회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

Genetics

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Summary

포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 표본 인간의 질병의 분자 biomarkers의 귀중 한 소스를 나타냅니다. 여기 우리는 실험실 기반 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜, 처음 신선한 냉동된 RNA로 설계 하 고 최적화 된 조직에서 보관 된 microRNAs 분석 저장 최대 35 년 제시.

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Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

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Abstract

-보관, 임상 분류 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 암 개발의 회고전 분자 연구에 대 한 핵 산을 제공할 수 있습니다. 사용 하 여 나중에 침략 적인 질병을 개발 하는 환자에서 비 침 습 또는 미리 악성 병 변, 진 식 분석 암 위험을 predispose 초기 분자 변경 식별 도움이 됩니다. 그것은 음 핵 산 FFPE 직물에서 발견 한 심각한 물리적 손상과 그들의 분석을 어렵게 하 고 일반적으로 적응된 분석 실험을 요구 한다 화학 수정 받은 설명 하고있다. 그러나 MicroRNAs (miRNAs),, 소규모 클래스를 대표 하는 RNA 분자 ~ 18-24만 까지의 스패닝의 뉴클레오티드, 장기 저장을 견딜 하는 FFPE 샘플에서 성공적으로 분석 된 표시 되었습니다. 여기에서 우리는 3' 바코드 보완 DNA (cDNA) 라이브러리 준비 프로토콜 때 보관 사용 하 여 강력 하 고 매우 재현 될 최근 시연 했다 보관 된 조직에서 추출 하는 작은 RNAs의 분석을 위해 특별히 최적화 된 선물 임상 표본 최대 35 년 저장입니다. 이 라이브러리 준비는 소재의 손상/저하 (최대 18) RNA 샘플 개별 3' 바코드 어댑터와 출혈 하 고 후속 효소 및 생 화 확 적인 준비에 대 한 다음 함께 풀링된 다중 분석을 잘 적응 이전에 분석. 모든 담긴 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지), 크기 관련 선택 및 바코드 작은 RNA 종의 풍부는에 의해 수행 됩니다. 이 cDNA 라이브러리 준비는 파일럿 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 차세대 시퀀싱 (NGS)에 대 한 자료의 최적의 금액을 생산 하는 특정 증폭 주기의 결정 수 분 RNA 입력에 잘 적응. 이 이렇게 최대 35 년 동안 보관 하는 표본에서 저하 FFPE RNA의 사용을 위해 최적화 되었다 고 매우 재현 NGS 데이터를 제공 합니다.

Introduction

miRNAs는 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 표본1,2,3에 너무나 잘 보존 된다. 이러한 짧은 규제 비 코딩 단일 좌초 RNA 분자의 표현을 FFPE 샘플에서 총 RNA를 사용 하 여 성공적으로 평가할 수 있다 고 관련 유전자 표현 데이터 원본 신선한에 비해 제공 이전 작품 시연 하고있다 조직4,,56,7,8. 비판적으로 FFPE 조직 처리 (포름알데히드, 열, 건조, ), 내 생 RNases miRNAs (~ 18-24의 작은 크기는 견본의 나이 의해 영향을 받을 수 표시 된 큰 크기 메신저 RNAs에 비교 될 때 뉴클레오티드) 저하 방지 및 장기 저장, 보관 된 표본9의 높은 처리량 mRNA 연구를 능가할 미르 식 연구를 통해 증명 또한 탄력 있도록 나타납니다. miRNA 식 연구 주로 소규모 분석에서 수행 되었습니다, 보관 된 임상 견본을 사용 하 여 해당 단일 증명 또는 다중화 정량 PCR 분석 실험, microarray 기술, 그리고 가장 최근 NGS의 종류 수 있습니다. 이 분석 실험10,,1112,,1314의 최적화 후 보존 된 miRNAs의 식을 평가 하기 위해 사용.

그것은 명백한 되고있다 dysregulation 미르 식의 다양 한 인간 악성의 개발과 관련 된 되었습니다 하 고 보관 된 표본 주석는 잠재적으로 거 대 한 공급의 임상,을이 작은 RNA 분자는 잠재적인 암 바이오 마커의15,16,,1718의 유망한 소스를 나타냅니다. NGS 같은 높은 처리량 유전자 표현 기술의 사용 PCR 그리고/또한 microarrays19등 대상된 기술에 비교 될 때 모든 miRNA 성적표의 글로벌 평가 제공의 이점이 있다. 이러한 이유로, NGS 위한 이전 보관 된 표본에서 작은 RNAs의 cDNA 라이브러리 준비를 위한 최적화 된, 저렴 한 가격, 그리고 쉽게 적용 가능한 프로토콜 대규모 회고전 연구20수 있도록 최적화 되었다.

우리는 이전 우리 현대 상업 키트21을 능가할 수 있는 오래 된 보관 된 표본에서 RNA와 DNA의 별도 복구에 대 한 동시 RNA/DNA 추출 프로토콜을 설립. 시간의 연장된 기간 동안 보관 하는 FFPE 직물에서 총 RNA를이 추출 프로토콜을 사용 하 여, 우리 최대 35 년 동안 임상 표본에서 보존 하는 miRNAs의 NGS 위한 cDNA 라이브러리의 준비를 최적화. 또한, 최근에 출판 된 연구에서 우리가 어디에서 임상 분류 ductal 암에 제자리에 cDNA 라이브러리 (DCIS) 표본 준비, 우리는 표시 된 정량 PCR에 의해 검증 된 차동 표현 된 miRNAs 확인 그 특정 miRNA 표정 변화 DCIS 유방암을 개발 하지 않는 환자에서 DCIS 장애에 비해 유방암에 걸린 환자에서 병 변에서 감지 될 수 있습니다.

고려 상업 키트 작은 RNA cDNA 라이브러리의 준비를 위해, 그들의 중지에 대 한 잠재력의 비용으로 최적화할 수 없습니다 저작권/특허 보호 시 약의 사용, 우리는 이전 게시 된 적응 하기로 실험실 및 키트 무료 3' 바코드 cDNA 라이브러리 준비 위한 프로토콜 FFPE 표본에서 보관 하는 작은 RNAs의 NGS,22를샘플링 18의 동시 분석을 허용 합니다. 이 프로토콜 FFPE RNA 견본에 적응에 대 한 중요 했다, 시각 및 기술 평가 검문소와 이상적이 고 강력한 단계별 절차를 제공 하 고 손상 된 또는 어려운 다른 소스를 응용 프로그램에 대 한 강한 잠재력을가지고 이용 하 여 RNA 소재. 원래 프로토콜의 적용 형광 (예를 들어, SYBR 골드)와 방사성 레이블된 크기 마커를 대체 하 여 향상 되었습니다 감지 RNA 크기 마커 큰 polyacrylamide 젤에 합자 라이브러리의 선택 사용. 3' 18 개별 FFPE RNA 견본을에 바코드 어댑터의 결 찰 의존이 최적화 된 프로토콜 다음 5' 어댑터 결 찰을 함께 풀링된 리버스-전사, 그리고 파일럿 PCR 분석에 대 한 맞춤형 최종 cDNA의 증폭 높은 처리량 시퀀서에 대규모 PCR 증폭, 정화, 그리고 NGS 이전 도서관.

