Kortlægning stofskifte: Overvågning af laktat Dehydrogenase aktiviteten direkte i væv

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en protokol for kortlægning af den geografiske fordeling af enzymatisk aktivitet for enzymer, der genererer nicotinatmide-adenin-dinucleotid-phosphat (NAD(P)H) + H + direkte i vævsprøver.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jelinek, D., Flores, A., Uebelhoer, M., Pasque, V., Plath, K., Iruela-Arispe, M. L., Christofk, H. R., Lowry, W. E., Coller, H. A. Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue. J. Vis. Exp. (136), e57760, doi:10.3791/57760 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kortlægning enzymatisk aktivitet i tid og rum er afgørende for at forstå det molekylære grundlag af celle opførsel i normale væv og sygdom. In situ metaboliske aktivitet assays kan give oplysninger om den geografiske fordeling af metaboliske aktivitet inden for en væv. Vi giver her en detaljeret protokol til overvågning af aktiviteten af enzymet laktat dehydrogenase direkte i vævsprøver. Laktat dehydrogenase er en vigtig faktor for hvorvidt forbrugt glukose vil blive konverteret til energi via aerobe eller anaerobe glykolyse. En opløsning indeholdende laktat og NAD tilbydes til en frossen væv sektion. Celler med højt laktat dehydrogenase aktivitet vil konvertere den medfølgende laktat til pyruvat, mens samtidig konvertere nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) til NADH og en proton, som kan påvises baseret på en reduktion af nitrotetrazolium blå til formazankoncentrationen, som er visualiseret som et blåt bundfald. Vi beskriver en detaljeret protokol til overvågning af laktat dehydrogenase aktivitet i mus hud. Anvendelsen af denne protokol, fandt vi, at laktat dehydrogenase aktivitet er høj i inaktiv hår follikel-stamceller i huden. Anvendelsen af protokollen til kulturperler mus embryonale stamceller afslørede højere farvning i kulturperler embryonale stamceller end mus embryonale fibroblaster. Analyse af frisk isolerede mus aorta afslørede farvning i glatte muskelceller vinkelret på aorta. Den metode, der kan bruges til at rumligt kort aktiviteten af enzymer, der genererer en proton i frossen eller frisk væv.

Introduction

Forstå steder i væv hvor enzymer har høj eller lav aktivitet er afgørende for udvikling af forståelse og fysiologi. Udskrift eller protein niveauer bruges ofte som surrogater for enzymatisk aktivitet. Sådanne undersøgelser kan være informativ, giver de ikke oplysninger, der kan være kritisk for fastsættelse af et enzyms aktivitet, såsom posttranslationelle modifikationer, tilstedeværelsen af proteinkomplekser, eller det enzym subcellulært lokalisering. Når enzymatisk aktivitet måles direkte, er det ofte overvåges i homogeniseret protein lysates, der ikke længere indeholder oplysninger om individuelle celler i blandingen eller den geografiske fordeling af celler med høj eller lav aktivitet inden for en væv.

Vi giver her en detaljeret protokol for kortlægning af den geografiske fordeling af enzymatisk aktivitet inden for en vævsprøve. Metoden er baseret på tidligere undersøgelser viser, at tetrazolium salte kan bruges til at lokalisere aktiviteten af dehydrogenases, reductases og oxidases i frossen væv1. Med disse metoder dannes en vanduopløselig formazankoncentrationen når protoner er overført til en tetrazolium salt2,3. Glucose-6-fosfat dehydrogenase genererer NADPH og en proton, og er blevet opdaget med tetrazolium aktivitet. Glucose-6-fosfat dehydrogenase er blevet overvåget i i europæiske skrubbe hepatocytter4, i alveolær type 2 celler af lungerne5 og nephrons nyre5. Tetrazolium salte har også været brugt til at overvåge transketolase aktivitet i frossen væv6. En lignende fremgangsmåde blev for nylig brugt til at overvåge aktiviteten af flere dehydrogenases i det samme væv på tilstødende dias7.

