人多潜能干细胞第一心场样心脏祖细胞和心室样细胞的生成

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

在这里, 我们描述了一种可伸缩的方法, 使用激活 a 和慢病毒北疆介导的 Id1-overexpression 的简单组合, 从人类多潜能干细胞中生成第一个心场样的心脏祖细胞和心室样心肌细胞。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yu, M. S., Spiering, S., Colas, A. R. Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57688, doi:10.3791/57688 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

大量的功能性人类多潜能干细胞的产生是基于细胞的心脏治疗和疾病建模的先决条件。我们最近表明, Id 基因是必要的, 足以指定第一个心脏领域祖细胞在脊椎动物的发展。这种分化协议利用这些发现, 并使用 Id1 过度表达结合激活 A 作为有力的指定线索, 以产生第一个心脏场状 (FHF) 祖细胞。重要的是, 由此产生的祖细胞有效地区分 (~ 70–90%) 成心室状心肌。这里我们描述了一个详细的方法到 1) 生成 Id1-overexpressing hPSCs 和 2) 区分可伸缩数量的 cryopreservable FHF 祖细胞和心室样心肌。

Introduction

大规模生产人多潜能干细胞 (hPSCs) 源性心脏祖细胞和心肌细胞是干细胞治疗的先决条件1, 疾病建模2,3和快速表征新的路径调节心脏分化4,5,6和生理学7,8。虽然一些研究9,10,11,12,13,14,15以前描述高效心脏分化协议从 hPSCs, 没有解决导致心肌细胞的心脏领域起源, 尽管辨认重要分子区别左 (第一心脏领域) 和权利 (第二心脏领域)心室心肌细胞16与心场特异性先天性心脏病的存在;发育不良左心综合征17或致心律失常右心室发育不良18。因此, hPSCs 的心源和心肌细胞的产生是提高其作为治疗和疾病建模工具相关性的必要条件。

这个协议依赖于 Id1 的本构表达, 最近确定的5第一心脏领域-指定提示, 结合激活 a, 是必要的, 足以启动 cardiogenesis 在 hPSCs。值得注意的是, 坎宁安。(2017)5显示 Id1-induced 祖细胞特别表达第一心脏领域 (HCN4, TBX5), 但不是第二心脏领域标记 (SIX2, ISL1), 当他们接受心脏分化。此外, 作者还表明, 转基因小鼠胚胎缺乏完整的基因家族 (Id1-4), 发展不形成第一心脏领域的心脏祖细胞, 而更多的内侧和后心脏祖细胞 (第二心脏领域) 仍然可以形成, 从而表明, Id 蛋白是必不可少的启动第一心脏领域 cardiogenesis在体内。方便地, Id1-induced 祖细胞可冷冻保存, 自发分化为心肌样特征, 包括心室特异性标记 (IRX4MYL2) 表达和心室状动作电位。

在这里, 我们描述了一个简单的和可伸缩的方法, 以产生第一个心脏场样 (FHF) 心脏祖细胞和心室样心肌 Id1 overexpressing hPSCs。该协议的一个重要特点是, 通过一个方便的超低温保存步骤, 拆的心肌祖细胞产生的可能性。总之, 本协议详细说明了必要步骤 (1) 生成 Id1-overexpressing hPSCs, (2) 从 hPSCs 生成 FHF 心祖细胞, (3) cryopreserve 产生祖细胞, (4) 恢复 FHF-l 心祖分化, 生成高度丰富的 (> 70–90%) 跳动的心室状心肌细胞。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Id1 病毒的制备和感染

  1. 由转染 pCMVDR8.74、pMD2、pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene: 质粒 #107735) 生成 Id1 overexpressing 慢病毒北疆 HEK293T 细胞。收集病毒粒子, 滤液, 从上清纯化, 并存储在-80 摄氏度, 如在次郎。(2003)19. 或者, 通过向慢病毒北疆生产的供应商发送 pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR, 在商业上生产 Id1 慢病毒北疆。
    注意: 请遵守慢病毒载体安全法规和标准操作协议。
    注意: 重要的是: 最佳病毒效价应至少为 108至 109传感单位/毫升 (TU/毫升)。
  2. 在感染之前, 用50µl 的涂层试剂涂上一层96的井板, 通常是由 Engelbreth-圣群小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶蛋白混合物 (见材料表)。
  3. 在6井板中, 加入1毫升的 PBS, 不含钙2 +2 +和0.5 毫米 EDTA, 将一井中的多能干细胞分离出来。
    注: 离解时间从3–10分钟不等。当超过80% 的细胞从盘子的底部分离出来时, 继续下一步。
  4. 将无菌吸管的细胞悬浮液收集到15毫升塑料离心管中。
  5. 中和分离试剂与5毫升的 PBS 含钙2 +和镁2 +
  6. 颗粒细胞离心 (200 x g 3 分钟)。
  7. 去掉上清, 轻轻地轻弹管子, 以去除颗粒。
  8. 在1毫升的干细胞培养基中重新悬浮细胞。
  9. 根据供应商说明使用自动单元格计数器计数单元格。
  10. 在50µL 的干细胞介质中, 每层2万个可行细胞 (96 井板) 辅以2µM/岩石通路抑制剂 (见表1和 2)。
  11. 24小时后, 监测细胞附件和替换介质与100µl 干细胞培养基补充2µM/岩石通路抑制剂和 6 ng/毫升铵溴 (见表 12), 一小时之前, 慢病毒载体感染。
    注意: 细胞应该牢固地附着在盘子的底部。
  12. 在冰上解冻 Id1-lentivirus。
  13. 添加3µL 的纯化慢病毒北疆每井 (病毒滴度应介于 108到 109涂/毫升), 然后转移板块回细胞培养孵化器 (37 °c, 5% CO2, 20% O2)。
  14. 24 h 病毒感染后, 将新鲜干细胞培养基的100µL 添加到受感染的细胞中。
  15. 48 h 慢病毒载体感染后, 用200µL 新鲜干细胞培养基替换含有培养基的病毒, 辅以1µg/毫升嘌呤霉素。
  16. 每天刷新媒体与200µL 干细胞介质补充1µg/毫升嘌呤霉素。
  17. 当文化达到80% 融合, 离解细胞使用200µL 的 PBS 没有钙2 +和镁2 + 0.5 毫米 EDTA (为一个井的96井板)。
  18. 将细胞悬浮液收集到离心管中。
  19. 中和分离试剂与5毫升的 PBS 含钙2 +和镁2 +
  20. 颗粒细胞离心 (200 x g 3 分钟)。
  21. 去掉上清, 轻轻地轻弹管子, 以去除颗粒。
  22. 在1毫升的干细胞培养基中重新悬浮细胞, 辅以2µM/岩石通路抑制剂。
  23. 将所有单元 (1 毫升) 转移到12井板的涂敷井中。
  24. 24小时后, 在转导前, 用1毫升的干细胞介质, 用2µM/岩石通路抑制剂和 6 ng/毫升铵溴化酶, 对井内细胞附着进行监测, 并更换培养基。
  25. 在冰上解冻 Id1-lentivirus。
  26. 添加5µL 的纯化病毒每井 (12 井板)。
  27. 24 h 后慢病毒载体感染, 取代含有1毫升新鲜干细胞培养基的病毒, 补充3µg/毫升嘌呤霉素。
  28. 48 h 后慢病毒载体感染, 替换含有1毫升新鲜干细胞培养基的病毒, 辅以6µg/毫升嘌呤霉素。
  29. 当文化达到80% 融合, 离解细胞使用500µL 的 PBS 没有钙2 +和镁2 +和与0.5 毫米 EDTA (为一个井的12井板)。
  30. 将细胞悬浮液的一半 (250 µL) 转移到一井中, 涂层试剂涂覆 6-井板, 含有2毫升的干细胞介质, 辅以2µM/岩石通路抑制剂。
  31. 使用另一半 (250 µL) 的样品 RNA 提取和 qRT PCR, 以确定慢病毒载体介导的Id1表达水平, 如在可乐。(2012)4
    注意: 重要的是: 如果Id1 mRNA 表达水平低于0.005 倍的GAPDH表达水平 (见表 3为 qRT PCR 引物), 重复感染过程如上所述, 直到 Id1 表达水平超过阈 值。

2. hPSCsId1维护

  1. 培养 hPSCsId1在涂层6个井板和增长在3毫升每井干细胞媒介补充6µg/毫升嘌呤霉素。
  2. 当 hPSCsId1达到80% 融合, 通道细胞作为骨料 (1:6 分裂比率) 使用无酶离解试剂遵循供应商指南和增长3毫升每井的干细胞培养基补充6µg/毫升嘌呤霉素。

3. hPSCsId1的制备

  1. 涂层12井板与500µL 每井涂料试剂。
  2. 当 hPSCsId1达到90% 融合离解细胞通过增加1毫升 PBS 没有钙2 +和镁2 +和以0.5 毫米 EDTA 每井为 5–10 min. 检查离解过程每分钟, 一旦80% 的细胞与板块分离, 请继续下一步。
  3. 将细胞悬浮液收集到离心管中。
  4. 中和分离试剂与5毫升的 PBS 含钙2 +和镁2 +
  5. 颗粒细胞离心 (200 x g 3 分钟)。
  6. 去掉上清, 轻轻地轻弹管子, 以去除颗粒。
  7. 在2毫升的干细胞培养基中重新悬浮细胞, 辅以2µM/岩石通路抑制剂。
  8. 使用自动单元格计数器计数单元格。
  9. 在1毫升的干细胞培养基中, 30万细胞每井均辅以2µM/岩石通路抑制剂和6µg/毫升嘌呤霉素, 并将其转移到组织培养孵化器中。
  10. 每日刷新媒体与2毫升干细胞培养基补充6µg/毫升嘌呤霉素, 直到文化达到90% 融合。在这一点上, 启动心脏分化 (下一步)。

4. hPSCsId1分化为第一心脏场样心脏祖细胞 (FHF CPs)

  1. 对于12井板格式, 启动分化 (0 天) 取代干细胞介质与1.5 毫升的感应介质 (表 1) 补充与激活 A (100 ng/毫升) (见表 2的建议体积和激活浓度不同的板格式)。
  2. 1天 (在分化开始后24小时), 用2毫升的感应介质替换介质, 而不激活 a (每井12井板)。
  3. 3天, 用2毫升的感应介质替换介质, 而不激活 a (每井12井板)。
  4. 在5天, 收集 FHF CPs 进行冷冻保存 (下一步)。
    注意: 重要的是: 在这一点上, 冷冻保存是首选, 因为它使拆的心脏祖生成从随后的心肌细胞生产和生物库大批电池。请注意, 另一种情况是, 5 天 FHF cps 可以传递到一个新的涂层板继续分化, 请参阅步骤5.1–5.5 到 passFHF CPs, 然后进行步骤6.5 的区别。

5. FHF 的超低温保存

  1. 从含有5天 FHF CPs 的水井中吸取所有介质, 并快速添加1毫升的温 (37 °c) 1x 酶的离解试剂 (见材料表)。把盘子放在组织培养孵化器里。
  2. 1分钟后, 在孵化器中摇板侧侧。
  3. 2分钟 (总时间) 后, 从孵化器取出板, 并添加1毫升10% 的血清介质。
  4. 用5毫升的吸管轻轻吸管细胞, 以促进细胞脱离板块。
  5. 用 200 x g 离心法在离心管和颗粒细胞中收集细胞悬浮液3分钟
  6. 在2毫升的冷冻保存试剂中重新悬浮细胞颗粒。
  7. 使用自动单元格计数器计数单元格。
  8. 添加冷冻剂 (见材料表) 在足够的体积, 以 cryopreserve 细胞在所需浓度 (通常 5–10 x 106细胞/毫升)。
  9. 将细胞转移到冷冻瓶中, 将瓶子放在冷却装置中 (1 °c/分钟), 并将冷却装置放在-80 摄氏度冷藏柜中过夜。
  10. 24小时后, 将冷冻小瓶转移到液氮中长期贮存。
    注意: 协议可以在这里暂停。

6. FHF 向心室状心肌细胞分化

  1. 转让日 5 FHF 从液氮储存到干冰容器的冷冻瓶。
  2. 放置小瓶在37°c 水浴为2到3分钟, 直到细胞悬浮完全地解冻。
    注意: 重要的是: 解冻过程是时间敏感的。将细胞暴露在冷冻介质中, 时间过长 (10 分钟) 会降低细胞的存活能力。
  3. 转移细胞到15或50毫升离心管, 取决于解冻瓶的数量。
  4. 分配滴状 (每30秒5滴) 预预热 (37 °c) 心源介质 (表 1) 到细胞溶液。继续这个过程, 直到1:3 冷冻介质: 心源介质比率达到。此时, 增加心源性培养基的添加率直到1:10 冷冻介质: 心源介质比达到。
    注意: 重要: 快速渗透改变会增加细胞在解冻过程中的死亡;因此, 强烈建议, 如上文所述, 滴状添加心源性介质。
  5. 离心细胞悬浮和颗粒细胞离心 (200 x g 3 分钟)。
  6. 移除上清液, 轻轻轻拍离心管, 取出细胞颗粒。
  7. 再悬浮细胞与心源介质补充2µM/岩石通路抑制剂。
    注: 细胞活力可以从解冻到解冻的不同, 一般来说, > 65% 的可行性预测良好的电镀效率。
  8. 用心源介质稀释浓缩细胞悬浮液, 辅以2µM/岩石通路抑制剂, 以获得所需的电镀细胞浓度 (见表 2为不同的板材格式)。
    注意: 重要的是: 注意, 如果细胞种子太稀少, 心脏分化效率可能会下降。
  9. 种子细胞在板上。
  10. 将盘子放在组织培养罩中20分钟, 然后将其转移到组织培养孵化器。
  11. 在6天的分化, 监测细胞附着。
    注: 心脏祖细胞保存在分化的5天。24 h 在解冻以后细胞将是在6天分化。
    注意: 漂浮 (死) 细胞的存在是常见的。
  12. 在7天, 吸入50% 的媒体, 并取代相同数量的新鲜心源性媒体。
    注: 在这一点之后, 不需要在心源性介质中添加一条。
  13. 每隔一天用心源介质替换50% 的介质。
  14. 注意在11天和13天之间出现的自发跳动。
  15. 在15天, 用 DAPI (核染色) 和 ACTC1 (泛心标记) 对免疫荧光定量测定心脏分化效率。

7. 心室状心肌细胞的传递和维持

注意: 14–16天, 应获得一层自发收缩心室状心肌细胞。在这一点上, 建议分离和重新板细胞, 以融汇的文化和防止细胞脱离板块。

  1. 从水井中吸取所有介质, 并快速添加1毫升预热 (37 °c) 1x 酶的离解试剂。
    注: 1x 含酶的离解试剂体积因板材格式而异, 但应完全覆盖井表面的底部。
  2. 将板块转移到组织培养孵化器中。
  3. 在孵化箱内每隔2分钟轻轻摇动板侧, 加速脱离过程。
  4. 在5–15分钟后, 当80% 到100% 的细胞从盘子的底部分离出来时, 从孵化器中取出盘子, 并通过增加等量的10% 种血清介质来抑制1x 酶的离解试剂活性。
    注: 这一过程中含有1x 酶离解的孵化时间将因批次而异。
  5. 将细胞悬浮液收集到离心管上。
  6. 使用自动单元格计数器将单元格悬浮与吸管和计数单元格混合。
  7. 稀释细胞悬浮物到期望的细胞集中 (参见表 2为不同的板材格式) 与维护媒介补充与2µM/岩石通路抑制剂。
  8. 将心肌细胞播种后, 均匀分布, 使细胞在转印前10–20最小。
  9. 24小时后再电镀, 监控细胞的附着和恢复。
    注意: 漂浮 (死) 细胞的存在是常见的。48–72在重新电镀后, 心肌细胞应恢复自发收缩。
  10. 为了保持心肌细胞的培养, 每隔一天将50% 的培养基替换为维持介质, 直到使用心室状心肌, 进行后续实验。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

hPSCs 的产生Id1线条
hPSCs 感染慢病毒北疆调解 Id1 过度表达 (图 1a)。一旦 hPSCId1生成, 转基因的表达是量化的 qRT PCR (图 1B)。只有 hPSCId1线表达Id1 mRNA 的水平大于0.005 倍的GAPDH应用于分化。

hPSCsId1D 的维护和准备ifferentiation
最佳的培养条件是成功的第一心脏领域相似的心脏祖细胞分化的必要和关键 (图 2A)。hPSCId1文化应每天监测茎形态维持和持续增殖。当紧密包装的干细胞菌落到达 > 90% 融合时, 应开始分化 (图 2B)。如果在最佳融合前开始分化, 细胞死亡会增强, 分化效率可能下降 (图 2C)。同样, 杂草丛生的文化也会表现不佳 (图 2D)。

产生第一心场样心脏祖细胞 (FHF CPs) 从hPSCsId1
在1天 (24 h 后分化起始), 应监测细胞观察干细胞形态的丧失 (细胞显得平坦和黑暗比干细胞)。请注意, 细胞死亡在分化的第一天是常见的, 但细胞融合应保持在 > 75% (图 2E)。如果在 24 h 的分化, 50% 或更多的覆盖面积被丢失, 细胞应该被丢弃。

在3天, 区分单元格应保持群集, 并在初始 24 h 时间段内创建空白 (图 2F)。独立生长的扁平细胞预示着分化条件的不优。

在4天, 最佳的分化应该显示继续扩大和覆盖板块。

在5天, 细胞被收割和冷冻保存。最佳分化应导致紧密相连的细胞簇与均匀形态学外观 (图 2G)。请注意, 扁平细胞的低密度簇标志着一个次优分化结果。见表 2的平均产量5天的心脏祖细胞每井在不同的文化格式。

FHF 的心室状心肌细胞的生成
5天 FHF CPs 在表 2所述的板型密度下解冻, 以最大限度地提高其心脏分化潜能 (图 3A表 2)。解冻后的生存能力需要监测。一般来说, 生存能力范围从70–80%。如果生存能力低于 60%, 心肌细胞的产量将受到影响。

在6天 (恢复分化后24小时), FHF CPs 应覆盖可用表面积的 > 90%, 并显示为同质单层单元 (图 3B)。在6天的低汇合将减少 FHF 的 CPs 分化为心肌细胞。

产生的心肌细胞开始跳动的天11–13的分化 (图 3C电影 1)。在白天 14–16 replating 过程中, 见表 2的平均产量的心肌细胞每井在不同的文化格式。分化效率通常由免疫荧光法 (ACTC1)、成纤维细胞 (TAGLN) 和血管内皮标记 (CDH5) 和核 (DAPI) 标记物来评估。谱系量化是使用自动成像和荧光量化, 如在坎宁安。(2017)5 (图 3D E)。结果心肌细胞的亚型特征由 qRT PCR (图 3F) 和动作电位瞬态分析 (图 3G 和电影 2) 进行。电压探针的荧光量化和产生的动作电位痕量分析 (图 3H) 是按照 McKeithan的描述进行的。(2017)7

Figure 1
图 1: hPSCId1 线的生成.(A) hPSCsId1生成协议的示意图表示形式。(B) qRT PCR 结果的例子, 表明由慢病毒载体介导的 hPSCId1线和两行人类胚胎干细胞线所产生的代表性Id1 mRNA 水平。虚线表示Id1表达式阈值, 下面 hPSCId1线需要经历 Id1-lentivirus 感染的附加循环。"p" 表示段落编号。括号中的数字表示 Id1-lentiviral 感染的轮数。误差条代表三种实验的标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 由hPSCId1分化而成的第一心场样心脏祖细胞 (FHF CPs) 的生成。(A) FHF CP 生成协议的示意图表示形式。典型的明亮的领域图片 hPSCId1 (天 0) 在优选(B), 次汇合 (黄色箭头表明细胞之间的空隙区域) (C)和过汇合(D)密度。在1、3和5天分别(E)、( F)(G)hPSCId1的典型亮场图片。刻度条 = 100 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.

Figure 3
图 3:从 FHF 中产生心室状心肌细胞.(A)心室状心肌生成协议的示意图表示。(B) 6 天分化细胞的明亮场图 (一天解冻后)。(C) 12 天跳动的文化的明亮的田野形象。(D) 15 天文化的代表性免疫荧光图像 (384 井板格式)。ACTC1 标记心肌细胞, TAGLN: 成纤维细胞/平滑肌, CDH5: 血管内皮干细胞和 DAPI: 细胞核 (显示在插入)。(E) 15 天文化的血统量化。(F) qRT PCR 数据时间路线表达从5天到25天心室特异性标记 (IRX4MYL2) 和泛心标记 (MYL7)。(G) 有代表性的行动可能的痕迹从心室样心肌细胞在25天的分化。(H)产生心室状心肌细胞的动作电位持续时间测量 (apd50和 apd90) (n = 12)。误差线表示在四份中进行的实验的标准偏差 (除非另行注明)。刻度条 = 100 µm RFU, 相对荧光单元。请单击此处查看此图的较大版本.

基介质 添加剂
干细胞介质 mTesR1 n/a
感应介质 RPMI 1640 中等 无胰岛素 B-27 无血清补充剂, 1x
感应介质 RPMI 1640 中等 嘌呤霉素, 6 µg/毫升
感应介质 RPMI 1640 中等 青霉素-链霉素, 1x
心源介质 RPMI 1640 中等 B-27 无血清补充剂, 1x
心源介质 RPMI 1640 中等 青霉素-链霉素, 1x
维护媒体 RPMI 1640 中等 B-27 无血清补充剂, 1x
维护媒体 RPMI 1640 中等 剔除血清置换术, 2%
维护媒体 RPMI 1640 中等 青霉素-链霉素, 1x

表 1: 媒体组件 (见基础介质和添加剂材料表)。

384井 96井 12井 6井 100毫米 150毫米
涂装量 (每井) 10µL 50µL 500µL 1毫升 5毫升 10毫升
中型卷
(每井)
100µL 300µL 2毫升 5毫升 12毫升 30毫升
分化日0激活浓度 (ng/毫升) 100 100 100 300
心祖
5天产量
(细胞/井)
1.0-1.2 x 105 2.5-3.0 x 105 1.0-1.5 x 107 2.0-3.0 x 107
心祖日 5 replating 或解冻密度 (细胞/井) 2.0 x 104 7.5 x 105 4.5 x 106 8.0 x 106 2.2 x 107
心室状心肌细胞
日14–16产量
(细胞/井)
2.0-5.0 x 104 0.8-1.2 x 106 3.5-5.0 x 106 0.8-1.2 x 107 1.8-2.5 x 107
心室状心肌细胞 replating 密度
(细胞/井)
2.5 x 104 1.0 x 106 4.5 x 106 1.0 x 107 2.2 x 107

表 2: 可伸缩的分化参数 (涂层体积, 中等体积, 激活浓度, 产量, replating 密度)。

基因名称 基因银行加入 序列
GAPDH NM_001256799 F: GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
R: GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
鼠标 Id1 NM_010495 F: CCTAGCTGTTCGCTGAAGGC
R: CTCCGACAGACCAAGTACCAC
IRX4 NM_016358 F: GGCTCCCCAGTTCTTGATGG
R: TAGACCGGGCAGTAGACCG
MYL2 NM_000432 F: TTGGGCGAGTGAACGTGAAAA
R: CCGAACGTAATCAGCCTTCAG
MYL7 NM_021223 F: GCCCAACGTGGTTCTTCCAA
R: CTCCTCCTCTGGGACACTC

表 3: qRT PCR 引物序列。

Movie 1
影片 1: 明亮的现场录音 (100 帧/秒) 15 天心肌细胞自发收缩可以观察.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

Movie 2
电影 2:25 id1-induced 心室状心肌细胞的电压敏感荧光探针的动力学成像 (100 帧/秒).请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

为成功鉴别, 请务必密切遵循上面列出的指示。此外, 我们在这里强调的关键参数, 强烈影响分化的结果。在开始分化之前, 应观察以下三种形态学参数: hPSCsId1的茎形态、高细胞压实和0天的高汇流 (> 90%)。在这方面, 最佳分化条件最好是以电镀分离 hPSCsId1为单细胞, 并允许它们形成紧密的聚类膜, 在2到3天的过程中增长到90% 汇合。反之, 如果 hPSCId1文化表现出较差的细胞和菌落形态, 低菌落压实和大面积分化的存在, 在文化中, 成功的 FHF CP 分化是不可能的。

介质体积和激活浓度是 FHF CP 微分和板型依赖性的关键参数 (见表 2)。还请注意, 最佳激活浓度可能会因使用的 hPSC 线而异, 可能需要集中优化。

hPSCs 的Id1 mRNA 水平对有效促进 FHF 是至关重要的. 次优Id1水平将无法产生强健的 FHF l cp 分化和大规模细胞死亡的1天的分化将被观察到。Id1GAPDH的相对表达率必须超过 0.005, 以促进有效分化。建议继续选择使用更高剂量的嘌呤霉素 (6–10µg/毫升), 以保持高水平的慢病毒载体介导的 Id1 表达。建议每10个段落Id1 mRNA 水平的评价。

5天 FHF CPsis 的电镀密度也是心脏分化效率的关键参数。如果5天 FHF 在低密度下被镀, 相对心脏产量将减少。在表 2中列出了最佳电镀密度, 并且与板材格式相关。

该协议的主要局限性是使用慢病毒载体介导的 Id1 过度表达 promoteFHF-L CP 分化, 这可能限制治疗使用的结果祖细胞和心室样心肌。此外, 由于慢病毒可能会在可能影响 hPSC 维护和/或发展潜力的地点进行整合, stemness hPSCsId1菌落应通过评估茎基因表达和观察形态学征象来监测分化。请注意, 使用非集成向量的 overexpressing Id1 将克服这一限制, 目前正在实验室中进行研究。

这种方法的一个方便的特点是简单的差异化协议, 因为它只需要一个细胞因子, 激活 A, 产生 FHF CPs 从 hPSCsId1。相比之下, 其他协议9101112131415都需要复杂的细胞因子组合序列和/或小分子为了促进和维持心脏分化。此外, 该协议独特地描述了一个方便的超低温保存步骤, 使 FHF 拆的生成从随后的心肌细胞生产。这一功能可以生物库大量的 FHF CPs, 并快速地从冰冻祖细胞中生成心肌, 因为心脏分化从5天恢复到解冻时。这一策略允许获得1到2周的时间相比, 开始心脏分化从 hPSCs。此外, 最重要的是, 这项议定书是迄今为止第一个生成定义的心场起源的心脏祖细胞的协议, 而其他协议9101112 ,131415在这方面仍未确定。

总之, 本协议概述了一个健壮和可伸缩的方法, 以产生大量 (> 108–109) 的发育相关的 FHF CPs 和心室状心肌细胞。反过来, 产生的细胞可以用来确定新的调控途径, 控制心脏分化和生理学, 并为再生和疾病建模目的。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢可乐实验室的成员对稿件进行有益的讨论和评论。这项研究得到了 NIH/NIEHS R44ES023521-02 和 CIRM DISC2-10110 对可乐博士的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACTC1 antibody Sigma A7811
Activin A Stem Cell Technologies Hu Recom Activin A
Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) Thermo Fisher Scientific 15240062
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement w/o - insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
B27 supplement w/o - vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587001
CDH5 antibody R&D Systems AF938
CryoStor CS10 Stem Cell Technologies 7930 Cryopreservation reagent
DMEM high Glucose Mediatech 10-013-CV 
DPBS w/ Ca & Mg Corning 21-030-CV
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-038
FBS VWR 89510-186
FluoVolt membrane potential kit   Thermo Fisher Scientific F10488 For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Matrigel, Growth Factor Reduced Corning 356231 Coating reagent
mTeSR1 media kit Stem Cell Technologies 5850
PBS w/o Ca & Mg Corning 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Gibco
Puromycin  Acros 227422500
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Enzyme-free dissociation reagent
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
TAGLN antibody Abcam ab14106
Thiazovivin Stem Cell Technologies 72254 RHO/ROCK pathway inhibitor
TrypLE Express Thermo Fisher Scientific 12605 -010 1X enzyme-containing dissociation reagent
Tyrodes solution mix packets   Sigma T2145-10X1L (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  2. Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
  3. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
  4. Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
  5. Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. (2017).
  6. McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit 1F 13 (2012).
  7. McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
  8. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
  9. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
  10. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
  13. Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
  14. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  15. Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
  16. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
  17. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
  18. Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
  19. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics