Cancer Research
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同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療
Chapters
Summary October 9th, 2018
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実験マウスの同所性同種 PDAC 移植の診療には、腫瘍免疫微小環境のプロファイリングを目指しています。腫瘍は、手術を介して注入したがんです。200-600 mm3の大きさの腫瘍は、収穫され、異なる蛍光標識抗体を用いて免疫マルチ マーカー FACS 解析に続いて単一細胞懸濁液を準備する解離。
Transcript
このメッセージは、さまざまな免疫系統や老化戦略を特定するために使用されるマーカーなど、マウスモデルにおける免疫フェノタイピングの主要な質問に答える上で役立ちます。この技術の主な利点は、マーカーおよびエージングステートギーが、免疫平型化時に、様々なマウスモデルに適用できることである。バランスを使用してC57ブラック6マウスの体重を監視します。
また、腫瘍変化ドナーマウスの腫瘍体積を口径測定により監視する。バイオハザードフード内の動物の安楽死に続いて、プロトコルごとに、イオドファー綿棒を使用して腫瘍の周りの皮膚を殺菌する。テキストプロトコルに詳述されているように腫瘍を外科的に除去した後、4°Cに予冷したPBSの20ミリリットルを含むシャーレに腫瘍を入れる。
血液を汚染している場合は、腫瘍を別のペトリ皿に移し、PBSで腫瘍を洗浄します。腫瘍を半分に切る。余分な皮膚、血管、石灰化、壊死を取り除きます。
腫瘍の無傷の部分のみを選択し、無菌50ミリリットル遠心管に入れます。薬理学の研究のために別の動物室にチューブを輸送する前にPBSの20ミリリットルを追加します。正交性移植の準備をするために、右横方向の位置にある実験板の上に完全に麻酔マウスを固定する。
脾臓の周りの皮膚をイドジンで消毒し、75%エチルアルコールで脱イオジネートします。脾臓の中央値点を見つけ、腹部に1センチメートルの垂直切開を行い、脾臓を露出させる。平らな先端ピンセットを使用して脾臓の下に膵臓組織の一部を優しく引き出す。
そして、Cマウスから9-O bsorbable外科縫合によりレシピエントマウスの膵臓に生後マウスのホモグラフト腫瘍片を有する。6-Oシルク縫合糸で腹部を二重縫い目で閉じます。圧縮によって恒常性を達成する。
腫瘍移植を終了した後、出血または腫瘍組織漏れが起こらない限り、動物を暖かいケージに入れておく。彼らは胸骨の不用さを維持するために十分な意識を取り戻すまで、動物を監視します。麻酔から完全に回復した後、動物室に動物を戻します。
脾臓付近の腹部を触診して腫瘍変化マウスを監視し、直交性腫瘍を持つマウスを選択します。腫瘍ごとに、腫瘍消化バッファーを備えた1つのCチューブを準備します。腫瘍が完全に消化されるように、0.8グラム未満の腫瘍断片に対して3ミリリットルの消化バッファーを使用する。
研究コード、腫瘍、マウスID、治療群、および腫瘍重量で腫瘍にラベルを付けます。マウスから腫瘍を収集します。腫瘍を冷たいPBSで洗い、腫瘍に付着した組織をきれいにしてください。
消化培地に腫瘍を無菌の6ウェルプレートの1つの井戸に入れる。無菌ピンセットまたは鉗子で腫瘍を所定の位置に保持し、メスでスライスします。腫瘍を十分にスライスして小さくします。
次に、腫瘍片をCチューブに戻し、残りの消化バッファーを使用してプレートを洗浄します。液体をCチューブに移し、消化するまで氷の上に置きます。次に、ディソシエタとヒーターのスイッチを入れ。
腫瘍解離Cチューブを空き位置のスリーブに逆さまに置きます。チューブの位置のステータスを[フリー]から[選択済み]に調整します。プログラムの一覧が表示される必要なフォルダの選択に従って、解除プログラムを選択します。
プログラム終了後、Cチューブを解離器から取り出し、サンプルをパレットに短時間回転させます。サンプルを再中断し、50ミリリットルチューブの上の細胞ストレーナーに入れます。10ミリリットルの洗浄バッファーで細胞ストレーナーを通して細胞を洗浄し、単一の細胞懸濁液を提供します。
300Gで5分間遠心管を閉心した後、上清を捨て、5ミリリットルの洗浄バッファーで細胞を再懸濁する。生存細胞を数え、チューブあたりまたはサンプル当たり100万個の細胞に細胞濃度を調整します。免疫パネル設計、免疫染色および蛍光からテキストプロトコルの詳細として1つのコントロールを引いたものを実行します。
流れ器が使用する前にそれらを徹底的に渦巻くことによってウォーミングアップしている間、UltraCompビーズを準備してください。フルオロクローム共役抗体ごとに、12 x 75ミリメートルのサンプルチューブにラベルを付けます。各チューブに100マイクロリットルの染色バッファーを追加し、ビーズの1つのフルドロップを続けます。
抗体を追加し、テキストプロトコルに記載されているように染色手順を実行します。その後、各ビーズペレットに0.5ミリリットルの染色バッファーを加え、渦を介して完全に再中断します。ここで、所定の実験に対して、目標組織あたりのフローサイトメトリーPMT電圧を設定します。
前方散乱および側面散乱の測定値ごとにシングルビーズの個体数を得ることによってデータ取得のためのフローサイトメトリーを通してサンプルを通してサンプルを実行します。流量を毎秒 200 ~ 300 イベントに設定します。FL1対FL1ドットプロットを用いて、所定のフルオレセインFITC結合抗体に対して適切な補償を設定します。
負のビーズが左下の象限内に、正のビーズが右上または右下の象限内になるように、四半角ゲートを配置します。各集団の中央値フルオレセイン強度がほぼ等しくなるまで補償値を調整します。すべてのチューブに対して、これらの手順を繰り返します。
次に、実際の染色サンプルの取得に進みます。補正ウィザードを実行し、日付、実験、およびイニシャルの形式で設定を保存します。膵管腺癌の異形性移植は、皮下移植に見られるものと同様の急速な腫瘍増殖をもたらした。
代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色画像が示され、皮下および異形性移植器の同様の成長を示す。適度に高い生存細胞収率は、両方のタイプの移植の腫瘍試料から得られた。代表的なFACSスプラットは、死細胞および細胞破片から分離された腫瘍から生存可能な細胞を示す。
ここに示す、腫瘍免疫細胞のいくつかの主要なサブセットの主要な分子細胞集団の免疫プロファイルの比較を浸潤する腫瘍である。膵臓癌の皮下対交方同種の同種移植が示されている。このデータは、腫瘍が健康なマウスの膵臓と比較して免疫細胞浸潤を有意に増加させたことを明らかに示している。
さらに、異なる割合の腫瘍浸潤免疫細胞サブセットが、異なった割合で、異なった異形と皮下の同種移植片で発見された。例えば、異方性のB細胞は皮下よりも有意に多い。この手順を試みている間、すべての関連する材料および試薬を事前に準備することを忘れないでください。
このビデオを見た後、マウス モデルの FACS 解析を実行する方法についてよく理解する必要があります。
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