Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
支持浮遊ブロックを用いた透過電子顕微鏡におけるサンプル支持膜の作製
Chapters
Summary April 8th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
この方法の構造決定ワークフローにおいて、クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)のサンプル調製は重要なボトルネックとなっている。ここでは、透過EM試験用サンプルを安定化させる支持膜の作製に使いやすい3次元印刷ブロックを用いた詳細な方法を提供する。
Transcript
ここでは、このような繊細なフィルムの取り扱いを容易にする新しい浮揚ブロックを使用して、サポートフィルムでクライオEMサンプルを調製するための改良されたプロトコルを紹介します。この方法の主な利点は、変性のような有害な影響が発生する空気水界面からサンプルが保護されていることです。ここで示すプロトコルの1つは、グラフ化親水性をレンダリングするための高価な処理を避けるため、EMコミュニティ全体へのアクセス性を高めます。
小さな浮遊装置は、良好な準備のために電気顕微鏡でまだ広く使用されていません。したがって、これらの視覚的なデモンストレーションは、その使用のためのベンチマークを提供することができます。まず、TEMグリッドを二重蒸留水と酢酸エセルで洗浄し、続いてプラズマ洗浄を行います。
次に、サンプルの10〜12マイクロリットルを緩衝液交換ウェルに加え、浮遊ブロックと2%小便尿酢酸溶液の10〜12マイクロリットルを隣接する非緩衝液交換ウェルに加えて、負の染色のために十分に交換する。汚れで作業する際には、適切な安全対策を講じる必要があります。慎重に上に事前堆積カーボンフィルムとマイカの2つの小片をカット。
マイカの破片は、炭素が浮遊している間に断片が井戸の上に座ることができ、ピンセットで断片を処理するのに十分なスペースがあるように、井戸の長さよりも井戸に収まるほど広いことを確認してください。マイカがウェルのランプに座り、液体サンプルの表面でカーボン層が観察されるまで、ほぼ45度の角度でマイカを井戸に浸します。サンプルでカーボンをインキュベートした後、マイカシートを非常にゆっくりと引き出して、カーボンフィルムを回収し、残存粘度試料保持を最小限に抑えます。
下段の非炭素表面を濾紙でタップしてマイカを慎重にブロットし、過剰な液体を除去し、マイカフラグメントを2%小便尿酢酸溶液を含む反対側ウェルに浸し、炭素層を負の汚れと交換する。洗浄され、プラズマ洗浄EMグリッドの聖なる炭素被覆側で浮遊炭素層を回収します。その後、TEM上でイメージングするまでグリッドを空気乾燥したままにし、好ましくは空中汚染を避けるためにそれらを覆います。
先に示したようにTEMグリッドを洗浄した後、使用直前に酸化グラフェン懸濁液を調製し、渦を徹底的に行ってください。その後、4つの非緩衝液交換井戸に10〜12マイクロリットルの酸化グラフェン懸濁液を加える。浮揚ブロックに沿って。
ブロックの残りの4つの緩衝液交換井戸に10〜12マイクロリットルの二重蒸留水または超純水を加えます。各ウェルのグラフェン酸化物懸濁液に4つのグリッドを穏やかに落とし、1分間インキュベートして、聖なる炭素被覆側が溶液に接触していることを確認します。1分後、ピンセットを各非バッファ交換のピンセット溝に滑り込まして、各グリッドを慎重に回収します。
水滴がグリッドに見えるまで、隣接する井戸の二重蒸留水で各グリッドの銅非炭素被覆側を穏やかに簡単に微調整します。その後、慎重にフィルター用紙の一部に対してグリッド水のドロップを逆さまに保持します。グリッドを覆い、ピンセットに入れて空気を乾かします。
ガラススライドに堆積した銅グラフシートの上に4つの洗浄グリッドを配置し、各グリッドをイソプロパノールの滴で覆い、単層グラフェンとグリッドの間に親密な接触を可能にします。イソプロパノールの完全な蒸発後、ガラスペトリ皿の塩化第二鉄溶液にグリッドを持つ銅グラフェンシートを浮かべます。その後、空気中の汚染を避けるために皿を覆い、一晩室温でエッチングにしておきます。
TEMグリッドサイズよりも大きな直径のループを使用して、グラフェン単層に浮かぶグリッドを釣り上げ、洗浄用の二重蒸留水を含むガラスペトリ皿に慎重に移します。グリッドを水で2回洗い、サンプル調製と凍結が完了するまでサンプルバッファーを含むペトリ皿にグリッドを移します。浮遊ブロックのウェルにサンプルの10〜12マイクロリットルを加えます。
サンプルがブロックで準備ができたら、きれいなピンセットのペアを使用してバッファ溶液からグラフェンコーティングされたグリッドを選び、それをよく含むサンプルの表面に置きます。適切なインキュベーション期間の後、きれいな凍結ピンセットでグリッドを拾い、ブロッティングとガラス化を進めます。支持浮揚ブロックで調製された負の染色されたグリッドは、典型的には、グリッド表面全体にわたってアモルファスカーボンで覆われる。
炭素膜の破損は、いくつかの例では発生するが、グリッドの正方形の多数は、手付かずであるため、負の染色目的に適用されます。同様に、良好なフィルムカバレッジは、グラフェン酸化物プロトコルを使用してグリッド全体にわたって日常的に達成されます。酸化グラフェングリッドは原料から迅速に調製することができ、サンプルの保護が高い。
グラフェンを凍結直前に濡れ、サンプル塗布をその場で維持することは、クライオEMに適した氷層を生成するのに十分です。このプロトコルは、グラフェン親水性をレンダリングする機器を必要とせず、サンプル回収の利点を提供します。支持浮揚ブロックは、グリセロール勾配から派生したサンプルのために非常に有用であるC2でバッファ拡張を可能にする各ウェルの部位に2つの針ポートを有する。
浮遊ブロックは、小容量の制御可能な緩衝液流と機能化された支持膜を利用して、グリッドアフィニティー精製法の探索を可能にした。
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
