Developmental Biology
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从人多能干细胞中产生气道上皮细胞气液界面培养物
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Summary June 14th, 2022
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人类诱导多能干细胞分化方案的最新进展允许逐步衍生器官特异性细胞类型。在这里，我们提供了在气液界面培养物中维持和扩增iPSC衍生的气道基底细胞及其分化为粘纤毛上皮的详细步骤。
Transcript
该方案是有帮助的，因为它提供了易于遵循的步骤，允许产生功能性气道上皮细胞，然后可用于研究气道生物学的各个方面。该方案的主要优点是能够产生许多功能性气道上皮细胞培养物，同时避免获得和培养原代气道细胞的困难。演示该程序的将是来自我们实验室的研究生Taylor Matte。
首先在冰上解冻足够体积的3D矩阵。将其保存在冰上，直到准备使用。通过将一小瓶先前冷冻保存的iBC单细胞悬浮液在37摄氏度的水或珠浴中孵育，直到没有可见的冷冻培养基，将其解冻。
使用五毫升血清移液器，将细胞悬浮液转移到15毫升锥形管中。向细胞悬浮液中滴加6至10毫升DMEM / F12。轻轻混合并以300 RCF离心五分钟以沉淀细胞。
吸出上清液并用P1000微量移液管将细胞沉淀重悬于一毫升基底细胞培养基中。准备10微升等分试样并进行细胞计数。将细胞以300 RCF离心五分钟。
吸出上清液，并以每微升4， 000个细胞的密度重悬于先前用P1000微量移液管在3D基质中解冻的细胞。使用P200微量移液管，将对应于约25至50微升的基质溶液液滴加入到12孔组织培养处理的板的每个孔的基底。将板在37摄氏度孵育约15分钟。
然后向每个孔中加入足够的基础细胞培养基，以使用五毫升血清学移液管将液滴完全浸没。将板放回加湿的培养箱中。每两天使用新鲜的基底细胞培养基喂养细胞。
用五毫升血清移液管将新鲜培养基加入孔的侧面，注意不要干扰细胞液滴。在冰上解冻足够体积的3D矩阵。将其保存在冰上，直到准备使用。
在孵育培养板约五至七天后，从每个孔中吸取培养基，然后使用P1000微量移液管，直接在球体上加入一毫升的分散酶II以从基质液滴中解离。将板放入37摄氏度的培养箱中10至15分钟。使用P1000微量移液管，通过上下移液两次来混合分散酶，分解3D基质的大团块。
将板恢复到37摄氏度再持续30至40分钟，使基质完全溶解。当3D基质的液滴在光学显微镜下不再可见时，使用5毫升血清移液器吸头将自由漂浮的球体加入15毫升锥形管中。加入DMEM/F12，使最终体积为每锥形管10毫升，并在200 RCF下离心三分钟以沉淀球体。
抽出上清液，并为每一滴解离的初始液滴加入一毫升0.05%胰蛋白酶。在37摄氏度下孵育，每两到三分钟研磨一次。每隔几分钟用光学显微镜评估一次溶液。
当超过90%的球状体解离到单细胞时，在胰蛋白酶中加入10%的胎牛血清。通过40微米的细胞过滤器过滤细胞，并在300 RCF下离心五分钟。进行细胞计数，并以每微升解冻的3D基质400个细胞的密度均匀地重悬细胞。
避免引入气泡。根据需要重悬尽可能多的液滴以进行下游应用。对每个孔重复此过程。
在最近一次传代10至14天后，如前所述，将球状体解离为单细胞悬浮液并进行细胞计数。将单元格重悬于排序缓冲区中。这将是主要人口。
将25至50微升的小等分试样转移到单独的管中。这将是次要人口。将偶联抗NGFR抗体添加到主细胞群中。
向小细胞群添加同种型对照抗体。保护细胞免受光照，并将它们保持在冰上30分钟，间歇性地对细胞进行研磨以防止沉淀。30分钟后，将分类缓冲液加入每管细胞。
将细胞以300 RCF离心五分钟。吸出上清液，在分选缓冲液中重悬沉淀的细胞，并加入活细胞或死细胞染色剂。使用适当的NGFR阳性门控策略，对足够的NGFR阳性细胞进行分类，用于必要的下游应用。
根据制造商的说明，通过在顶端室中加入200微升的基质来制备6.5毫米多孔膜插入物。将其置于37摄氏度至少两小时，然后需要。从刀片的顶端腔室吸出涂层基质。
向基底外侧腔室中加入500微升基底细胞培养基。在100至200微升基底细胞培养基中重悬至少30， 000个分类的NGFR阳性细胞，并使用P200微量移液管转移到顶端室。对剩余的孔重复上述步骤。
将板置于加湿的37摄氏度培养箱中。在两到三天内，吸入顶端和基底外侧腔室，并用新鲜的基底细胞培养基喂养。每天用光学显微镜监测顶端室。
当细胞汇合度达到80%以上时，在顶端和基底外侧室中用ALI分化培养基替换基底细胞培养基。通过保持介质容器用铝箔包裹并在可能的情况下关闭头顶灯来保护ALI差异化介质免受光照。第二天，从顶端室吸出培养基，从而将顶端表面暴露在空气中。
每两至三天更换基底外侧腔内的ALI分化培养基。每1至2天监测一次培养物外观。小心地从顶端腔室中吸取任何积聚的液体，而不会干扰细胞层。
轻轻地向顶腔内加入100微升不含钙或镁的PBS，以去除碎屑或粘液。在37摄氏度下孵育10分钟，然后小心地吸出PBS。评估 TEER 的上皮完整性。
空气暴露7至10天后，使用光学显微镜观察多纤毛的外观。根据计划的实验和读数，可以在暴露14至28天后分析细胞。在最近一次3D培养传代10至14天后，如前所述，将球状体解离为单细胞悬浮液。
进行细胞计数，将细胞悬液重悬于冷冻保存培养基中的冷冻保存中。将冷冻管放入容器中，以确保温度稳定下降。并转移到零下80摄氏度24至48小时，然后转移到零下150摄氏度长期储存。
使用这种门控技术，28%的活单细胞是NGFR阳性。两天后，单个细胞最初很容易识别，并具有细长的纺锤形外观。再过两天，细胞形成融合且松散堆积的单层。
在随后的几天到几周内，细胞形成了一个紧密堆积，高度细胞的上皮层。7到10天后，明显出现了跳动纤毛和粘液的产生。测量样品的TEER，结果与原代气道上皮细胞对照样品的测量结果相似。
随后用多聚态醛固定，并对MUC5AC和乙酰化α-微管蛋白等进行规范气道上皮细胞标志物的免疫标记。按照该协议，研究人员可以生成大量患者来源的气道上皮细胞培养物，以评估各种读数，包括测试基底细胞，分泌细胞和多纤毛细胞在疾病和健康中的功能的读数。
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