培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。

Biochemistry

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Summary

腸宿主微生物間相互作用は、合成経口コミュニティ、体外消化消化、および小腸上皮のモデルを組み合わせる手法を使用して評価されました。病原体と複数種バイオ フィルム細胞浸潤を評価したり、プロバイオティクス製剤の生存性をテストするために合わせることができる方法を提案します。

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Calatayud Arroyo, M., Van de Wiele, T., Hernandez-Sanabria, E. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (137), e57699, doi:10.3791/57699 (2018).

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Abstract

ホストと細菌叢との間の相互作用を長い間認識されており、記載されています。口の中は、常駐細菌が発生し、外因性の細菌によって植民地化を防ぐことができます、消化管の他のセクションに似ています。確かに、600 種以上の細菌が口腔内にあるし、単一の個人はいつでも異なる 100 前後を運ぶことができます。口腔内細菌は、居住者の微生物のコミュニティおよび支持の成長そして存続の内で統合になって口腔生態系における様々 なニッチを遵守する能力を有する.しかし、腸内細菌のバランスを乱すに嚥下時に腸に細菌の流れが提案されています。実際には、 pの経口投与は回腸内細菌叢の細菌の組成をシフトしました。生存とシミュレートされた胃腸管内輸送条件を受ける口腔内細菌の生存率を明らかにするのに自然な口腔生態系の簡略表示として合成コミュニティを使用しました。14 種は選択体外唾液、胃、および腸の消化プロセスを受けるおよび腸粘膜上皮をシミュレートするカコ 2 と MTX HT29 細胞を含む細胞のマルチコンパートメント モデルを提示しました。このモデルは、腸肝循環に関与する細胞に飲み込んだ細菌の影響を解明するため提供しています。合成のコミュニティを使用して、制御性と再現性のことができます。したがって、この方法論は、病原体の生存率と関連付けられている炎症変化、プロバイオティック混合物の植民地化の能力を評価するために合わせることができる、最終的には、潜在的な細菌に広範囲 presystemic の循環に影響を与えます。

Introduction

人間は、細菌細胞の1と同じ数であると同居します。したがって、それは人間のマイクロバイの包括的な理解を得ることが重要重要なは。こうして様々 な細菌やそれらの別の場所でバイオ フィルムを含むいくつかの小さい生息地に分かれていることで口腔内はユニークな環境です。オープンなエコシステムをされて、口の中にいくつかの種は、一時的な訪問者にあります。ただし、特定の微生物を誕生とフォーム編成バイオ2後はすぐに植民地化します。これらは上記の歯肉溝、歯肉縁下の隙間、舌、粘膜表面と歯科補綴、充填3歯の表面で発見されます。細菌はフロックと歯管の内腔の浮遊性細胞壊死の歯髄組織と混合または流体相の中断として存在できます。

アクティブな連続的な宿主細胞と常駐微生物叢4間クロストークがあります。内および種の細菌間で通信し、他の細菌がこれらの主な植民にアタッチしながら、自然の植民の小さい割合だけが組織に付着することが。例えば、微生物間のセル セルの結合、口腔バイオ フィルム、二次植民に統合し、相互作用する微生物電池4の複雑なネットワークの構築にとって重要です。約唾サンプルの細菌の集合体の 70% は正体不明のバクテロイデス門Veillonella sp. Prevotellaの sp連鎖球菌sp.についての sp によって形成されます。F. nucleatumは、ポケット内のバイオ フィルムと歯周炎5に関与しているp、t. へTannerella レンギョウ、後半の植民と集計中間植民です。さらに、連鎖球菌可鍛鋳鉄 s. 血統s. gordonii3を植民地化ことを好む中粘膜と歯科の生息地を占めています。したがって、s. 血統にある下の切歯と犬歯、上部前歯6放線菌 naeslundiiが見つかったとき。

さらに、先住民マイクロバイは2人の健康を維持する上で役割を果たしています。免疫教育、病原体の膨張を防止する常駐微生物叢が参加しています。この植民地化の抵抗は、サーフェスにアタッチするのに適応しより効率的な成長のための利用可能な栄養素の代謝でのネイティブの細菌をより良い可能性があるために発生します。プロバイオティクス菌株は消化管の通過を生き残るため、アクティブのまま、消化管の上部の場所から飲み込んだ土着菌の永続性が完全に記載されていません。したがって、シミュレートされた胃腸管内輸送条件に人工コミュニティ、口腔生態系の代表を受けます。細菌の細胞の生存率は、腸上皮に似たマルチコンパートメント モデルを使用して評価されました。現在腸シミュレータは、内腔の微生物コミュニティ7の解析の観点から適切な再現性を提供しています。ただし、細菌の付着やホスト微生物間相互作用別に対処、微生物と細胞を組み合わせて、8に挑戦します。対照的に、腸内のインターフェイスで報告されるイベントの成功植民地化の潜在的な機械論的説明を提供するフレームワークを提案する.確かに、このモデル ホスト表面上の微生物の影響を評価する、共同で腸の静的モデルを使用できます。

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Protocol

1. 系統文化条件と

注: 合成経口コミュニティ系統一般的経口マイクロバイ3に存在によって作曲されました。

  1. アメリカのタイプ文化コレクション (ATCC) から次の菌株を取得:アグリゲイティバクター ・ アクチノミセテムコミタンス(ATCC 43718)、フゾバクテリウム nucleatum (ATCC 10953)による(33277) Prevotella intermedia (ATCC 25611) (ATCC 25175)ミュータンス連鎖球菌連鎖球菌sobrinus (ATCC 33478)、放線菌 naeslundii (ATCC 51655)、 連鎖球菌 gordonii (ATCC 49818)、放線菌細菌(ATCC 15987)、および連鎖球菌可鍛鋳鉄(ATCC 49456)。
  2. ライプニッツ研究所実装 DSMZ ドイツ コレクションの微生物および細胞培養 (DSM 2007 年)、BCCM/LMG 細菌コレクション (LMG 14657) から連鎖球菌血統からVeillonella parvulaを取得および使用連鎖球菌レンサひずみトーベ R9、および連鎖球菌口腔単純性疱疹10

2. 開発の口腔マイクロバイ多種間コミュニティ代表

注: は、口腔内細菌培養腸上皮への潜在的な接着能力をシミュレートする合成コミュニティを生成します。ヘルナンデス サナブリアで説明するように 5 μ g/mL ヘミン、1 μ g/mL メナジオン 5% 無菌脱フィブリン馬の血液と補われる血液寒天版の細菌を成長します。(2017)11します。 簡単に言うと。

  1. 1 メートル naoh 水溶液 2 mL でヘミンの 100 mg を溶解、オートクレーブ蒸留水 100 mL を加えます。暗いコンテナーに格納します。0.22 μ m のフィルターを通過中に追加する前に滅菌します。
  2. 96% のエタノール 20 mL にメナジオンの 100 mg を溶解します。0.22 μ m のフィルターを通過中に追加する前に滅菌します。
  3. 血液寒天培地の 1 L を準備 (材料表参照) 製造元の指示、オートクレーブによると。馬の血液とサプリメントを追加する前にクールダウンをさせます。混ぜ、プレートを注ぐ。
  4. 以前に報告された12として変更された脳心臓注入 (BHI) スープを準備します。オートクレーブ後ヘミンの 5 μ g/mL と 1 μ g/mL メナジオンを追加します。
  5. ハンゲイト管中の 9 mL を分注し、ゴム栓、アルミ キャップを閉じます。N2/CO2 (90%/10%) チューブをフラッシュします。
  6. 注射器で嫌気性培地 1 mL を取得し、1.5 mL 遠心チューブに配置します。各菌種のシングル コロニーをピックアップ、媒体で再懸濁します、嫌気性修正 BHI に転送。S. 以上の結果、24 時間培養する必要がありますを除いて、37 ° C で 48 時間孵化させなさい。
  7. 必要な場合は、合成のコミュニティを組み立て前に文化の純度を確認してください。簡単に言えば。
    1. ヘルナンデス サナブリアのように液体文化から DNA を抽出します。(2010 年)13プライマーを用いた 16S rRNA 遺伝子を増幅する 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) と 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT)、次のプログラム: 95 ° c、5 分、1 分の 95 ° C の 30 サイクル 55 ° C 1 分 1.5 分の 72 ° C に続いて最後の拡張手順72 ° C で 5 分の
    2. 商業的に PCR の製品の浄化キット (材料の表を参照してください)、製造元の指示に従います。
    3. 10 μ L の容量の 0.5 μ L を含む精製製品のシーケンス反応を実行染料 (材料の表を参照)、M13f のプライマー (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)、2.0 μ x 配列バッファー、5 と 20 の 3.2 pmol テンプレートの ng を使用して、商業シーケンス システム キット (材料の表を参照してください)。
      注: この手順を商業的に実行しました。
    4. 最も近い知られている分類群を決定し、RDP 分類オンライン ツール (http://rdp.cme.msu.edu/) と、シナを使用して、元のひずみのシーケンスと比較するすべてのシーケンス (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) で BLAST 検索を実行します。調整サービス (https://www.arb-silva.de/aligner/)。
  8. ヘルナンデス サナブリアで述べるように、フローサイトメトリー、SYBR グリーン/Propidium ヨウ化染色を使って、インキュベーションの終わりに細胞数を測定します。(2017)11. 105セル mL-1文化を希釈、BHI を変更を使用します。
  9. 嫌気性 BHI の 75 mL に 1 mL を追加し、固定相 (6 h) までインキュベートします。以下、各希薄のひずみと嫌気条件下でミックスの 0.75 mL を収集します。
  10. すべての文化が混合されている、一度、縮図の 1 mL を取り出して、BHI の 75 mL に追加。10% 未満の合成のコミュニティを孵化させなさい CO210% H2, 80% N2 48 時間 37 ° C、200 rpm (材料の表を参照してください)。
  11. 2.8 のように細胞の密度を測定します。前に細胞のモデルには、コミュニティを提示します。量的なリアルタイム PCR、プライマーを使用して、アニーリング温度スロムカの表 1 に群落の組成が行われる(2017)10します。 さらに、初期メンバー現在の13,14の情報を提供するために 16S rRNA 遺伝子増幅配列を使用します。いずれかの身元確認のプロトコルに転写してタンパク質、細菌を示すテンプレートとして cDNA を使用し、系統の有無を明らかにするテンプレートとして DNA を使用します。

3. 一般的な細胞培養方法

注: 細胞培養の一般的な側面は、著者を参照してマスターとステイシー (2007)15。ヨーロッパ コレクションの認証された培養細胞 (カコ 2 ECACC 86010202 と HT29 MTX E12 ECACC 12040401、保健のイギリス, イギリス) から使用される細胞株を取得します。細胞培養用試薬を購入することができます (材料の表を参照)、特に明記しない限り。

  1. メンテナンスとカコ 2 と MTX HT29 細胞株の継
    注: カコ 2 と MTX HT29 細胞は補われた DMEM 培地 (表 1) を含む 25 cm2培養フラスコで日常的に育ちます。60-70% の合流点に達すると、細胞がトリプシンします。
    1. フラスコから細胞培養培地を削除します。/Mg Ca ++++なし 5 mL の PBS で 2 回洗浄します。
    2. トリプシンと 0.22 g/L エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 0.5 mg/L 溶液 2 mL を追加します。フラスコを軽く動かすことによってトリプシン溶液を配布します。1.5 mL のトリプシン溶液を外し、10 分の 37 ° C でフラスコを孵化させなさい。
    3. 細胞がフラスコ表面から切り離されたかどうか、顕微鏡下でチェックしてください。必要な場合、さらに 5 分間インキュベートします。
    4. トリプシンを不活化するフラスコに補われたセル培地 5 mL を追加します。上下均一な単一細胞懸濁液を得るにピペットで移しなさい。
    5. すぐに、細胞懸濁液の分注 50 μ L を取るし、caco-2 細胞の割合が 1:1 (v/v) または 1:5 v/v HT29 MTX の滅菌の 0.4% トリパン ブルー溶液を混ぜます。カウントの商工会議所にピペッティングしてロード ミックス (材料の表を参照してください)。
    6. 顕微鏡下で実行可能な細胞 (白い明るい細胞) をカウント (製造元の指示を参照してください)。
    7. カコ 2 と HT29 MTX、それぞれシード 4 x 105セル/cm2と 1 × 104セル/cm2の密度で新しいフラスコ。
      注: (1) caco-2 細胞を区別するため、密度に達するタイトな接合を形成します。Trypsinization 前に、以上 confluency を避けるために非常に重要です。フラスコで細胞の異常増殖 trypsinization および/または細胞塊後細胞の剥離でエラーが発生することができます。(2) HT29 MTX 細胞は、粘液産生が高い代謝活性16セル。これらの機能が原因での細胞培養媒体の高速酸性細胞高密度の場合は特に。(表 1) 7 と 7.2 の pH を維持するために細胞培養培地に HEPES バッファーを追加できます。PH が低下すると、メディアがすることができますと、50% 未満と合流、交換です。しかし、もし合流 > 50%、細胞培養を分割する必要があります。

4. 腸宿主微生物インターフェイスをシミュレートする細胞のマルチコンパートメント モデルのアセンブリ

注: は、ダブル室井 (直径 24 mm、細孔サイズ 0.4 μ m; 参照テーブルの材料) で培養を完了します。

  1. 根尖部コンパートメントと基部に 2 mL に完全な細胞の培養基の 1.5 mL を追加します。中古播種時に細胞懸濁液の均一な分布を取得する 20-30 分間インキュベートします。
  2. セクション 3 で説明したカコ 2 と HT29 MTX の細胞培養を trypsinize します。Trypsinization 手順は、群生せず、単一細胞懸濁液中の両方の細胞の均一な分布を達成するために正確に実行する必要があります。
  3. 3.1.8 で説明されているように実行可能なセルをカウントします。
  4. 6.5 × 104セル/cm2カコ 2/HT29 MTX 細胞の 90/10 の割合で細胞密度を調整します。
  5. 細胞懸濁液の均質化、カコ 2 と MTX HT29 細胞量に応じたを補われた細胞の培養基であらかじめ滅菌コンテナーに追加します。商工会議所の頂側から吸引で前培養メディアを削除します。
  6. 優しく、ピペッティングにより細胞懸濁液をミックスし、1.5 mL を商工会議所挿入の頂のコンパートメントに転送します。播種手順には、細胞が堆積する傾向があるセル中断の一定の均質化が必要です。ユーザーと作業速度の経験によって 1-3 井戸を調剤後細胞懸濁液を混合する必要があります。
  7. 優しく前後プレートを移動し、左右から、右 (5-10 回) も取得する井戸で細胞の広がり。インキュベーターに移し、プレートの動きを繰り返します。
  8. 樹状突起と基底区画補われた DMEM に 2 日ごとの更新 15 日カコ 2/HT29 MTX 細胞の共培養を維持します。この時間後の細胞培養媒体は補われた DMEM 抗生物質/抗真菌ソリューションなしに変更できます。
  9. 媒体 2 日ごとの更新で播種後 20-21 日までシステムを維持します。
  10. 電気抵抗を用いたアッセイを開始する前に上皮バリアの整合性を測定 (材料の表を参照)、製造業者の指示に従います。
    1. TEER 機器が完全に充電を確認 (> 24 h) 測定を開始する前に。
    2. 電源とプラスチック製オートクレーブ バッグ カバーから TEER 装置を外します。電極を紹介し、メーターの入力ポートに差し込みます袋に穴をあけます。70% エタノール/水 (v/v) 流れのキャビネットに TEER 機器を導入する前にスプレーしてください。
    3. 電極を消毒するには、15 s. リンスに予め温めておいた細胞培養媒体における電極の乾燥空気に 15 分許可 70% エタノール/水 (v/v) 溶液に電極先端を浸します。
    4. インキュベーター外細胞を取るし、セルをフロー キャビネット内部室温に来るようにします。
    5. メーターが充電器から切断されたことを確認します。オームと電源スイッチを上にモード スイッチを設定します。
    6. 挿入の短いヒントと井戸から長く先端電極を浸すことによって細胞の抵抗を測定します。90 ° の角度で電極を保つため、板を挿入します。

5. 細菌の生存以下の体外消化管輸送条件

注: 準備模擬消化 Minekusのプロトコルに従う流体(2014)17、後述の変更。純水とすべての希釈液を準備します。フィルターは 0.22 μ m のフィルターを通して、すべてのソリューションを殺菌し、無菌条件下で消化手順を実行します。

  1. 経口消化。
    1. 細菌群集の 3 mL を 50 mL の滅菌チューブに、シミュレートされた唾液 (SSF) (でモル L-1) を含む 3 mL を混ぜて: KCl、15.1;KH2PO43.7;NaHCO36.8;MgCl2(H2O)60.5 (NH4) CO30.06;HCl、1.1;CaCl2(H2O)20.75。ひと唾液タイプ IX A と SSF にブタの胃型 II から 2 グラム/L のムチンから α-アミラーゼの 75 U/mL を追加します。
    2. 37 ° C と 100 rpm での 2 分間混合物を孵化させなさい。DNA の抽出の流れの cytometry の定量化 (S1) 2 mL サンプルを収集します。
  2. 胃の消化力:
    1. (モル L-1) 入っているシミュレートされた胃液 (SGF) の 4 つの mL を追加: KCl、6.9;KH2PO40.9。NaHCO325;塩化ナトリウム 472億;MgCl2(H2O)60.1 (NH4) CO3、0.5 です。HCl、15.6;CaCl2(H2O)20.075。さらに、SGF には 2 g/L ブタの胃型 II からムチンにはが含まれています。
    2. PH を測定し、必要に応じて 1 M 塩酸で pH 3 に調整します。37 ° C と 100 rpm で孵化させなさい。2 mL サンプル (S2) を収集します。
  3. 小腸の消化力:
    1. (でモル L-1) を含む人工腸液 (SIF) の 4 つの mL を追加: KCl、6.8;KH2PO40.8;NaHCO385;塩化ナトリウム、38.4;MgCl2(H2O)60.33;HCl、8.4;CaCl2(H2O)20.3;消化管。
    2. 必要に応じて 1 M NaOH で pH 7 に調整します。37 ° C と 100 rpm で孵化させなさい。2 mL サンプル (S3) を収集します。

6. 細菌の植民地化能力以下の体外消化管輸送条件

  1. 小腸の消化、2,650 × gで 10 分の 2 mL を遠心します。
  2. 上澄みを除去し、抗生物質や抗真菌薬なし補足 DMEM の 5 mL の細菌のペレットをミックスします。
  3. 流れの cytometer を使用してそのまま/ダメージを受けた細胞を定量化を汚し、(参照材料表)、ヘルナンデス サナブリアet al.による記述で(2017)11
  4. 抗生物質と抗真菌薬なし補足 DMEM で希釈することによって 105実行可能なセル/ml の細胞密度を調整します。
  5. Transwell システムの頂の培地を取り除き、細菌懸濁液 1.5 mL を加えます。細胞共培養系 (37 ° C、湿度 95%、5% CO2) 一般的な細胞培養条件下で 2 時間。
    注: この時間を 48 h に必要とされる実験的プロトコルに応じて拡張できます。汚染を避けるためにルーチンの細胞維持に使用される別のインキュベーターで共培養を維持できます。
  6. 4.11 で説明されているように上皮バリアの整合性を評価するためのインキュベーション後 TEER 値を測定します。
  7. インキュベーション時間を完了すると、根尖部のメディアを削除し、さらなる分析 (S4) の 0.5 mL を収集します。乳酸脱水素酵素 (LDH) アッセイによる細胞生存率の評価のためメディアのサブサンプルを使用できます (材料の表を参照)、製造業者の指示に従います。
  8. HBSS (NAC バッファー) HT29 MTX による粘液の可溶化および付着細菌を回復するに 10 mM N-アセチルシステインの 0.5 mL を追加します。攪拌下の 1 h の 37 ° C で版を孵化させなさい (135 rpm は、材料表を参照してください)。
  9. 微量遠心チューブ (S5) に NAC HBSS を回復し、2 回 1 ml の DPBS セルを洗浄します。
  10. 0.5 %0.5 mL を加えるトリトン X-100 (w/v)、単分子膜上にピペッティングにより細胞を混乱させる、1 分速度は洗剤で細菌の細胞の損傷を避けるために重要な液体と渦を回復します。
  11. 2,650 x gで 5 分間細胞を遠心し、上清 (S6) とペレット (S7) を分離します。

7. サンプル分析

注: は、収集されたサンプル (S1 S7) 細菌の生存率を評価して次の模擬消化管消化、腸の細胞に潜在的な接着を分析します。

  1. 細菌の生存率: 0.45 μ m を 2 回サンプル S1 S5 を渡すとライブ/死細胞染色を用いた細菌の細胞を定量化し、フローサイトメトリー、ステップ 2.811で示される。
  2. 潜在的な接着: S1 S6 のシリアル希薄 (-8-1) の準備し血液寒天培地に 10 μ L を連勝、BHI プレートを変更します。24-48 h. プレート原液 S7 の同じボリュームの嫌気条件下 37 ° C で孵化させなさい。
    1. 付着細菌の分類学的同定:
      1. 文化ループと個々 のコロニーをピックアップし、ヌクレアーゼ フリー水の 10 μ L をそれぞれ再懸濁します。この懸濁液の 4 μ L を収集し、プライマーと 2.7.1 で説明する条件を使用して 16 s rRNA 遺伝子の pcr のテンプレートとして使用します。
      2. 2.7.3, と 2.7.4 に記載されている手順を使用して、シーケンスの検証プロトコルを次のシーケンスを実行します。
  3. 合計の DNA の抽出、qPCR 定量化および 16S rRNA 増幅シーケンス、RNA の抽出、必要に応じてプロファイリング トランスクリプトームなど下流の分析をさらに。
    注: サンプリング直後後流れの cytometry の定量化を行った。グリセリン膜細胞のコントロールとして 70 ° C、3 分にさらされるサンプルは使用されました。バック グラウンド ノイズは、消化液や細菌なし細胞培養モデルから得られたサンプルのフローサイトメトリーによる測定によって評価しました。すべてのサンプルは、3 通で測定しました。

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Representative Results

このプロトコルは、生存とシミュレートされた胃腸管内輸送条件を受ける口腔内細菌の生存率の解明に適したモデルの生成に します。個々 の緊張からそのままなセルのカウントは約 108細胞 mL-1前合成のコミュニティでは、コミュニティ (確立中に実行可能なセルの 90% 以上含まれている多種間の縮図の作成図 1Aおよび1 b)。細菌の生存率ライブ/死者の定量化に基づく、各消化手順 (図 2) 後減少します。これは、生理的条件下で発生する、小腸消化液中に含まれる胆汁酸塩の胃の通過中に酸性の pH の結果をすることができます。In vitroin vivoの両方消化消化を通過中に生存環境の変動に依存するかもしれません (例えば、 供給絶食条件)、あるいは細菌保護プロセス (胞子形成や腸溶性コーティング)。

流れフローサイト メーター カウントは、熱殺された細菌や正確な生菌定量化18を実行する、背景にサンプルなどの適切な制御と比較する必要があります。胃や小腸の消化の過酷な条件では、どちらか成長するか分割する生きたバクテリアである可能な培養細胞に細菌を切り替えることができます。このため、プレート カウントは、フローサイトメトリーを用いて生菌によって異なります。例えば、図 3、粘膜のインターフェイスから回復した生菌は流れの cytometry プロットに青色で着色されます。ただし、成長が認められなかったときこれらの粘液サンプルされたメッキ (結果は示されていない)。

細菌が生存率を表示分数は、プレート カウント (図 4) によって明らかにされた、細胞の残骸 (S7) です。コロニー数の変数がありますが、代謝活性細菌の存在が少ない希薄サンプルで発見しました。

Figure 1
図 1: 細胞の in vitro消化消化の初めに多種間微生物群集を構成する細菌の生存率です。ライブ/死染色とフローサイトメトリーによる定量化(A)生菌数 (ログ単位) (平均 ± 標準偏差, n = 3)。(B)代表的な流れ cytometry プロット多種間微生物共培養 48 時間後の。それぞれ緑、赤、および黒を表す実行可能で、破損している、背景または非分類細菌のドットします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 模擬消化管消化後の細菌の生存率をセルします。バーは、口腔、胃、および小さい腸の消化手順後生菌 (ログ単位) の数を表す (平均 ± 標準偏差, n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 粘膜の相間で細菌細胞の代表的なプロットします。赤いドットは、背景と青のドット実行可能なセルを表します。条件は、小道具に基づいて設立されたフローサイトメトリーします。(2016)19。 粘膜サンプル希釈 1: 100 (v/v)、Sybr グリーン/Propidium ヨウ化で、15 分間染色し 100 μ l のサンプルを FL1 で測定した: 533/30 nm、FL2: 585/40 nm、FL3: > 670 nm ロングパスとを FL4: 675/25 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: コロニー形成単位 (CFU) で細胞の残骸から成長が BHI プレートを変更します。3 生物学的複製は細菌の付着試金のため使用され、CFU 定量化のため 3 つの技術的な複製を行った。細胞の残骸 (S7) の-6 希薄に-1 を含む 2 つのレプリケート プレートは図のとおりです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

細胞培養 付着性/懸濁液 養殖中 一般的なサプリメント 特定のサプリメント 倍加時間 培養条件
カコ 2 (ECACC 86010202) 付着性 4.5 G/L グルコース ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) ウシ胎児血清 (10 %v/v) を不活化
ペニシリン (100 U/mL) *
ストレプトマイシン (0.1 mg/mL) *
アムホテリシン (0.0025 mg/mL) *
Glutamax (4 mM)
非必須アミノ酸 (1 %v/v)
ピルビン酸 (1 mM)
65-72 h 95% 湿度と 10% CO2
CO2インキュベーター (材料の表を参照)
HT29 MTX (ECACC 12040401) 付着性 HEPES (1 mM) 20-24 h
* 抗生物質や抗真菌薬が、アッセイを開始する前に 2 日間の細胞培養媒体から削除されました。

表 1: 細胞文化の維持の細胞ラインおよびメディア組成の説明。

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Discussion

口腔マイクロバイは、最近いくつか著者20,21によって報告された人間の健康の重要な要素です。前の調査結果は、大量の細菌を含む唾液の摂取が免疫のプライミングのためメインのサイトの 1 つである小腸の微生物の生態系に影響を与えることができますをお勧めします。ホスト上の微生物のコンポーネントの影響を解明して腸の上皮と粘液分泌細胞によって表されるホスト インターフェイスで静的な上部消化管消化モデルの組み合わせです。

In vitroモデルは、機構研究を実施し、背景知識を減らすため、意図を達成するための研究を行う研究生体内でより効率的より良いターゲットの基本的なツールです。このため、純度、生存率、および合成微生物コミュニティを確立する前に無菌共生栽培の最適な成長を確保する重要です。生存率と分析にバイアスを避けるために、細胞培養への暴露前に細菌群集組成の評価をお勧めします。破損した細菌の数が多い可能性があります接着を妨げるし、さらに細胞モデルの整合性に影響を与えます。さらに、セル行誤認、汚染、および貧しい注釈、22実験の再現性を高めるセルラインの信頼できるソースの使用が最小限になります。

粘液産生細胞などにより、小腸に似ている、粘液とムチンは消化管23の最初防衛線を提供します。さらに、粘膜は細菌の代謝産物の特徴づける二国間輸送を可能にする細菌の植民地化に適しています。また、模擬消化管条件はカコ 2 とムチンに24、我々 のモデルで消化器系のプロセスを組み込むことの関連性を支えるラクトバチルスパラカゼイ系統の接着能力を高めます。

以前に再検討された25として、免疫ホスト コンポーネントを組み込むモデルでさらなる改善を導入できます。ただし、上皮および免疫細胞の現在の共培養システム使用されていないこれらのシステムがない場合があることを示す可能性がありますホスト微生物相互作用のアプリケーション (例えば、プロバイオティクス食品の生理活性化合物の評価)再現性25

カコ 2、HT29 MTX または共培養前の研究は、プロバイオティクスや哺乳類細胞26,27に病原性株の付着を評価しました。単一を使用して汚れや微生物のいくつかの団体があります限られた概要ホスト微生物の相互作用、それは人間の消化管の複雑さの代表ではないです。自然の微生物社会の使用より体内のシナリオの代表をすることができます、彼らは特徴付けるため勉強することは困難。対照的に、我々 の方法論は、複雑な代表的な小宇宙を使用して、複数のホスト ・微生物相互作用を評価する機会を提供しています。定義された合成微生物群集は、複雑さの軽減28システムの世代の使用します。社会の変化は、個々 の実験においてアイソレータケージ条件の結果をすることができます。したがって、このモデルの微生物のコンポーネント簡単にスケールできます上または下選択的な力としての環境の影響を分解するため。最後に、サンプリング アクセシビリティを保証さらにひと細胞と関連する微生物群集の機能的な活動の性格描写。

過去数年間における技術に基づく新しい体外モデルが開発されています。Organoids が表される一次組織の主要な機能のいくつかを組み込む 3 D 細胞培養です。腸 organoids 成体幹細胞と組織を勉強するために近い生理的なシステムですが、このようなモデルには、いくつかの制限もあります。腸 organoids 制限を使用して免疫細胞を欠けていると同時に感染症や薬物、炎症反応に似ているのです。また、organoids、生存率、サイズ、および表現型スクリーニングおよび標準化を複雑なレンダリングを妨げる形状に関する異種。不死化細胞株の in vitro健全なティッシュのモデリングのための制限にもかかわらず、よ特徴付けられた、安定したセルラインを使用は、再現性、再現性、低コストなどの利点を提供しています。これらの利点は、いくつかの条件の同時上映が、データの橋渡しの使用は物議を醸す。一次電池より、生体内の生理; の代表があります。ただし、個体間のばらつきが大きい、完全に特徴付けされていません、異種、限られている時間のスパン。これらの要因など複数の条件のための欠点は、または 1 つの試金で複製。

高い柔軟性と基本的なセル装備研究所で応用より代表まで再現性と再現性のあるモデルの開発に着目した細胞を組み合わせて複雑な微生物群集の挑戦を表しているよう利用可能なモデルになりよく特徴付けられました。腸インターフェイス特徴づける異物への影響、例えば、上部消化管におけるプロバイオティクスの挙動を評価するためにこれらのマルチコンパートメント モデルを使用して多様な細菌群集の機能評価を行った.したがって、プロバイオティクス、薬、または関連して定義された体外生態系内の食品化合物の多種多様なさらに試金のための拠点としてこのモデルを提案します。

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Disclosures

著者がある何も開示するには

Acknowledgments

作者は感謝してマルタ カラタユ アロヨ (FWO ポスドク ・ フェローシップ 12N2815N) フランダース研究財団から財政支援を認めます。エマ ・ ヘルナンデス サナブリアはフランダースの技術革新と起業家精神 (Agentschap フォール Innovatie ドア Wetenschap en テク、IWT) でサポートされている研究員。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
STRAINS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans American Type Culture Collection ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum American Type Culture Collection ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis American Type Culture Collection ATCC 33277
Prevotella intermedia American Type Culture Collection ATCC 25611
Streptococcus mutans American Type Culture Collection ATCC 25175
Streptococcus sobrinus American Type Culture Collection ATCC 33478
Actinomyces viscosus American Type Culture Collection ATCC 15987
Streptococcus salivarius  TOVE-R
Streptococcus mitis American Type Culture Collection ATCC 49456
Streptococcus sanguinis BCCM/LMG Bacteria Collection LMG 14657
Veillonella parvula Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM 2007
Streptococcus gordonii American Type Culture Collection ATCC 49818
CELL LINES
Caco-2 cells European Collection of Authenticated Cell Cultures 86010202
HT29-MTX cells European Collection of Authenticated Cell Cultures 12040401
REAGENTS AND CONSUMABLES
Brain Heart Infusion (BHI) broth Oxoid CM1135
Blood Agar 2 Oxoid CM0055 Blood Agar medium
Menadione Sigma M9429
Hemin Sigma H9039
5% sterile defibrinated horse blood E&O Laboratories Ltd, P030
InnuPREP PCRpure Kit Analytik Jena 845-KS-5010250 PCR purification kit
Big Dye Applied Biosystems 4337454 Dye for sequencing
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit Applied Biosystems 4337456
SYBR Green I Invitrogen S7585
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP
T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile VWR 734-2311
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924-100ML
Trypan Blue solution
0.4%, liquid, sterile-filtered
Sigma-Aldrich T8154 
PBS Gibco 14190250
DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate Life technologies 31966-047
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts Sigma-Aldrich CLS3450-24EA
Mucin from porcine stomach Type II   Sigma-Aldrich M2378
Inactivated fetal bovine serum Greiner Bio One 758093
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062
Triton X 100 for molecular biology Sigma-Aldrich T8787 
DPBS without calcium, magnesium Gibco 14190-250
Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit Thermo Fisher Scientific 88953
Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm Corning Costar Corp 3450
Nuclease-free water Serva Electrophoresis 28539010
EQUIPMENT
Neubauer counting chamber improved Carl Roth T729.1
BD Accuri C6 Flow cytometer BD Biosciences 653118
PowerLyzer 24 Homogenizer MoBio 13155
T100 Thermal Cycler BioRad 186-1096
Flush system Custom made -
InnOva 4080 Incubator Shaker New Brunswick Scientific 8261-30-1007 Shaker for 2.10
Memmert CO2 incubator Memmert GmbH & Co. ICO150med
Millicell ERS (Electrical Resistance System) EMD Millipore, Merck KGaA MERS00002
Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system Millipore, Merck KGaA -
Shaker (ROCKER 3D basic) IKA 4000000 Shaker for 6.10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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