Laser fange Microdissection av svært ren trabekulært Meshwork fra musen øyne for Gene Expression analyse

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her beskriver vi en reproduserbar laser fange microdissection (LCM) er en protokoll for å isolere trabekulært meshwork (TM) for nedstrøms RNA analyse. Muligheten til å analysere endringer i byggkorn under TM vil hjelpe forstå underliggende molekylære mekanismer av TM-relaterte okulær sykdommer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Laser fange microdissection (LCM) har tillatt gene expression analyse av enkeltceller og beriket celle populasjoner i vev deler. LCM er et flott verktøy for å studere molekylære mekanismer underliggende celledifferensiering og utvikling og progresjon av ulike sykdommer, inkludert glaukom. Grønn stær, som omfatter en rekke progressive fiberoptisk neuropathies, er den vanligste årsaken til irreversible blindhet i verden. Strukturelle endringer og skader innenfor de trabekulært meshwork (TM) kan resultere i økt intraokulært Press (IOP), som er en stor risikofaktor for å utvikle glaukom. Men er de presise molekylære mekanismene involvert fremdeles dårlig forstått. Muligheten til å utføre gene expression analyse vil være avgjørende i å få ytterligere innsikt i funksjon av disse cellene og dens rolle i regulering av IOP og glaukom. For å oppnå dette, beriket en reproduserbar metode for å isolere svært TM fra frosne deler av musen øyne og en metode for nedstrøms gene expression analyse, som RT-qPCR og RNA-Seq. Metoden beskrevet her er utviklet for å isolere svært ren TM fra musen øyne for nedstrøms digital PCR og microarray analyse. Dessuten, kan denne teknikken lett tilpasses for isolering av andre høyt anriket okulær celler og celle rom som er vanskelig å isolere fra musen øyne. Kombinasjonen av LCM og RNA analyse kan bidra til en mer omfattende forståelse av mobilnettet hendelsene underliggende glaukom.

Introduction

Grønn stær er en gruppe sykdommer preget av fiberoptisk nevropati og retinopati som til slutt fører til irreversible blindhet1,2. Det er anslått at av 2020 over 70 millioner mennesker over hele verden vil leve med noen form for sykdom3,4,5,6,7. Primære åpen vinkel glaucoma (POAG), den mest utbredte typen glaukom, er preget av en nedgang i aqueous humor (AH) strøm fører til økt intraokulært Press (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Venstre ubehandlet, kronisk opphøyet IOP fører til progressive og irreversibel skade på netthinnen og synsnerven hodet forårsaker radial blindhet1,2,19. Alle gjeldende metoder for å senke progresjonen av glaukom fokuserer på å redusere IOP, enten ved å redusere hastigheten på produksjon av AH av ciliary kroppen eller forbedre sine ut1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabekulært meshwork (TM) spiller en viktig rolle i å regulere aktivt primære AH strøm veien og dens feil funksjon er en utløsende faktor for Hypertensiv glaukom1,2,19. Imidlertid molekylære mekanismer knyttet TM dysfunksjon og hvordan å regulere AH drenering er ennå ikke fullt ut forstått og er for tiden av glaukom forskning1,2,19, 20. mens flere genomet hele association studier (GWAS) har koblet en rekke gener til grønn stær og økt motstand mot AH strøm anlegg på TM, nøyaktig molekylære mekanismer som føre til sykdom ikke er ennå fullt ut forstått21 , 22 , 23 , 24 , 25.

Dyremodeller har kraftig forbedret vår nåværende kunnskap av sykdomsprogresjon i glaukom (mye-omtalt i3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Flere banebrytende metoder har blitt utviklet for å studere TM34,35,36 , og disse metodene har vært mye brukt til å fremme vår nåværende forståelse av normal og sykt vev. Et område som ikke har utforsket mye er bruk av genmodifiserte musen modeller å studere molekylære mekanismer for TM svikt. Transgene knock-i og banke ut musen studier av TM forbundet gener som Myocilin (Myoc)37,38 og Cyp1b139, er hovedverktøyene du bruker når du studere molekylære mekanismer for TM funksjonen. Forståelig nok, den lille størrelsen på TM i mus representerer et alvorlig hinder som må overvinnes for å begynne å studere dette vevet. Musen modeller representerer et kraftig verktøy for å studere genetikk og molekylære mekanismer av sykdom, mens fremskritt i LCM teknologi gir nødvendig verktøy for å styrke studiet av de minste og mest delikate vev, inkludert TM.

I denne rapporten er en robust og reproduserbar metode beskrevet for LCM av høyanriket TM fra musen øyne med påfølgende RNA isolasjon og forsterkning for nedstrøms uttrykk analyse. Lignende metoder har blitt brukt med hell i mus for å isolere andre typer øye vev40,41,42,43,44, metodikken rapporterte her kan brukes til andre diskret vev i øyet å studere RNA, microRNA, DNA og proteiner. Viktigere, gjør denne teknikken bruk av genmodifiserte mus å forstå molekylær patogenesen av TM svekkelse i grønn stær og okulær sykdom3,15,16,17 ,,18,,26,,31,,45,,46. Muligheten til å isolere TM musen øyne av LCM vil være en nyttig teknikk med å få ytterligere innsikt i molekylære mekanismer av flere øyet sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Animal Care og bruk Committee (ACUC) godkjent alle metoder for denne studien under NIEHS dyr studere forslag IIDL 05-46.

1. optimal vev samling for Laser Microdissection

  1. Få 2 til 3 måneder gammel mus, mann eller kvinne C57BL/6. Euthanize med CO2 i minst 1 min eller til åndedrett har opphørt. Fjern dyret fra buret og sikre død av cervical forvridning, halshogging eller thoracotomy.
  2. Før disseksjon, kontrollere du at alle disseksjon verktøy er rene og sterilisert.
    Merk: Fjerning av øynene buet saks og tang med taggete spissen (foretrukket størrelsen: 0,5 x 0.4 mm) vil være nødvendig.
  3. Legge musen ned på en flat overflate på siden slik at øyet er lett tilgjengelig. Forstå på canthus (hjørnet av øyet) med tang å stabilisere musen, deretter ved hjelp av buet saks, overfor kurven unna øyet, klippe rundt øyet bruke øye socket som en guide til øyeeplet kan lett bli tatt fra kontakten (bruk kurven ikke den tips av saksen).
  4. Trekk forsiktig, og ved hjelp av buet saks, kuttet synsnerven, som frigjør øyet fra orbital kontakten. Nøye fjerne ikke-okulær vev fra øyet og skyll i 1 x fosfat bufret saltvann (PBS). Gjenta 1.3-1.4 for kontralateral øyet.
  5. Blot øyet med en vev tørke fjerne fuktighet før innebygging. Plass øyet i prøven mold (25 x 20 x 5 mm3) slik at linsen og synsnerven er parallelle med benk toppen for å få sagittal deler. Embed øyne i Optimal kutte temperatur (O.C.T.) sammensatte og plassere på tørris fryse. Når frosset, lagre blokkene på-80 ° C.

2. frosne delen forberedelse til Laser Microdissection

  1. Før bruk ruge polyetylentereftalat (PET) lysbilder membran i UV kryss-linker på maks effekt i 45 minutter.
  2. Spray RNase dekontaminering løsning på penselen, tang, kopling krukker og montering chuck. Tørk grundig. Skyll med nuclease-fritt vann og tørk. Tørke ned kryostaten med 100% etanol å unngå kryss-kontaminering.
  3. Justere kryostaten til-18 ° C. Fjerne en frosset blokk fra-80 ° C fryser samtidig og levere til kryostaten med tørris. Tillate frosne blokk til equilibrate med temperaturen på kryostaten minst 10 min.
  4. Klem en liten mengde O.C.T. på montering delen (figur 1A) og fjerne vev blokken fra formen og forsiktig plassere blokken på montering chuck (figur 1B). Når vev blokken på montering chuck er frosset fast, sett inn på prøveholderen av kryostaten (figur 2A).
  5. Justere kryostaten å kutte 8 µm deler og nøye delen gjennom O.C.T. blokk å nå vev prøven. Når vev er observert, stopp skjæring, trimme frosne blokkene på alle sider ved hjelp av en ren barberblad og la 3-4 mm O.C.T. omkringliggende vev for å aktivere håndtering med maling pensel (figur 2B). Bruke en ny ren pensel i stedet for ned stabiliseringsplaten mellom hver eksempel endring å unngå eksempel kryssforurensning.
  6. Delen gjennom arbeider raskt. Flekk hver tredje delen av flom lysbildet med en rask ettrinns hematoxylin og eosin (H & E) flekken for 60 s, skyll med vann fra springen, luften tørr, klart i clearing agent og montere på et ladet glass lysbilde med en dekkglassvæske. Vis under mikroskopet og fortsette snitting til TM er tydelig i delene kutt.
  7. Når TM begynner å vises, klipp 2 seksjoner og montere på en ladet objektglass for rutine H & E flekker for å danne kart for kutting med LCM.
    Merk: Se avsnitt 3 for kart og flekker detaljer.
  8. Når første H & E tilordnet lysbildet, kutt og linje 6 føljetong 8-µm tykke snitt i kryostaten og samtidig montere på PET membran lysbildet (figur 3A, B). Overholde vev ved å skyve kort hansker tommelen langs baksiden av membranen. Etter montering, plassere PET membran lysbildet umiddelbart i en lysbilde-boksen på tørris.
    Merk: Færre deler kan monteres, men montering inndelingene på lysbildet samtidig anbefales å redusere RNA fornedrelse ved å begrense hvor lenge hver del er utsatt til romtemperatur luft.
  9. Fortsette å delen øyet, etter hver to PET membran lysbilder med 6 deler hver, samle to inndelinger på et ladet glass lysbilde å opprette et annet kart lysbilde til H & E farging. Videre snitting ca 100 føljetong 8-µm tykke snitt, til TM er ikke lenger synlig. Bekreft ved raskt flekker en del på et ladet glass lysbilde (se 2.6).
  10. Lagre alle PET membran lysbilder ved-80 ° C for senere LCM bruk.

3. H & E kart Skyv fargeprotokoll og morfologiske gjennomgang

  1. Visualiser og vurdere kart lysbildene på ladet glass lysbilder, destillert fastsette vev ved å overføre umiddelbart inn i en flekker krukke fylt med 100 mL rask fikse løsningen for 7 s. skylling lysbildet ved dyppe den i vann 10 - 20 ganger , deretter overføre lysbildet til et koblingen krukke med rent destillert vann.
  2. Fjern lysbildet fra vann og blot tørr kantene med vev tørke. Pipetter 200 µL endret filtrert Harris Hematoxylin på hver del og Inkuber for 30 s ved romtemperatur. Nøye skyll lysbildet under rennende vann fra springen til renner klar. Blot slutten av lysbildet med en vev tørke mellom hvert trinn (klatt mellom hvert trinn fra 3,2-3,5) for å fjerne overflødig væske.
  3. Sted lysbilde i 1 x PBS ved romtemperatur for 30 s. Deretter forsiktig rense lysbildet under rennende vann for 30 s.
  4. Dypp lysbildet 3 - 4 ganger i 95% etanol badekar. Bruke nok Eosin Y fargestoff løsning for å dekke vev på lysbildet og ruge 15 s ved romtemperatur.
  5. Skyll lysbildet i 95% etanol bad to ganger med 10-20 rask dips hver. Skyll lysbildet i 100% etanol bad to ganger med 10-20 rask dips hver. Deretter skyll slide to ganger i xylen bad (10-20 rask dips hver).
  6. Montere ved å bruke resinous montering medium til vev, legger dekkglassvæske nøye for å unngå luftbobler og la det tørke i panseret over natten.
  7. Se H & E lysbilder visuelt eller ved hjelp av en digital slide skanner. Identifisere kart lysbilder med TM klart synlig og tilgjengelig for skjæring. Bruk PET membran lysbilder mellom disse kart lysbilder for LCM.

4. polyetylen Terephthalate (PET) membran lysbilder prosessering og flekker

  1. Før fjerne PET lysbilder fra fryseren først forberede cresyl violet lagerløsning ved å løse opp 0,3 g cresyl violet acetate på 20 mL 75% etanol og plassere på shaker for 2 h. Filter løsningen med 0.22 µm sterilt filter enhet og butikk på 4 ° C lenger enn 6 man ths.
  2. Forberede eosin Y hydroalcoholic løsning med fersk 75% etanol i forholdet 1:4. Forberede fiksering (75% etanol) og dehydrering løsninger (75%, 95% og 100% etanol) i ren, nuclease-fri, 50 mL konisk polypropylen rørene på is. Legge til RNase hemmer hver løsning.
  3. Fjerne boksen lysbildet som inneholder frossent inndelinger fra-80 ° C fryseren og plassere den på tørris. Behandle ett lysbilde samtidig. Fastsette lysbilder ved å plassere lysbildet umiddelbart til kalde 75% etanol for 30 s.
  4. Forsiktig dukkert lysbildet i nuclease-gratis vann i 10-15 s å oppløse O.C.T. uten å forstyrre delene vev.
  5. Nøye Pipetter 300 µL av 1,5% cresyl violet acetate løsning direkte på delene og ruge for 45 s ved romtemperatur. Deretter vaske én gang ved å plassere den i 75% etanol badekar for 30 s. Pipette 200 µL eosin Y løsning på delene og ruge for 3-5 s.
  6. Tørke vev ved å plassere lysbildet senere i 75% etanol, 95% etanol, og til slutt, 100% etanol bad for 30 s hver. Blot slutten av lysbildet med en vev tørke mellom hvert skritt å fjerne overflødig væske. La den lysbildet luften tørke helt under panseret i 5 min. Når tørr, utføre LCM umiddelbart etterpå.
    Merk: Det anbefales å unngå bruk av xylen for dette trinnet, kan forårsake vev deler til mangelfullt binding til membran lysbildet og reduserer effektiviteten av vev fange.

5. laser Microdissection med UV Laser

  1. Slå på datamaskinen og la boot. Slå på mikroskopet hvitt lys strømforsyningen. Slå på nøkkelen UV laser og en gul LED vil lyse. Start LCM programvare, la det laster fullt og en live video vises. Trykk laser på boksen kontrolleren og en grønn LED vil belyse.
  2. Laste inn en ny objektglass på mikroskopet scenen, og plasser PET membran lysbildet med farget vev side vender ned direkte på toppen av objektglass. Kontroller at membranen og av objektglass er sammenkoblet tett på mikroskopet scenen.
  3. Start LCM ved først å angi skyve grensene. Velg de laveste 4 X forstørrelse i mål-panelet (Figur 4). Deretter Definer arbeidsområdet membran lysbildet ved å flytte mikroskop xy-scenen til øvre venstre hjørne der metall og membran møtes vises i live video feed, trykk på "Limit 1"-knappen og en rød firkant vises på veikart. Deretter flytter til xy-fase til motsatt hjørne og trykk på "Begrens 2"-knappen. Trykk på "scan" for å skape et veikart bilde av membran og vev mellom angi grensene.
  4. Dobbeltklikk nær TM en av øyet delene i veikart, TM kan plasseres nær toppen av iridocorneal vinkelen (figur 5A). En gang TM er identifisert, kan du øke forstørrelsen til 10 X og manuelt fokus på TM. Gjenta med 20 X og 40 X mål. Når TM er i fokus med 40 X målet (figur 5B), navigere til et tomt område i nærheten (fokus må justeres litt), velg "Frihånd tegneverktøyet" og tegne en lang linje på et tomt område i vev.
  5. Angi parameterne laser slik at "kutt hastigheten" er 34% "fokus" er 58% og "makt" er 70% (Figur 4), og trykk på "cut"-knappen. Justere fine laser hastigheten, fokus og makt parametere til en klar og fin kutte linje er observert (se figur 5C). For nøyaktig skjæring, sikre skjærende følger tegnet linjen.
  6. Last isolasjon tube lokket inn i cap-holderen og åpne røret. Knytte cap-holderen til cap-heisen og kontroller at røret er invertert. Forsikre at limet cap materialet stikker utover spissen av lokket til å sikre at den ønskede vev er riktig fanget.
  7. Velg "Manuell" disseksjon modus i programvare-panelet. Lese nøye gjennom at TM (figur 5B) er direkte under isolasjon tube. Angi hvitbalansen og justere lysstyrke for å få optimal bildekvalitet (Figur 4).
  8. For å starte kutte, manuelt justere fokus og tegne ved hjelp av verktøyet frihånd, sørg for at samlingen lokket forblir i øvre posisjon ikke berøre membranen. Trekke delvis sirklene nær der TM møter sclera (figur 5C), trykk deretter "cut." Når de første kuttene er ferdig, plasser lokket i ned stilling og Juster fokus, så trekke to linjer i åpen eller ledig plass til å koble de to delvise sirklene å fullføre sirkelen rundt TM, så presse "cut" og samle vev fra delen , sikre at TM ble plukket opp av microdissection cap (Figur 5 D-F).
  9. Plasser lokket tilbake i den aktuelle stillingen og gjenta (5.2-5.8) på de gjenværende delene. Finjustere cap stillingen så alle isolerte prøvene vil passe på hetten og ikke overlapper (figur 5G). For konsistens er tidsvinduet for ett lysbilde 20 min. Bruk færre deler per kjæledyr Skyv hvis mer tid er nødvendig for å isolere TM fra alle deler. For neste PET membranen, sette inn en ny isolasjon tube og gjenta seksjon 5.

6. lysis av Microdissected TM vev

  1. Fersk forberede RNA lyseringsbuffer til lyse LCM isolert vev. Legge til 10 µL β-mercaptoethanol hvert 1 mL av lyseringsbuffer. Lagre lyseringsbuffer med β-mercaptoethanol ved romtemperatur i mer enn 1 måned.
  2. Fjerne isolasjon tube fra cap innehaveren innen 20 min fra begynnelsen av microdissection. Visualisere cap overflaten av øye å sikre erobringen av TM.
  3. Nøye Pipetter 10 µL lyseringsbuffer på lokket av samling rør sikre lyseringsbuffer dekker helt microdissected TM. Forsiktig Lukk selvklebende cap og ruge samling rør opp-ned ved romtemperatur for 10 min. Etter inkubasjon sentrifuge 800 x g i 2 minutter og plasser lysate på tørris. Lagre lysates ved-80 ° C for senere rensing og analyse.

7. RNA isolering og analyse av kvalitet

  1. Analysere RNA kvaliteten ved tining samples ved romtemperatur. Bassenget sammen alle prøver isolert fra en enkelt mus i en RNase-fri 1,5 mL microfuge tube.
    Merk: For eksempel hver biologiske replikere, 10-12 rør med microdissected caps i 10 µL lysate ble generert og alle lysates ble overført til et enkelt rør for hver biologiske replikere (100-120 µL lysate).
  2. Legge ett volum av nylagde 70% etanol (laget med RNase-fritt vann) til hver lysate løsning. Deretter rense totale RNA følge RNA isolering kit bruker retningslinjene. Sikre fjerning av genomisk DNA fra hver RNA prøve.
    Merk: Genomic DNA kan påvirke nedstrøms RNA analyse.
  3. Måle kvaliteten på RNA isolert fra TM av pooling sammen prøver fra hver musen og analysere ribosomal RNA integriteten (figur 6A).
    Merk: Den lille størrelsen på TM, ribosomal RNA topper kanskje ikke er observerbare (figur 6B) i RNA kvalitet profilen (to toppene observert mellom 1000-4000 bp i figur 6A, C) som brukes til å beregne RNA integritet nummeret (RIN) 47.
    1. Få en mer nøyaktig måling av RNA integritet av aisolering RNA fra mer rikelig gjenværende vev på membran lysbildet. For å få en representant RIN, isolere RNA fra okulær-vevet lysbildets membran av pipettering 10 µL lysis buffer på en vev delen og utføre RNA isolasjon. Analysere RNA kvalitet og beregne RIN (figur 6C).
  4. For nedstrøms RNA programmer isolerte bruk en lav input RNA kit for sekvensering og cDNA bibliotek generasjon å gi reproduserbar resultat som 80 deler av LCM TM.

8. analyse

  1. For å bekrefte at vevet samlet er faktisk beriket i TM-assosiert gener, samle flere ekstra RNA fra microdissected hele øyet, sclera, iris, netthinnen, hornhinnen og linsen fra 3 separate mus. Bruk denne RNA i kombinasjon med LCM samlet RNA fra isolerte TM og ciliary kropp fra 4 separate mus.
  2. Konvertere RNA fra microdissected prøvene var å cDNA med en cDNA omvendt transkripsjon kit. Forsterke RNA fra LCM isolert prøver og konvertere til cDNA ved hjelp av en lav input RNA cDNA Kit.
  3. Analysere alle RNA for trabekulært meshwork uttrykke genene, myocilin (MYOC) og alpha-utgangen-2 (ACTA2), og normalisere bruker HSP90a1 housekeeping genet av digitale PCR (figur 7A-B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LCM samlet RNA fra TM og ciliary kropp fra 4 forskjellige mus ble isolert for å kunne analysere genuttrykk og sammenligne uttrykket som i hele øyet, sclera, iris, netthinnen, hornhinnen og linsen isolert fra tre separate mus. TM uttrykke genene, ble MYOC48 og ACTA249 analysert i alle innsamlede vev å bekrefte at isolert TM prøvene var faktisk høyanriket i TM. På grunn av ekstremt lavt antall cDNA fra LCM prøvene ble digital PCR brukt, som har vist seg for å være mer reproduserbar med mindre materiale50. Uttrykk for MYOC og ACTA2 var normalisert bruker HSP90a1 housekeeping genet, så hvert vev ble sammenlignet med hele øyet. Disse resultatene viser at MYOC (figur 7A) og ACTA2 (figur 7B) er svært uttrykt i TM utvalgene, bekrefter vellykket isolering av høy kvalitet fra høyanriket TM prøvene for nedstrøms RNA analyse. Som bevis på konseptet, ble denne teknikken brukt til TM-isolert RNA forberedt fra WT mus og en stamme av mus med en forhøyet IOP fenotypen og analyseres av microarray. Denne analysen identifiserte mange gener involvert i glaukom som uttrykkes ulikt mellom TM av WT musene, og de av mus med glaukom fenotypen (figur 7C).

Figure 1
Figur 1: plassering av frossent blokkere i kryostaten. (A) O.C.T montering medium brukes kryostaten montering delen. (B) frosset prøveblokken er jevnt plassert på montering chuck. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: snitting prosedyren for frosne øyevevet i kryostaten. (A) utarbeidelse av skjæring overflate å nå øyevevet. (B) Trimming O.C.T. av frosne blokken før samle deler for laser microdissection. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: utarbeidelse av frosne snitt i kryostaten. (A) 6 føljetong 8 µm tykk deler er stilt opp i kryostaten. (B) deler er samtidig montert på PET membran lysbildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: skjermbilde av laser microdissection programvare fremheve viktige funksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: trabekulært meshwork og UV laser parameterinnstillinger for riktig isolering av trabekulært meshwork. (A) lav (4 X) forstørrelse på ett enkelt avsnitt på PET membranen fremhever den trabekulært meshwork for laser microdissection. (B) høy (40 X) forstørrelse av trabekulært meshwork og tilstøtende vev. (C) første delvis sirkelen kutt på TM nær Innbukking regionen med cap i øvre posisjon. (D) Final kutt i ledig plass fullføre sirkelen rundt TM med cap i nedre posisjon. (E) TM fjernet fra delen og (F) festet til dekselet. (G) kuttet inndelingene kuttet fra samme PET membranen ikke overlapper overholdt til hetten. S (Sclera), SC (Schlemms kanalen), TM (trabekulært Meshwork), AC (fremre kammer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Total RNA avkastning og kvalitet estimering innhentet fra microdissected trabekulært meshwork vev. (A) totale RNA fra 80 deler av trabekulært meshwork (tilnærmet størrelse var 0,8 mm2). (B) Total RNA fra 20 deler av trabekulært meshwork (tilnærmet størrelse var 0.2 mm2). (C) Total RNA fra gjenværende øyevevet etter laser microdissection. RIN, RNA integritet tall; BP, base parene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: nedstrøms RNA analyse av LCM isolert trabekulært meshwork. Kvantitativ digital PCR analyse av TM-assosiert gener i TM isolert av LCM. TM-assosiert genene (A) MYOC (B) ACTA2 svært uttrykt i LCM fanget TM prøver i forhold til andre øye vev. (C) Heatmap generert fra data fra microarray analyse av trabekulært meshwork RNA isolert fra WT mus og KO mus med en forhøyet IOP fenotypen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: sammenligning av vev forberedelse før og etter optimaliseringen. Øye deler skåret og plassert på PET membran lysbilder med (A) standard 95% etanol dehydrering utarbeidelse (B) eller optimalisert 75% etanol dehydrering utarbeidelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TM spiller en viktig rolle i å opprettholde aktivt homøostatisk IOP og dens dysfunksjon er allment akseptert som den viktigste utløsende faktoren for Hypertensiv glaukom1,2,19. En rekke single nukleotid polymorfismer i flere gener identifisert av GWAS analyse har vært knyttet til økt glaukom risiko og økt motstand mot AH strøm anlegg på TM; men er de presise molekylære mekanismene som gir opphav til denne sykdommen ennå ikke fullt ut forstått21,22,23,24,25. Genetisk musen modeller kan gi et kraftig verktøy for å studere molekylære mekanismer for glaukom. Men representerer den lille størrelsen på musen TM vev en formidabel utfordring for isolering av svært-beriket TM fra musen øyne og høy kvalitet RNA for gene expression analyse. LCM er en verdifull teknikk for å isolere et enkelt eller lavt antall celler og kan brukes til å studere genuttrykk i vevsprøver beriket for spesifikke celletyper. I denne studien er en robust og reproduserbar LCM metoden beskrevet å isolere høyanriket TM og høy kvalitet RNA som kan brukes til å studere regulering av genuttrykk og celle signalisering i TM. I tillegg kan metoden beskrevet LCM også brukes til andre vev i øyet.

LCM teknologi og en høy oppmerksomhet på detaljer for optimalisering av vev håndtering spilte en viktig rolle i den vellykkede utviklingen av denne metoden. Metodikk vev bevaring og isolasjon er en viktig komponent i isolere høykvalitets RNA for gene expression profilering. LCM krever en meget høy oppmerksomhet på detaljer i dissekere, og kryosnitt, fiksering, flekker, dehydrering, og varighet av laser microdissection skal lykkes i å få kvalitet RNA51. Vev snittykkelsen kan økes; men som tykkelse øker, så UV laser kraften som trengs. Økt laser makt resultater i en bredere laser bane som kan forårsake RNA degradering. Det ble funnet at laser banen med 8 µm deler var tynn og gitt nok tissue for nedstrøms RNA analyse. Figur 8 viser hvordan optimalisering av vev preparatet kan drastisk endre muligheten til å laser dissekere TM fra øyet. Optimalisering av dette trinnet i protokollen (som beskrevet i Seksjon 4) gitt overlegen okulær-vev immobilisering og fullstendig fjerning av O.C.T. (figur 8B) ved å bruke 75% i stedet for 95% etanol (figur 8A) for å tørke vevet etterfulgt av inkubasjon i RNase-fritt vann fjerne monterer medier. Videre dehydrering og flekker oppnås ved hjelp av alkohol-basert flekker reagenser. I tillegg ble det funnet at alkohol-basert flekker reagenser gitt overlegne resultater i forhold til vandig flekker reagenser (vannbasert cresyl fiolett eller hematoxylin) og ytterligere beholder RNA integritet52. Generelt behandler okulær vev med optimalisert protokollen med alkohol-basert flekker reagenser gitt konsekvent okulær-vev deler som var fullt immobilisert på PET membran lysbildet.

Vårt mål for denne studien var å utvikle en robust og pålitelig metode for å isolere høykvalitets mRNA fra TM musen øyne for nedstrøms uttrykk analyse for å få innsikt i molekylære mekanismer som ligger til grunn for forhøyet IOP og glaucoma. Som vist i heatmap i figur 7C, gir beskrevet protokollen for skille TM av LCM en svært pålitelig metode for å isolere RNA fra TM og studere forskjeller i byggkorn under TM fra vill type og mutant mus. Metoden beskrevet her vil tillate etterforskere utføre molekylær analyse på en vev sentralt i patogenesen av glaukom i en i vivo system som er relativt enkel og pålitelig, og kan brukes på gene expression analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86, (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377, (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32, (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80, (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90, (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82, (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73, (1), 115-121 (1995).
  8. Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126, (4), 487-497 (1998).
  9. The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126, (4), 498-505 (1998).
  10. The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130, (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14, (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120, (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120, (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121, (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4, (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8, (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2, (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40, (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29, (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4, (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11, (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12, (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57, (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15, (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75, (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120, (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21, (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24, (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52, (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28, (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183, (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91, (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280, (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30, (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10, (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416, (1), 123-125 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics