En samskrevet Intestinal Loop modell bedøvet bestemt patogen gratis kyllinger å studere Clostridium Perfringens virulens

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å opprette kirurgisk 'intestinal samskrevet looper' i kylling små tarmer. Denne prosedyren kan sammenligne flere Clostridium perfringens stammer virulens i situ i en enkelt vert. Denne metoden reduserer betydelig antall kyllinger vanligvis nødvendig for lignende i vivo eksperimenter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Parent, E., Burns, P., Desrochers, A., Boulianne, M. A Ligated Intestinal Loop Model in Anesthetized Specific Pathogen Free Chickens to Study Clostridium Perfringens Virulence. J. Vis. Exp. (140), e57523, doi:10.3791/57523 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nekrotisk enteritt ble studert i kyllinger bruker ulike i vivo infeksjon modeller. De fleste av disse bruker en kombinasjon av faktorene, som coccidiosis og kosthold, med gavage eller administrasjon via feed ved hjelp av Clostridium perfringens. Disse modellene krever sammenligning av flere C. perfringens stammene for virulens studier mange verter å få betydelige resultater. Dødelighet i løpet av studien kan være høy avhengig av eksperimentell modell, dermed heve visse etiske spørsmål om dyrevelferd i forskning. Utviklingen av nye infeksjon modeller krever færre dyr å studere patogenesen, likevel gir statistisk signifikant og gyldig resultater, er viktig å redusere dyr bruk i forskning. Intestinal samskrevet loop modeller har blitt brukt til å studere clostridial infeksjoner i ulike arter som mus, kaniner og kalver. Etter kirurgiske prosedyrer til å opprette samskrevet loop segmenter, C. perfringens stammene er injisert direkte inn looper å etablere en nær kontakt mellom bakterier og tarmen. Prøver av tynntarm og luminal innholdet er tatt ved oppsigelse av fremgangsmåten etter noen timer. Flere bakteriell stammer kan være inokulert i hvert dyr, derfor redusere antall nødvendige fag i forsøkene. Også er prosedyrer utført under narkose å redusere dyr smerte. I kyllinger, ville denne modell være mer hensiktsmessig enn peroral administrering sammenligne C. perfringens belastning virusets fordi færre dyr kreves ingen faktorene som kreves for å indusere sykdommen og pain kontrolleres av smertestillende . Intestinal samskrevet loop modellen er dårlig beskrevet i kyllinger og standardisering er avgjørende for optimal bruk. Dette manuskriptet gir alle nødvendige skritt for å opprette mange intestinal ligated looper i kyllinger og gir informasjon om kritiske punkter å oppnå gyldig resultater.

Introduction

Bruk av dyr modeller å studere smittsomme sykdommer som påvirker mennesker og dyr er et sentralt verktøy i vurderingen virulens faktorer regulere patogenesen av et bestemt vilkår samt å utdype strategier for å forebygge eller kurere sykdommer1. Til tross for mange fordeler med å bruke dyremodeller for å studere ulike sykdommer, er Etiske bekymringene om denne praksisen som oppstår. Forskere må redusere dyr bruk under henting signifikant og gyldig resultater. Begrepet 3 Rs prinsipper (Erstatt, Reduser og Forny) ble utarbeidet for å sikre at velferd var adressert i slike studier. Kylling nekrotisk enteritt studier brukes i vivo kylling modeller å undersøke den etiologi, forebygging og behandling av denne tilstanden2,3,4,5. Sykdomsfremkallende stammer av C. perfringens bærer bestemte virulens faktorer, for eksempel NetB gift6, administreres for å forårsake nekrotisk enteritt i kyllinger7. Erstatning prinsippet er derfor vanskelig å oppnå i så fall som disse virulens faktorer ikke kan være så avgjørende i andre dyrearter. De fleste modeller for nekrotisk enteritt i kyllinger bruker en kombinasjon av risikofaktorer, som coccidiosis og endret kosthold for å indusere nekrotisk enteritt etterfulgt av gavage kjøttkraft kultur som inneholder store mengder C. perfringens2. Disse modellene vil indusere sykdommen i en rekke kyllinger og dødelighet kan være viktig i slike forsøk8dermed øke bekymringer om reduksjon og raffinement prinsippene i Forsøksdyrutvalget.

Intestinal samskrevet looper modeller er et ønskelig alternativ for studier av sykdommer forårsaket av intestinal patogener med hensyn til prinsippet reduksjon, og raffinement. Disse modellene opprettes intestinal segmenter som kalles "looper" ved å plassere ligaturer langs tarmkanalen til uavhengige og hermetiske rom hvor patogener kan injiseres alene9 eller med andre molekyler, som vaksine kandidater 10 , 11. patogener av interesse er plassert nær kontakt med intestinal celler og etter noen timer infeksjon tid, intestinal prøver kan gjenopprettes for videre analyse. Dette tillater bruk av flere behandling og kontroll grupper i samme dyret. Statistisk analyse kan utføres med gjentatte measures modeller, som øker kraften til diskriminering mellom grupper og reduserer antallet nødvendige kyllinger sammenlignet muntlig gavage forsøk. Også utføres kirurgiske prosedyrer og påfølgende infeksjon ganger under kontinuerlig narkose og analgesi, derav som dyr smertene. Lukket sløyfe ligations er en ideell mal for å redusere vert tall og skape en mer human system i Forsøksdyrutvalget.

Intestinal samskrevet looper modeller er også beskrevet i ulike arter, som kalver, kanin og mus2,9, men dårlig beskrevet i kyllinger7. For optimal utnyttelse av denne kirurgiske modellen er riktig teknikk og utførelse avgjørende for etableringen av samskrevet intestinal looper å unngå skader på intestinal integritet. Målet med dette manuskriptet er å beskrive en steg for steg metoden i etableringen av flere intestinal looper i en kylling modell. Denne teknikken er begrenset av kirurgens dyktighet og erfaring, som nøyaktig prosedyrer er avgjørende for suksess for prosjektet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer med levende dyr bruk ble godkjent av den etiske komiteen av fakultetet av Veterinary medisin, Université de Montréal (CÉUA, «Comité d» éthique de l'utilisation des Animaux ").

1. betraktninger før kirurgi

  1. Velg 10 uker gammel bestemte patogen gratis (SPF) leghorn kyllinger for operasjonen.
    NOTE Sin vekt må være mellom 1,0 og 1,2 kg.
  2. Trekke feed 12t før fremgangsmåtene å tømme tarmkanalen.
  3. Før kirurgi, plassere kyllinger under narkose etter en protokoll bekreftet av en anesthesiologist. Premedicate hver kylling 15 min før kirurgi med en intramuscular (IM) injeksjon av midazolam 1 mg/kg og butorphanol 4 mg/kg. Gjenta, hver 4 h, injeksjon av butorphanol 4 mg/kg IM eller når puste mønster endringene og frekvens øker under anestesi. For narkose, i alle prosedyrer, administrere isoflurane i en konsentrasjon mellom 1,5 og 2,5% med et intratracheal rør.
    Merk: Bruk av premedication for sedasjon og analgesi anbefales som de vil betydelig forbedre dybden av anestesi, redusere mengden av bedøvelse nødvendig under alle prosedyrer, samt aktiverer forskere til å kontrollere smerte nivåer.
  4. Overvåke av bedøvelsen ved kroppstemperatur, hjertefrekvens og elektrokardiogram (ECG), respiratory rate og rytme, oksygenmetning, utløpt karbondioksid (CO2) og nevrologiske reflekser.
    Merk: En person må tilordnes til å overvåke disse parameterne gjennom alle prosedyrer.
  5. Følg sterilitet prinsipper gjennom de kirurgiske prosedyrene. Kontroller at kirurgen og assisterende kirurg kjole med sterilt kjoler, hansker, en maske og beskyttende briller ifølge institusjonelle preoperativ protokoller. Kontroller at kirurgen scrubs hendene med chlorhexidine gluconate impregnert sterilt pensel opp til albuen med vekt på negler og hver fingeren overflaten.
  6. Sterilisere de kirurgiske instrumentene med en sterilisere.

2. kirurgisk klargjøring

  1. For det første fjerne manuelt fjær fra magen med en mild trekkraft.
  2. Skrubbe kirurgiske området med en chlorhexidine gluconate vaskemiddel impregnert sterilt pensel. Forsiktig skrubbe huden fra center på utsiden for en kontakt totaltiden i 5 minutter uten å komme tilbake til sentrum.
  3. Utfør 3 alternativ passasjer kirurgiske området med chlorhexidine gluconate løsning og isopropyl alkohol bruker sterilt gauzes.
    Merk: Passasjen må begynne fra midten av det kirurgiske området mot å unngå forurensning fra ikke desinfisert områdene til kirurgiske området.
  4. Plass det sterile kirurgiske drapere på kyllingen.

3. utvinning av små tarmen fra bukhulen

  1. Incise det kirurgiske drapere med saks å utsette bare huden av kirurgiske området.
  2. Incise huden ved å utføre et '' L'' figur lav-midtlinjen snitt med skalpell blad #3.
    1. Start den første snittet 1 cm caudal til sternum og avslutte det på 1 cm skallen til den tidligere imot kloakk.
    2. Utføre andre innsnitt vinkelrett på den første snittet. Starte fra caudal slutten av den første snittet og fortsette 5 cm på venstre side av magen etter bekkenet linjen.
      Merk: Denne åpningen vil skape en klaff at en lettere utvinning av tarmen.
  3. Med kirurgi klippe saks, peritoneum og magemusklene med samme '' L'' figur mønster åpne bukhulen.
    Merk: Dette vil utsette luft sacs. Tarmen ligger under disse strukturene. Luft sacs må være humidified med gauzes mettet med bakteriefri saline 0,85% å unngå uttørking og mulig brudd i hele denne prosedyren.
  4. Sett inn en Snook spay kroken i bukhulen etter venstre bukveggen og arbeide på måten rundt abdominal luft sacs.
  5. Forsiktig exteriorize tarmen og spre dette ut på kirurgiske feltet.
    Merk: Holde tarmen fuktet ved ofte sprøyting sterilt saltvann 0,9% i hele denne prosedyren. Gauzes fuktet med sterilt saltvann kan også plasseres på tarmen å unngå uttørking.
  6. Grab tarmen med en tørr sterilt gasbind og trekk forsiktig ut små tarmen av manuell trekkraft til å utsette jejunum.
    Merk: Hvem fartøy er skjøre og overdreven spenninger kan brudd dem som kan føre til intestinal iskemiske lesjoner og sterkt kompromiss utfallet av prosedyren.

4. fabrikasjon av Intestinal looper

  1. Oppretting av loop nr. 1.
    1. Plass en enkelt ligatur med et polyglactin multifilament syntetiske absorberbare materiale i den proksimale jejunum ved å unngå ligatur av store hvem fartøy.
    2. Plass en distale ligatur 2 cm fra den proksimale ligaturen.
      Merk: Enkel ligaturer laget med multifilament Sutur materiale er plassert langs tarmkanalen opprette hermetiske segmenter. Et skjema (figur 1) beskriver plasseringen av alle ligaturer. Løkkene består av en proksimale og distale ligatur atskilt med 2 cm.
  2. Oppretting av interloop nr. 1.
    1. Plass en enkelt ligatur 0,5 cm aborally til den distale ligaturen av loop no.1.
      Merk: Mellom etterfølgende looper er det interloops på 1 cm, dvs segmenter gjør en fysisk separasjon mellom looper. Du kan sannsynligvis redusere mulig risiko for kryss-kontaminering fra en løkke til en annen, er en enkelt ligatur plassert midt interloop (0,5 cm fra den distale og proksimale ligaturen av 2 tilstøtende løkker). Dette reduserer risikoen for en mulig lekkasje miljøgifter fra en loop å nå ligatur av en tilstøtende løkke. Disse segmentene er ikke obligatorisk, men vil redusere risikoen for kryss-kontaminering.
  3. Oppretting av påfølgende looper og interloops.
    1. Gjenta 4.1 og 4.2 å få antall ønskede looper.
      Merk: I dette eksperimentet, 9 looper og 8 interloops ble opprettet. Totallengde utgjorde 26 cm. Antall sløyfer kan justeres avhengig av studiet.

5. injeksjon av Clostridium perfringens stammer i løkker

  1. Injisere sterile sprøyter og nål 26 G patogen i loop no.1. Forsiktig inn nålen på antimesenteric side av tarmen på en vinkel på 45 grader.
    Merk: I dette eksperimentet, 0,2 mL hjernen hjertet infusjon (BHI) som inneholder 1 x 106 CFU (kolonien danner enheter) av C. perfringens i midten av Logg vekstfase ble injisert i hver løkke. 5 ulike stammer ble injisert i 5 forskjellige ledd og 4 gjenstående looper ble injisert med en negativ kontroll som inneholder ingen bakterier (sterilt BHI), vekslende patogener og sterile BHI looper.
  2. Gjenta trinn 5.1 å injisere alle løkkene.
  3. Forsiktig erstatte tarmkanalen i bukhulen, under luft sacs dorsal området.

6. nedleggelsen av bukhulen

  1. Suture peritoneum og magemusklene.
    1. Sutur peritoneum og magemusklene langs bekkenet (laget i trinn 3.3) med en enkel Sutur kontinuerlig mønster med en polyglactin multifilament syntetiske absorberbare materiale.
    2. Sutur peritoneum og magemusklene fra sternum til den tidligere imot kloakk (gjort i trinn 3.3. med en enkel Sutur kontinuerlig mønster med en polyglactin multifilament syntetiske absorberbare materiale.
  2. Sutur i huden.
    1. Bruker en polyglactin multifilament syntetisk materiale og en enkel Sutur kontinuerlig mønster, stenge incision over huden langs bekken gjorde i trinn 3.2.
    2. Bruker samme multifilament ligatur materialet og en enkel Sutur kontinuerlig mønster, stenge incision av huden fra sternum til tidligere imot kloakk gjorde i trinn 3.2.

7. konklusjon

  1. Etter den kirurgiske prosedyrer, holde kylling under narkose med riktig bruk av smertestillende å minimere dyr smerte under infeksjon tid. Fortsette bedøvende overvåking for å sikre en tilstrekkelig anestesi.
  2. Etter den ønskede infeksjon tid, Human euthanize kylling av cervical forvridning under narkose.
    Merk: For disse prosedyrene, nødvendig tid til å indusere mikroskopiske lesjoner med C. perfringens sykdomsfremkallende stammer var 7 h.
  3. Med skalpell blad #3, kuttet en 0,5 cm til 1 cm lang loop seksjon og plasser den i 10% formalin for fiksering overnatting og ytterligere histopathological analyse.
  4. Med samme skalpell bladet, klippe den gjenværende loop seksjonen og plasser den i et sterilt microcentrifuge rør for isolering av C. perfringens stammene i hver løkke ytterligere bacteriologic analyse for deres genetisk karakterisering.
  5. Gjenta trinn 7.2 og 7.3 for alle looper ved å endre skalpell bladet mellom hver løkke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skjematisk 9 intestinal looper og 8 interloops er vist i figur 1. I denne modellen, totalt 9 looper og 8 interloops opprettes med enkel ligaturer. En løkke består av proksimale og distale ligaturer linjeavstand av 2 cm målt fra den proksimale ligaturen. To tilstøtende løkker er atskilt med en interloop på 1 cm. Du kan redusere mulig risiko for kryssforurensning mellom looper av lekkasje fra en ligatur, plasseres en interloop ligatur halvveis fra distale ligatur og proksimale ligatur av 2 tilstøtende løkker. Antall sløyfer kan justeres avhengig av kravene i studien.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av samskrevet intestinal looper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2A (HPS flekken) viser mikroskopiske utseendet på en intestinal loop injisert med en kontroll sterilt medium. Det er ingen nekrose i delen mucosal Lyngen grensen er intakt. Mild lunger kan finnes i tarmen lag (mucosa, submucosa, muscularis og serosa) av segmentene. Figur 2B (HPS flekken) viser mucosal nekrose 7 timer etter injeksjon av en sykdomsfremkallende stamme av Clostridium perfringens fra et klinisk tilfelle av nekrotisk enteritt på en kylling gård. Villi tips er erodert med nekrotisk enterocytes rundt villi tips. I nekrotisk materialet rundt villi, er klynger av store stav-formet bakterier observert (piler). Disse bakteriene ble ytterligere identifisert som Gram-positive bakteriene med en Twort flekk (ikke vist). Dette funnet, kombinert med isolering av bakteriell stort antall Clostridium perfringens, angir lesjonene var forårsaket av denne bakterien. Figur 2C (HPS flekken) viser histologiske lesjoner av en iskemiske løkke, der nekrose er ikke relatert til injeksjon av patogene C. perfringens stammene, men resultatet av dårlig utført prosedyrer. Denne forstørrelsen viser alvorlige koagulering nekrose som kan feiltolkes som lesjoner forårsaket av Clostridium perfringens. Men er ingen bakterier observert i denne delen. Blodårene i muskel laget er også sterkt utvidet ved Oppsamling av store mengder degenereres erytrocytter (piler). Dette er tegn på vaskulær lunger og i dette tilfellet lunger skyldtes samskrevet hvem blodkar. Iskemiske looper kan lett identifiseres macroscopically under de kirurgiske prosedyrene; etter alvorlige vaskulær lunger blir serosa mørk blå i stedet for det normale rosa-rød farge.

Figure 2
Figur 2: Histopathologic funn 7 h etter infeksjon. (A) det er ingen nekrotisk lesjoner i mucosa på histopatologi etter injeksjon av hjernen hjertet infusjon (BHI), en steril kultur medium. (B) i løkker injisert med en sykdomsfremkallende stamme av Clostridium perfringens, det merket nekrose mucosa med mange store Gram-positive stav-formet bakterier dekker mucosa. (C) iskemiske lesjoner kan ligne nekrotisk lesjoner forårsaket av C. perfringens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I denne studien ble looper injisert med et sterilt kontroll kultur medium (BHI) eller en av de fem ulike stammene av Clostridium perfringens utvinnes fra ulike antibiotika gratis kylling flokker berørt eller ikke med nekrotisk enteritt12 . Ti kyllinger ble brukt i denne studien. Stammer virusets kunne bestemmes basert på evnen til å forårsake gjentatte ganger lesjoner kompatibel med nekrotisk enteritt til mucosa. Mens stammer fra kliniske tilfeller av nekrotisk enteritt viste muligheten til å forårsake mucosal nekrose 7 h etter infeksjon, stammer utvinnes fra klinisk sunn kylling gårder få ikke mucosal nekrose og mucosa var normal funn fra de sløyfer injisert med BHI12. Ved hjelp av mange løkker i samme dyret, kan fem C. perfringens stammene og fire sløyfer brukes i samme fuglen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intestinal looper modeller har blitt beskrevet i mange arter å studere vert-patogen samhandling og patogenesen av sykdommer forårsaket av ulike intestinal patogener, som Clostridium perfringens, Clostridium difficile og Salmonella enterica7,9,13,14,15. Det er også brukt til å analysere mucosal immunrespons16, effekten av antistoffer til å nøytralisere bakteriell giftstoffer utskilles av intestinal patogener11 og vurdere vaksine kandidater for å hindre tarm sykdommer10 . Men denne modellen med mange ligated looper i en enkelt individuelle dyr er dårlig beskrevet i kyllinger og standardisering av denne teknikken er obligatorisk å få gyldig resultater som utilstrekkelig manipulasjoner kan føre til falske resultater og feiltolkninger . Dette manuskriptet viser skapelsen av 9 påfølgende samskrevet looper ligger i jejunum og ileum av kylling mage-tarmkanalen. Denne studien brukt bestemte patogen gratis (SPF) leghorn hann kyllinger veier mellom 1,0 og 1,2 kg. Maksimalt antall sløyfer tillates av denne rasen denne vekt var 9, siden 26 cm av små tarmer kan lett exteriorized fra coelomic hulrom. Det er ikke utelukket at ved hjelp av en annen rase og/eller en tyngre leghorn hann kylling, antall sløyfer opprettet kan være forskjellige, enda høyere enn 9. Intestinal looper lengde kan også endres, men hvor 2 cm ble regnet som optimalt å tillate prøvetaking for histopatologi og bakteriell mens du bruker den maksimale kapasiteten tilgjengelig intestinal lengden.

Intestinal samskrevet loop teknikken er beskrevet i denne artikkelen kan være et nyttig alternativ til den aktuelle modeller tilgjengelig å studere nekrotisk enteritt i kyllinger forårsaket av Clostridium perfringens. Ifølge resultatene beskrevet i en tidligere artikkel12, var evaluering av 5 C. perfringens stammene med 10 kyllinger tilstrekkelig til å skille svært virulente og commensal stammer av C. perfringens. Sammenligning krever andre infeksjon modeller bruke per os vaksinering til å gjengi nekrotisk enteritt med C. perfringens et stort antall individer å oppnå det samme resultatet. I litteraturen, antall fugler måtte vurdere virulens av C. perfringens stammene varierer fra 10 til 30 kyllinger per gruppe17,18,19 til hundre verter per gruppe20. I forhold til raffinement prinsippet dyr bruk i forskning, ville det anbefales å bruke teknikken krever det laveste antallet verter for å få betydelige resultater. Intestinal samskrevet loop modellen beskrevet i denne artikkelen er mest sannsynlig modellen krever det laveste antallet kyllinger å sammenligne virulens av C. perfringens stammene.

Siden krysskontaminering av lekkasje fra en ligatur kunne evalueres etter C. perfringens kultur og karakterisering av pulserende feltet gel geleelektroforese (PFGE) mange dager etter prosedyrer, var av aller største betydning å minimere denne risikoen ved 1 cm interloops som inneholder en interloop ligatur halvveis mellom 2 tilstøtende looper. Ved å ta disse forholdsreglene, var det mulig å unngå en mulig kryssforurensning. Faktisk, mens sykdomsfremkallende stammer forårsaket mikroskopiske nekrose leksjonen overensstemmende med nekrotisk enteritt, det var ingen betydelig mikroskopiske lesjoner i tilstøtende looper injisert med ikke-patogene C. perfringens stammene eller BHI kultur medium negativ kontroll. Dette var indikativ at ulike stammer kan injiseres trygt i tilstøtende intestinal ledd av samme kylling.

En av de mest utfordrende problemene med denne modellen var exteriorization av små tarmen uten at ventilasjon og intestinal endometrial blodkar. Fugler har en annen luftveiene enn pattedyr. Membranen er fraværende, og ventilasjon styres av airsacs, tynne vegger strukturer i bukhulen. Det er 7 av disse i kyllinger deles i livmorhalsen (1), anterior thorax (2), bakre thorax (2) og abdominal (2) luft sacs. Disse ballong-lignende strukturer er direkte koblet til lungene og tillate flytting av luft i luftveiene. Ved åpning bukhulen mellom sternum og tidligere imot kloakk, abdominal airsacs er fremtredende og tendens til å være lett sprukket, spesielt hvis tørr. Derfor er konstant luftfukting med gauzes dempet med bakteriefri saline viktig å lette tilstrekkelig ventilasjon og anestesi under prosedyrer. Det kan også være vanskelig å unngå små punkteringer i abdominal airsacs mens exteriorizing tarmen av bukhulen. Det er viktig å overvåke bedøvende parametere, for eksempel respirasjonsfrekvens og mønster, palpebral reflekser, hjertefrekvens og kylling bevegelser, sørge for kylling forblir under en tilstrekkelig flyet av anestesi. Liten luftlekkasje er mindre sannsynlig å påvirke kvaliteten på anestesi, men denne lekkasje minimeres. Det er viktig å lukke hermetisk peritoneum etter prosedyrene. Dette vil gjenopprette interne lufttrykket og ventilasjon kommer tilbake til det normale etter dette trinnet. Etter nedleggelsen av denne strukturen, bør det være ingen luftlekkasje fra magen. Dette kan kontrolleres ved å sprøyte en liten mengde sterilt saltvann på bildet og se etter boble formasjon som angir luft kommer fra bukhulen. Hvis dette skjer, kan ekstra enkelt hud suturer plasseres på luft lekkasje området.

En annen teknisk utfordrende aspekt knyttet til risikoen for iskemiske lesjoner utvikler i tynntarmen på grunn av dårlig utført kirurgiske prosedyrer. Ischemia skjer når det finnes en begrensning av blod forsyning til vev, forårsaker mangel på oksygen og andre molekyler nødvendig for cellenes stoffskifte. I dette tilfellet tarmen blir raskt macroscopically mørk blå i stedet for rosa-rød og intestinal slimhinnene cellene vil degenerere raskt. Dette vil føre iskemiske lesjoner relatert til injisert patogen og det vil forstyrre histopathological tolkningen. To problematiske situasjoner kan føre til iskemi. Først får ligatur av hvem fartøy av inadvertence denne tilstanden. Derfor er det avgjørende å se nøye på plasseringen av ligaturer langs tarmkanalen å unngå inkludert hvem fartøyene. Andre kan iskemi skje hvis blødninger av hvem fartøyene oppstår under prosedyrene. Disse strukturene er tynne vegger og skjør. Overdreven spenning kan føre til deres brudd og mens manuelt exteriorizing tarmen, oppmerksomhet bør gis til spenningen på hvem fartøyene å sikre deres integritet i dette trinnet. Hvem fartøy blødning kan også oppstå hvis dette er punktert med en kirurgisk Sutur nål. Kirurgen må se nøye på hvor gjennomboret gjennom mesentery med nålen. Blødning kan bli stoppet i begge situasjoner, men den koagulering prosessen vil stoppe eller redusere betydelig blodstrømmen til disse intestinal segmenter, derfor forårsake irreversible lesjoner og å svekke gyldigheten av resultatene.

Denne modellen er nyttig for studiet av vert-patogen interaksjoner og patogenesen av tarm sykdommer forårsaket av smittestoffer. Modellen kan tilpasses avhengig av studiet ved å endre antall sløyfer opprettet eller ved å endre lengden på hver hempe. Før du implementerer slike endringer, er det anbefalt å standardisere metoden for å sikre betydelige resultater. Begrensninger av denne teknikken er dyktighet orienterte bare riktig utdannet personell skal utføre denne operasjonen på levende dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av stolen i fjørfe forskning (M. Boulianne) fra Veterinary fakultet over Université de Montréal. Dr. Boulianne og overordnede utviklet modellen. Dr. Boulianne og overordnede fremført operasjoner. Dr. Burns bistått i utviklingen av anestesi-protokollen. Dr. Parent redigert video og skrev manuskriptet. DRS Burns, Desrochers og Boulianne endret manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Scrub 747 Becton Dickinson and Company 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes 
Isopropyl alcohol 70% USP 4 L Commercial isopropyl alcohol P016IP70 Web address: http://www.comalc.com/products/
Chlorexidine Sigma-Aldrich 282227-1G Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z
WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration Veterinary Specialty Products 32724 Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.
detail&productgroup_id=15
Scalpel blades #3 Swann-Morton 301 Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Sterile saline NaCl 0.9% Sigma-Aldrich S8776-100ML Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr&region=CA
Vicryl 3-0 Ethicon D9003 Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Syringe 1 ml with 26G needle Becton Dickinson and Company 329652 Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion Sigma-Aldrich 1104930500 Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr&region=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf tube Sigma-Aldrich T9661-500EA Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh
30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Formalin solution, buffered neutral, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr&region=CA
Clostridium perfringens strains Université de Montréal, Chaire en recherche avicole N/A Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2, (1), 1-4 (2015).
  2. Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. (2015).
  3. Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41, (1), 112-116 (1977).
  4. Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21, (2), 230-240 (1977).
  5. Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56, (4), 1229-1231 (1977).
  6. Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4, (2), e26 (2008).
  7. Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32, (6), 503-512 (2009).
  8. Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45, (3), 365-369 (2016).
  9. Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149, (1), 103-112 (2013).
  10. Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47, (1), 52 (2016).
  11. Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12, (1), 101 (2016).
  12. Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46, (2), 138-149 (2017).
  13. Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7, (9), e45608 (2012).
  14. Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68, (12), 7122-7125 (2000).
  15. Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40, (1), 5 (2009).
  16. Gerdts, V., et al. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256, (1-2), 19-33 (2001).
  17. Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
  18. Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16, (3), 289-292 (2010).
  19. Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142, (3-4), 323-328 (2010).
  20. Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51, (4), 834-839 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics