Simian इम्यूनो वायरस में mRNA और सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति की एकल-कोशिका Quantitation-संक्रमित CD4+ टी कोशिकाओं को रीसस मकाक से पृथक कर

Immunology and Infection

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Summary

वर्णित एक पद्धति है ९६ जीन और 18 एकल कोशिकाओं के द्वारा सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति quantitate पूर्व vivo, विभेदक व्यक्त जीन और अप्रभावित कोशिकाओं के सापेक्ष वायरस संक्रमित कोशिकाओं में प्रोटीन की पहचान के लिए अनुमति देता है । हम SIV-संक्रमित CD4+ टी कोशिकाओं रीसस मकाक से अलग अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण लागू होते हैं ।

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Tokarev, A., Creegan, M., Eller, M. A., Roederer, M., Bolton, D. L. Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques. J. Vis. Exp. (139), e57776, doi:10.3791/57776 (2018).

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Abstract

एकल सेल विश्लेषण कोशिकाओं की विषम आबादी विदारक के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । दुर्लभ कोशिकाओं की पहचान और अलगाव मुश्किल हो सकता है । इस चुनौती को दूर करने के लिए, एक पद्धति के संयोजन अनुक्रमित प्रवाह cytometry और उच्च प्रवाह मल्टीप्लेक्स मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) विकसित किया गया था । उद्देश्य की पहचान करने और simian इम्यूनो वायरस (SIV) की विशेषता थी-रीसस मकाक के भीतर मौजूद संक्रमित कोशिकाओं. प्रतिदीप्ति द्वारा सतह प्रोटीन के quantitation के माध्यम से-सक्रिय कोशिका छँटाई (FACS) और mRNA द्वारा qPCR, वायरस संक्रमित कोशिकाओं वायरल जीन अभिव्यक्ति, जो मेजबान जीन और प्रोटीन माप के साथ संयुक्त है एक बहुआयामी प्रोफ़ाइल बनाने के द्वारा की पहचान कर रहे हैं . हम दृष्टिकोण, लक्षित एकल सेल Proteo-transcriptional मूल्यांकन, या tSCEPTRE । विधि प्रदर्शन करने के लिए, व्यवहार्य कोशिकाओं फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी एक सेल सबसेट और/या बहाव phenotypic विश्लेषण के FACS अलगाव के लिए इस्तेमाल सतह मार्करों के लिए विशिष्ट के साथ दाग रहे हैं । एकल कोशिकाओं को तत्काल lysis, मल्टीप्लेक्स रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी), पीसीआर पूर्व प्रवर्धन, और ९६ टेप तक का उच्च प्रवाह qPCR के बाद हल कर रहे हैं । FACS माप छंटाई के समय में दर्ज की गई है और बाद में अच्छी तरह से एक संयुक्त प्रोटीन और transcriptional प्रोफ़ाइल बनाने की स्थिति से जीन अभिव्यक्ति डेटा से जुड़े । SIV-संक्रमित कोशिकाओं सीधे पूर्व vivoका अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं कई वायरल आरएनए प्रजातियों का पता लगाने qPCR द्वारा की पहचान की गई. वायरल टेप के संयोजन और प्रत्येक की मात्रा वायरल जीवन चक्र के विभिंन चरणों में कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान (उदा, उत्पादक बनाम गैर उत्पादक) । इसके अलावा, SIV के tSCEPTRE+ कोशिकाओं को एक ही नमूना से पृथक करने के लिए विभेदक व्यक्त की मेजबान जीन और प्रोटीन का आकलन करने के लिए संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में थे । विश्लेषण से पता चला पहले की सराहना की वायरल आरएनए अभिव्यक्ति संक्रमित कोशिकाओं के बीच विविधता के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक सेल संकल्प के साथ vivo SIV-मध्यस्थता पोस्ट-transcriptional जीन विनियमन में . tSCEPTRE विधि किसी भी सेल सतह प्रोटीन मार्कर (ओं), मेजबान या रोगज़नक़ जीन (एस), या तत्संबंधी संयोजन की अभिव्यक्ति द्वारा पहचान के लिए उत्तरदाई जनसंख्या के विश्लेषण के लिए प्रासंगिक है ।

Introduction

कई intracellular रोगजनकों प्रतिकृति करने के लिए मेजबान सेल मशीनरी पर निर्भर करते हैं, अक्सर मेजबान सेल जीवविज्ञान फेरबदल या मेजबान कोशिकाओं के बहुत विशिष्ट उपआबादी लक्ष्यीकरण को अपने प्रचार के अवसरों को अधिकतम करने के लिए । नतीजतन, सेल जैविक प्रक्रियाओं सामांयतः मेजबान के समग्र स्वास्थ्य के लिए बचके परिणामों के साथ, बाधित कर रहे हैं । वायरस और मेजबान कोशिकाओं में वे स्पष्ट रोग तंत्र है कि बेहतर चिकित्सा और रणनीतियों के संक्रमण को रोकने के विकास में सहायता कर सकते है दोहराने के बीच बातचीत को समझना । प्रत्यक्ष विश्लेषणात्मक उपकरण है कि मेजबान के अध्ययन-रोगज़नक़ बातचीत सक्षम इस अंत की ओर आवश्यक हैं । एकल-कक्ष विश्लेषण किसी विशेष जीनोटाइप, या संक्रमण स्थिति1के लिए एक सेलुलर phenotype को स्पष्ट रूप से एट्रिब्यूट करने का एकमात्र साधन प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, रोगजनक संक्रमण अक्सर होस्ट कक्षों में प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष दोनों परिवर्तन पैदा करते हैं । इसलिए, उनके संक्रमित समकक्षों से संक्रमित कोशिकाओं को भेद करने के लिए या तो प्रत्यक्ष संक्रमण या द्वितीयक प्रभाव, जैसे सामान्यीकृत सूजन के लिए मेजबान सेल परिवर्तन विशेषता के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, कई रोगजनकों के लिए, जैसे SIV और मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी), कई चरणों के माध्यम से मेजबान सेल संक्रमण आय, जैसे जल्दी, देर से, या अव्यक्त, जिनमें से प्रत्येक विशिष्ट जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल2 द्वारा विशेषता हो सकती है , 3 , 4 , 5. सेल मिश्रण के थोक विश्लेषण इस विविधता6पर कब्जा करने में विफल हो जाएगा । इसके विपरीत, उच्च मल्टीप्लेक्स एकल सेल विश्लेषण के लिए दोनों वायरल और मेजबान जीन की अभिव्यक्ति का अंदाजा लगाने में सक्षम एक संक्रमण-विशिष्ट सेलुलर perturbations, संक्रमण चरणों में बदलाव सहित समाधान के लिए एक साधन प्रदान करते हैं । इसके अलावा, विश्लेषण मेजबान-शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेटिंग्स में रोगज़नक़ बातचीत संक्रमित जीवों में होने वाली घटनाओं की पहचान के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, सीधे वीवो पूर्व लागू किया जा सकता है कि तरीके vivo प्रक्रियाओं में सबसे अच्छा कब्जा करने की संभावना है ।

SIV और एचआईवी लक्ष्य CD4+ टी कोशिकाओं, जिसमें वे मेजबान एंटीवायरल "प्रतिबंध" कारकों और downregulate प्रतिजन पेश अणुओं उत्पादक संक्रमण स्थापित करने के लिए और प्रतिरक्षा निगरानी7,8से बचने के प्रभावहीन, 9,10,11. उपचार के बिना, CD4+ टी कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर नुकसान में संक्रमण के परिणाम, अंततः अधिग्रहीत इम्यूनो सिंड्रोम (एड्स)12में समापन । एंटीरेट्रोवाइरल चिकित्सा की स्थापना में, अव्यक्त रूप से संक्रमित सेल जलाशयों दशकों के लिए जारी रहती है, उपचारात्मक रणनीतियों के लिए एक दुर्जेय बाधा खड़ी । vivo एचआईवी/SIV-संक्रमित कोशिकाओं में के गुणों को समझना मेजबान सेल रोगजनन और हठ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई सुविधाओं को प्रकट करने की क्षमता है । हालांकि, यह किया गया है अत्यधिक चुनौतीपूर्ण, मुख्य रूप से संक्रमित कोशिकाओं और आसानी से उन्हें पहचान करने में सक्षम रिएजेंट की कमी की कम आवृत्ति के कारण. कोशिकाओं है कि वायरल आरएनए टाइप, 0.01 पर मौजूद होने का अनुमान है – CD4+ टी कोशिकाओं के रक्त में 1% और लसीकावत् ऊतक13,14,15. दमन चिकित्सा के तहत, अव्यक्त रूप से संक्रमित कोशिकाओं को भी कम कर रहे है पर लगातार 10-3-10-7 16,17,18। वायरल प्रोटीन धुंधला परख है कि इस तरह के intracellular चुप के लिए के रूप में इन विट्रो संक्रमण, में अध्ययन के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, 0.01 के धुंधला पृष्ठभूमि के कारण-0.1%, के समान या अधिक संक्रमित कोशिकाओं की आवृत्ति13की तुलना में इष्टतम हैं, 14. अच्छी तरह से विशेषता SIV/एचआईवी Env-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर Env प्रोटीन के लिए सतह धुंधला भी मुश्किल हो गया है, इसी तरह के कारणों के लिए संभावना साबित किया गया है । हाल ही में, उपंयास उपकरण का उद्देश्य या तो चुप झूठ आरएनए के लिए विशिष्ट परख शामिल द्वारा या वैकल्पिक इमेजिंग प्रौद्योगिकियों14,15,19का उपयोग करके चुप व्यक्त कोशिकाओं का पता लगाने में सुधार करने के लिए । हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण प्रत्येक कोशिका पर प्रदर्शन मात्रात्मक माप की संख्या में सीमित रहते हैं ।

यहां, हम पद्धति का वर्णन है कि (1) एकल वायरस संक्रमित कोशिकाओं को पहचानता है सीधे पूर्व संवेदनशील और विशिष्ट वायरल जीन मात्रात्मक qPCR द्वारा vivo और (2) quantifies की अभिव्यक्ति के लिए 18 सतह प्रोटीन और ९६ जीन के लिए प्रत्येक संक्रमित (और अनसंक्रमित) सेल. इस पद्धति FACS द्वारा तत्काल सेल lysis और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के द्वारा पीछा किया एकल सेल सतह प्रोटीन मापन को जोड़ती है, पर मल्टीप्लेक्स लक्षित qPCR का उपयोग कर के निशान प्रणाली । एकीकृत द्रव सर्किट (IFC) प्रौद्योगिकी एक साथ ९६ नमूनों से ९६ जीन के मल्टीप्लेक्स quantitation की अनुमति देता है, ९,२१६ कक्षों जिसमें व्यक्तिगत qPCR प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन कर रहे है की एक मैट्रिक्स द्वारा पूरा किया । लाइव सेल FACS छंटाई रिकॉर्ड उच्च सामग्री प्रोटीन बहुतायत माप है, जबकि विश्लेषण के लिए पूरे transcriptome के संरक्षण के तुरंत बहाव का प्रदर्शन किया । वायरस की पहचान करने के लिए संक्रमित कोशिकाओं, परख वैकल्पिक रूप से ब्याह और ब्याह वायरल RNAs (vRNA) के लिए विशिष्ट qPCR विश्लेषण में शामिल हैं, उपयोगकर्ता के एक पैनल के साथ-९६ जीन को totaling परख परिभाषित, परख वर्तमान में समायोजित की अधिकतम संख्या IFC । जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन प्रत्येक कोशिका के लिए एकत्र की जानकारी अच्छी तरह से स्थिति से जुड़े हुए हैं । हम पहले से इस विश्लेषण से परिणाम की सूचना दी20कहीं । यहां, हम और अधिक विस्तृत methodological दिशानिर्देश प्रदान करते है और साथ ही साथ SIV-संक्रमित CD4+ टी कोशिकाओं के phenotyping वर्णनात्मक ।

यह दृष्टिकोण है, जो हम शब्द tSCEPTRE, किसी भी व्यवहार्य सेल के निलंबन के लिए लागू किया जा सकता है फ्लोरोसेंट लेबल के लिए प्रतिक्रियाशील और उपलब्ध qPCR परख के साथ संगत transcriptome व्यक्त की आबादी । उदाहरण के लिए, यह दुर्लभ कोशिकाओं या सतह प्रोटीन मार्करों द्वारा आसानी से प्रतिष्ठित नहीं कोशिकाओं में निस्र्पक अंतर जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । नमूना तैयारी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग कर एक मानक दाग प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है । एकल सेल छंटाई क्षमता के साथ Cytometers भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन अतिरिक्त सुरक्षा सावधानियों संक्रामक जीवित कोशिकाओं प्रसंस्करण के लिए आवश्यक हैं । रिकॉर्डिंग एकल सेल अच्छी तरह से प्रत्येक कोशिका के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, अनुक्रमित छंटाई के रूप में यहां निर्दिष्ट, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध FACS छँटाई सॉफ्टवेयर की एक आम सुविधा है । गणना के ब्याज की कोशिका आबादी के बीच विभेदक व्यक्त की मेजबान जीन का विश्लेषण यहां वर्णित नहीं है, लेकिन संदर्भ पहले प्रकाशित तरीकों को प्रदान की जाती हैं ।

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Protocol

नोट: एक योजनाबद्ध प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो आरेख 1में दिखाया गया है । यह तीन प्रमुख चरणों के होते हैं: FACS, आरटी और सीडीएनए पूर्व प्रवर्धन, और qPCR के लिए ९६ जीन एक साथ के लिए । प्रोटोकॉल के दो संस्करण, कमजोर पड़ने और एकल कक्षों को सॉर्ट करना सीमित करने में कक्ष सॉर्टिंग, चरण 5 और चरण 6, में क्रमशः अधिक विवरण में वर्णित हैं । इन रणनीतियों विभिंन अनुसंधान प्रश्नों का पता लेकिन इसी तरह की प्रक्रियाओं का पालन करें ।

1. शर्त या पूर्व विश्लेषण

  1. सभी जीन अभिव्यक्ति परख मांय के रूप में पहले6वर्णित इस्तेमाल किया जाएगा ।
    नोट: यह चरण प्रयोग की तारीख के अग्रिम में अच्छी तरह से किया जाता है । सभी परख, वाणिज्यिक और कस्टम मांय, को सुनिश्चित करने के कुशल और प्रासंगिक आरएनए के रैखिक प्रवर्धन एकल सेल स्तर के नीचे की आवश्यकता है । कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और कस्टम परख इन विनिर्देशों को पूरा करने में विफल । प्रसंस्करण और अप करने के लिए ९६ जीन की अभिव्यक्ति की परख के एक साथ योग्यता के लिए स्वचालित वक्र फिटिंग पूरक कोडिंग 1 फ़ाइलें-5में प्रदान की जाती हैं, लेकिन व्यक्तिगत परख आर2 और रैखिक फिट की ढलान का उपयोग योग्य हो सकता है । प्रतिनिधि सफल और विफल परख योग्यता भूखंडों चित्रा 2में दिखाए जाते हैं ।
  2. हित के सेल सतह मार्करों दाग करने के लिए एंटीबॉडी के एक प्रवाह cytometric पैनल विकसित करना ।
    1. एक प्रासंगिक नमूना दाग द्वारा अनुमापन एंटीबॉडी, उदाहरण के लिए, रीसस परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs), प्रत्येक एंटीबॉडी के साथ. १०० µ एल धुंधला प्रतिक्रिया में परीक्षण प्रति एंटीबॉडी के 20 µ एल के साथ शुरू करो और ८ २-गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाएं । नकारात्मक और सकारात्मक आबादी के बीच एक स्पष्ट जुदाई को बनाए रखते हुए अधिकतम धुंधला तीव्रता दर्शाती है कि इष्टतम एकाग्रता की पहचान करें.
    2. कदम 1.2.1 में निर्धारित इष्टतम एकाग्रता पर सभी एंटीबॉडी के मिश्रण का उपयोग कर अतिरिक्त सेल नमूना (ओं) पर संयुक्त धुंधला का मूल्यांकन करें । सुनिश्चित करें कि दाग के समान है कि व्यक्तिगत एंटीबॉडी दाग के लिए मनाया । यदि धुंधला क्या मनाया जाता है जब किसी भी एंटीबॉडी अलगाव में इस्तेमाल किया गया था की तुलना में कम है, वैकल्पिक fluorochrome conjugates ऐसे एंटीबॉडी की जगह पर विचार करें ।

2. जीन अभिव्यक्ति परख तैयारी

  1. एक RNase में ९६ जीन अभिव्यक्ति परख का मिश्रण/DNase-नि: शुल्क 1-15 मिलीलीटर ट्यूब (आकार सॉर्ट प्लेटों की संख्या के साथ भिंन हो सकते हैं) । इस अध्ययन में प्रयुक्त होने वाले परख के पैनल को तालिका 1 और तालिका 2में निर्दिष्ट किया गया है । जिसके परिणामस्वरूप सामग्री "परख मिश्रण" के रूप में जाना जाता है । आगे और रिवर्स प्राइमरों के १८० एनएम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक परख जोड़ें । डीएनए निलंबन बफर जोड़ें परख मिश्रण के उपयुक्त कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: व्यावहारिक प्रयोजनों के लिए, कस्टम (उपयोगकर्ता जनित) परख स्टॉक्स 18 µ एम में तैयार किया जा सकता है के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध "20x" जीन अभिव्यक्ति qPCR परख (सामग्री की तालिका) की एकाग्रता के अनुरूप हो । 18 µ मी कस्टम आगे के घोला जा सकता है और प्रत्येक जीन के लिए रिवर्स प्राइमर डीएनए निलंबन बफर में स्टॉक समाधान से बना रहे हैं । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परख (सामग्री की तालिका) भी जांच में शामिल हैं, लेकिन जांच RT या सीडीएनए पूर्व प्रवर्धन के लिए आवश्यक नहीं है और इस तरह कस्टम परख के लिए लोप हो सकता है । यह छंटाई की दक्षता का आकलन करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण में उपयोग के लिए एक या अधिक गृह व्यवस्था जीन शामिल करने के लिए सिफारिश की है, सेल वसूली, और सीडीएनए संश्लेषण. यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग सीडीएनए उत्पंन करने के लिए निर्धारित नहीं किया गया है, लेकिन जीन से कम कुशल विशिष्ट प्राइमरों की उंमीद है ।
  2. ७.१ कदम (मल्टीप्लेक्स qPCR) में उपयोग के लिए 2x परख प्लेट तैयार करते हैं । प्रत्येक ९६ x ९६ चिप सरणी प्रत्याशित के लिए, पिपेट एक ९६-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के नामित अच्छी तरह से प्रत्येक परख के 6 µ एल । उदाहरण के लिए, 5 चिप्स, प्रत्येक परख के 30 µ एल के लिए ९६ अच्छी तरह से थाली में एक भी अच्छी तरह से कब्जा होगा । अगर ९६ परख का उपयोग कर, ९६ की एक अच्छी तरह से थाली एक परख शामिल होंगे । चिपकने वाली सील के साथ प्लेट सील ।
    नोट: आदर्श रूप में, कदम २.१ और २.२ एक साथ प्रदर्शन कर रहे हैं, जीन अभिव्यक्ति परख के लिए कई फ्रीज गल चक्र से बचने के लिए । परख प्लेट के भीतर सभी जीन भी परख मिश्रण में मौजूद है चाहिए (२.१ कदम) । दोनों परख मिश्रण और परख थाली में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c या लंबे समय के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या कम अवधि के उपयोग, क्रमशः ।

3. सतह के दाग व्यवहार्य कोशिकाओं

नोट: Intracellular धुंधला, permeabilization, और निर्धारण इस विधि के साथ संगत नहीं कर रहे है के रूप में वे आरएनए समझौता ।

  1. प्रत्येक एंटीबॉडी सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध २.५ पर मुआवजा मोतियों की ४० µ एल को जोड़ने के द्वारा मुआवजा नमूने तैयार है कि सेल धुंधला के लिए इस्तेमाल की तुलना में उच्च एकाग्रता गुना । 25 ° c प्रकाश से सुरक्षित पर 20 मिनट के लिए मशीन । मोतियों के लिए पंजाब के 3 मिलीलीटर जोड़ें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक । पंजाबियों को महाप्राण और पंजाबियों के ~ ३०० µ jk में मोतियों को फिर से सस्पेंड करें ।
  2. नमूना प्रसंस्करण के लिए फ्लो cytometric सेल सॉर्टर तैयार: मुआवजा ट्यूबों प्राप्त, मुआवजा मैट्रिक्स बनाने के लिए, और प्रायोगिक नमूनों के लिए अधिग्रहण फ़ाइलों के लिए मैट्रिक्स लागू होते हैं ।
  3. सामग्री की तालिकामें निर्दिष्ट के रूप में प्रत्येक एंटीबॉडी के उपयुक्त मात्रा के संयोजन से फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी कॉकटेल के मास्टर मिश्रण तैयार, एक १.५ मिलीलीटर एंबर ट्यूब में सभी नमूनों के लिए दाग हो । भंवर और 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए २१,००० x g पर कॉकटेल केंद्रापसारक एंटीबॉडी समुच्चय गोली ।
    नोट: यहां इस्तेमाल किया एंटीबॉडी सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।
  4. गल cryopreserved कोशिकाओं को एक ३७ ° c पानी स्नान में 2 मिनट के लिए । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पंजाब के 12 मिलीलीटर के लिए सेल निलंबन के 0.5 – 2 मिलीलीटर जोड़ें, 25 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक, और महाप्राण पंजाबियों । पंजाब के 3 मिलीलीटर में पुनर्निलंबित और एक 5 एमएल polystyrene ट्यूब को हस्तांतरण । ऊपर के रूप में और महाप्राण के रूप में, पंजाबियों ~ 20 µ एल अवशिष्ट पंजाबियों छोड़ केंद्रापसारक ।
    नोट: धुंधला तापमान गर्म या ठंडा तापमान के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के रूप में विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक एंटीबॉडी अनुमापन धुंधला शर्तों तदनुसार संशोधित करके (१.२ कदम देखें) ।
  5. एंटीबॉडी कॉकटेल के ८० µ एल में 2 एक्स 107 धोया कोशिकाओं को resuspend और 25 डिग्री सेल्सियस प्रकाश से सुरक्षित पर 20 मिनट के लिए मशीन । 2 x 107 कक्षों से अधिक के नमूनों के लिए, < 2 x 107 कक्षों/100 µ l को बनाए रखने के लिए उसके अनुसार धुंधलान प्रतिक्रिया वॉल्यूम बढ़ाएं ।
  6. पंजाब के 3 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं धो 3 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक, और supernatant aspirating ।
  7. अच्छी तरह से एक ३५ µm नायलॉन सेल छलनी टोपी के माध्यम से pipetting द्वारा पंजाब और फिल्टर के 500 µ एल में 300-कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड । कोशिकाओं को बर्फ पर रखें और सॉर्ट तक प्रकाश से सुरक्षित ।

4. सेल संग्रह प्लेटें तैयार, FACS तरह प्रदर्शन, और सीडीएनए उत्पन्न

  1. RT-preamp प्रतिक्रिया मिश्रण घटकों (तालिका 3) pipetting द्वारा एक एकल RNAse/DNAse मुक्त बाँझ ट्यूब में संयोजित.
    नोट: इस चरण से पहले या चरण 3 में धुंधला होने के दौरान किया जा सकता है । qPCR संकेत करने के लिए डीएनए टेम्पलेट का योगदान निर्धारित करने के लिए RT एंजाइम को यहाँ छोड़ा जा सकता है.
  2. ९६-well पीसीआर सॉर्ट संग्रह प्लेटों की इच्छित संख्या में RT-preamp प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 µ एल वितरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें । चिपकने वाली फिल्म के साथ प्लेटें सील, और पूर्व ठंडा ९६-अच्छी तरह से एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर प्लेटों जगह है ।
  3. सना नमूना के लगभग २०,००० कोशिकाओं से डेटा प्राप्त करके प्रवाह cytometer पर सेल छंटाई गेटिंग योजना स्थापित करना । सुनिश्चित करें कि मुआवजा मैट्रिक्स एकत्र डेटा के लिए लागू किया जाता है । गेट्स ड्रा और गेटिंग पेड़ है कि ब्याज की कोशिका जनसंख्या (ओं) की पहचान के लिए जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए अलग हो परिभाषित ।
    नोट: गेटिंग ट्री संभावित SIV vRNA+ कक्षों के संग्रह के लिए उपयोग किया गया चित्र 3में दिखाया गया है ।
  4. संख्या और प्रत्येक कुआं में हल किया जा करने के लिए कक्षों के सबसेट को निर्दिष्ट करने के लिए उपयुक्त साधन सेटिंग्स दर्ज करें । या तो एक सीमित सेल कमजोर पड़ने श्रृंखला या एकल कोशिकाओं छंटाई के लिए अतिरिक्त विस्तृत अनुदेश चरण 5 और 6, क्रमशः में प्रदान की जाती हैं ।
  5. FACS तैयार ९६-well पीसीआर संग्रह प्लेटों में कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें । सॉर्ट करने से पहले चिपकने वाला सील निकालें और सॉर्ट के बाद एक नए सिरे से सील के साथ बदलें ।
    नोट: हर समय पूर्व ठंडा एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर प्लेटें रखना, सॉर्ट के दौरान सहित ।
  6. तुरंत बाद सॉर्ट, भंवर और २,००० x g पर संग्रह की थाली केंद्रापसारक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए ।
  7. Thermocycle एक पीसीआर मशीन में थाली निंनलिखित शर्तों का उपयोग कर एक गरम ढक्कन के साथ: ५० ° c 15 मिनट के लिए (RT), 2 मिनट के लिए ९५ ° c, 15 एस के लिए ९५ ° c के 18 चक्र के बाद और ६० ° c 4 मिनट के लिए (पूर्व प्रवर्धन) ।
  8. एक नया ९६-well पीसीआर प्लेट में डीएनए निलंबन बफर के 20 µ एल में सीडीएनए के 5 μL स्थानांतरित करके सीडीएनए 1:5 पतला । पतला सीडीएनए 4 डिग्री सेल्सियस या-20 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए इस बिंदु पर संग्रहित किया जा सकता है । सीडीएनए अब qPCR के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है (चरण ५.२, ७.४).
    नोट: यह कमजोर पड़ने सुनिश्चित करता है कि आरटी-preamp प्रतिक्रिया में उपस्थित प्राइमरों बहाव qPCR के लिए योगदान नहीं है ।

5. भिन्नता a: FACS vRNA+ कोशिकाओं की आवृत्ति का निर्धारण करने या प्रयोगात्मक गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन करने के लिए एक सीमित कमजोर पड़ने श्रृंखला में क्रमबद्ध कोशिकाओं

नोट: एक एकल-कक्ष सॉर्ट करने से पहले, इसे दोहराने में सीरियल कमजोर पड़ने में कोशिकाओं छंटाई द्वारा ब्याज की कोशिकाओं की आवृत्ति, निर्धारित करने के लिए उपयोग का हो सकता है । चरण ५.३ में वर्णित के रूप में यह चरण भी सॉर्ट दक्षता, कक्ष lysis, आरएनए पुनर्प्राप्ति और सीडीएनए संश्लेषण के लिए मूल्यवान गुणवत्ता नियंत्रण प्रदान करता है । vRNA का पूर्व निर्धारण+ सेल आवृत्ति उचित संचालित vRNA+ सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूना आकार को प्राप्त करने के लिए हल किया जाना चाहिए कि एकल कोशिकाओं की संख्या का अधिक सटीक आकलन के लिए अनुमति देता है.

  1. FACS ९६-अच्छी तरह से कदम 4.1 – 4.2 में के रूप में तैयार प्लेटों में कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें, और इकट्ठा 1-1000 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से कई प्रतिकृति में ।
    नोट: प्रत्येक कोशिका कमजोर पड़ने पर कुओं की प्रतिकृति की संख्या आमतौर पर व्युत्क्रम प्रति अच्छी तरह से सेल एकाग्रता के साथ जुड़ा हुआ है । जब संक्रमित कोशिका आवृत्ति 1% से अच्छी तरह से नीचे है, सेल कमजोर पड़ने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए 100 – 1000 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से. एक उदाहरण सॉर्ट प्लेट मानचित्र चित्रा 1, ऊपर छोड़ दिया में प्रदान की जाती है । १,००० कोशिकाओं से अधिक प्रति अच्छी तरह से प्रतिक्रिया की मात्रा में परिणामस्वरूप बढ़ जाती है और बहाव सीडीएनए संश्लेषण और ठहराव के साथ हस्तक्षेप के कारण बचा जाना चाहिए ।
  2. qPCR रिएजेंट्स में एक मास्टर मिश्रण समाधान तालिका 4में संयोजित । एक 25 µ एल प्रतिक्रिया मात्रा के लिए, २२.५ µ एल मास्टर मिक्स के २.५ µ एल के साथ संयुक्त है पतला सीडीएनए के चरण ३.९ से टेंपलेट । (उदा., 5 मिनट के लिए ९४ ° c, 15 s के लिए ९४ ° c के ४० चक्र और 1 मिनट के लिए ६० ° c) के बाद मानक साइकलिंग शर्तों का उपयोग करके qPCR निष्पादित करें ।
    नोट: Singleplex qPCR प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर एक पारंपरिक वास्तविक समय qPCR साधन एक या कुछ परख के एक किफायती प्रारंभिक विश्लेषण के रूप में सिफारिश कर रहे है कुशल कोशिका छंटाई, आरएनए वसूली, और सीडीएनए संश्लेषण का प्रदर्शन । यह भी vRNA+ कोशिकाओं की आवृत्ति की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मल्टीप्लेक्स qPCR प्रतिक्रियाओं का उपयोग आम तौर पर बड़े पैमाने पर एकल सेल विश्लेषण के लिए अधिक उपयुक्त हैं ।
  3. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, प्लॉट एट मान (एट = सीटीमैक्स − सीटी) बनाम एक लॉग10 स्केल पर अच्छी तरह से सॉर्ट किए गए कक्षों की संख्याएं और रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण लागू करें ।
    नोट: संगत प्रतिकृति, रेखीय प्रतीपगमन ढलान के ३.३ (± ०.३), और R2 > 0.9 एक कुशल प्रयोग का संकेत कर रहे हैं । इष्टतम और इष्टतम सॉर्ट, आरटी-preamp के प्रयोगों के उदाहरण चित्रा 4में दिखाए जाते हैं ।
  4. vRNA+ कोशिकाओं की आवृत्ति का निर्धारण करने के लिए, x-अक्ष (लॉग10 स्केल) पर अच्छी तरह से प्रति सॉर्ट किए गए प्लॉट कक्ष संख्याओं और y-अक्ष पर प्रत्येक कोशिका कमजोर पड़ने पर vRNA के लिए धनात्मक कुओं का अंश । उदाहरण के लिए, चित्र 1 (निचला बायां, Poisson वितरण) देखें । ६३.२% कुओं के सकारात्मक (y-अक्ष पर ०.६३२)21करने के लिए संगत, औसत पर एक सकारात्मक सेल बंदरगाह है कि कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए डेटा के लिए एक रैखिक प्रतिगमन मॉडल लागू करें । इस सेल कमजोर पड़ने संख्या (x-अक्ष अवरोधन) एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त आवृत्ति में कनवर्ट करें । उदाहरण के लिए, एक vRNA+ कक्ष प्रति ४८ कक्षों की आवृत्ति २.१% के बराबर है ।

6. भिंनता B: एकल-कक्ष विश्लेषण के लिए FACS सॉर्ट कक्ष

  1. चरण 4.1 – 4.8 का पालन करें, और अच्छी तरह से मैप किए गए प्रत्येक कक्ष के लिए व्यक्तिगत FCS फ़ाइलें बनाने के लिए प्रवाह cytometer की अनुक्रमणिका सॉर्ट सुविधा का उपयोग करके एक कक्ष सॉर्ट करें ।
    नोट: यदि सॉर्ट संग्रह पट्टियों की संख्या उपलब्ध thermocyclers की संख्या से अधिक है, तो सायकलिंग को रिवर्स transcriptase निष्क्रियण चरण (2 मिनट के लिए ९५ ° c) के बाद रोका जा सकता है और सीडीएनए 4 डिग्री सेल्सियस पर thermocyclers उपलब्ध होने तक संग्रहित किया जा सकता है । इस मामले में, 15 एस के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस के पहले चक्र में पूर्व प्रवर्धन शुरू ।
  2. वैकल्पिक: अवशिष्ट undiluteed सीडीएनए का उपयोग कर ब्याज की दुर्लभ कोशिकाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए एकल कोशिकाओं के उपयोगकर्ता परिभाषित बैचों से सीडीएनए से मिलकर "ताल" बनाएँ. एक नया ९६-अच्छी तरह से प्लेट में मल्टीचैनल पिपेट द्वारा पतला एकल सेल पूर्व सीडीएनए प्रवर्धित के µ एल स्थानांतरण । एक ही अच्छी तरह से एक नामित पूल के सभी अतिरिक्त एकल कोशिकाओं से सीडीएनए के 2 µ एल pipetting द्वारा दोहराएँ । ब्याज की जीन (ओं) के लिए स्क्रीन सीडीएनए पूल (जैसे, vRNA) उन है कि सकारात्मक कोशिकाओं को शामिल निर्धारित करने के लिए पारंपरिक qPCR का उपयोग । चूंकि पूलिंग की आवश्यकता होती है केवल एक छोटा aliquot प्रत्येक कक्ष से सीडीएनए की, शेष ~ 8 µ l सीडीएनए अभी भी एकल-कक्ष विश्लेषण के लिए उपलब्ध है ।
    नोट: पूलिंग रणनीति एकल सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए पहले एक संसाधन गहन मल्टीप्लेक्स qPCR द्वारा पूछताछ की एकल कोशिकाओं की संख्या को कम करने के प्रयास में सिफारिश कर रहे हैं । यह परिस्थितियों में जो ब्याज की कोशिकाओं (जैसे, SIV mRNA +) एक प्रारंभिक एकल plex qPCR परख द्वारा पहचाना जा सकता है के लिए उपयुक्त है । सीधा उच्च प्रवाह रणनीतियों सीडीएनए पूल बनाने के लिए एक संग्रह तरह प्लेट की पंक्तियों (यानी, पंक्ति में सभी 12 कोशिकाओं को एक) या कॉलम (यानी, कॉलम 1 में सभी 8 कोशिकाओं), एक अच्छी तरह से एक नई थाली में में से undilute सीडीएनए के 2 µ एल के संयोजन शामिल हैं । सबसे अच्छा पूलिंग रणनीति का निर्धारण करने के लिए, चरण ५.४ से ब्याज की कक्षों की अपेक्षित आवृत्ति पर विचार करें । उदाहरण के लिए, यदि कोशिकाओं के 10% सकारात्मक होने की उंमीद कर रहे हैं, छह एकल सेल सीडीएनए नमूनों के शामिल पूल अक्सर नकारात्मक होगा और उस पूल में प्रतिनिधित्व कोशिकाओं को अनुप्रवाह एकल सेल विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है ।

7. मल्टीप्लेक्स qPCR पर निशाना मंच

नोट: यह अनुभाग या तो संस्करण A या B ऊपर वर्णित का पालन कर सकते हैं । यहां वर्णित अध्ययन में, यह एकल सेल विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से लागू किया गया था ।

  1. 2x परख प्लेट से एक परख के pipetting 4 µ एल द्वारा qPCR परख प्लेट तैयार (२.२ कदम में) एक नया ९६-अच्छी तरह से पीसीआर 4 µ एक अच्छी तरह से परख लोड हो रहा है एजेंट की l युक्त प्लेट में तैयार किया । 4 डिग्री सेल्सियस पर परख थाली बनाए रखें ।
    नोट: परख प्लेट 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए और एक महीने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है । इस प्रकार, यह कई चिप्स और उचित रूप से दुकान के लिए पर्याप्त सामग्री तैयार करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।
  2. कंट्रोल लाइन के तरल पदार्थ को भड़काने वाले सीरिंज से चिप के दो सेवन वाल्वों में बांट लें. प्लेट के नीचे से सुरक्षात्मक प्लास्टिक निकालें । A1 स्थिति में पायदान पर साइड के साथ एक IFC नियंत्रक पर चिप रखें. मुख्य मेनू से, "प्रधानमंत्री" स्क्रिप्ट का चयन करें । स्क्रिप्ट चलाएं ।
  3. प्रत्येक microfluidic चिप के लिए पीसीआर मास्टर मिक्स (सामग्री की मेज) के ५०० µ एल के साथ नमूना लदान रिएजेंट के ५० µ एल मिश्रण से वास्तविक समय प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें । पिपेट ४.४ µ एल एक नए ९६-खैर पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुआं में, फिर से "नमूना प्लेट" के रूप में नामित ।
  4. पिपेट ३.६ µ एल के 1:5 से पतला सीडीएनए नमूना थाली में वास्तविक समय प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त चरण ४.८ से ।
    नोट: यदि एक पीसीआर नीचे चयन करने के लिए दुर्लभ (उदा, vRNA+) के लिए स्क्रीन के लिए चरण ६.२ में चर्चा के रूप में बहाव विश्लेषण के लिए किया गया था, केवल कक्ष सकारात्मक पूल में प्रतिनिधित्व शामिल हैं ।
  5. चिप भड़काना के पूरा होने के बाद, चिप की ओर से इसी तरह के पायदान पर (परख) में 5 µ एल वितरण द्वारा की सुविधा देता भार चिप, और 5 µ नमूना प्लेट से एल पर इसी अच्छी तरह से अंय (नमूना) की ओर चिप के । । IFC नियंत्रक में चिप डालें और "लोड मिश्रण" स्क्रिप्ट चलाएँ.
  6. division qPCR को निष्पादित करने के लिए चिप को स्मार्क प्लेटफार्म पर ट्रांसफर करें । उपकरण सेटअप और qPCR वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की कदम दर कदम अनुदेश निंनलिखित के साथ आगे बढ़ना है और पीसीआर के ४० चक्र के साथ जीन अभिव्यक्ति (जीई) ९६.९६ मानक V .1 प्रोटोकॉल का उपयोग कर । ChipRun फ़ाइल को किसी निर्दिष्ट फ़ोल्डर में सहेजें ।
    नोट: कई चिप्स प्रति दिन और कई दिनों से अधिक चलाया जा सकता है.
  7. qPCR डेटा का विश्लेषण करें ।
    1. रीयल-टाइम पीसीआर विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें । "फ़ाइल से" ChipRun. bml "फ़ाइल खोलें । खोलें "मेनू ।
    2. ढूंढें "चिप एक्सप्लोरर" और "चिप भागो सारांश" सॉफ्टवेयर विंडो के ऊपरी बाएं कोने में । चिप भागो सारांश के तीन घटकों की पहचान: विश्लेषण दृश्य, नमूना सेटअप, और डिटेक्टर सेटअप ।
    3. "डिटेक्टर सेटअप" पर क्लिक करें । "कार्य" के अंतर्गत, "नया" क्लिक करें और कंटेनर प्रकार "SBS प्लेट", और संग्राहक स्वरूप "SBS96" चुनें । "मानचित्रण" के बगल में,... बटन पर क्लिक करें, और "M96-Assay-SBS96. डीएसपी" का चयन करें ।
      1. वैकल्पिक: एक डिटेक्टर निरुपित (परख) एक संख्या या नाम "नाम" अनुभाग में एक अच्छी तरह से डबल पर क्लिक करके 1सेंट पर । "F2" दबाने से अगले अच्छी तरह से ले जाएँ ।
    4. "नमूना सेटअप" पर क्लिक करें । "मैपिंग" के आगे "कार्य" के अंतर्गत,... बटन पर क्लिक करें और "M96-Sample-SBS96. डीएसपी" चुनें.
    5. "विश्लेषण विचार" पर क्लिक करें । "कार्य" के अंतर्गत "qPCR" टैब में, का चयन करें "आधार रेखा सुधार के लिए रेखीय (व्युत्पन्न)", और "सीटी थ्रेशोल्ड विधि उपयोगकर्ता (डिटेक्टरों) के लिए" । "सीटी थ्रेसहोल्ड" टैब में, "ऑटो बॉक्स के साथ शुरू" की जाँच करें. ऊपर "विश्लेषण" बटन पर क्लिक करें ।
    6. "विश्लेषण विचार" के ऊपरी दाएँ वृत्त का चक्र में, दूसरे टैब पर क्लिक करें "परिणाम तालिका". ड्रॉप-डाउन मेनू से, "हीट मानचित्र दृश्य" चुनें. डेटा के साथ हीट मैप दिखाई देगा.
      1. वैकल्पिक: चिप भर में वर्दी ROX प्रतिदीप्ति सुनिश्चित करने के लिए, एक ही मेनू से "गर्मी नक्शा देखें" के बजाय "छवि देखें" का चयन करें. गर्मी के नक्शे के ऊपर सही खिड़की से दूसरे में, "ROX" का चयन करें । दाईं विंडो से पहले, 1 – 40 चक्रों में से एक का चयन करें । ROX प्रतिदीप्ति के काले और सफेद प्रदर्शन के लिए स्विच करने के लिए दाईं विंडो से चौथे पर क्लिक करें. एक छवि दिखाई देगा कि छींटे, कणों, या चिप पर दोष बताते हैं । यदि ROX एकरूपता निहायत अस्पष्ट हो तो फिर से चिप चलानी पड़ती है.
    7. हीट मानचित्र के अंतर्गत, "थ्रेशोल्ड" और "लॉग ग्राफ़" पर क्लिक करें. (हीट मैप के कॉलम) परख पर क्लिक करके और दहलीज के रूप में घातीय चरण में प्रवर्धन घटता काटना करने के लिए आवश्यक खींचकर प्रत्येक डिटेक्टर के लिए सीटी थ्रेसहोल्ड मैन्युअल रूप से समायोजित करें । जब किया, क्लिक करें "विश्लेषण" ।
  8. qPCR डेटा को. csv फ़ाइल के रूप में निर्यात करें । एक स्प्रेडशीट या सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, JMP) में डेटा आयात और चिप पर नमूना और परख पदों से परिणाम नक्शा । एक नया स्तंभ बनाकर और सशर्त सूत्र का उपयोग करके, वायरल जीन की अभिव्यक्ति के आधार पर समूहों में कोशिकाओं को व्यवस्थित करें । "विश्लेषण करें" के अंतर्गत, "X द्वारा फ़िट Y", और प्लॉट जीन व्यंजक बनाम समूह चुनें. सांख्यिकीय विश्लेषण लागू करें ।
    नोट: प्रतिनिधि एकल-कक्ष परिमाणात्मक अभिव्यक्ति चार SIV आरएनए प्रजातियों का चित्र 5में bivariate भूखंडों में दर्शाया गया है । मात्रात्मक मेजबान SIV आरएनए में जीन अभिव्यक्ति+ कोशिकाओं चित्रा 5Bमें दिखाया गया है.
  9. एकल-कक्ष FACS डेटा से मात्रात्मक प्रोटीन व्यंजक मानों को निकालें.
    1. fcs फ़ाइलों को FACS सॉर्ट (चरण ६.१) से ९६-well प्लेट FlowJo 9 संस्करण का उपयोग करने के लिए इसी खोलें । के साथ फ़ाइल नाम पर प्रकाश डाला, चुनें "मंच । घटना संख्या गेट | अनुक्रमित क्रमबद्ध गेट्स बनाएं "। व्यक्तिगत कक्ष पंक्ति द्वारा प्रदर्शित दिखाई देंगे ।
    2. सभी ९६ कक्षों को हाइलाइट करें (पंक्तियां नहीं) और "कार्यस्थान" चुनें । निर्यात । सभी क्षतिपूर्ति fluors का चयन करें "। "डेटा प्रकार" के अंतर्गत, "FCS फ़ाइल" चुनें, "निर्यात करें" पर क्लिक करके एक निर्दिष्ट फ़ोल्डर चुनें.
    3. नए FlowJo कार्यस्थान में व्यक्तिगत कक्षों के लिए नई. fcs फ़ाइलें खींचें । सभी कक्षों को हाइलाइट करें, "आँकड़े जोड़ें" (ऊपरी बाएँ कोने में "Σ" बटन पर क्लिक करे) "| मतलब । सभी fluor पैरामीटर "।
    4. ऊपरी बाएँ कोने में बाईं ओर से चौथे बटन पर क्लिक करके "तालिका संपादक" खोलें. प्रथम कक्ष के सभी fluores हाइलाइट करें और उंहें तालिका संपादक विंडो में खींचें । तालिका संपादक विंडो में, शीर्ष पर एक ही बटन क्लिक करें "बनाएं और देखें तालिका" । यह ९६ कक्षों की तालिका बनाएगा और प्रत्येक fluor के लिए एक सांख्यिक पैरामीटर देगा.
    5. एक डेटाबेस सॉफ्टवेयर में आउटपुट की प्रतिलिपि बनाएं (जैसे, एमएस एक्सेल, JMP), या तो नकल/चिपकाने या क्लिक करके "सहेजें और अनुप्रयोग लॉंच" (तालिका के ऊपर बाएं बटन से चौथा) ।
      नोट: यह कार्यविधि FlowJo संस्करण 9 के लिए विशिष्ट है । FlowJo संस्करण 10 अनुक्रमणित डेटा आयात करने के लिए किसी भिन्न कार्यविधि का उपयोग करता है । अनुक्रमित प्रवाह डेटा भी कॉपी किया जा सकता है/JMP में सीधे सेल सॉर्टर द्वारा बनाई गई. csv फ़ाइलों से चिपकाया ।
  10. एकल-कक्ष FACS डेटा और qPCR डेटा को प्लेट संख्या और अच्छी स्थिति से मर्ज करें । संयुक्त एकल-सेल जीन (qPCR) और प्रोटीन अभिव्यक्ति (FACS) डेटा पर चित्रमय और सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं ।
    नोट: एकल-कक्ष संयोजित qPCR और FACS डेटा के उदाहरण चित्रा 6 (SIV-संक्रमित, ब्याह vRNA+ रीसस समूल कोशिकाओं के लिए मेजबान सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल) में दिखाए जाते हैं, चित्रा 7 (CD4 जीन अभिव्यक्ति बनाम सतह ब्याह vRNA+ रीसस समूल कोशिकाओं में CD4 प्रोटीन अभिव्यक्ति), और पहले से प्रकाशित20। ब्याज की कोशिका जनसंख्या (ओं) में अंतर व्यक्त जीन की पहचान करने के लिए, एकल-सेल विश्लेषण विधियों पहले वर्णित20,22,23,24, सिफारिश कर रहे है जो खाते के लिए एक जीन के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के अनुपात के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सतत जीन अभिव्यक्ति मूल्य ।

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Representative Results

संपूर्ण प्रोटोकॉल के लिए वर्कफ़्लो आरेख 1में दर्शाया गया है. यह क्रमबद्ध कक्षों की संख्या द्वारा परिभाषित दो रूपांतरों के होते हैं: या तो कमजोर पड़ने या एकल कक्षों के रूप में सीमित, जैसा कि पाठ में वर्णित है. 2-गुना सीरियल आरएनए कमजोर पड़ने पर प्राइमर-जांच योग्यता विश्लेषण के उदाहरण चित्रा 2में दिखाए जाते हैं । गेटिंग रणनीति संभावित SIV+ कोशिकाओं की पहचान करने के लिए चित्रा 3में दिखाया गया है । एक सफल, इष्टतम और विफल गुणवत्ता नियंत्रण qPCR पर गृह व्यवस्था जीन GAPDH के लिए FACS-सॉर्ट की गई कोशिकाओं को सीमित करने में आंकड़ा 4में दिखाया गया है । चार SIV आरएनए प्रजातियों और रीसस समूल जीन है कि संक्रमित कोशिकाओं में अंतर व्यक्त किया गया के एकल सेल मात्रात्मक अभिव्यक्ति चित्रा 5में दिखाया गया है । प्रतिनिधि bivariate, हिस्टोग्राम, और scatterplots SIV आरएनए की सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का चित्रण+ CD4+ T चित्रा 6में प्रवाह cytometry द्वारा मापा कोशिकाओं. trivariate बुलबुला प्लॉट (चित्रा 7) सतह CD3 या CD4 प्रोटीन, CD3 या CD4 mRNA, और मात्रात्मक वायरल जीन के बीच संबंधों को प्रदर्शित करता है (एक ही कक्ष मेंजैसे/

Figure 1
चित्रा 1 : प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह के योजनाबद्ध तीन प्रमुख घटकों को दर्शाता है: फ्लो cytometric सॉर्ट, रिवर्स प्रतिलेखन प्लस पीसीआर-आधारित सीडीएनए के पूर्व प्रवर्धन (आरटी, पूर्व amp), और qPCR. सॉर्ट या तो एक सीमित कमजोर पड़ने के रूप में प्रदर्शन किया जा सकता है (एक, हरी पृष्ठभूमि) या एकल कोशिकाओं के रूप में (बी, नारंगी पृष्ठभूमि). तुरंत FACS प्रकार के बाद, कोशिकाओं लीजड ड रहे हैं और आरएनए qPCR टेम्पलेट तैयार करने के लिए सीडीएनए और पूर्व परिवर्धित (आरटी, पूर्व amp पीसीआर) में लिखित रिवर्स है. सीमित कमजोर पड़ने प्रकार Poisson वितरण सांख्यिकी के साथ ही प्रायोगिक दक्षता और नमूना वसूली का उपयोग कर वायरल आरएनए के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की आवृत्ति का निर्धारण । हरे तीर सिर के प्रति अच्छी तरह से एक वायरल जीन के लिए एक सेल सकारात्मक (इसी तरह के कुओं के ६३.२% संभाव्यता जीन सकारात्मक जा रहा है), जो एक कोशिका आवृत्ति में परिवर्तित हो जाता है से संबंधित कोशिकाओं की अनुमानित संख्या इंगित करता है । आवृत्ति अनुमान एक अनुवर्ती सॉर्ट (B) में संग्रहीत एकल कक्षों की संख्या को सूचित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । अनुक्रमित एकल सेल FACS छंटाई एक सेल के प्रति अच्छी तरह से और प्रत्येक सेल के लिए डेटा फ़ाइलों को उत्पंन अच्छी तरह से ९६-अच्छी तरह से थाली के भीतर की स्थिति । एकल सेल qPCR मल्टीप्लेक्स में ९६ जीन एक साथ के लिए किया जाता है । सतह प्रोटीन (FACS) और mRNA अभिव्यक्ति के संयोजन व्यक्तिगत कोशिकाओं (सही कॉलम) की रूपरेखा के लिए अनुमति देता है । एक वायरल जीन के लिए एक वैकल्पिक qPCR पूर्व प्रवर्धन पीसीआर और मल्टीप्लेक्स्ड qPCR के बीच प्रदर्शन किया जा सकता है (बी, मध्य) एकल कोशिकाओं या एकल सेल सीडीएनए के पूल के लिए डाउन-चुनें वायरल आरएनए+ कोशिकाओं या पूल मल्टीप्लेक्स qPCR विश्लेषण के लिए । गर्मी नक्शा ९६ परख (कॉलम) और ९६ एकल कोशिकाओं (पंक्तियों) के लिए जीन अभिव्यक्ति (सीटी मूल्य) दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि qPCR प्राइमर योग्यता प्रयोगों से डेटा सफल (बाएँ और मध्य) के लिए दिखाया गया है और (सही) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परख विफल (CD6, SIV जैसे , और TLR3, क्रमशः). CD6 और TLR3 के लिए , आरएनए 106 FACS-क्रमबद्ध रीसस समूल PBMC CD4+ टी-कोशिकाओं का उपयोग करके एक वाणिज्यिक किट से निकाला गया था । एक बारह सूत्री आरएनए के आठ दोहराने दो गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला (0.023-48 एनजी आरएनए, 1.2-2400 सेल CD4 प्रति 20 स्नातकोत्तर आरएनए+ टी सेल संभालने समकक्ष) आरटी-preamp और qPCR के अधीन थे । SIV जैसे के लिए /rev, आरएनए रीसस समूल PBMCs SIVmac239 के साथ इन विट्रो में संक्रमित से निकाला गया था । आरएनए कमजोर पड़ने के लिए 6-12000 कोशिकाओं की शाही सेना के समकक्ष फैले तैयार थे । एट (४०-सीटी) मूल्यों, जो जीन अभिव्यक्ति के साथ वृद्धि, अनुमानित सेल संख्या बनाम साजिश रची है । कमजोर पड़ने श्रृंखला आर2 का प्रदर्शन > 0.97 और ३.३२ ± ०.३ की ढलान सफल प्राइमरी योग्यता का संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: SIV द्वारा संभावित रूप से संक्रमित रीसस समूल कोशिकाओं के अलगाव के लिए गेटिंग योजना के साथ Bivariate FACS भूखंड । स्मृति (CD95 +) CD4+ टी कोशिकाओं का चयन करने के लिए अनुक्रमिक गेट्स प्रत्येक जनसंख्या नाम के साथ कम सही करने के लिए ऊपरी बाएँ से दिखाया जाता है संकेत दिया । प्रत्येक गेट के भीतर गिर जाता है कि जनक साजिश का प्रतिशत संकेत दिया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : qPCR के प्रतिनिधि प्रायोगिक सत्यापन का उपयोग कमजोर पड़ने को सीमित करने में FACS-क्रमबद्ध कोशिकाओं पर प्रदर्शन GAPDH तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए गृह व्यवस्था जीन: सफल (बाएं), इष्टतम (मध्य), और विफल (दाएं) । 10-100 कोशिकाओं की प्रतिकृति अच्छी तरह से नहीं 2 Ets से अधिक अवधि चाहिए, और 300-1 एट के भीतर 1000 सेल वेल्स । रैखिक प्रतिगमन ढलान ३.३२ ± ०.३, आर2 > 0.95 होना चाहिए । इन विनिर्देशों को प्राप्त करने में विफलता चरण 1, 2, 3, या तत्संबंधी संयोजन में तकनीकी कठिनाइयों को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : एकल-सेल मात्रात्मक वायरल और मेजबान जीन अभिव्यक्ति में FACS-क्रमबद्ध रीसस समूल CD4+ mesenteric लिम्फ नोड से टी कोशिकाओं 10 दिनों के बाद SIVmac251 संक्रमण. () वायरल जीन अभिव्यक्ति bivariate भूखंडों का गुणा-ब्याह (ताट/rev) और अकेले ब्याह (env) SIV mRNA द्वारा एकल कोशिकाओं (बाएं) । जैसे/rev+env- कोशिकाओं (x-अक्ष के साथ हल्के हरे रंग की कोशिकाओं) env+ कोशिकाओं (डार्क ग्रीन), एक प्रारंभिक के साथ संगत से जैसेकम प्रतियां/ संक्रमण की अवस्था और Rev प्रोटीन से पहले मध्यस्थता स्थिरीकरण और आंशिक रूप से ब्याह vRNAs जैसे envके परमाणु निर्यात । ब्याह एक्सप्रेस नहीं है कि कोशिकाओं वायरल आरएनए ग्रे में चित्रित कर रहे हैं (कोई वायरल आरएनए), ब्राउन (ढकोसला+ और बाएं से दाएं+), या तन (या तो झूठ+ या लीटर). ब्याह (झूठ+) और कुल (लीटर+) SIV mRNA अभिव्यक्ति एक ही कोशिकाओं (दाएं) के लिए दिखाया गया है । जैसेही/rev+env+ कोशिकाओं में ब्याह झूठ चुप आरएनए के उच्च बहुतायत प्रचुर जीनोमिक आरएनए नवोदित में पैकेजिंग के लिए व्यक्त की है, जिसके दौरान देर से मंच उत्पादक संक्रमण के अनुरूप है virions । () रीसस के वायलिन भूखंडों को समूल संक्रमित कोशिकाओं (ग्रे) की तुलना में SIV-संक्रमित कोशिकाओं के एक सबसेट में विभेदक रूप से व्यक्त किया जाता है । सांख्यिकीय विश्लेषण पहले20,22,23,24के रूप में वर्णित किया गया था । तारांकन संक्रमित कक्षों के सापेक्ष संयुक्त संभावना अनुपात परीक्षण तुलना में ग़लत खोज दर < 10% इंगित करता है । लाइन प्रत्येक जीन के लिए सेल समूहों में मतलब मूल्यों को जोड़ता है । यह आंकड़ा बोल्तों एट अल से संशोधित किया गया है । 20 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिनिधि मेजबान सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल FACS-क्रमबद्ध कोशिकाओं से रीसस समूल mesenteric लिम्फ नोड 10 दिनों के बाद SIVmac251 संक्रमण. () CD3 के Scatterplot प्रदर्शन, CD4, और ICOS में सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति संक्रमित (ग्रे), झूठ+जैसे/rev- (ब्राउन), और झूठ+जैसे/ प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रत्येक कोशिका (डॉट) के लिए साजिश रची है । ग़ैर बॉक्स भूखंडों interquartile रेंज (IQR) और माध्य (बॉक्स), बॉक्स (मूंछ) से १.५ x IQR के भीतर दूर अंक दर्शाती है, और संभावित outliers (कट अंक) । शीर्ष पर क्षैतिज पट्टियां महत्वपूर्ण अंतर दर्शाती है (p < 0.05, nonparametric Wilcoxon रैंक परीक्षण) । () Bivariate और हिस्टोग्राम (A) में दर्शाए गए कक्षों के लिए सरफ़ेस CD3 और CD4 प्रोटीन व्यंजक का प्रदर्शन. डॉट साजिश (बाएं) एक वृत्त का चक्र के भीतर प्रत्येक कोशिका जनसंख्या के प्रतिशत इंगित करता है । CD3 और CD4 हिस्टोग्राम (मध्य, सही) ढकोसलाके बीच सतह प्रोटीन downregulation का चित्रण+जैसे-// rev- कोशिकाओं को संक्रमित और झूठके सापेक्ष + जैसे कोशिकाओं/ () बारह प्रतिनिधि ताट/rev+ एकल कोशिकाओं से (A – B) CD3/CD4 (बाएं), CD69/CD38 (मध्य), और ICOS/एचएलए-डॉ (दाएं) की सतह अभिव्यक्ति के लिए तीन bivariate भूखंडों में दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : Trivariate एकल सेल वायरल जीन प्रदर्शित भूखंड (जैसे/rev), मेजबान जीन (CD3 या CD4), और मेजबान सतह प्रोटीन (CD3 या CD4) अभिव्यक्ति में SIV-संक्रमित स्मृति CD4+ टी कोशिकाओं mesenteric लिम्फ नोड से 10 दिन SIVmac251 संक्रमण के बाद । CD4 प्रोटीन अभिव्यक्ति (प्रतिदीप्ति) CD4 mRNA (qPCR), के खिलाफ साजिश रची है, जबकि प्रत्येक कोशिका द्वारा व्यक्त की मात्रा / In /rev+ कोशिकाओं (हरा), सतह CD4 और निरंतर CD4 और CD3 टेप, क्रमशः के साथ CD3 प्रोटीन अभिव्यक्ति की कमी हुई, संकेत मिलता है कि सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति बहाव संग्राहक है जीन अभिव्यक्ति की. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1: प्राइमरों और जांच SIV न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया । जब किसी प्राइमरी या जांच के लिए दो सीक्वेंस का संकेत दिया जाता है तो दोनों सीक्वेंस की equimolar मात्रा का इस्तेमाल किया जाता था । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

तालिका 2: एक ९६-जीन पैनल amplicons के quantitation के लिए इस्तेमाल किया पर निशान उपकरण। चार SIV परख नीली पृष्ठभूमि के साथ संकेत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

तालिका 3: प्रतिक्रिया मिश्रण रिवर्स प्रतिलेखन और पूर्व प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

तालिका 4: qPCR प्रतिक्रिया एक क्वांट स्टूडियो 6 साधन पर प्रदर्शन किया वास्तविक समय पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया मिश्रण । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 । जीन अभिव्यक्ति परख योग्यता के लिए निर्देश । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: JMP में नमूना मानचित्र टेम्पलेट. कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 3: JMP में जांच नक्शा टेंपलेट । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 4: JMP के लिए प्राइमर विश्लेषण स्क्रिप्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 5. JMP के लिए खण्डशः विश्लेषण स्क्रिप्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

प्रोटोकॉल यहां वर्णित है, tSCEPTREed, एकल-सेल सतह प्रोटीन quantitation द्वारा मात्रात्मक एकल सेल mRNA अभिव्यक्ति के साथ multiparameter प्रवाह cytometry द्वारा एकीकृत उच्च मल्टीप्लेक्स आरटी-qPCR । इन दोनों प्रौद्योगिकियों के संघ उच्च-प्रवाह स्वरूप में एकल कक्षों की संयुक्त transcriptional और प्रोटीन प्रोफ़ाइल की हाई-कंटेंट स्नैपशॉट्स को सक्षम करता है । हम heretofore मायावी vivo मेंSIV से संक्रमित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए विधि का उपयोग करें, और विभेदक व्यक्त की मेजबान जीन और प्रोटीन का वर्णन । प्रोटोकॉल की सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति से अलग ब्याज की किसी भी सेल जनसंख्या के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (ओं), mRNA, या एक संयोजन तत्संबंधी । वर्णित विधियां सटीक एकल-कक्ष सॉर्टिंग पर निर्भर करती है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध qPCR रिएजेंट और division रीयल-टाइम पीसीआर इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ युग्मित प्रवाह cytometry द्वारा डेटा रिकार्डिंग करती है । उत्पादन संवेदनशील, एकल सेल संयुक्त प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति डेटा का मात्रात्मक आकलन है ।

अन्य एकल कोशिकाओं में प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति को जोड़ने के दृष्टिकोण1,25,26,27वर्णित किया गया है । अनुक्रमित FACS RNAseq द्वारा पीछा छंटाई, टेम स्टेम कोशिकाओं के लक्षण वर्णन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू, एक विशेष रूप से आशाजनक दृष्टिकोण28का प्रतिनिधित्व करता है । हालांकि, जबकि RNAseq लक्षित जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण पर कई फायदे हैं, अर्थात् निष्पक्ष पूर्ण transcriptome विश्लेषण, यह एक उच्च एकाधिक तुलना सांख्यिकीय लागत के अधीन है और कम प्रति के ठहराव के लिए कम संवेदनशील हो सकता है टेप. इसके अलावा, यह वर्तमान में दुर्लभ संक्रमित कोशिकाओं की खोज में कोशिकाओं के हजारों पर RNAseq प्रदर्शन करने के लिए आर्थिक रूप से संभव नहीं है आवृत्तियों < 1% (जैसे, एचआईवी, SIV). अंय उभरते एकल सेल प्रौद्योगिकियों उद्देश्य एक एकल readout उत्पंन करने के लिए, अर्थात्, FACS या पीसीआर द्वारा, दोनों प्रोटीन और एक ही सेल में न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए । ये फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी और mRNA द्वारा oligonucleotide FACS विश्लेषण (mRNA-प्रवाह-मछली)14,15,29,30के बाद जांच द्वारा प्रोटीन का पता लगाने में शामिल हैं । वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन एंटीबॉडी-oligonucleotide conjugates के जोड़े द्वारा पता लगाया जा सकता है कि qPCR द्वारा रिवर्स लिखित mRNA31,३२,३३,३४ के साथ समानांतर में पता चला रहे हैं . ये "संकर" दृष्टिकोण tSCEPTRE के समान एकल-कक्ष रिज़ॉल्यूशन के साथ एक साथ न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन माप प्रदान करते हैं, लेकिन वे सीमित हैं जहां वे या तो मात्रात्मक नहीं हैं (mRNA-प्रवाह-मछली) या अनुकूलित एंटीबॉडी या mRNA की आवश्यकता हो सकती है जांच. हमारे tSCEPTRE दृष्टिकोण दोनों प्रोटीन और mRNA माप के लिए मात्रात्मक है और सभी एजेंट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, रोगज़नक़ के संभावित अपवाद के साथ विशेष परख ।

विशेष ध्यान प्रायोगिक नमूनों के विश्लेषण से पहले प्रोटोकॉल में कई कदमों के लिए लागू किया जाना चाहिए । पहले, उच्च पैरामीटर प्रवाह cytometry फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के एक पैनल के सावधान अनुकूलन के लिए संवेदनशील पता लगाने और३५संकल्प सुनिश्चित करने की आवश्यकता है । प्रत्येक एंटीबॉडी व्यक्तिगत रूप से titrated किया जाना चाहिए एकाग्रता है कि इष्टतम जुदाई और न्यूनतम पृष्ठभूमि धुंधला प्राप्त होता है की पहचान करने के लिए, धुंधला जब सभी एंटीबॉडी conjugates संयोजन में उपयोग किया जाता है के आकलन के बाद । दूसरा, उपयुक्त qPCR जीन अभिव्यक्ति परख के प्रायोगिक निर्धारण को मापने के लिए ब्याज की प्रत्येक जीन आवश्यक है. कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परख प्रत्येक जीन के लिए आम तौर पर उपलब्ध हैं, लेकिन हमारे अनुभव में, कई एकल सेल स्तर6पर मात्रात्मक नहीं कर रहे हैं । इस प्रकार, यह प्रश्नपत्र पतला आरएनए पर सभी प्रस्तावित परख मात्रात्मक जीन अभिव्यक्ति के लिए उपयोग करने से पहले योग्य महत्वपूर्ण है । इन रिएजेंटों का अनुकूलन समय लगता है, लेकिन एंटीबॉडी conjugates और जीन अभिव्यक्ति परख है कि ब्याज के सभी अणुओं के प्रति संवेदनशील का पता लगाने के लिए अनुमति देता है के विश्वसनीय पैनलों के मूल्य समय निवेश को सही ठहराते हैं । इसके अलावा, प्राथमिकता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जांच है कि अवधि एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शनों (प्रत्यय के साथ नामित "m1") के लिए mRNA के लिए विशिष्टता में सुधार, हालांकि वैकल्पिक जीनोमिक डीएनए का पता लगाने में सक्षम परख (प्रत्यय "एस 1" या "g1" से युक्त दिया जाना चाहिए ) जीन अभिव्यक्ति परिणाम प्रत्येक कोशिका में समकक्ष गुणसूत्र प्रतियां के कारण प्रभाव की संभावना नहीं माना जाता है । आर सी की शाही सेना के संरक्षण महत्वपूर्ण है और ठंडा नमूनों रखने के द्वारा हासिल की है, के रूप में प्रोटोकॉल भर में उल्लेख किया । इसी तरह, FACS छंटाई की अवधि और छंटाई और आरटी-preamp के बीच अंतराल के लिए एक ंयूनतम रखा जाना चाहिए । दोनों कमजोर पड़ने और एकल सेल छंटाई सीमित करने के लिए, सीडीएनए पहले अत्यधिक व्यक्त गृह व्यवस्था जीन की आरएनए वसूली का आकलन करने के लिए पारंपरिक qPCR द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । यदि स्वीकार्य अभिव्यक्ति की प्रतिकृति के बीच समान नहीं है कक्ष संख्या, या कमजोर पड़ने वाले सीमित करने के लिए रेखीय फ़िट की ढलान मांयता विफल रहता है, समस्या निवारण कक्ष सॉर्टिंग और बहाव प्रक्रियाओं पर किया जाना चाहिए ।

दृष्टिकोण की संभावित सीमाएं यहां वर्णित शामिल है (1) आरएनए के अलावा डीएनए का पता लगाने, विशेष रूप से mRNA ब्याह जंक्शनों के लिए विशेष परख नहीं, और (2) सतह प्रोटीन और जीन मापा की सीमित संख्या । हालांकि, डीएनए का पता लगाने के लिए काफी अंतर मेजबान जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए ऊपर कहा कारण के लिए योगदान की संभावना नहीं है । इसके अलावा, हम सीधे किस हद तक डीएनए दो दृष्टिकोण से इस प्रोटोकॉल में qPCR संकेत करने के लिए योगदान देता है: एक) रिवर्स transcriptase को छोड़कर, और ख) कोशिका lysis प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए परमाणु झिल्ली lysis बढ़ाने के । रिवर्स transcriptase के अभाव में, दोनों ब्याह और ब्याह वायरल जीन अभी भी पता चला रहे थे, लेकिन काफी कम आवृत्ति की तुलना में रिवर्स transcriptase की उपस्थिति में (~ 6 गुना और 2-गुना कटौती, क्रमशः)20। इसलिए, वायरल जीन अभिव्यक्ति परख सेल जुड़े वायरल डीएनए की उपस्थिति के कारण एक सेल में मौजूद वायरल आरएनए की राशि का अनुमान लगा सकते हैं । हम cytoplasmic RT उत्पादों को होस्ट सेल संक्रमण, दोनों ब्याह और ब्याह SIV/एचआईवी आरएनए आवक virions३६से उत्पंन होने के लिए जाना जाता के दौरान उत्पंन करने के लिए इस खोज विशेषता । इस प्रकार, यह उचित हो सकता है quantitate डीएनए को रिवर्स transcriptase कमी शर्तों को प्रयोगों के एक हिस्से को समर्पित कुछ अनुप्रयोगों के लिए टेंपलेट व्युत्पंन । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि SIV/एचआईवी आरएनए आने वाले वायरस से प्राप्त de नोवो संश्लेषित वायरल आरएनए से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है । दूसरा, हम आरटी-preamp प्रोटोकॉल में एक परमाणु lysis कदम शामिल है और एकीकृत SIV डीएनए में एक घातीय वृद्धि (Alu-बाएं) प्रतियां (बोल्तों एट अल कीचित्रा S3 ) मनाया 20. जीनोमिक डीएनए इसलिए न्यूक्लिक एसिड यहां इस्तेमाल सेल lysis विधि से निकाले टेंपलेट के लिए काफी योगदान की संभावना नहीं है । ध्यान दें की, एक परमाणु lysis कदम के अलावा भविष्य में एकल सेल SIV या अंय वायरस डीएनए की जांच की मांग-अव्यक्त रूप से संक्रमित कोशिकाओं सहित सकारात्मक कोशिकाओं, अध्ययन में उपयोगी हो सकता है ।

सतह प्रोटीन का विश्लेषण की संख्या प्रवाह cytometric कोशिका सॉर्टर की क्षमता द्वारा तय किया जाता है । वर्तमान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों 30 मापदंडों से अधिक नहीं है । भविष्य और अधिक उंनत प्रवाह cytometry रोजगार के अध्ययन और इस दृष्टिकोण की क्षमता की रूपरेखा प्रोटीन व्यापक होगा । टेप की संख्या भी ९६ से परे बढ़ाया जा सकता है, (उदाहरणके लिए, उच्च एकाग्रता के प्राइमरों), उपकरण और इंस्ट्रूमेंटेशन समर्थन प्रदान की है । अंततः, उभरते एकल सेल प्रौद्योगिकियों कि proteome के विश्लेषण का मिश्रण (मास स्पेक्ट्रोमेट्री), transcriptome (RNAseq), और जीनोम (DNAseq) डिस्कवरी अनुसंधान के लिए लक्षित दृष्टिकोण का स्थान होगा31,३७, ३८ , ३९. हालांकि, लक्षित qPCR संभावना इस तरह के "ओमिक्स" दृष्टिकोण मांयता के लिए एक मूल्यवान उपकरण रहेगा मात्रात्मक अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक स्वर्ण मानक के रूप में ।

tSCEPTRE द्वारा संयुक्त प्रोटीन और प्रतिलेखन विश्लेषण दुर्लभ या ऐसे रोगजनकों बंदरगाह उन के रूप में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए मुश्किल की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, oncogenes युक्त, या अंयथा एक ंयायपालिका phenotype प्रदर्शन । transcriptionally के लिए नए मार्कर सक्रिय SIV/एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं को इस तरह से पहचाना जा सकता है, साथ ही इन वायरल संक्रमण के रोगजनन में शामिल नए तंत्र की खोज । अव्यक्त रूप से संक्रमित कोशिकाओं की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल के आगे विकास की आवश्यकता होगी वायरल डीएनए का आकलन करने के लिए मेजबान जीनोम में एकीकृत । ध्यान दें की, एचआईवी/SIV संक्रमित कोशिकाओं की आवृत्ति क्रोनिक viremic या इलाज संक्रमण में काफी कम है, जो इन सेटिंग्स से व्युत्पंन संक्रमित कोशिकाओं का अध्ययन करने में एक व्यावहारिक चुनौती पेश करेंगे । हमारे दृष्टिकोण एक पहले असभ्य तंत्र का आकलन करने के लिए आधार देता है: कि एकल सेल स्तर पर पोस्ट-transcriptional विनियमन के, और मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के रूप में अच्छी तरह से अधिक सामांय सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए व्यापक प्रयोज्यता है ।

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Disclosures

यह काम एक सहकारी समझौते द्वारा समर्थित किया गया था (W81XWH-07-2-0067) हेनरी एम जैक्सन के बीच सैंय चिकित्सा की उंनति के लिए फाउंडेशन, Inc, और अमेरिका के रक्षा विभाग (DOD) । व्यक्त विचार लेखकों के हैं और अमेरिकी सेना या रक्षा विभाग के पदों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नहीं लगाया जाना चाहिए. पशु कल्याण अधिनियम के अनुपालन में एक AAALACi मान्यता प्राप्त सुविधा में एक अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल के तहत अनुसंधान आयोजित किया गया था और अन्य संघीय क़ानूनों और जानवरों को शामिल करने और प्रयोगों से संबंधित नियमों और सिद्धांतों का पालन करता है देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं, एनआरसी प्रकाशन, २०११ संस्करण के उपयोग के लिए गाइड में कहा गया है ।

Acknowledgments

लेखकों NIAID VRC प्रवाह Cytometry कोर और Cytometry उपकरणों और छँटाई उपकरणों के रखरखाव और संचालन के लिए MHRP प्रवाह FACS कोर सुविधाओं का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा; मारिया Montero, विशाखा शर्मा, विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Kaimei गीत; माइकल Piatak, जूनियर (मृतक) SIV qPCR परख डिजाइन के साथ सहायता के लिए; और ब्रेंडन कील और मैथ्यू Scarlotta SIV अलग दृश्यों के लिए । व्यक्त विचार लेखकों के हैं और अमेरिकी सेना या रक्षा विभाग के पदों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नहीं लगाया जाना चाहिए. पशु कल्याण अधिनियम के अनुपालन में एक AAALAC मान्यता प्राप्त सुविधा में एक अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल के तहत अनुसंधान आयोजित किया गया था और अन्य संघीय क़ानूनों और जानवरों को शामिल करने और प्रयोगों से संबंधित नियमों और सिद्धांतों का पालन करता है देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं, एनआरसी प्रकाशन, २०११ संस्करण के उपयोग के लिए गाइड में कहा गया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments

RNA extraction and PCR reagents and consumables

Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate

BioExpress/VWR

T-3060-1

Adhesive PCR Plate Seals

ThermoFisher

AB0558

Armadillo 384-well PCR Plate

ThermoFisher

AB2384

MicroAmp Optical Adhesive Film

Applied Biosystems/ThermoFisher

4311971

DEPC Water

Quality Biological

351-068-101

Glass Distilled Water

Teknova

W3345

Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit

Invitrogen/ThermoFisher

11732088

SUPERase-In Rnase Inhibitor

Invitrogen/ThermoFisher

AM2696

Platinum Taq

Invitrogen/ThermoFisher

10966034

dNTP Mix

Invitrogen/ThermoFisher

18427088

ROX Reference Dye (if separate from kit)

Invitrogen/ThermoFisher

12223012

DNA Suspension Buffer

Teknova

T0223

RNAqueous kit

Invitrogen/ThermoFisher

AM1931

TaqMan gene expression assays not listed in Table 2

CD6

Applied Biosystems/ThermoFisher

Hs00198752_m1

TLR3

Applied Biosystems/ThermoFisher

Hs1551078_m1

Biomark reagents

Control Line Fluid Kit

Fluidigm

89000021

TaqMan Universal PCR Mix

Applied Biosystems/ThermoFisher

4304437

Assay Loading Reagent

Fluidigm

85000736

Sample Loading Reagent

Fluidigm

85000735

Dynamic Array 96.96 (chip)

Fluidigm

BMK-M-96.96

FACS reagents

SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)

Spherotech Inc.

CMIgP-30-5H

CompBeads Anti-Mouse Ig,k

BD Biosciences

51-90-9001229

5 ml Polystyrene tube with strainer cap

FALCON

352235

Aqua Live/Dead stain

Invitrogen/ThermoFisher

L34976

dilute 1:800

Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2

BD Biosciences

563916

dilute 1:40

Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200

BD Biosciences

563914

dilute 1:20

Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8

BD Biosciences

564804

dilute 1:10

Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2

Biolegend

302948

dilute 1:20

Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2

BD Biosciences

564710

dilute 1:10

Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2

Biolegend

301842

dilute 1:83

Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8

Biolegend

302048

dilute 1:167

Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7

Biolegend

302340

dilute 1:37

Anti-CD38-R PE clone OKT10

NHP reagent recource

N/A

dilute 1:100

Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50

BD Biosciences

564364

dilute 1:10

Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6

BD Biosciences

561358

dilute 1:20

Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A

Biolegend

313528

dilute 1:80

Instruments

BioPrptect Containment Enclosure

Baker

BD FACS Aria

BD Biosciences

ProtoFlex Dual 96-well PCR system

Applied Biosystems/ThermoFisher

4484076

Quant Studio 6 qPCR instrument

Applied Biosystems/ThermoFisher

4485694

IFC controller HX

Fluidigm

IFC-HX

Biomark HD

Fluidigm

BMKHD-BMKHD

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References

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