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Protocol

1입니다. 모든 시 약 및 뇌관의 준비

  1. 그림 1에 설명 된 대로 모든 뇌관 및 어댑터를 주문.
  2. 준비는 교정기 칵테일 주식 각 개별 결 찰에 아군 것입니다.
    1. RNase 무료 물 0.5 µ m 캐리어 oligonucleotide (그림 1) resuspend 0.5 µ M 캐리어 oligonucleotide 솔루션을 사용 하 여 100 µ m 10 교정기 oligonucleotides (그림 1) resuspend
    2. 100 µ M 칵테일 교정기 재고를 시 microcentrifuge에서 10 교정기의 각각의 10 µ L를 결합 하 고-20 ° c.에 저장할 0.026 nM 솔루션 준비
  3. 20 고유, 동결 건조 된, adenylated 3' 어댑터 50 µ M (그림 1)의 최종 농도에 RNase 무료 물과 함께 희석.
    참고: 그것은 개별 시 튜브에 각 어댑터에서 2.5 µ L aliquots를 준비 하 고 2 년까지-80 ° C에서 그들을 저장 하 고 좋습니다.
  4. Resuspend desalted 19 nt-3' 어댑터와 24 nt-3' 어댑터 크기 마커 oligonucleotides 250 ng/ml (그림 1).
  5. RNAse 무료 물으로 100 µ m HPLC 정제 5' 어댑터 resuspend 100 5'과 3' PCR 뇌관 resuspend µ M RNase 무료 물 (그림 1)를 사용 하 여.
    참고: 약 수 1-2 실험 및-80 ° c.에가 게에 필요한 금액에 모든 oligonucleotides
  6. Polyacrylamide (PAA) 젤 1% 98.8 %formamide 결합 하 여 염료를 로드 (v/v) 0.5 M 나2H2 EDTA, pH 8.0 및 0.2 %bromophenol 파랑, 변성 시키기를 준비 하 고 1 mL aliquots-80 ° c.에 설정
    1. 2H2 EDTA 분말의 18.6 g nuclease 무료 물 50 mL에 추가 하 여 0.5 M 나2H2 EDTA 솔루션을 준비 합니다. PH 8.0에 도달 NaOH 펠 릿을 추가 합니다. 0.5 M 나2H2 EDTA, pH 8.0 재고 솔루션을 얻을 수 100 mL를 볼륨을 조정 합니다.
    2. Bromophenol는 별도 15 mL 튜브에 파란색의 15 밀리 그램 무게. Nuclease 무료 물 600 µ L를 추가 합니다. 드 이온된 formamide의 14.25 mL를 추가 합니다. 0.5 M 나2H2 EDTA, pH 8.0 솔루션의 150 µ L를 추가 합니다.
    3. 약 수 1 mL aliquots-80 ° c.에 15 mL의 PAA 최종 솔루션
  7. Agarose 젤 0.2 %bromophenol 파랑, 0.2% 자일 렌 cyanol FF, 50 m 나2H2 m EDTA, pH 8.0, 및 20%를 결합 하 여 염료를 로드 x 5를 준비 Ficoll 유형-400.
    1. 2H2의 1.86 g resuspend-실 온 (RT)에서 자력에 400 mL 비 커에 nuclease 무료 물 50 mL에 EDTA. PH 8.0 도달 NaOH 펠 릿을 추가 합니다. 50mm 나2H2 EDTA 솔루션을 얻을 수 100 mL에 도달 nuclease 무료 물을 추가 합니다.
    2. 50mm 나2H2 EDTA의 5 mL에 resuspend 그리고 bromophenol 블루 가루 20 mg, 20mg 자일 렌 cyanol FF 분말, 및 Ficoll 유형 400 가루 2 g 무게.
    3. 와 3을 포함 하는 관 동 염료 고 50mm 나2H2 EDTA의 5 mL를 추가 합니다. 5 x agarose 젤 로드 염료를 혼합 하 고, 1 mL aliquots, 준비 하 고-80 ° c.에 저장

2.에 3' 바코드 어댑터 Ligations 18 개별 RNA 샘플 설정

  1. 18 개별 RNA 표본을 식별 (pre-100 aliquoted nuclease 무료 물 1.5 mL 시 microcentrifuge 튜브에 9.5 µ L에서 ng), 10 분 녹을 얼음에 튜브를 설정.
  2. (ATP) 없이 RNA 리가 버퍼 신선한 x 10을 준비 합니다.
    1. 1.5 mL 시 microcentrifuge 튜브에 RNase 무료 물 343 µ L, 500 µ L 트리 1 M pH 7.5, 1 M MgCl2, 20 mg/mL 소 혈 청 알 부 민의 50 µ L의 14 M 2-mercaptoethanol 7 µ L의 100 µ L의 결합. 튜브, 2 원심 분리기를 터치 하 여 믹스 g와 RT, 그리고 설정된에서 얼음 x 2000에서 s.
      참고: 모든 단계에이 프로토콜을 나타내는 "원심 분리기 2 s" 튜브의 하단에 솔루션을 수집 RT 2000 x g의 최고 속도에서 벤치탑 microcentrifuge에서 수행 됩니다.
  3. 2 mL 시 microcentrifuge 관에서 DMSO의 1 mL에 물 RNase 무료의 1 mL을 추가 하 여 50% 수성 DMSO 주식을 준비 하 고, 알루미늄 호 일에 튜브를 포장 하 고 실시간 저장
  4. 1.5 mL 시 microcentrifuge 관에서 다음 순서로 결합 하 여 10 분 준비 결 찰 마스터 믹스에 대 한 얼음에 0.026 nM 캘 리브레이 터 칵테일을 없애다: RNA 리가 버퍼와 200 mL 피 펫을 사용 하 여 50% 수성 DMSO의 120 µ L 10의 40 µ L 10 µ L 피 펫을 사용 하 여 칵테일 0.026 nM 교정기의 10 µ L을 추가 하 고. 터치 믹스 2 s, 및 설정에 대 한 원심을 1.5 mL 튜브 얼음에 그것.
  5. 부드럽게 터치 튜브, 2 s, 그리고 얼음에 저장소에 대 한 원심 분리기, 18 개별적으로 aliquoted FFPE RNA 샘플의 각각 결 찰 마스터 믹스 8.5 µ L를 추가 합니다.
  6. 18, 3' 바코드 어댑터의 각 2.5 µ L aliquots를 녹 인 다 고 20 분 녹을 얼음에 넣어.
    1. 3 µ L 피 펫을 사용 하 여 각 어댑터의 1 µ L RNA 및 결 찰 마스터 믹스 (, 9.5 µ L + 8.5 µ L) 포함 된 해당 FFPE RNA 샘플을 전송.
    2. 하지를 위아래로 플라스틱, 단순히 액체에 분배 하 고 팁을 꺼내. 팁 FFPE RNA 샘플 사이 변경할 수 있는지 확인 합니다. 각 튜브를 닫습니다, 터치 믹스, 하 원심 분리기 2 s, 그리고 얼음에 설정된에 대 한.
  7. 1 분 동안 90 ° C에서 열 블록에 18 튜브를 배치 하 여 반응을 변성 하 고 즉시 얼음에 놓습니다.
  8. 준비 결 찰 효소 솔루션 diluting 10 µ L 잘린 K227Q T4 RNA 리가 2의 RNase 무료의 10 µ L로 하 여 물 시 신선한 1.5 mL microcentrifuge 튜브로.
  9. 3 µ L 피 펫을 사용 하 여 각 18 RNA 샘플의 희석된 결 찰 효소의 1 µ L를 전송 (아래로, 플라스틱 없고 각 튜브 사이의 팁을 변경). 얼음에 18 ligations를 설정 하 고 4 ° C 18 h의 야간 보육에 대 한 차가운 공간에 둡니다.

3입니다. 합자 작은 RNAs의 정화

  1. 90 ° C에서 열 블록에 1 분 18 튜브를 삽입 하 여 결 찰 반응을 비활성화 하 고 진정 적어도 2 분 동안 얼음에 반환 합니다.
  2. Covalently 5 M RNase 무료 NaCl의 26 µ L glycogen 신선한 시 microcentrifuge 튜브로 연결 된 파란 염료의 1 µ L을 추가 하 여 강 수 마스터 믹스를 준비 합니다.
    1. 각 18 튜브로 강수량 마스터 믹스의 1.2 µ L를 전송 합니다. 18 관의 각 100% 에탄올의 63 µ L를 추가 합니다. 각 튜브를 닫습니다, 터치 믹스, 2 s, 그리고 장소에 대 한 원심 하 얼음에 튜브. 시 단일 1.5 mL 튜브에 모든 18 튜브의 내용을 결합 합니다.
    2. 튜브를 닫습니다, 그리고 2 s, 그리고 침전에 60 분 동안 얼음에 대 한 혼합, 원심 분리기를 세 번 반전.
  3. 페이지에 대 한 큰 (16 x 20 cm2) 15 %polyacrylamide 젤을 준비 합니다.
    1. 캐스트 2 시 0.1 cm 스페이서가 유리 접시 (안전한 대안 실 란 코팅을 함께 처리).
    2. 시스템 희석제, 시스템 집중, 시스템 버퍼의 3 mL, ap (9%), 240 µ L의 50 mL 튜브에서 TEMED의 12 µ L 18 mL의 9 mL을 결합 합니다.
    3. 30 mL 피 펫을 사용 하 여 유리 접시 사이 페이지 젤 솔루션 전송, 14 잘 빗 (0.1 c m 두께), 삽입 하 고 젤 30 분 RT에서 공고히 하자.
  4. 16000 x g 및 60 분 동안 4 ° C에서 풀링된 ligations와 1.5 mL 튜브 원심
  5. 빗을 제거 합니다. RNase 무료 물 우물 안에 도달 하는 싱크대 위에 (하나 잘 한 번에) 취소 polymerized 아크릴 끝 200 µ L 팁 물 총 병을 사용 하 여 풍부 하 게 우물을 청소. 설정 15% 페이지 젤 기구에 트리 스 Borate EDTA (TBE) 솔루션, x 0.5 저수지 작성 및 미리 30 분 젤 450 V에서 실행.
  6. 원심 분리기에서 풀링된 ligations와 튜브를 복구 하 고 신중 하 게 RNA 펠 릿 건조.
    1. 1 mL 피 펫 팁 상쾌한 제거 하지만 하단에 어떤 액체를 두고. 튜브를 기울기 고 20 mL 피 펫을 사용 하 여 나머지 상쾌한 펠 릿을 건드리지 않고 제거. 진공 흡입 튜브의 끝에 10 µ L 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 펠 릿을 건드리지 않고.
    2. 튜브를 터치 하 여 RNA 펠 릿 RNase 무료 물 20 µ L에서 resuspend. PAA 젤 resuspend RNA, 터치 믹스 하는 솔루션을 로드의 20 µ L를 추가, 2 원심 분리기 RT, 토를 1 분 동안 90 ° C에 튜브를 설정 하 고 즉시 얼음에 장소.
  7. 양쪽 (그림 2)에 2-빈 우물을 떠나는 신선한 0.5 x TBE, 고 부하, 사다리 크기 마커, 그리고 합자 miRNAs는 젤의 센터에서 젤 기구의 교체 0.5 x TBE.
  8. 젤 450 V에서 실행 (35 mA) 60 분, 10 분, 진정 하 고 다시 520 V에서 실행에 대 한 실행을 일시 중지 (25 mA) 대 한 또 다른 60 분 Uncast 15% 유리 접시 중 하나를 제거 하 여 페이지.
  9. 가볍게 유리 접시에 젤 스프레이 TBE, 고 x 0.5 25 mL에 형광 염료 솔루션 (10 µ L)으로 평면 어둠 속에서 5 분 동안 앉아.
  10. 파란 가벼운 transilluminator에 젤과 유리를 놓고 정렬 모두 19 nt와 합자 작은 RNAs (그림 2)의 절단을 직접 통치자와 24 nt 크기 마커. 젤 삭제하시오
  11. 장소 삭제 젤 0.5 mL 튜브, 조각 젤 조각, 시 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 안전 하 게 위치 하도록 설계 되었습니다. 실시간 Resuspend에서 3 분 16000 x g에서 400 mM NaCl 솔루션의 300 µ L로 조각난된 젤 centrifuge 튜브, 닫고 파라핀 영화와 함께 그것을 봉인.
  12. 야간 보육 (16-17 h)에 대 한 4 ° C 차가운 방에 1100 rpm에서 thermomixer에 동요에 튜브를 설정 합니다.

4입니다. 5' 어댑터의 결 찰

  1. 전송 솔루션 및 5 µ m 필터에 조각난된 젤 시 1.5 mL 튜브에 앉아 튜브, 파라핀 필름, 인감 및 g 및 실시간 x 2300에서 5 분 동안 원심
  2. 필터링된 솔루션을 100% 에탄올의 950 µ L를 추가, 튜브를 닫고, 혼합, 2 원심 반전 s, 파라핀 필름, 튜브를 밀봉 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 설정.
  3. 12% 페이지 젤 3.3, 단계에서 설명한 대로 준비 하지만 희석제, 집중, 버퍼의 3 mL의 14.4 mL의 12.6 mL, 240 µ L APS, 50 mL 튜브에 TEMED의 12 µ L을 결합 하 여. 사전 실행 12 %450 V에서 30 분 동안 페이지 젤 (~ 35 mA) 0.5에서 x TBE.
  4. 4 ° c.에 60 분 16000 x g에서 순화 된 작은 RNA 솔루션을 원심
  5. 조심 스럽게 1 mL 피 펫을 사용 하 여 솔루션의 대부분을 제거 하 고 펠 릿을 건드리지 않고 나머지 솔루션을 제거 하려면 200 mL 피 펫을 사용 하는 상쾌한 밖으로 플라스틱.
  6. 진공 플라스 크에 연결 하는 그것의 끝에 10 mL 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 건조 한 펠 릿 그것을 건드리지 않고.
  7. 아래로, pipetting 없이 RNase 무료 물 9 µ L에 펠 릿을 resuspend 하지만 가볍게 터치 튜브, 하 여 원심 2 s, 및 세트 얼음에 튜브.
  8. 1 M Tris pH 7.5의 500 µ L를 결합 하 여 RNA 리가 버퍼 (ATP) 신선한 x 10을 준비, 1 M MgCl2, 20 mg/mL의 50 µ L의 100 µ L acetylated BSA, 10 m ATP, 2-mercaptoethanol의 7 µ L m의 200 µ L 14 M 그리고 143 µ L RNase 무료 물.
  9. 튜브를 터치 하 여 RNA 리가 버퍼 (ATP)와 x 10을 혼합 하 고 2에 대 한 원심 튜브의 하단에 솔루션을 수집 하는 s.
  10. RNA 리가 버퍼 (ATP), x 10의 추가 2 µ L 5' 어댑터 결 찰 설정 100 µ M 5' 어댑터 및 9 µ L, 3' 바코드 작은 RNA 솔루션을 6 µ L 50% 수성 DMSO의 1 µ L.
  11. 가볍게 혼합, 2 원심 튜브 영화 s 솔루션을 수집 하 고 적어도 2 분 동안 얼음에 다시 1 분 동안 90 ° C에서 열 블록에 튜브 장소.
  12. 추가 솔루션에 T4 RNA 리가 1 2 µ L (할 하지 플라스틱 아래로), 튜브, 원심 분리기 2 s, 그리고 떠 있는 튜브 랙 60 분 동안 37 ° C 물 욕조에 앉아에 대 한 영화.
  13. 동시에, 19 nt-3 사이 2 개의 ligations 설정 ' 어댑터와 5' 어댑터, 그리고 24 nt-3 사이 2 개의 ligations' 어댑터와 어댑터 5'.
    1. 2 µ L 19nt-3의 결합 ' 어댑터 (250 ng / µ L) 또는 24 nt-3' 어댑터 (250 ng / µ L): 5' 어댑터 (100 µ M), RNA 리가 버퍼 (ATP), x 10의 2 µ L의 2 µ L 50% 수성 DMSO, RNase 무료 물 6 µ L의 6 µ L 그리고 시 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 T4 RNA 리가 1 2 µ L.
    2. 터치 믹스, 2 s, 및 설정에 대 한 원심 관 튜브 60 분 동안 37 ° C에서.
  14. 20 µ L PAA 변성 시키기 버퍼의 모든 ligations에 추가 (작은 RNAs, 19nt-3 2 ligations 정화 ' 어댑터, 그리고 24nt-3 2 ligations' 어댑터).
    1. 튜브, 2 원심 분리기를 터치 하 여 믹스 s, 얼음, 모든 튜브 1 분 전송에 대 한 90 ° C에서 열 블록에 튜브를 품 어 그리고 사다리 (3 mL의 사다리와 함께 PAA의 20 µ L)를 준비.
  15. 사전 실행 젤 기구의 위 저수지 비어 12% 페이지 젤, 그리고 신선한 0.5 x TBE 솔루션 (웰 스는 길고, 얇은 팁 피 펫을 비우지는) 우물의 수준 아래에 추가.
    1. 그림 3에 설명 된 대로 얇은 피 펫 팁과 샘플을 로드 합니다.
    2. 젤 상단에 개별 우물을 채우기 위해 사용 신선한 0.5 x TBE.
    3. 신선한 0.5 추가 x TBE 우물과 시작 12%의 전기 이동 법 위에 저수지에 450 V에서 60 분에 대 한 페이지 (~ 35 mA).
    4. 젤을 10 분 동안 발전기에서 전환 하 여 실행을 일시 중지 합니다. 생성자를 다시 시작 하 고 60 분 젤 520 V에서 실행 (25 mA).
  16. 발전기, 멈추고, 반전, 싱크대 위에 장치 하 여 저수지 비어 12 %uncast 유리 접시 중 하나를 제거 하 여 페이지.
  17. 앉아 젤 평면 유리, 스프레이 젤 25 mL 0.5에에서 형광 염료의 10 µ L x TBE, 5 분 블루 빛 transilluminator에 젤과 유리 하다 대 한 어둠 속에서 알을 품고 있고 정렬 모두 19 nt 및 모두는 24 nt 크기 마커 (그림 3) 합자 작은 RNAs의 절단을 직접 통치자.
    1. 젤을 삭제할 고 삭제 젤 조각 0.5 mL 젤 분리기 관으로 전송. 젤 브 레이 커 튜브 1.5 mL 시 microcentrifuge 튜브로 설정 하 고 파라핀 영화와 함께 보안의 뚜껑을 닫습니다. 젤 브 레이 커 튜브 제거, 1.5 mL 튜브에 짓 눌린된 젤 조각 300 mm NaCl, 300 µ L 및 100 µ M 3' PCR 뇌관의 1 µ L를 추가.
    2. 추운 방에 (17-18 h) 4 ° C에서 1100 rpm에서 thermomixer에 동요 하룻밤에 파라핀 영화와 함께 튜브를 봉인.

5. 리버스는 5' 출혈의 전사 및 3' 바코드 정화 작은 RNAs

  1. 검색에서 thermomixer와 필터 튜브 5 µ M 필터 튜브 솔루션 정화.
    1. 전송 5 µ M 필터 튜브 1.5 mL에 삽입에 솔루션을 1 mL 피 펫 사용 시 RNase 무료 컬렉션 튜브. G 및 실시간 x 2300에서 3 분 동안 관을 원심
    2. 필터 튜브를 버리고 고 1.5 mL microcentrifuge 컬렉션 튜브 포함 하는 필터링된 솔루션을 100% 에탄올의 950 µ L를 추가 합니다. 혼합, 2 s, 및 60 분 centrifuging 16000 x g 및 1 시간에 4 ° C에 튜브에 의해 작은 RNA 침전 ice에 대 한 원심 분리기 튜브 반전.
  2. RNA 펠 릿 건조.
    1. 뚜껑 열고 하단에 어떤 액체를 떠나는 1 mL 피 펫과 상쾌한을 조심 스럽게 제거 합니다.
    2. 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 모든 나머지 상쾌한 펠 릿을 건드리지 않고 제거. 펠 릿의 반대편에 앉아 어떤 해결책 든 지 수 있도록 튜브 기울기.
    3. 10 mL 필터링 되지 않은 피 펫 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여는 상쾌한 발음 하 고 건조 한 진공 청소기를 사용 하 여 펠 릿을.
  3. RNase 무료 물 5.6 µ L에서 RNA 펠 릿을 resuspend.
    1. RNase 무료의 5.6 µ L를 버퍼, 4.2 µ L의 10 x deoxynucleotide 3 인산 염 (dNTPs) (각 2 m m), 및 dithiothreitol (DTT)의 1.5 µ L x 5의 3 µ L을 추가 하 여 반전 녹음 방송 반응을 15 분 설정에 대 한 얼음에 반전 녹음 방송 시 약을 녹 인 다 resuspended 펠 릿입니다.
    2. 혼합 반응, 2 원심을 튜브를 부드럽게 터치 솔루션을 수집 하는 s. 정확히 30 s와 50 ° c.에 thermomixer에 직접 다음 전송에 대 한 90 ° C에서 열 블록에 반응 설정
    3. 온도 균일화를 2 분 동안 thermomixer에 튜브를 둡니다. 튜브 30 분 50 ° C에서 thermomixer에 즉시 다시 집합, 솔루션, 부드럽게를 섞어, 영화에 직접 역 전사 효소의 0.75 µ L를 추가 합니다.
  4. 30 분, 후 반전 녹음 방송 중지를 1 분 동안 95 ° C에서 열 블록에 튜브를 전송 합니다. 반전 녹음 방송에 직접 RNase 무료 물 95 µ L을 추가 하 고 혼합, 튜브 영화 2 분 동안 얼음에 직접 설정.
  5. CDNA 재고 라이브러리 및 라이브러리 id 튜브 라벨

6. 파일럿 PCR 및 대규모 PCR 증폭

  1. 신선한 10 x PCR 버퍼 RNase 무료 물 추가 304 µ L에 의해, 2 M KCl, 1 M Tris pH 8.0의 50 µ L의 125 µ L를 준비 1 M MgCl2의 10 µ L, 1% 트라이 톤 X-100, 그리고 6 µ L의 1 M 2-mercaptoethanol 시 microcentrifuge 튜브에서의 5 µ L 실시간에 계속
  2. RNase 무료 물 67 µ L, 10 µ L PCR 버퍼, 10 µ L 10 x dNTPs, 100 µ M 5' PCR 뇌관, 100 µ M 3' PCR 뇌관의 0.5 µ L, 사진 라이브러리, cDNA의 10 µ L의 0.5 µ L의 x 10의 그리고 50의 2 µ L를 결합 하 여 파일럿 PCR 반응 조립 x Taq 중 합 효소.
    1. 2 설정 PCR 주기는 thermocycler에 다음과 같이: 45 1: 94 ° C 파일 s, 50 ° C 85에 대 한 s, 및 60 72 ° C 10 사이클에 대 한 s 4 ° C;에서 개최 파일 2: 94 ° C 45 s, 50 ° C 85에 대 한 s, 및 60 72 ° C s 2 사이클, 4 ° c.에서 개최 thermocycler에서 파일럿 PCR 반응 고 파일 1을 시작 합니다.
    2. 파일의 끝 1, PCR 튜브를 열고 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 전송 12 µ L의 5 x 3 µ L을 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 관으로 파일럿 PCR 반응에서 염료를 로드 젤, 아래로 pipetting으로 혼합, 튜브 및 "10 주기" 레이블을.
    3. 파일럿 PCR 튜브를 닫고는 thermocycler에서 파일 2를 시작 합니다. 파일 끝에의 2, PCR 튜브 및 20 mL 피 펫을 사용 하 여 솔루션의 12 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브 젤 로드 염료, x 5의 3 µ L로 전송 열고 "12 사이클" 레이블을.
    4. 6.2.2 고 6.2.3 파일럿 PCR 반응에서 PCR 주기 14, 16, 18, 및 20에서 12 µ L PCR 제품을 수집 하는 단계에 설명 된 단계를 반복 합니다. 각 12 µ L PCR aliquots 젤 로드 염료 x 5의 3 µ L을 추가 하 고 20 nt 사다리 사다리의 3 µ L 및 RNase 무료 물 9 µ L를 포함.
  3. 0.5와 2.5 %agarose 젤 준비 x TBE.
    1. 깨끗 한 비 커에 agarose의 2.5 g의 무게와 0.5의 100 mL를 추가 x TBE. 전자 레인지에 솔루션을 열 때 그것은 종 기까지. 전자 레인지에서 솔루션을 제거, 소용돌이 agarose를 혼합, ethidium 평범한 사람 (10mg/mL)의 4 μ를 추가 하 고 솔루션 테이프로 양쪽 끝에 폐쇄 7 x 10 cm2 전기 이동 법 용지함에 전송 하는 병.
    2. 설정 8 잘 빗 고 응고 agarose 젤 전기 이동 법 기구 0.5로 가득에 실시간 전송에서 공고히 agarose 젤 x TBE.
  4. 사다리와 agarose 젤에 PCR 샘플을 로드 하 고 120 V에서 30 분 동안 그것을 실행.
  5. 최적의 PCR 주기 (그림 4A)를 식별 하는 UV 상자에 젤을 평가 합니다.
    참고: 예상된 PCR 밴드의 크기는 그림 4B에 표시 됩니다.
    1. 관찰 다른 우물의 각 두 개의 PCR 밴드 (위 밴드: DNA 도서관, 낮은 밴드: 뇌관 이합체).
    2. CDNA 라이브러리 표시 하 하지만 뇌관 이합체는 거의 주기를 선택 하 여 cDNA 증폭에 대 한 적절 한 PCR 주기를 식별 관찰.
      참고: 일반적으로, 적절 한 PCR 주기 12-16 주기 사이 선택 됩니다. 그림 4A에이 라이브러리에 대 한 적절 한 PCR 주기는 14 이다.
  6. Agarose 젤 라이브러리 정화에 대 한 대규모 PCR 반응 (6 x 100 µ L)를 설정 합니다.
    1. PCR 버퍼 다음 단계 6.1 x 10의 신선한 튜브를 준비 합니다.
    2. 1.5 mL 튜브에 대규모 PCR 주인 혼합 RNase 무료 물, 10 x PCR 버퍼, 65 µ L 10 x dNTPs의 5' PCR 뇌관, 3' PCR 뇌관, 및 혼합 아래로 pipetting 3.25 µ L의 3.25 µ L의 65 µ L의 435.5 µ L를 결합 하 여 준비 합니다.
    3. 6 0.5 mL PCR 튜브에 PCR 주인 혼합의 88 µ L를 전송 합니다. 10 µ L cDNA 재고 라이브러리 (얼음에 저장 된)의 전송, 6 PCR 튜브의 각 50 x Taq 중 합 효소의 2 µ L을 추가 하 고 혼합 플라스틱.
    4. RNase 무료 물, 10 x PCR 버퍼의 10 µ L, 10 x dNTPs의 10 µ L, 5' PCR 뇌관의 0.5 µ L, 0.5 µ L 3' PCR 뇌관의 그리고 50 x Taq 중 합 효소, 및 혼합 피 펫 2 µ L의 77 µ L를 결합 하 여 부정적인 PCR 반응 관을 준비 합니다.
    5. PCR 튜브 thermocycler PCR 주기 단계 6.2.1에서에서 설명 하 고 증폭 사이클의 최적의 수 설정을 사용 하 여 놓습니다. 0.5를 사용 하 여 2.5 %agarose 젤 준비 x TBE, 단계 6.3에서에서 설명한 대로.
  7. PCR 확대 후 전송할 9 µ L 각 PCR 튜브에서 6 1.5 mL microcentrifuge 관 젤 로드 염료 x 5의 3 µ L를 포함.
    1. RNase 무료 물과 1.5 mL 튜브에 염료를 로드 하는 추가 3 µ L 젤 9 µ L에 사다리의 3 mL을 결합 하 여 20 nt 사다리를 준비 합니다.
    2. 사다리, 부정적인 PCR 제어, 그리고 6 PCR 제품 agarose 젤에 로드 하 고 30 분 동안 젤 120 V에서 실행.
    3. UV 상자 (이미지 걸릴에) 차선 사이 PCR 확대의 균일성을 확인 합니다.
    4. 두 시 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (3 x 91 µ L)으로 3 PCR 반응 결합, 5 M NaCl의 27 µ L 및 100% 에탄올의 950 µ L를 추가 합니다. 혼합-20 ° C 하룻밤 침전 PCR 제품에서 그들을 설정 하는 튜브를 반전.

7. cDNA 라이브러리 정화 및 평가

  1. 4 ° c.에 60 분 16000 x g에서 PCR 반응 두 튜브 원심
  2. 1 mL 피 펫과 상쾌한 제거 그리고 기울기 상부에 펠 릿와 더 낮은 측에 액체 튜브 욕조와 진공 플라스 크에 연결 된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 액체 10 mL 팁 파스퇴르 피 펫의 끝에 발음 하는 고.
  3. PmeI 다이제스트를 설정 합니다.
    1. Nuclease 무료 물, 17.5 µ L PCR 펠 릿 중 하나를 resuspend 하 고 resuspended 펠 릿 두 번째 PCR 펠 릿을 전송. 버퍼 x 10의 2 µ L 및 PmeI 효소의 0.5 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 2 h 물 욕조에 다이제스트를 설정
    2. 0.5를 사용 하 여 2.5 %agarose 젤 준비 x TBE (단계 6.3). 다이제스트를 젤 로드 염료 x 5의 6 µ L를 추가 합니다. Agarose 젤의 두 인접 한 우물으로 각 다이제스트의 13 µ L를 전송, 끝 웰 스에서 20 nt 크기 사다리를 로드 하 고 실행 (그림 4D) 150 V에서 90 분 젤.
    3. UV 상자에 젤에서 상단 PCR 악대 소비 세, 갓 무게 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 젤 조각 전송 및 규모에 젤 조각 무게.
  4. 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여 삭제 PCR 증폭된 cDNA 라이브러리를 정화. 계량 DNA 정량화 분석 결과 및 제조업체의 지침에 따라 악기를 사용 하 여 cDNA 라이브러리.
  5. 크기와 Bioanalyzer (그림 5)에 높은 감도 DNA 칩과 cDNA 라이브러리의 순도 평가 합니다. 높은 처리량의 시스템을 사용 하 여 cDNA 라이브러리 시퀀스입니다. 어댑터 트리밍 및 미르 시퀀스를 식별 하는 인간 게놈에 정렬에 대 한 RNAworld 파이프라인에 FASTQ 데이터 파일을 전송.

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Representative Results

총 18 개별 FFPE RNA 샘플 메서드는 여기에 설명 된 대로 (100 ng 각) 3' adenylated 바코드 oligonucleotide T4 내 고 하룻밤을 별도 튜브에 설정 됩니다. 다음 날, 효소 반응 열 비활성화, 결합, 되며 단일 튜브에 침전. RNA 펠 릿 resuspended와 합자 RNA 분자 15 %polyacrylamide 젤 (페이지), 페이지 젤의 인접 한 우물에 하는 RNA oligonucleotide 크기 마커를 적절 하 게 크기의 3' 바코드를 선택 하는 데 사용 됩니다를 변성 시키기에 분리 된다 작은 RNAs (그림 2). 삭제 젤 조각 elute 합자 RNA 분자를 하룻밤 NaCl 용액에 알을 품는. 다음 날, eluted RNA 침전 하 고 5' 어댑터 결 찰 수행 됩니다. 5' 어댑터 출혈 작은 RNA 분자는 마이그레이션 그리고 12% 아크릴 아 미드 젤, 어디 다시 마이그레이션된 RNA 크기 마커 oligonucleotides 허용 작은 RNAs의 크기 절단 3' 바코드 oligonucleotides 및 5' 어댑터 ( 에 분리 그림 3). 삭제 젤 RNA의 차입을 허용 하는 NaCl 해결책에 하룻밤 incubated. 다음 날, 합자 작은 RNA 분자는 시 켰 던, 그리고 펠 릿 RNase 무료 물, 역-전사; 뒤에 resuspended cDNA 분자의 약 수는 파일럿 PCR 반응 (그림 4A)를 겪 습. CDNA 라이브러리의 동일한 입력을 사용 하 여 대규모 PCR 반응 설정 하 고 모든 반응 했다 PCR 증폭 (그림 4B), 풀링 이전 하 고 하룻밤 에탄올 강수량 적절 하 게 확인 하는 2.5 %agarose 젤에 평가 됩니다. 다음 날, 증폭 된 cDNA 라이브러리 18 독특한 FFPE RNA 표본에 대 한 모든 18 개별 라이브러리를 포함 하는 2.5 %agarose 젤에 최고 PCR 밴드, nt excised 이며 정화 100에서 실행 (그림 4C) 마이그레이션됩니다. CDNA 라이브러리 정화 순화 PCR 제품 뇌관 이합체의 초과 또는 PCR 반응의 다른 부산물을 포함 하지 않는 확인 하는 높은 감도 DNA 칩 (그림 5)에서 다음 계산 됩니다. PCR 제품 다음 높은 처리량 시퀀싱 시스템에 분석 된다. 어댑터 트리밍 및 각 18 표본 18 개별 파일의 생성 RNAworld 파이프라인을 사용 하 여 수행 됩니다 (액세스 제공 된 우리에 게 토마스 Tuschl 박사에 의해). Biostatistical 분석 다음 FFPE RNA 견본의 미르 내용을 평가 하기 위해 수행 됩니다.

이 확인 하기 위해 최적화 절차, 일치 하는 신선한 냉동 고 FFPE 유 방 종양 표본을 분석 (그림 6) 사용 되었다. 2 유사한 절차의 감도 평가 하 고 미르 식 차이 두 신선한 냉동된 조직 사이 식별 또한에 검출 될 수 있는 경우는 일치 보관 FFPE 결정에 침략 적인 ductal 유 방 암 (IDC) 종양 선정 됐다 RNA의 표본 이 실험에 대 한 총 RNA 2 신선한 냉동 및 일치 2 FFPE RNA 샘플 로부터 얻은 했다의 품질 평가 (그림 6A). 예상 대로, RNA 크기와 FFPE 표본의 품질 심각 하 게 감소 했다 (비교 레인 1, 3, 2, 4 차선) 일치 신선한 냉동된 RNAs에 비교 될 때. FFPE RNA 중 하나는 4 년 (침략 적인 유 방 암 1, (IBC1))에 대 한 실시간에 보관 했다 하 고 다른 했다 보관 RT에서 8 년 (IBC2), 신선한 냉동된 대응 했다-80 ° c.에 저장 된 4 명의 개별 RNA 표본 4 개별 바코드와 미르 플롯 그림 6B에 표시 되는 메일을 읽기를 사용 하 여 단일 라이브러리에 분석 되었다. 두 개의 상위 패널 표시 미르 식 상관 관계 2-신선한 냉동된 종양 RNAs와 특정 FFPE RNA 견본 들 사이. 음모 사이 일치 신선한 냉동 FFPE miRNAs 나타냅니다 그 cDNA 라이브러리 준비 제공 좋은 재현성 표본 다르게 처리 (냉동 대 FFPE)에서 발견 하는 miRNAs 사이 높은 상관 관계를 관찰 될 수 있다. 두 낮은 패널 두 개의 다른 FFPE 종양 및 두 개의 서로 다른 냉동된 종양에서 miRNA 식 데이터 사이의 상관 관계를 표시합니다. 그림 6 c에 표시 된 대로 두 신선한 냉동된 종양 사이 식별 미르 식 차이 차이 두 일치 FFPE 종양 표본 사이 감지와 상관 했다. 의미 미르 식 차이 감지 했다 모두 신선한 냉동 고 FFPE 종양.

이 방법의 감도 더 평가 하려면 12 보관된 FFPE 표본 및 4 신선한 냉동된 RNA 표본에서 miRNA 식 데이터 사용 되었다 (그림 6D). 16 다른 RNA 표본 개별적으로 3' 바코드와 모두 단일 cDNA 라이브러리의 준비를 위해 사용 했다. 이 라이브러리에 포함 된 두 개의 유 방 셀 라인는 MCF10A에 사용 RNA 샘플 (보통 같은 셀 라인)와 MCF7 (유방암 암 세포 선) 신선한 냉동 그들의 보관된 FFPE 대응23, 일치와 신선한 세포에서 RNA와 FFPE RNA 샘플 두 개의 유방암에서 샘플 (IBC1와 IBC2 그림 6A 에서 6B), 독립적으로 분석 하 고 일치 하는 신선한 냉동 및 FFPE RNA 정상적인 자 궁 경부 샘플 (Cx)에서 합니다. 또한, 보통 (일반 Br1, 정상적인 Br2, 및 정상적인 Br3), 및 그들의 신선한 냉동된 대응 없이 암 유 방 조직 (IBC 5, IBC 6, 및 7 IBC)에서 보관 된 FFPE 표본 분석 되었다. 신선한에 heatmap에 관찰 냉동 또는 FFPE RNA 기원, 미르 식 프로필 동일한 셀 (MCF10 또는 MCF7), 또는 같은 조직 (IBC1, IBC2, 또는 Cx) 함께 클러스터. 또한, 왼쪽에서 오른쪽, 자율된 클러스터에서 설명 했 듯이 정상적인 유 방 세포와 조직에 유 방 종양과 종양 세포 동안 함께 클러스터 클러스터 오른쪽에. 표시 다른 미르 식 프로필, 자 궁 경부 조직은 heatmap의 오른쪽에 클러스터링.

고려 하 고는 대부분의 임상 보관된 FFPE 표본 필요가 없습니다 신선한 냉동된 대응 하지만 그들은 다른 저장 기간 후 검색할 수 있습니다, 그것은 최적화 된 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜 적용 했는지 확인 하고자 했다 고 점점 나이가 FFPE 견본으로 재현. 그림 7, 18, 20, 22, 27에 대 한 보관 하는 FFPE 직물에서 miRNA 식 프로필에에서 표시 된 대로 30, 및 35 년 얻은 했다. RNA는 최적화 된 동시 RNA/DNA 절차21를 사용 하 여 추출 된 그리고 각 개별 FFPE 견본에서 quadruplet RNA aliquots 같은 날에 준비 하 고 이전 라이브러리 준비-80 ° C에 저장 했다. 9 다른 FFPE 표본의 총 각 개별 RNA 약 수 같은 라이브러리 내 다른 바코드 oligonucleotides (총 18 바코드)와 출혈은 중복에서 분석 되었다. 이 실험은 2 주 연속 (1 주와 2 주) 동안 반복 되었다. 이 단일 라이브러리 내의 그리고 일주일 간격으로 두 개의 서로 다른 라이브러리 사이 2 개의 다른 바코드를 사용 하 여 동일한 RNA 견본으로 cDNA 라이브러리 준비 재현성 평가 허용. 그림 7에 관찰, 상관 계수는 견본 또는 라이브러리 준비 주;의 나이에 0.96 위에 남아 따라서, 최적화 된 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜 FFPE 표본의 보관 시간에 재현할 수 분석을 위한 강력한 도구를 제공 합니다, 그리고 예를 들어 35 세 보관된 FFPE RNA 높은 재현성 측정 표시 (유 방 #9 참조) 20-올해-옛 FFPE RNA 샘플 (유 방 #3 참조)와 함께 언급 하는 그 것과 같습니다.

Figure 1
그림 1: Oligonucleotides. 모든 oligonucleotide 시퀀스, 해당 화학 수정 및 농도이 프로토콜에 사용 되는 설명 되어 있습니다. 화학 수정 유형의 수정 상자와 oligonucleotide 시퀀스에 표시 하는 약식된 수정에 설명 되어 있습니다. 캘 리브레이 터 칵테일 10 개별 RNA oligonucleotide 교정기, 캐리어 oligonucleotide (0.5 µ M)를 포함 하는 솔루션에서 resuspended 했다의 목록을 표시 합니다. 18 3' 바코드 oligonucleotide 어댑터 회색 음영 바코드의 시퀀스 자세히 나와 있습니다. 5' 어댑터의 RNA 순서 그리고 3' PCR 및 5' PCR 뇌관의 DNA 시퀀스 자세히 나와 있습니다. 즉 19 nt-3 프로토콜에서 참조 된 두 개의 크기 마커 oligonucleotides의 RNA 시퀀스 ' 어댑터와 24 nt-3' 어댑터 크기 마커, 제공 됩니다. 모든 DNA와 RNA oligonucleotides 상업적으로 구매 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 3' 바코드 RNA 샘플의 페이지 정화. 후 풀링 및 계기 18 바코드 RNA 샘플, resuspended RNA 펠 릿 마이그레이션 및 15% 아크릴에 전기 이동 법으로 분리 젤 (잘 8 참조). 붉은 광장 3' 바코드 microRNAs, 메스 칼 날 excised 되었고 시 microcentrifuge nuclease 무료 튜브로 포함 된 영역을 강조 표시 합니다. 총 4 개의 우물, 19 nt-3를 포함 하는 두 ' 어댑터와 포함 된 24 nt-3 2 ' 어댑터 라이브러리의 각 측에 잘 떨어져 설정 (참조 우물 5, 6, 10, 11, 각각). 합자 크기의 정화 및 T4 RNA 리가 1에 대 한 테스트로 될 마커 완료 다음 날, 결 찰 반응 19 nt-3를 포함 하 ' 어댑터 크기 마커 5' 어댑터와 24 nt-3' 5' 어댑터와 어댑터 크기 마커 스 2에서에서 실행 한 d 3, 각각. 노란색 사각형 5' 어댑터와 합자 크기 마커 RNA oligonucleotides 대표 삭제 밴드를 표시 합니다. 이 밴드는 정화, 침전, 하 고 실행 중 12%에 페이지 정화 ( 그림 3 참조). 웰 스 1과 13 합자 제품의 예상된 크기를 확인 하는 것을 도운 20 nt 크기 사다리를 포함 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 5' 어댑터의 결 찰 후 정화 라이브러리의 페이지 정화. 순화 된 RNA 도서관은 5' 어댑터와 함께 출혈 및 예상된 제품 크기 12%에서 excised 했다 (빨간색 사각형 참조) 합자 크기 마커를 사용 하 여 페이지. 19 nt-3 사이 T4 RNA ligations의 제품 ' 어댑터와 5' 어댑터 (웰 스 4, 9) 24 nt-3 사이 ' 어댑터와 5' 어댑터 (웰 스 5와 10) 필요는 잘 포함 하는 RNA 라이브러리의 각 측에 병렬로 실행 했다. 최고의 밴드 (흰색 별표 참조) 5' 어댑터 결 찰의 제품 이며 젤 밴드 절단 포함 5'에 대 한 가이드로 사용 어댑터 출혈 RNA 라이브러리. 이전 페이지에서 정화 하는 결 찰 크기 마커 결 찰 제품 잘 3에서 실행 됩니다. 웰 스 1과 12에서에서 관찰, 20 nt 크기 사다리 RNA 라이브러리의 예상된 크기를 확인 하기 위해 또한 실행 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 파일럿 PCR 및 cDNA 도서관의 대규모 증폭. 크기와 PCR 제품의 비율이 2.5 %agarose 젤 ethidium 평범한 사람 앞에 평가 되었다. (A) 후 바코드 RNA 라이브러리, cDNA 라이브러리의 약 수의 반전 녹음 방송 단 하나 조종사 PCR 반응에 5'과 3' PCR 뇌관을 사용 하 여 증폭 되었다. Aliquots 파일럿 PCR 반응의 10, 12, 14, 16, 18, 및 20 사이클에서 얻은 고 2.5 %agarose 젤에 마이그레이션. 웰 스 1과 7 사이 관찰, cDNA 라이브러리 및 어댑터 이합체의 존재 했다 기 하 급수적으로 관찰 (녹색 사각형 참조). 이 라이브러리에 대 한 PCR 주기 cDNA 도서관의 확대를 위한 선택 했다 15. (B)이이 회로도는 위치와 길이 다른 oligonucleotides 및 결과 RNA와 DNA, 제품 페이지 및 agarose 젤에 식별할 수 있는 표시 됩니다. 6 대규모 PCR 반응 ( A에서 식별)의 (C) Aliquots 2.5 %agarose 별도로 분석 했다 (스 3-8 참조) 젤. PCR 제품의 두 가지 유형, 즉 라이브러리 (위 밴드) 및 뇌관 이합체 (낮은 밴드)에 표시 됩니다이 젤 (참조 녹색 사각형). CDNA 없이 빈 PCR 반응 없음 PCR 확대 표시 (도 2 참조). 20 nt 크기 사다리 제품의 크기 (잘 1 참조)의 확인을 수 있습니다. (D) 젤 2.5 %agarose 블루 빛 transilluminator에 이미지 젤 풀링된 PCR 반응을 포함 하는 두 개의 인접 한 우물에 달렸다. 관찰, 두 웰 스에서 최고의 밴드 예상된 라이브러리 크기 이내 이며 어댑터 이합체 밴드 아래 위치 하 고 있습니다. 위 PCR 악대 excised 되었고 젤 추출 키트와 함께 정화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 순화 된 PCR의 증폭 DNA 도서관. PCR 증폭된 cDNA 도서관의 작은 약 수 (1 µ L) 마이크로 기반 플랫폼에 높은 감도 DNA 칩을 사용 하 여 분석 된다. (A)이이 패널 표시 계측기의 교정에 대 한 크기 표식의 마이그레이션. (B)이이 패널에는 순화 된 PCR 증폭된 cDNA 라이브러리의 마이그레이션을 표시 됩니다. 가장 높은 100의 크기로 측정 혈압 (별표 참조) cDNA 라이브러리를 나타냅니다. 작은 피크 72에 평가 악기에 의해 혈압 뇌관 어댑터 이합체를 나타냅니다. 100 bp 피크 포함 18 개별 바코드 RNA 표본 후속 NGS 시퀀싱 높은 처리량 시스템에 대 한 증폭 된 cDNA 라이브러리에 대 한 예상된 크기 기반 마이크로 플랫폼 계시에 의해 감지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: cDNA 라이브러리 준비 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 일치 하는 포함 하는 신선 냉동 하 고 포 르 말린 고정 파라핀 표본. (A) 총 RNA 추출에서 일치 신선한 냉동 고 FFPE 침략 적인 ductal 암 (IDC) 종양 마이크로 기반 플랫폼에 총 RNA 칩에 분석 했다. (B) 총 RNA 일치 신선한에서 냉동 고 FFPE 표본 (IBC 1와 IBC2) 받았다 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜 및 미르 시퀀싱 데이터 표시 했다. (C) DifferentialmiRNA 식 IBC1/IBC2 표본 및 상관 관계 사이 사이 언 FFPE 대응 샘플. miRNA 식 당 로그 수에 표시 됩니다 백만 (CPM), 높은 낮은 읽기 (블루 색상 빨강)에서. 미르, 당 두 조직 쌍 식 차이의 중요성 높고 낮은 식 miRNAs 신선한 및 FFPE 샘플에서 확인 된 회색 원으로 표시 됩니다. (D) 총 RNA 일치 신선 하 고 유 방 셀 라인 (MCF10A 및 MCF7), 인간의 침략 적인 유방암 (IBC 1와 IBC2), 자 궁 경부 조직 (Cx)의 FFPE RNA 표본에서 추출한 정상적인 유 방 직물 (일반 Br1, 정상적인 Br2, 및 정상적인 Br 3), 보관 및 보관 된 침 윤 성 유방암 (IBC 5, IBC 6, 및 IBC7) 같은 실행 내에서 cDNA 라이브러리 준비를 했습니다. 라이브러리에서 검색 하는 miRNAs의 NGS 데이터 열 맵 구성에 표시 됩니다. 이 그림 Loudig 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 20 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: cDNA 라이브러리 준비와 미르 식 사이 상관 관계가 더 오래 사용 하 여 복제 FFPE 표본 보관. 18, 20, 22, 27, 30, 및 35-올해-옛 보관된 FFPE 유 방 조직 표본에서 총 RNA 우리의 최적화 된 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜을 받았다. 9 다른 FFPE 표본에서 복제 RNA 샘플 다른 3' 바코드 oligonucleotides와 출혈 되었고 주 1 (w1)에 동일한 라이브러리 내에서 분석. 동일한 실험 1 주 간격 (주 2 또는 w2) 내에서 반복 되었다. 0.93에서 0.99 사이 평가 상관 계수는 heatmaps에서와 같은 보관 된 RNA 표본 간에 중복된 미르 식 데이터의 재현성 측정 표시 됩니다. 이 그림 Loudig 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 20 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

NGS FFPE RNA 표본에서 보관 하는 작은 RNAs의에 대 한 높은 재현성 및 강력한 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜 Hafner 외. 에 의해 설명 하는 절차의 수정 하 고 최적화 된 버전은이 프로토콜에서 제공 됩니다. 22

이 프로토콜의 모든 단계는 FFPE 표본에서 발견 이전 보관 및 손상 된 총 RNA와 함께 사용 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 프로토콜 FFPE RNA의 적은 양을 처리의 핵심 단계 18 독특한 3' 바코드 어댑터와 개별 ligations 후 (, 18 개별 100 ng FFPE RNA 샘플) 모든 RNA 샘플의 풀링에서 거주 한다. 이 중요 한 단계 18 FFPE RNA 샘플을 균일 하 게 모든 후속 생화학 및 효소 단계 작은 RNA cDNA 라이브러리의 준비를 위해 필요한 수 있습니다. 또한,이 단계 precipitations 겪고 RNA의 양을 극대화 및 젤 담긴 작은 RNA 분자의 캐리어 효과 강화 하 고 촉진 하 여 관찰 작은 젤 선택. 이 프로토콜을 추가 FFPE RNA의 소량을 작업할 때 그 다양성을 강조, 파일럿 PCR 반응 cDNA 라이브러리의 최적의 확대 주기를 식별 하는 데 사용은의 또 다른 주요 기능. 이 단계는 또한 뇌관 이합체 증폭, 대규모 PCR 반응 준비 하 고 정화는 agarose에 작은 RNA 도서관 젤 중요 한 때 대 도서관 증폭의 역학에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 이 프로토콜에 추가 하는 데이터 사이이 방법의 재현성 일치 냉동 최대 35 년 동안 보관 하는 FFPE 표본, 그리고 또한 강조 이전 FFPE RNA에 그것의 적용에서 표본 샘플 보여 줍니다.

낮은 질 및 화학적 수정 하 고 손상 된 FFPE RNA의 수량에서 만든 작은 RNA 라이브러리의 준비를 위해 최적화 되어 있으므로이 프로토콜의 원래 버전에서 수정 되었습니다. 칵테일은 초기 3' 바코드 어댑터 결 찰를 입력 0.026 감소 했다 동안 아군 캘 리브레이 터의 양 관련이 성공적으로 선 하 고 증폭 하는 FFPE 표본에서 작은 RNAs 수정 된이 절차의 한 측면을 방지 하기 위해 nM 낮은 abundancy의 결 찰과 경쟁 작은 RNAs는 FFPE RNA 샘플에 존재합니다. 원래 프로시저에 다른 중요 한 수정이 했다 모든 방사성 레이블된 크기-마커 페이지 젤에 합자 작은 RNAs의 선택 사용의 제거. 이러한 방사선된 크기 마커의 사용 뿐만 아니라 실험실 라디오 동위 원소의 사용 하지만 젤에 RNA 제품의도 막 았된 관찰에 대 한 인증을이 방법의 적용을 제한. 대신,이 최적화 된 프로토콜에서 크기 마커는 웰 스 라이브러리 페이지 젤에 인접 한에서 실행 하 고 합자 작은 RNAs의 절단 하는 형광 염료와 직접 시각. 중요 한 것은, 형광 염료 RNA 제품의 확산을 방지 하기 위해 젤에 가볍게 뿌리 이며 다음 블루 라이트 박스에 시각. 그 후, 예방의 및 삭제 페이지 젤 조각에 포함 된 합자 작은 RNAs의 보급 향상을 측정 젤 분리기 튜브는 균일 하 게 동요에서 4 ° C에서 하룻밤 NaCl 용액에 부 화 하기 전에 젤을 짝사랑 하 사용 됩니다. 이러한 모든 단계는 작은 양의 재료와 함께 작동 하도록 신중 하 게 평가 했다.

이 프로토콜은 서로 다른 양의 시간에 대 한 저장 했다 다른 소스 (장기 및 기관)에서 FFPE RNA 샘플에 적용 되었습니다. 분석 절차를 최적화 사용 하 여이 때 신선 하 고 냉동 표본에서 작은 RNAs를 시퀀싱의 높은 재현성을 공개 했다. 최대 35 년 동안 저장 보관 된 이전 FFPE 표본를 사용 하 여 추가 분석 프로토콜의 광대 한 적용 임상 견본에 입증 되었습니다. FFPE 표본에 대 한 최소 FFPE RNA 입력된 요구 100 표시 했다 니. 이 낮은 요구 사항을 허용 다양 한 병 변은 서로 다른 크기와 가용성,이 프로토콜의 적용 하지만 단일 셀 FFPE RNA의 분석을 허용 하지 것 이다. 그러나 주의 하는 것이 중요 하다,,이 프로토콜 최적화는 또한 함께 사용 되었습니다 미만 1의 입력 exosomes 순환에서 추출 된 총 RNA ng 재현할 매우 작은 RNA 식 프로필 (데이터 표시 되지 않음)를 제공 하 고. 이 낮은 입력 제안 FFPE 샘플 작은 RNAs 비록 원래 신선한 조직의 대표는 exosomes 순환에서 총 RNA에 보다 훨씬 더 낮은 비율에 존재 합니다.

어디이 최적화 된 프로토콜 임상 분류 DCIS FFPE 표본에 적용 된, 최근 작품에 양이 많은 PCR 미르 식 차이 cDNA 라이브러리의 NGS 식별의 유효성을 검사할 수는 발견 했다. 이 작품의 대규모 회고전 연구 [20] 다른 기관에서 보관 된 조직에서 병 변 DCIS를 사용 하 여 타당성을 설명 했다. 이 연구는 또한이 cDNA 라이브러리 준비 재현성 및 분석 결과의 감도 저하 없이 (에서 몇 주 간격), 서로 다른 시간에 수행 될 때의 견고성을 강조 했다.

임상 분류 보관된 FFPE 표본 방대한 고려이 최적화 된 프로토콜 대규모 회고전 분석에서 cDNA 라이브러리의 준비를 위한 및 미르 biomarkers의 잠재적인 식별을 위해 강력한 도구를 제공 암 개발21와 관련 된.

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Disclosures

저자는이 원고에 표시 하는 데이터의 일부를 포함 하는 간행물 Loudig 그 외 여러분 에 의해 분자 과학의 국제 저널에 출판 되었음 공개 하고자 21.

Acknowledgments

우리는 박사 토마스 Tuschl, RNA 분자 생물학 실험실의 머리 뿐만 아니라 그들의 지원에 대 한와 그의 실험실에 RNAworld 파이프라인에 대 한 액세스를 제공 하는 개발 된 기술을 공유 하기 위한 그의 실험실의 구성원 감사. 우리는 또한 그의 프로토콜을 공유 하 고 그의 초기 절차에 사용 된 모든 생화학 및 효소 단계에 자세한 설명을 제공 하 박사 마르쿠스 Hafner 감사 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

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References

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