Vi beskriver her en metode til at bruge tetrazolium salte til at overvåge den geografiske fordeling af laktat dehydrogenase aktivitet (figur 1). Laktat dehydrogenase kan konvertere pyruvat genereret af glykolyse til laktat og den modsatgående reaktion. Laktat dehydrogenase aktivitet er derfor en vigtig faktor for pyruvats indgang til tricarboxylic syre cyklus versus sin sekretion som laktat. Laktat niveauer i blodet er ofte bruges til at diagnosticere en række sygdomme, herunder kræft8,9,10, fordi det kan signalere at sygdom eller skade har beskadiget celler og enzymet er blevet frigivet.

Der er fire laktat dehydrogenase gener: LDHA, LDHB, LDHC og LDHD11. LDHA og LDHB menes at være opstået fra gentagelse af en tidlig LDHA gen12. LDH er aktiv som en tetramer og LDHA og LDHB kan danne homotetramers og heterotetramers med hinanden. LDHA er rapporteret at have højere affinitet til pyruvat, mens LDHB er rapporteret at have højere affinitet for laktat og fortrinsvis konvertere laktat til pyruvat13. LDHA promotor indeholder bindingssteder for HIF1α, cMYC og FOXM1 transskription faktorer11. Hertil kommer, ligesom mange andre glykolytiske enzymer14,15, kan LDH ændres af posttranslationelle modifikationer. Fibroblast vækstfaktor receptor 1 kan phosphorylate LDHA på Y10, som fremmer tetramer dannelse, eller Y83, som fremmer NADH substrat bindende16. LDHA kan også være acetyleret17. Af disse grunde kræver en fuldstændig forståelse af LDH aktivitet overvågning ikke kun LDH protein niveauer, men enzymets aktivitet så godt.

Ud over den metode, vi præsenterer her, har været anvendt andre metoder til at overvåge laktat dehydrogenase aktivitet. Laktat dehydrogenase aktivitet kan overvåges spektrofotometrisk i homogeniseret protein lysate. Generation af NADH som laktat omdannes til pyruvat kan måles baseret på absorbans ved 340 nm, mens forsvinden af NADH kan overvåges som pyruvat omdannes til laktat18. Laktat dehydrogenase aktivitet er også blevet overvåget med magnetisk resonans imaging (MR). 13 C-pyruvat kan administreres og omdannelse af pyruvat til laktat kan overvåges som forholdet mellem [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvat. Forhøjet nøgletal af [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvat er blevet observeret i kræft væv19. Mens Mr-baserede tilgange kan give oplysninger om laktat dehydrogenase aktivitet i normal og sygdom væv, har metoderne, der ikke den beslutning, der er nødvendig for at bestemme aktivitetsniveau i bestemte celler. Den metode, der her kan give oplysninger om laktat dehydrogenase aktivitet i væv og selv i enkelte celler.

Bruger i situ aktivitet assays, fandt vi, at aktiviteten af laktat dehydrogenase er høj i hårsækken stamceller af musen hud20. Vi brugte også metoden til at overvåge aktiviteten af laktat dehydrogenase i kulturperler embryonale stamceller og fandt aktiviteten er højere i stamcellerne end feeder lag. Endelig, vi overvåges aktiviteten af laktat dehydrogenase i friske mus aorta og observeret farvning i glatte muskelceller. Vi beskriver her en detaljeret protokol til overvågning af laktat dehydrogenase aktivitet i frosne mus hud.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg beskrives blev godkendt af Animal Care Udvalget ved University of California, Los Angeles.

1. skabe lysbilleder af frosne mus hud

  1. Aflive mus i institution politik.
    Bemærk: Følg institutionelle politik for Beskyttelsesbeklædning. Alle protokoller, der involverer dyr skal godkendes af den institutionelle dyr efterbehandling udvalget.
  2. Fjerne den mus hår med en dyr hår trimmer.
  3. Gør indsnit i huden ved hjælp af saks. Brug af tang, løft huden væk fra musen. Brug saks, skåret afsnittet hud væk.
  4. Fyld cryomold med frysning reagens sammensatte (Se Tabel af materialer).
  5. Sted hud sektioner i fyldt cryomolds ved hjælp af nåle-næse pincet. Orientere huden, således at væv skiver vil generere et tværsnit af huden fra epidermis til dermis og hypodermis muskel (figur 2).
    Bemærk: Hvis det er muligt, montere eksperimentelle og styrer mus sammen i den samme cryomold, så de kan i samme diaset i snit og behandles sammen. Passe på ikke for at skabe bobler.
  6. Placer cryomold på den flade del af en blok af tøris i en isspand og lad fryse. Fortsætte med at observere orientering af huden. Juster om nødvendigt.
    Bemærk: Brug kryogene handsker når du håndterer tøris.
  7. Overføre cryomolds til en-80 ° C fryser til opbevaring. Prøver kan opretholdes i fryseren i ca 3 måneder uden betydelige tab af enzymatisk aktivitet. Lad ikke frosne dele tørre ud.
  8. Ved hjælp af en kryostaten ved-20 ° C, skive væv til at oprette sektioner 7-10 µm tykt for den bedste hud morfologi21.

2. udarbejde dias til farvning

  1. Etablere sæt af dias, der skal testes. Omfatte en kontrol dias som NAD vil blive tilbageholdt og et andet kontrolelement slide som substrat, laktat, vil blive tilbageholdt. Omfatte en positiv kontrol dias fra en frossen væv blok tidligere undersøgt.
  2. Kort lave dias, der indeholder hud sektioner med 4% formalin i 5 min enten af pipettering 1 mL af 4% formalin i diaset, eller ved behandling af flere dias, ved at dyppe glider ind i en beholder, der indeholder 4% formalin.
    Bemærk: Optagelsen vil sikre huden ikke skrælle fra dias i løbet af de følgende procedurer og bevare huden morfologi.
    Forsigtig: Formalin er kræftfremkaldende og farlige; bære handsker, lad ikke det rører din hud og udføre dette trin i en kemisk stinkskab.
  3. Vask dias med mindst 1 mL phosphat bufferet saltvand, pH 7,4, pr dias enten af pipettering eller dypning.

3. forberedelse farvning løsning

  1. Vortex sammen reagenser til laktat dehydrogenase aktivitet farvning (50 mM Tris pH 7,4, 750 µM NADP, 80 µM phenazine methosulfate (PMS), 600 µM nitrotetrazolium blå chlorid og 30 mM laktat) i en passende størrelse rør afhængigt af mængden af farvning løsningen krævede.
    Bemærk: 1 mL er tilstrækkelig til at dække helt ét dias.
  2. Forberede en anden løsning, hvor alle reagenser findes undtagen NAD. Forberede en tredje løsning, hvor alle reagenser findes undtagen laktat.

4. Inkuber dias i farvning løsning

  1. Forsigtigt afpipetteres Farvningsopløsningen eller kontrol løsninger på rede dias dækker afsnittet i sin helhed (1 mL er tilstrækkelig for ét dias). Hvis flere dias behandles sammen, dyp alle diassene i Farvningsopløsningen samtidig (Sørg for at beholderen har nok løsning helt dække afsnittet væv).
  2. Glassene inkuberes i en fugtig miljø ved 37 ° C i mørke. Hvis farvning løsning er på toppen af diaset, skal du placere diaset i en fugtig miljø at forhindre fordampning.

5. Overvåg dias

  1. Overvåge konvertering af Farvningsopløsningen fra klar til blå ved besigtigelse. Når prøverne har nået den ønskede blueness, reaktionen standses ved at fjerne Farvningsopløsningen.
    Bemærk: For hud, 10 min er tilstrækkelig. Tiden afhænger af orglet og den enzymatiske aktivitet.
  2. Skyl dias med fosfatbufferet saltopløsning af pipettering (1 mL er tilstrækkelig for hvert dias) eller dypning.
    Bemærk: Alle prøver, der skal sammenlignes med hinanden skal holdes i Farvningsopløsningen for den samme mængde tid.

6. kontrastfarve og montere

  1. Med pipette overfoeres en kontrastfarve på dias når dias har nået et passende niveau af blueness.
    Bemærk: Counterstains, at vende kerner, røde eller grønne vil give god kontrast med den blå lavet af formazankoncentrationen fældningsmiddel.
  2. Mount med vandige eller ikke-vandige montering medium22. Én til tre dråber montering medium (40-50 µL) er tilstrækkelig afhængigt af størrelsen af den dække slip.

7. billede dias og kvantificere

  1. Billede glider under et lysmikroskop. Tage fotografier af eksperimentelle og kontrolprøver samt alle negative kontroller på 10 X og 20 X 40 X forstørrelse.
  2. Bestemme intensiteten af blå plet i forskellige regioner med billede analyse software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tidligere rapporteret resultater for i situ aktivitet assays i mus hud20. Som vist i figur 3, observerede vi, høje niveauer af laktat dehydrogenase aktivitet i hårsækken stamceller i bunden af hårsækken når procedurerne beskrevet ovenfor blev fulgt. Disse fund blev bekræftet af fluorescens aktiveret celle sortering af huden for hårsækken stamceller og bekræfter høj laktat dehydrogenase aktivitet i stamceller rum med aktivitet assays på sorteret celler.

Baseret på vores resultater, at hår follikel-stamceller har høj laktat dehydrogenase aktivitet, udvidede vi vores undersøgelser af kulturperler embryonale stamceller. Musen embryonale fibroblaster tjener som en feeder lag blev analyseret alene eller i nærværelse af embryonale stamceller. For at analysere kulturperler celler, mellemlang var indsugning, og cellerne blev kortvarigt fast og inkuberes med laktat dehydrogenase farvning løsning som beskrevet ovenfor. Vi observerede høj laktat dehydrogenase aktivitet i de embryonale stamceller sammenlignet med musen embryonale fibroblaster (figur 4).

Vi har også anvendt til farvning protokollen til frisk isoleret væv. Musen aortas var dissekeret og skåret åben. Fartøjerne, der blev åbnet og immobiliseret så indersiden lumen af aortas var tilgængeligt. Prøverne blev inkuberet med Hank's Balanced Salt Solution indeholdende 0,5% Triton-X til 10 min., derefter med laktat dehydrogenase farvning løsning for 10 min. laktat dehydrogenase farvning løsning blev anvendt til frisk væv. Efter inkubationen blev billeder indsamlet, viser farvning i glatte muskelceller (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Kemiske aktivitet af laktat dehydrogenase og dens afsløring. Laktat dehydrogenase konverterer lactat + NAD til pyruvat + NADH + H+. Den proton, der genereres vil reducere nitroblue tetrazolium til formazankoncentrationen, som vil danne et blåt bundfald. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Skematisk af orientere mus hud i cryomolds. Musen hud bør være orienteret inden for cryomolds, således at hvert snit sektion vil indeholde et tværsnit af hele huden fra epidermis, dermis, hypodermis og muskel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Laktat dehydrogenase farvning af musen hud afslører høj aktivitet i hårsækken stamceller. Musen hud var frosset i cryomolds og inkuberes med laktat dehydrogenase farvning løsning indeholder laktat. Laktat dehydrogenase aktivitet var fremtrædende i hårsækken stamceller. (A, B) To billeder af laktat dehydrogenase aktivitet assay af musen hud. (C, D) To billeder af kontrol farvning med substrat laktat tilbageholdt. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Høj laktat dehydrogenase aktivitet i kulturperler mus fosterstamceller. Kulturperler mus embryonale stamceller dyrkes på en bestrålet mus embryonale fibroblast feeder lag blev analyseret for laktat dehydrogenase aktivitet. Høj aktivitet blev observeret i de stamceller, sammenlignet med fibroblaster. Musen embryonale fibroblaster viste lignende niveauer af farvning med og uden bestråling. Billeder blev taget med en 20 X mål. Skalalinjen = 50 µm. (A, B, D, E) mus embryonale fibroblaster og stamceller. (C, F) Musen embryonale fibroblaster alene. (A-C) Billeder blev taget efter 7 minutters inkubering med farvning løsning. (D-F) Billeder blev taget efter 20 minutters inkubering med farvning løsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Høj laktat dehydrogenase aktivitet i de glatte muskelceller omkring musen aorta. Aortas blev isoleret fra aflivede mus. Fartøjer, der blev fastsat i 2 minutter i 2% PARAFORMALDEHYD og vasket 3 x 10 minutter i 1 x phosphat bufferet saltvand. Fartøjer var inkuberes med Hanks afbalanceret saltopløsning med 0,5% Triton-X og vasket 3 x 5 minutter i fosfatbufferet saltopløsning. Laktat dehydrogenase farvning løsning blev tilføjet og prøverne blev inkuberet i 10 minutter ved 37° C og vasket 3 x 5 min. med 1 x fosfatbufferet saltopløsning. Prøverne blev derefter fastsat til 1 time i 2% PARAFORMALDEHYD, vasket 3 x 5 min. med 1 x fosfatbufferet saltopløsning og afbildet. (A) laktat dehydrogenase løsning indeholdende laktat. B laktat dehydrogenase løsning uden laktat som en negativ kontrol. For hver sektion, der er en lavere forstørrelse billede til venstre og et dertil indrettet område er vist med højere forstørrelse til højre. (A, B) Komplet laktat dehydrogenase løsning indeholdende laktat blev brugt til farvning. B er et forstørret billede af det angivne område i billedet A. (C, D) laktat dehydrogenase løsning uden laktat blev anvendt til farvning som en negativ kontrol. D er et forstørret billede af det angivne område i C. A og C blev taget med 20 X mål (skalalinjen = 50 µm) og B og D blev taget med en 40 X mål (skalalinjen = 20 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden beskrevet her kan bruges til at overvåge aktiviteten af laktat dehydrogenase eller andre metaboliske enzymer, der genererer NADH eller NADPH, i forskellige celletyper i et væv eller inden for forskellige dele af et væv over tid. Laktat dehydrogenase er et vigtigt enzym for at forstå biologi af stamceller og tumorer, og evnen til at overvåge laktat dehydrogenase aktivitet i enkelte celler er tilbøjelige til at give vigtig indsigt i funktionen af dette enzym.

En vigtig fordel af denne protokol sammenlignet med andre metoder er der mulighed for at overvåge enzymatisk aktivitet, snarere end bare protein overflod, kan resultere i mere afgørende oplysninger om ikke bare hvor laktat dehydrogenase enzymer er stede, men hvor de er faktisk funktionelle. Metoden beskrevet her kan kombineres med immunhistokemi, således at en valgte protein, for eksempel, en celle lineage markør, er fastsat i de samme vævsprøver som laktat dehydrogenase aktivitet. Forhold til Mr-baserede tilgange til overvågning af laktat dehydrogenase aktivitet, har protokollen i henhold den fordel, at det kan give større rumlige opløsning og med til at bestemme de specifikke celler i et væv, der har høj enzymaktivitet . Forhold til tilgange til kortlægning stofskifte baseret på fluorogenic substrater, er afsløre signal med protokollen beskrevet ikke begrænset af autofluorescence1. Miller og medforfattere udført en lignende analyse af tid afhængighed og substrat afhængighed af fem forskellige enzymer ved at overvåge konvertering til formazankoncentrationen7. Reaktionerne blev opdaget at følge støkiometriske principper for enzymkinetik. Miller og medforfattere distinguished mitokondrie enzymer fra ikke-mitokondrie enzymer af co lokalisering med mitokondrie farvnings-7. De brugte 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium chlorid (CTC) som en afsløring reagens efterfulgt af Konfokal mikroskopi for subcellulært Co lokalisering analyse7.

Den beskrevne metode har ulemper så godt. Mens Mr-baserede tilgange kan bruges i levende organismer, kræver fremgangsmåden frossen eller frisk væv. Frossen væv er kun egnet for et par måneder fordi aktiviteten af enzymer nedbrydes med tiden, selv når frosne. Yderligere, da underlaget er i overskud, tilgangen giver oplysninger om "aktivitet potentiale" under forudsætning af substratet er til stede. Hvis niveauet af substratet er begrænsende, kan derefter aktivitet distribution observeret med dette assay afvige fra mængden af aktivitet, der opstår fysiologisk. Desuden, hvis der er forskellige isoformer af det samme enzym, der udfører den samme enzymatisk aktivitet, er den metode, der præsenteres her ikke stand til at skelne mellem dem. For eksempel, kan ikke metoden præsenteret skelne mellem aktiviteten af LDHA versus LDHB. Én tilgang til adresse problemet ville være at bruge genetisk manipulerede mus, hvor en enkelt enzym isoform er genetisk inaktiveret.

Vi har eksperimenteret med PMS, en photochemically stabil elektron luftfartsselskab, der medierer elektron overførsel mellem NADH og tetrazolium farvestoffer23. Mens nogle forskere har rapporteret, at PMS hæmmer glucose 6-phosphat dehydrogenase aktivitet og fundet PMS lidet5, fandt vi PMS være værdifulde for enzymet lokalisering og medtage det i vores protokol. Nogle andre forfattere har rapporteret ved hjælp af polyvinylalkohol til at begrænse udbredelsen af glucose-6-fosfat dehydrogenase enzym1. I vores forsøg, vi fandt ikke polyvinylalkohol at være hjælpsom og elimineret det.

Et par skridt er afgørende for succes af farvning. Et vigtigt spørgsmål er at sikre, at vævsprøver er placeret korrekt i cyromolds. Huden sektioner bør lægges fladt så at skiver på tværs af huden. Desuden, hvis flere sektioner skal være forberedt på, er det ideelt hvis de er indlejret i den samme cryomold, så de kan være skiveskåret sammen på den samme dias. Dette vil bidrage til at fjerne variation på grund af tykkelsen af det dias, der er skåret med kryostaterne. Det er også vigtigt at sikre at vævet stadig bevarer enzymatisk aktivitet.

Det bedste tidspunkt at slutte reaktion bør fastlægges empirisk. Det er nødvendigt at overvåge dias under inkubationstiden og bestemme det rigtige tidspunkt at tilføje kontrastfarve og montere dias baseret på intensiteten af den blå plet. Hvis prøverne er for let plettet, vil det ikke være muligt at afgøre, hvor aktiviteten er. Hvis prøverne er overstained, kan formazankoncentrationen bundfald sprede, hvilket gør det vanskeligt at fastslå de specifikke områder, der var oprindeligt høje aktivitet.

Vi forventer, at denne protokol vil være værdifuld for videnskabsmænd med en bred vifte af spørgsmål om rollen for metabolisme. Applikationerne omfatter Co farvning for metaboliske aktivitet og celle lineage markører eller spredning markører, vurdering af bidrag fra forskellige enzymer med genetiske modeller, vurdere subcellulært lokalisering af enzymaktivitet, overvågning enzymatisk aktivitet i sygt væv eller under udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at videregive.

Acknowledgements

HAC var Milton E. Cassel lærd af Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dette arbejde blev finansieret af tilskud til HAC fra National Institute for generelle medicinske videnskaber R01 GM081686, R01 AR070245, National Institute of generelle medicinske videnskaber R01 GM0866465, Eli & Edythe bred Center for regenerativ medicin og forskning i stamceller ( Rose bakker og Hal Gaba awards), Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, leukæmi lymfom Society, indvirkning priser fra Jonsson Comprehensive Cancer Center til WEL og HAC. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute af National Institutes of Health under Award nummer P50CA092131. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. HAC er medlem af Eli & Edythe bred Center for regenerativ medicin & stamcelleforskning, UCLA Molekylærbiologisk Institut og UCLA Bioinformatik mellemtjenstlig Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical instruments For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm Fisher Scientific NC9511236 For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound Fisher Scientific NC9638938 For mounting cryomolds
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide Fisher Scientific 12-545-78
4% formalin Fisher Scientific 23-245-684 Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base Fisher Scientific 23-245-684
NAD Sigma-Aldrich N7004
Phenazine methosulfate Sigma-Aldrich P9625
Nitrotetrazolium blue chloride Sigma-Aldrich N6876
Lithium L-lactate Sigma-Aldrich L2250 Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain Anatech 861 Counter stain
Mounting medium Vector Laboratories H-5000 
Cover slips for slides Fisher Scientific 12-544D
Light microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
  2. Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
  3. Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. Bios. (1992).
  4. Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
  5. Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
  6. Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
  7. Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. (2017).
  8. Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482 (2016).
  9. Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
  10. Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
  11. Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
  12. Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
  13. Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
  14. Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
  15. Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
  16. Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
  17. Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
  18. Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
  19. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).
  20. Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. (2017).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).
  22. Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
  23. Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics