिकाओं की एक उच्च उपज अनुकूलित ट्यूमर पृथक्करण प्रक्रियाओं का उपयोग कर असंबद्ध ट्यूमर से बरामद; दूसरा, उपलब्ध एजेंट के आधार पर बड़े बहु रंग धुंधला पैनलों के अनुकूलित डिजाइन; तीसरा, विश्लेषण में एक अनुकूलित गेटिंग रणनीति । लेखक दोनों डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के ऑपरेटरों के प्रशिक्षण और अनुभव पर जोर देना चाहते है तिल के सफल प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

सभी लेखकों के वर्तमान पूर्णकालिक कर्मचारियों क्राउन विज्ञान, Inc के हैं

Acknowledgments

लेखक Dr. जोड़ी Barbeau शुक्रिया अदा करना चाहूंगा-महत्वपूर्ण पढ़ने और पांडुलिपि के संपादन के लिए, और कलाकृतियों को डिजाइन करने के लिए राल्फ मैनुअल धंयवाद । लेखक भी अपने महान तकनीकी प्रयासों के लिए, Vivo टीम में क्राउन विज्ञान ऑन्कोलॉजी इंयूनो-ऑन्कोलॉजी के मार्कर टीम और कैंसर विज्ञान का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia machine \ SAS3119 \
Trocar 20 \ \ 2 mm
Petri dish \ \ 20 mm
100x antibiotic and antimycotic \ \ \
Iodophor swabs \ \ Daily pharmacy purchase
Alcohol swabs \ \ Daily pharmacy purchase
Liquid nitrogen Air chemical \ \
Biosafety hood AIRTECH BSC-1300IIA2 \
FACS machine LSRFortessa X-20 BD LSR Fortessa \
antibodies BD \ \
Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration BD 354248 \
FACS buffers BD 554656 Mincing buffer
Brilliant Staining Buffer BD 563794 \
Mouse BD Fc Block BD 553142 \
cell filters BD-Falcon 352350 70 µm
routine blood tube BD-Vacutainer 365974 2 mL
Kaluza Beckman vs 1.5
6-well plates Corning 3516 \
Foxp3 Fix/Perm kit ebioscience 00-5523-00 \
UltraComp eBeads ebioscience 01-2222-42 \
Centrifuge eppendorf 5810R,5920R \
FlowJo software FlowJo LLC \ vs 10.0
PBS Hyclone SH30256.01 50 mL
RPMI 1640 Hyclone SH30809.01 \
Disposable, sterile scalpels Jin zhong J12100 11#
knife handle Jin zhong J11010 \
eye scissors and tweezers Jin zhong Y00030 Eye scissors 10 cm
eye scissors and tweezers Jin zhong JD1060 Eye tweezers 10 cm with teeth
Portable liquid nitrogen tank Jinfeng YDS-175-216 \
Electronic balance Metter Toledo AL204 0-100 g
Miltenyi C-tubes Miltenyi 130-096-334 \
Miltenyi Gentle MACS with heater blocks Miltenyi 120-018-306 \
Tumor Dissociation Kit Miltenyi 130-096-730 \
Cell counter Nexcelom Cellometer Cellometer Auto T4
cryopreservation tube Nunc 375418 1.8 mL
Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME PathClear 3442-005-01 \
syringes Shanghai MIWA medical industry \ 1-5 mL
Studylog software Studylog \ software
Studylog-Balance and supporting USB OHAUS SE601F Balance and supporting USB
Studylog-Data line of vernier calipers Sylvac 926.6721 Data line of vernier calipers
Caliper Sylvac 910.1502.10 Sylvac S-Cal pro
Sterilized centrifuge tubes Thermo 339653 50 mL
Sterilized centrifuge tubes Thermo 339651 15 mL
Ice bucket Thermo KLCS-288 4 °C
Ice bucket Thermo PLF-276 -20 °C
Ice bucket Thermo DW-862626 -80 °C
RNAlater Thermo am7021 \

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169, (4), 736-749 (2017).
  2. Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
  3. Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5, (1), 29-41 (2017).
  4. Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17, (8), e1316 (2016).
  5. Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22, (8), 851-860 (2016).
  6. Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6, (3), 270-285 (2016).
  7. Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
  8. Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112, (4), 1167-1172 (2015).
  9. Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26, (6), 674-677 (2007).
  10. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172, (5), 2731-2738 (2004).
  11. von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202, (9), 1159-1162 (2005).
  12. Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170, (3), 793-804 (2007).
  13. Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72, (5), 1070-1080 (2012).
  14. Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117, (18), 4836-4843 (2011).
  15. Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29, (10), 2110-2113 (2015).
  16. Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91, (1), 167-181 (2012).
  17. Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169, (4), 750-765 (2017).
  18. Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3, (12), 1308-1315 (2015).
  19. Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22, (4), 726-733 (2017).
  20. Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. (2016).
  21. Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4, (3), 194-203 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics