Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Immunology and Infection

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Summary

La differenziazione degli adipociti bianchi e beige da progenitori vascolari del tessuto adiposo porta il potenziale di miglioramento metabolico nell'obesità. Descriviamo i protocolli per CD34 + CD31 + isolamento di cellule endoteliali da grasso umano e per una successiva in vitro espansione e differenziazione in adipociti bianchi e beige. Diverse applicazioni a valle sono discussi.

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Haynes, B. A., Huyck, R. W., James, A. J., Carter, M. E., Gaafar, O. U., Day, M., Pinto, A., Dobrian, A. D. Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (137), e57804, doi:10.3791/57804 (2018).

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Abstract

L'obesità è accompagnata da un vasto rimodellamento del tessuto adiposo soprattutto via l'ipertrofia degli adipociti. Estremi del adipocyte crescita determina una scarsa risposta all'insulina, ipossia locale e l'infiammazione. Stimolando la differenziazione degli adipociti bianchi funzionale da progenitori, ipertrofia radicale della popolazione degli adipociti può essere prevenuta e, di conseguenza, la salute metabolica del tessuto adiposo può essere migliorata con una riduzione di infiammazione. Inoltre, stimolando una differenziazione degli adipociti beige/marrone, il dispendio energetico totale del corpo può essere aumentato, con conseguente perdita di peso. Questo approccio potrebbe prevenire lo sviluppo di comorbilità dell'obesità come diabete di tipo 2 e malattie cardiovascolari.

Questo articolo descrive l'isolamento, espansione e la differenziazione degli adipociti bianchi e beige da un sottoinsieme delle cellule endoteliali di tessuto adiposo umano che co-esprimono i marcatori CD31 e CD34. Il metodo è relativamente economico e non è alta intensità di lavoro. Richiede l'accesso al tessuto adiposo umano e il deposito sottocutaneo è adatto per il prelievo. Per questo protocollo, campioni di tessuto adiposo fresco da oggetti morboso obesi [indice di massa corporea (BMI) > 35] vengono raccolti durante le procedure di chirurgia bariatrica. Utilizzando un immunoseparation sequenziale dalla frazione vascolare stromal, abbastanza cellule sono prodotte da un minimo di 2 – 3 g di grassi. Queste cellule possono essere espanse in coltura oltre 10 – 14 giorni, possono essere crioconservate e mantengono le proprietà adipogenico con passaggio fino a passaggio 5 – 6. Le cellule sono trattate per 14 giorni con un adipogenico cocktail utilizzando una combinazione di insulina umana e l'agonista PPARγ-rosiglitazone.

Questa metodologia può essere utilizzata per l'ottenimento della prova degli esperimenti di concetto sui meccanismi molecolari che guidano le risposte adipogenico in cellule endoteliali adipose, o per lo screening di nuovi farmaci che possono migliorare l'adipogenico risposta diretta sia verso il bianco o differenziazione del adipocyte beige/marrone. Utilizzando piccole biopsie sottocutanee, questa metodologia utilizzabile per identificare i soggetti non responsivi per studi clinici voluti a stimolare adipociti bianchi e beige/marrone per il trattamento dell'obesità e co-morbidità.

Introduction

Dati recenti indicano che sia nei topi e nell'uomo, un sottoinsieme delle cellule che risiedono nel sistema vascolare del tessuto adiposo può essere differenziato nei adipocytes bianco o beige/marrone1,2,3. Il fenotipo di tali cellule è un argomento di polemica, con prove a sostegno di cellule endoteliali, muscolo liscio/pericyte o uno spettro di fenotipi intermedi4,5,6,7. L'ambito di sviluppo di questa metodologia è stato testare il potenziale adipogenico di CD34 + CD31 + cellule endoteliali isolate da diversi depositi di grasso da esseri umani obesi. Altri studi in letteratura si stanno concentrando sull'adipogenico potenziale della frazione vascolare stromal totale o del adipocyte noti progenitori2,8,9. Poiché le tecnologie attualmente esistenti possono indirizzare specificamente le cellule endoteliali del tessuto adiposo per droga consegna10, comprendere le potenzialità di tali cellule per subire adipogenico induzione verso adipocytes bianco o beige è importante per futuro di terapie mirate.

Diversi gruppi hanno riferito la combinazione di marcatori CD31 e CD34 come surrogati per isolare le cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano11,12,13. In genere, l'isolamento viene eseguita utilizzando due punti sequenziali e una selezione positiva utilizzando biglie magnetiche. In questo rapporto, è stato utilizzato immunoseparation utilizzando CD34 + biglie magnetiche combinati con perline in plastica CD31. Abbiamo trovato questa tecnica superiore alla immunoseparation magnetica sequenziale per quanto riguarda la conservazione della morfologia endoteliale tipico acciottolato. Inoltre, siamo stati in grado di generare abbastanza cellule necessarie per l'induzione di espansione e adipogenico a partire da un minimo di 1 – 2 g di grassi. Una biopsia di piccolo campione di grasso sottocutaneo è sufficiente per produrre la quantità necessaria di cellule per applicazioni a valle. Questo aspetto è potenzialmente importante, soprattutto se questo metodo sarà utilizzato per lo screening per una reattività ad induzione adipogenico nei soggetti umani.

A differenza di altri sistemi segnalati nella letteratura, questo metodo utilizza solo due ingredienti per l'induzione di adipogenico del CD34 + CD31 + cellule: un agonista PPARγ — rosiglitazone — e l'insulina umana. D'importanza, la quantità di insulina usata cade all'interno della gamma normale/alto di fare circolare l'insulina in esseri umani14. Il grado di reattività all'insulina del cellule in vitro, misurata dalla fosforilazione di Akt, non correla con la loro capacità di rispondere all'induzione cocktail. È interessante notare che, utilizzando questa condizioni di cocktail e sperimentale di induzione, un mix di bianche e beige/marrone cellule sono stati ottenuti come determinato dalle dimensioni e numeri di goccioline del lipido intracellulare e l'espressione di marcatori molecolari. Questo protocollo di induzione semplice e conveniente con la valutazione quantitativa del fenotipo delle cellule del radar-risponditore (bianco vs beige) permette uno screening degli agenti che potenzialmente possono alterare l'equilibrio del beige differenziato : bianco adipocytes.

Questo metodo fornisce anche un approccio traslazionale per comprendere i meccanismi di fondo del adipogenesis di progenitori endoteliali vascolari nel tessuto adiposo umano. Utilizzando questa tecnica di isolamento/differenziazione specifica, gli investigatori possono interrogare varie vie responsabili adipogenesis in un sottoinsieme delle cellule endoteliali vascolari da vari depositi di grasso in esseri umani magri ed obesi.

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Protocol

Comitato di Consiglio di revisione istituzionale presso la Eastern Virginia Medical School ha approvato la ricerca e la raccolta di campioni di tessuto adiposo umano utilizzato nello studio. Consenso informato scritto è stato raccolto dai pazienti.

1. preparazione del buffer, i Media e gli strumenti

  1. Preparare una soluzione di Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 mM di cloruro di sodio, 5 mM di cloruro di potassio, solfato di magnesio di 1 mM, 0.4 mM potassio fosfato bibasico, 5,5 millimetri di glucosio, adenosina di 1 mM, 0,01% antibiotico/antimicotico mix (50 µ g/mL di penicillina, 50 µ g/mL di streptomicina, 30 µ g/mL di gentamicina, 15 ng/mL di amfotericina) e 10 mM HEPES (pH = 7.4). Questa soluzione viene preparata fresco ogni volta per la raccolta di tessuto e la digestione.
  2. Preparare una soluzione di collagenasi fresche: 1 mg/mL di collagenasi, tipo 1, in KRBSS; fare 3 mL/g di grasso. Pre-riscaldare la soluzione della collagenosi a 37 ° C in un bagno di acqua prima della digestione del tessuto.
  3. Preparare un Buffer di isolamento delle cellule CD34: 2% siero bovino fetale (FBS) e 1 mM EDTA in soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS).
  4. Preparare il supporto di Adipogenesis: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina, 1.25 µ l/mL di insulina umana (5 µ g/mL o 144 mU/mL) e 0,36 µ l/mL di 2,8 mM rosiglitazone (1 µM).
  5. Preparare una soluzione stock di olio rosso O (ORO) 0,3% (peso/volume) da sciogliere 0,3 g di ORO in 100 mL di isopropanolo.

2. adiposo frazione vascolare Stromal isolamento

Nota: Lo studio ha incluso un gruppo trasversale dei diabetici obesi tipo 2 (T2D) e oggetti non-diabetico, età compresa tra 18-65 anni, sottoposti a chirurgia bariatrica presso il Sentara metabolica e il centro di chirurgia di perdita di peso (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Criteri di esclusione comprendevano una malattia autoimmune, tra cui il diabete mellito di tipo 1, condizioni che richiedono la terapia immunosopressiva cronica, farmaci anti-infiammatori, thiazolinendiones, l'uso attivo del tabacco, infezioni croniche o acute o una storia di malignità trattati negli ultimi 12 mesi. T2D è stata definita come un glucosio plasmatico a digiuno di 126 mg/dL o maggiore, una glicemia di 200 mg/dL o maggiore dopo una tolleranza al glucosio di 2 h di prova o l'uso dei farmaci antidiabetici.

  1. Raccogliere umano omentale (OM) e sottocutanea (SC) del tessuto adiposo (AT) da soggetti umani sottoposti a chirurgia bariatrica.
  2. Tenere l'OM e SC AT separate fiale contenente soluzione salina tamponata di Hank con 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina a temperatura ambiente subito dopo l'estrazione del tessuto.
  3. Pulire accuratamente e rimuovere sezioni di tessuto fibrotici e cauterizzati utilizzando pinzette e forbici monitorate di etanolo 70% quando il campione arriva al laboratorio dopo l'estrazione del tessuto.
  4. Pesare il tessuto adiposo e aliquote di it in 5 g (o meno) per la digestione della collagenosi di partizione.
  5. Tritare finemente 5 g di AT in 5 mL di soluzione in un flaconcino di scintillazione a temperatura ambiente, collagenosi utilizzando due paia di forbici.
  6. Aggiungere un ulteriore 10 mL di soluzione della collagenosi al tessuto macinato per 15 mL totale.
  7. Digerire i campioni per 1h a 37 ° C, in un bagnomaria con agitazione continua.
  8. Tagliare la punta fuori una siringa da 20 mL per rendere una punta smussata.
  9. Ritagliare un quadrato di 9 x 9 cm da una maglia di 250 µm e spingerlo a metà in una provetta conica 50 mL utilizzando la siringa di estremità smussata.
  10. Versare i campioni nella siringa da 20 mL estremità smussata e filtro attraverso la rete di nylon 250 µm nella provetta conica 50 mL per separare adipociti e cellule vascolari stromale dal tessuto non digerito.
    Nota: Non utilizzare più di 5g di AT per provetta conica da 50 mL, come la mesh verrà intasarsi a causa di materiale non digerito fibrotico in eccesso.
  11. Lavare il flaconcino di scintillazione con 10 mL di KRBBS e versarlo attraverso il filtro per raccogliere le cellule residue.
  12. Incubare i campioni filtrati per 5 min a temperatura ambiente.
    Nota: Questo passaggio è importante per consentire gli adipociti a galleggiare nella parte superiore del tubo e alcune delle cellule vascolari stromal di depositarsi sul fondo del tubo.
  13. Utilizzare una siringa da 20 mL e un 20 x 6 nell'ago di pipettaggio per rimuovere lo strato stromal frazione vascolare e trasferirlo in una provetta conica da mL 50 pulito.
  14. Aggiungere 10 mL di KRBBS e consentire ai campioni di sedersi sulla panchina per 5 minuti, a temperatura ambiente.
  15. Ripetere i passaggi da 2.12 – 2,14 due volte.
    Nota: Questa procedura garantisce che non esiste nessuna contaminazione delle cellule vascolari stromal con gli adipociti galleggiante.
  16. Mantenere le frazioni vascolare stromale da entrambi i depositi sul ghiaccio per un'ulteriore elaborazione, come descritto nella procedura seguente.
    Nota: Non lasciare le cellule sul ghiaccio per più di 1 h, come questo può avere un impatto sull'attuabilità delle cellule. Gli adipociti possono essere flash-congelati in azoto liquido per la conservazione a lungo termine o utilizzate freschi per gli esperimenti.

3. isolamento di cellule endoteliali del tessuto adiposo

  1. Girare le frazioni vascolare stromale (SVF) a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
  2. Rimuovere i campioni dalla centrifuga e versare con cautela il sovranatante; tenere il pellet contenente le celle di SVF.
  3. Delicatamente e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS.
    Nota: Se più di 5 g di un deposito di AT è stato elaborato in aliquote multiple (Vedi punto 2.4), riunire il pellet cellulare.
  4. Girare i campioni a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
  5. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di PBS contare le celle.
    Nota: Qui, un contatore di cellule automatica è stato usato per il conteggio delle cellule. La vitalità cellulare è stata ottenuta mescolando 12 µ l di sospensione cellulare con 12 µ l di una soluzione di acridina arancio/propidio ioduro (AO/PI) (Vedi Tabella materiali). Il numero medio di cellule per grammo di AT per ogni deposito è: (a) OM Depot: 1.69 x 105 ± 4,51 x 104; (b) SC Depot: 1,24 x 105 ± 6,45 x 104. L'attuabilità delle cellule da entrambi i depositi era > 90%.
  6. Pellet i campioni a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
    Nota: Un protocollo di selezione immunomagnetica CD34 (Vedi Tabella materiali) è stato adattato per la procedura 3,7 – 3,15.
  7. Risospendere il pellet in 100 µ l di tampone di isolamento di CD34.
    Nota: La conta totale delle cellule richiede i seguenti volumi di risospensione: (a) < 2 x 107 cellule: risospendere il pellet in 100 µ l; (b) 2 x 108– 5 x 108 celle: risospendere il pellet in 1 mL. Nei passaggi 3.9 – 3,16, i volumi dei reagenti utilizzati sono stati ridimensionati per < 2 x 107 cellule.
  8. Aggiungere 10 µ l di CD34 cocktail e incubare il campione per 15 minuti, a temperatura ambiente.
  9. Aggiungere 5 µ l di biglie magnetiche e incubare il campione per 10 min, a temperatura ambiente.
  10. Aggiungere 2,5 mL di tampone di CD34 isolamento per ogni campione e inserire i campioni nel magnete, per 5 minuti, a temperatura ambiente.
  11. Invertire il magnete per 5 s per versare il tampone di isolamento.
  12. Rimuovere i campioni dal magnete e ripetere i passaggi 4 x 3.10 e 3.11.
  13. Rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere 2 mL di buffer di isolamento di CD34.
  14. Agglomerare le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
  15. Risospendere il pellet di cellule in 1 mL di buffer di isolamento CD34 e contare le celle.
    Nota: Qui, il numero medio di cellule per grammo di AT è: (a) OM Depot: 4,75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC Depot: 1,06 x 104 ± 9,53 x 103. Un protocollo di plastica immunobead CD31 è stato adattato per la procedura 3.16 – 3,34 (Vedi Tabella materiali).
  16. A pellet di cellule a 500 x g per 5 min e risospendere il pellet in 250 µ l di tampone B e 250 µ l di tampone di lavaggio.
  17. Risospendere accuratamente le perline CD31 nel Vortex il tubo.
  18. Aggiungere 20 µ l di CD31 perline.
    Nota: A causa della totale delle cellule conta > 1 x 106, il volume è stato ridimensionato secondo ingresso del produttore.
  19. Incubare il campione con dondolo per 30 min a temperatura ambiente.
  20. Collegare una gabbietta in una provetta conica sterile 50 mL.
    Nota: L'apertura più grande del filtro deve essere sulla parte superiore.
  21. Prima la separazione delle cellule, aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio per equilibrare il colino. Applicare la miscela generata sotto passo 3.16 al filtro.
  22. Lavare il filtro con 5 mL di tampone di lavaggio in un movimento circolare per un volume totale di 20 mL. Collegare il connettore a una provetta conica sterile 50ml e chiudere luer-lock.
  23. Collegare la gabbietta al connettore. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio lungo la parete del filtro. Aggiungere 1 mL di tampone attivato D lungo la parete del filtro. Agitare delicatamente il campione e incubare per 10 minuti, a temperatura ambiente.
  24. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio. Separare le cellule dalle perle pipettando su e giù per 10 volte.
    Nota: Evitare di generare bolle d'aria.
  25. Aprire luer-lock e permettono alle cellule indipendente di fluire la provetta conica da 50 mL. Lavare il filtro 10 x con 1 mL di tampone di lavaggio ogni volta.
  26. Eliminare il connettore e il colino e centrifugare i campioni a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di completa EGM-2 Media per la cultura.
    Nota: Il numero medio di cellule per grammo di AT a questo punto è: (a) OM Depot: 5.92 x 103 ± 4,27 x 103; (b) SC Depot: 4,12 x 103 ± 2.1 x 103. La vitalità delle cellule da entrambi i depositi era oltre il 90%.

4. induzione di Adipogenesis in cellule endoteliali isolate

  1. Crescere le cellule in piastre di coltura del tessuto-trattati 6-pozzetti con completa EGM-2 media in un 37 ° C, 5% CO2 incubator. Sostituire i media ogni 3 – 4 giorni fino a quando le cellule raggiungono la confluenza di 80 – 90%.
    Nota: Il raddoppio della popolazione è tra 2 – 3 giorni.
  2. Espandere le cellule da loro placcatura su piastre Petri da 100 mm e dividere le celle 1:3 una volta. In questa fase, le cellule sono il passaggio 2.
  3. Conta le celle utilizzando una cella automatica del contatore (Vedi Tabella materiali).
  4. Celle di seme circa 100 – 200.000 in piastre da 6 pozzetti garantendo pozzetti duplicati per ogni deposito e cultura li in completo EGM-2 supporti per 2 giorni.
  5. Aspirate fuori qualsiasi media di crescita e sostituirlo con 2 mL di DMEM/F12 con 5% FBS e cellule di 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina per il controllo e sostituirlo con 2 mL di Adipogenesis media (Vedi punto 1.4) per le cellule di trattamento.
  6. Incubare le cellule a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 incubatore per 13 giorni, sostituendo i rispettivi media ogni 3-4 giorni.
    Nota: Cellule iniziano ad accumulare lipidi dopo 4 giorni di trattamento.
  7. Condotta di ORO e Nilo rosso colorazione secondo metodi pubblicati1517.
  8. Per isolare le cellule per un'estrazione di RNA, rimuovere il supporto dalle piastre induzione 6 pozzetti e lavare con 1 mL di PBS sterile.
  9. Aggiungere 350 µ l di una soluzione di tiocianato-fenolo-cloroformio guanidium (Vedi Tabella materiali) di ogni bene e incubare a temperatura ambiente per 5 – 10 min.
  10. Raschiare le cellule fuori la piastra con un raschietto in cella e trasferire le cellule in una microcentrifuga da 1,5 mL.
    Nota: I campioni possono essere conservati nel congelatore-80 ° C per l'estrazione di RNA e ulteriore elaborazione in una data successiva.
  11. Estrarre il mRNA dai campioni utilizzando un'estrazione di RNA adattata protocollo (Vedi Tabella materiali).
  12. Eseguire una reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) per valutare l'espressione genica utilizzando le seguenti sonde: adiponectina, UCP-1 e CIDEA (Vedi Tabella materiali).
    Nota: Qui, RT-PCR procedure sono state effettuate utilizzando il protocollo standard seguente: denaturazione (95 ° C; 15 s), ricottura ed estensione (60 ° C; 1 min) per 40 cicli. Gli esempi di geni con CT valori espressi > 35 sono stati considerati non rilevabile.

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Representative Results

Il nostro protocollo mira a fornire un approccio in vitro per determinare il potenziale adipogenico di CD34 + CD31 + cellule vascolari da diversi depositi del tessuto adiposo umano. Un diagramma semplificato è mostrato in Figura 1A. Il primo passaggio utilizzando una selezione positiva di CD34 in cellule che esprimono risultati in > 95% cellule CD34 + nella popolazione delle cellule appena isolate (Figura 1A). D'importanza, questo indicatore viene perso dopo le cellule sono coltivate per un paio di passaggi. Essendo un marcatore comune per diversi progenitori ematopoietici e non-emopoietici CD34, il seguente passaggio necessario per la separazione dei progenitori endoteliali è la selezione positiva di cellule CD31 + fuori la popolazione delle cellule CD34 + (Figura 1A). Anche se CD31 è un indicatore per le cellule endoteliali, può anche essere trovato su sottoinsiemi di cellule ematopoietiche. Abbiamo analizzato diversi preparati da entrambi il grasso omentale e sottocutaneo tramite flusso cytometry e trovato coerente che CD34 + CD31 + cellule non esprimono il marcatore CD45 (Figura 1B, pannelli superiori). In genere, < 1% delle cellule ha mostrato la positività CD45, fuori la popolazione totale delle cellule. Questo risultato ci ha portato a concludere che probabilmente abbiamo ottenuto una preparazione praticamente priva di progenitori ematopoietici. Per determinare se le cellule esprimono il marcatore di cellule staminali del adipocyte CD24, abbiamo analizzato le cellule dai depositi sia omentale e sottocutanei e trovato che praticamente nessun cellule hanno espresso il marcatore CD24 nel depot omentale (Figura 1B, pannelli di fondo) e meno del 5% del le cellule hanno espresso il marcatore nel deposito sottocutaneo (non mostrato). Per concludere, utilizzando questa metodologia di separazione, abbiamo ottenuto CD34 + CD31 + CD45-CD24-cellule da depositi sia omentali e sottocutanei di soggetti obesi.

Utilizzando le perle di plastica coniugate con un anticorpo di CD31, ottenemmo celle visualizzate la morfologia endoteliale del cobblestone durante i primi passaggi, al contrario di cellule separate utilizzando le biglie magnetiche coniugate con un anticorpo di CD31 che visualizzato un fusiformi fenotipo mesenchimale immediatamente dopo la separazione (Figura 2A). Ad per avvalorare ulteriormente l'identità endoteliale delle cellule di CD34 + CD31 +, abbiamo effettuato due saggi funzionali: un assorbimento di DiI-Ac-LDL e una matrice della membrana basale (denominato matrice hereon) tube formazione in vitro. CD34 + CD31 + le cellule sono state incubate con DiI-Ac-LDL e la grande maggioranza delle cellule era positiva per l'assorbimento (Figura 1). Come controllo positivo, abbiamo utilizzato una linea di cellule endoteliali microvascolari del primario di tessuto adiposo umano (HAMVEC) che è disponibile in commercio (vedere Tabella materiali e Figura 1). Abbiamo provato anche se le cellule di CD34 + CD31 + mantengono la loro funzione endoteliale dopo la coltura di determinare la capacità di tali cellule per formare spontanea la nave-come le strutture in vitro, in una matrice 3D. Dopo 3 passaggi, CD31 + CD34 + strutture tubolari di vaso-come forme in una matrice paragonabile ad una linea di primario delle cellule endoteliali umane HAMVEC (Figura 1).

Dopo l'espansione delle cellule per 2 – 3 passaggi, ci siamo scambiati le cellule da EGM-2 supporti completi contenenti fattori di crescita pro-angiogenici in DMEM/F12 media completati con 5% di FBS, rosiglitazone (1 µm) e insulina (144 mU/mL). Mantenere che le cellule in EGM-2 completano media drasticamente ridotto loro differenziazione adipogenico. Inoltre, un'aggiunta di desametasone e 3-isobuthyl-1-methylxanthine ai media non ha cambiato il tasso e l'entità di accumulazione del lipido e un'aggiunta di indometacina ha ridotto significativamente l'accumulazione del lipido (dati non mostrati). Basato su questi esperimenti preliminari, abbiamo deciso di utilizzare solo rosiglitazone e insulina per l'induzione di adipogenic. Dopo 14 giorni di cultura media adipogenico, le cellule erano fissi e macchiate con Oil Red O o Nilo rosso e i nuclei erano controcolorati con DAPI (Figura 2B). Nelle figure, immagini rappresentative sono mostrati delle cellule isolate da accoppiati sottocutanea (SC) (Figura 2B, pannello superiore) e omentale (OM) (Figura 2B, pannello inferiore) nel tessuto adiposo dei tre soggetti umani con un BMI fra 37 – 45 kg/m2. Siete pregati di notare che la risposta all'induzione varia ampiamente tra i soggetti e tra depositi del soggetto stesso. Come si vede nell'immagine fluorescente in Figura 2B, una popolazione mista di uniloculare (frecce rosse) e multilocular (frecce bianche) sono in genere presenti lipidi contenenti cellule così come le cellule che non si accumulano i lipidi (frecce gialle). La proporzione tra i numeri di queste cellule è inoltre altamente variabile con sia il soggetto e il deposito di origine. Una quantificazione della percentuale di lipidi contenenti cellule (basate sulla positività di Oil Red O) fuori dalle celle totale (basate su DAPI-ha macchiato i nuclei) hanno mostrato una differenza significativa tra i depositi di SC e OM dello stesso individuo, con le cellule dal deposito SC essere più reattivo all'induzione adipogenico (Figura 2). La spiegazione per l'eterogeneità nella risposta tra i soggetti e i depositi del soggetto stesso non è chiara. Tuttavia, speculiamo che è probabilmente correlata alla natura intrinseca della popolazione cellulare che porta l'impronta di in vivo fenotipo/ambiente e non a causa della variabilità del protocollo di isolamento.

Per confermare che le cellule hanno subito la differenziazione maturare adipociti, abbiamo misurato l'espressione genica di adiponectina marcatore pan-adipocita e i marcatori di marrone/beige UCP-1 e CIDEA nelle cellule dopo 13 giorni di induzione adipogenico rispetto al cellule di controllo delle Nazioni Unite-indotta. L'espressione di adiponectin è stato aumentato fino a 10,000-fold le cellule differenziate rispetto ai controlli (Figura 2D). L'espressione genica di CIDEA e UCP1 era rilevabile solo nelle cellule dopo la stimolazione adipogenico (Figura 2D). In particolare, l'espressione di UCP-1 era estremamente variabile, riflettendo le proporzioni differenti di bianco: marrone / beige celle all'interno della popolazione cellulare. L'espressione del gene delle pulizie RPL27 era notevolmente costante tra i campioni con valori di CT compresi tra i 18 – 20 cicli e nessuna differenza significativa è stata trovata fra le cellule che hanno subito la differenziazione adipogenico e il comandi non trattati. Inoltre abbiamo rilevato un'espressione di proteina UCP-1 nelle cellule che ha visualizzato il fenotipo multi-cinesiterapia, in un modello punteggiato che suggerisce una localizzazione mitocondriale (Figura 2E). La proteina UCP-1 non era rilevabile in cellule che ha fatto non si accumulano i lipidi o cellule con multiplo, molto piccole goccioline che probabilmente non sono completamente differenziano adipocytes (Figura 2E).

La nostra osservazione che il potenziale adipogenico del CD34 + CD31 + cellule è depot-specifiche e altamente variabile tra diversi soggetti li ha spinti a cercare potenziali correlazioni con BMI, età e HbA1c. Tra le 28 campioni testati, non abbiamo trovato alcun correlazioni significative tra potenziale adipogenico ed età o BMI; Tuttavia, abbiamo trovato una correlazione negativa significativa tra HbA1c e l'accumulo dei lipidi nelle cellule dalla stazione OM (Figura 3A). Ciò che trova indica un potenziale legame con l'ambiente iperglicemico cronica e merita la ricerca futura. Ciò suggerisce anche che il CD34 + CD31 + cellule probabilmente portano la firma di in vivo della loro capacità di rispondere ad un'induzione adipogenico. Mostriamo anche che queste cellule visualizzare variabili livelli di fosforilazione di Akt seguendo una stimolazione di insulina in vitro (Figura 3B, parte superiore). Tuttavia, questa variabilità nella risposta non correla bene con la loro capacità di subire una differenziazione adipogenico, come dimostra la macchiatura Oil Red O nelle immagini dei campioni corrispondenti (Figura 3B, in basso).

Figure 1
Figura 1: separazione e caratterizzazione di cellule dal tessuto adiposo umano di CD34 + CD31 +. (A) questo diagramma mostra i passaggi principali di isolamento e la differenziazione. Dopo la selezione positiva usando i branelli magnetici CD34, > 95% delle cellule di recente isolate, prima della seconda fase di selezione, sono CD34 +. (B) Questo citometria rappresentativa Mostra un forward sparsa trama gated per la popolazione di cellule vive; un campione senza macchia sul canale FITC (BluFl2); e CD45 colorazione di un campione rappresentativo omentale sulla parte superiore. La parte inferiore mostra la stessa sequenza, come illustrato sopra, ma per le cellule CD24 (Alexafluor 647-etichettato) dal campione omentale. (C) questi rappresentante micrografie mostrano un assorbimento di DiI-Ac-LDL (rosso) di CD34 + CD31 + cellule dopo 4 h di incubazione in vitro (pannello superiore). Un assorbimento simile è stato trovato in una linea di cellule primarie di cellule endoteliali microvascolari di tessuto adiposo umano (HAMVEC) (pannello inferiore). I nuclei sono mostrati in blu di DAPI. (D) questi rappresentante micrografie mostrano una formazione in vitro del tubo di CD34 + CD31 + cellule seminate in una matrice 3D. CD34 + CD31 + cellule (passaggio 3) sono state seminate in piastre da 24 pozzetti seguendo una colorazione con FITC-calceina e incubate per 4 h in media completa delle cellule endoteliali. Le cellule erano imaged utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza. HAMVEC, seminate ad la stessa densità, è stato utilizzato per il confronto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: adipogenico induzione e marcatori di cellule CD34 + CD31 +. (A) questi rappresentante Visualizza micrografie le differenze morfologiche tra cellule di CD34 + CD31 + isolati utilizzando una selezione positiva con CD31 + biglie magnetiche vs CD31 + perline in plastica. Le cellule erano imaged al passaggio 1 dopo l'isolamento. L'ingrandimento utilizzato è 100 X. (B) questi pannelli sono rappresentante micrografie di Oil Red O macchiato CD34 + CD31 + cellule da accoppiati sottocutanea (SC) e omentale viscerale (OM) campioni di 3 soggetti diversi. Le cellule sono state coltivate per 2 – 3 passaggi in EGM-2 completa per i media, quindi acceso DMEM/F12 media con 5% FBS e trattati con insulina (144 mU/mL) e rosiglitazone (1 µM) per 14 giorni, con mezzi cambiati ogni 3 giorni. L'ingrandimento utilizzato è 100 X. L'immagine rappresentativa fluorescente Mostra adipo goccioline di lipidi rosso (verde) e DAPI nucleare colorazione (blu). Si prega di notare un mix di cellule contenenti lipidi uniloculari (freccia rossa), gocce lipidiche multilocular (freccia bianca) o cellule che non mostrano nessun accumulo di lipidi (freccia gialla). L'ingrandimento utilizzato è 200 X, barra della scala = 50 µm. (C) questo pannello mostra una quantificazione di adipogenico potenziale espresso come olio rosso O (ORO) cellule positive normalizzate in totali DAPI-ha macchiato i nuclei. CD34 + CD31 + cellule da OM e SC i depositi dello stesso argomento mostrano una differenza significativa in adipogenico potenziali di test t di Student a un accoppiati (n = 7). Marcatori (D) l'espressione genica di adipocita maturo (adiponectina, UCP-1 e CIDEA) è stata misurata mediante RT-PCR nelle cellule dopo 14 giorni di induzione adipogenico e nelle cellule di controllo. I dati sono espressi come un cambiamento di piega per l'espressione del gene di adiponectin. L'espressione di CIDEA e UCP-1 non era rilevabile in campioni di controllo. I valori rappresentano ΔCt normalizzati a RPL27 come un gene housekeeping. I valori di CT per RLP27 erano tra i cicli di 18 – 20 per tutti i campioni inclusi nell'analisi (n = 3 – 5 soggetti). I dati sono espressi come media ± SD T-test di uno studente accoppiati è stato utilizzato per un'analisi statistica dei dati. p < 0,05 respinge l'ipotesi di null. (E) questo pannello mostra l'espressione della proteina UCP-1 in CD34 + CD31 + cellule dopo 13 giorni di induzione con insulina e il rosiglitazone. Immunocitochimica utilizzando un anticorpo policlonale di UCP-1 ha mostrato un'espressione selettiva di UCP-1 nei adipocytes multi-cinesiterapia. La rilevazione è stata ottenuta utilizzando un anticorpo secondario coniugato rodamina (rosso) e colorazione DAPI per nuclei (blu). Il grande ingrandimento nel riquadro Mostra il segnale rosso punteggiato corrispondente al UCP-1 (freccia rossa) così come le goccioline di lipidi più (LD) di diverse dimensioni che circonda il nucleo delle cellule (N). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Correlazione tra differenziazione adipogenico, HbA1c e in vitro segnalazione dell'insulina. (A) Spearman (non parametrica) e i coefficienti di correlazione Pearson (parametrici) per le cellule OM e SC, rispettivamente, sono stati utilizzati per determinare la correlazione tra HbA1c e l'accumulo di lipidi (n = 20). L'ipotesi è stata rifiutata per p < 0.05. (B) nella parte superiore, western blotting Mostra l'Akt fosforilato (verde) e l'espressione di Akt (rosso) totale in CD34 + CD31 + cellule stimolate in vitro con l'insulina per 30 minuti prima dell'induzione adipogenico 5-nM (n = 8). Nella parte inferiore, è mostrata un Oil Red O macchiatura delle stesse cellule dopo l'induzione di adipogenico per 14 giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il focus di questo lavoro è quello di fornire una metodologia per l'isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali da depositi di viscerale e sottocutanei del tessuto adiposo umano.

Metodologie sono state segnalate per l'isolamento di cellule endoteliali da vari posti letto vascolare di roditori o di esseri umani che coinvolgono principalmente le tecniche utilizzando anticorpi CD31 fluorescente etichettati o accoppiato a biglie magnetiche18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23. una sfida importante per l'uso universale di queste tecniche di isolamento è l'eterogeneità della popolazione delle cellule endoteliali in diversi distretti vascolari e l'elevato rischio di contaminazione con i fibroblasti e cellule vascolari murale. Tuttavia, i perfezionamenti delle tecniche di isolamento per evitare tali contaminazioni sono stati segnalati24. Usando queste tecniche, per lo più cellule endoteliali mature sono isolate dai tessuti. Il tessuto adiposo è un grande serbatoio di cellule staminali/progenitrici, tra cui progenitori endoteliali25,26. Alcuni documenti segnalati la purificazione delle cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano utilizzando una combinazione di cellule CD34 + e CD31 + anticorpi11,27. Le cellule che esprimono i due marcatori sono una popolazione mista di cellule endoteliali mature e progenitori endoteliali11,28,29. Diverse carte seminali recenti segnalano che un piccolo sottoinsieme di endoteliale (CD31 +) o murale (PDGFRβ +) cellule nel vasculature adiposa è una ricca fonte di adipocyte progenitori5,30. Queste cellule vascolari con potenziale adipogenico possono produrre adipociti sia bianchi o marrone/beige e sono associate con l'angiogenesi attiva nel sistema vascolare adiposa5. Questi risultati possono fornire nuove possibilità terapeutiche per migliorare la prestazione metabolica nell'obesità e/o per indurre la perdita di peso generando adipociti bianchi e/o termogenici dai progenitori vascolari. È, pertanto, di interesse per individuare una metodologia per l'isolamento di facile ed economica, l'espansione e valutazione del potenziale adipogenico delle cellule endoteliali vascolari da tessuto adiposo umano.

Il CD34 + CD31 + cellule da depositi umano omentale e sottocutaneo del tessuto adiposo viscerale erano precedentemente caratterizzate ha basato sulla loro potenziale angiogenico, la produzione dei mediatori infiammatori, i marcatori di senescenza e altre funzioni11 , 31. Tuttavia, non esiste nessuna prova pubblicata per il potenziale adipogenico di tali cellule. Precedenti pubblicazioni che separava CD34 + CD31 + cellule utilizzando biglie magnetiche report su dati dalle celle riuniti da un gran numero di soggetti (10 o più)11. Questa carta segnala per la prima volta un protocollo per l'isolamento di successo e l'espansione del CD34 + CD31 + cellule da donatori umani singoli da entrambi i depositi sottocutanei e omentali. Abbiamo isolato e ampliato le cellule da un minimo di 2 – 3 g di tessuto adiposo. Le cellule di CD34 + CD31 + rappresentata 3 – 5% delle cellule totali SVF e visualizzati > 90% redditività dopo l'isolamento. Queste cellule erano altamente proliferative e ha mostrato una vasta gamma di risposte verso la differenziazione adipogenico seguendo una stimolazione in vitro con rosiglitazone e insulina. Gli studi precedenti usato solo cellule staminali adipose o totale frazione vascolare stromale da tessuto adiposo umano per testare adipogenico risposte4,32,33,34. Uno studio recente ha usato sospensioni singola cella dal microcircolo del tessuto adiposo umano, ma non è chiaro se gli adipociti differenziati erano murale o endoteliale in natura3.

Ulteriori immunophenotyping del CD34 + CD31 + cellule mediante citometria a flusso ha mostrato la loro mancanza di marcatori CD45 e CD24 indipendentemente dal loro deposito di origine. D'importanza, abbiamo indicato che dopo 3 passaggi in coltura, il CD31 + CD34 + cellule conservano la propria funzionalità endoteliale dimostrato dall'accumulo di LDL acetilata e una formazione in vitro del tubo in una matrice 3D. Inoltre, gli adipociti differenziati rappresentato una popolazione mista di cellule bianche e beige/marrone, basato sulla loro morfologia e marcatori molecolari, compreso un espressione di proteina UCP-1. Gli studi precedenti in topi ha mostrato che il sistema vascolare del tessuto adiposo può essere una fonte di entrambi bianco e adipociti bruni5,30 e i dati più recenti hanno mostrato un risultato simile per quanto riguarda la differenziazione del bianco e funzionalmente termogeniche cellule beige dal sistema vascolare adiposo umano3.

A differenza della maggior parte delle pubblicazioni che utilizzato adipogenico cocktail contenenti ingredienti più per la differenziazione degli adipociti da una gamma di progenitori in vitro, abbiamo scoperto che il rosiglitazone e insulina sono necessarie e sufficienti per l'adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule. Anche se siamo consapevoli che rosiglitazone da solo può indurre un accumulo di lipidi in cellule non-adiposo35, la firma molecolare per pan-adipocita e gli indicatori del adipocyte marrone/beige, tra cui una proteina UCP-1 espressione nel selezionare le celle, conferma il maturo fenotipo del adipocyte di alcune delle cellule differenziate. I nostri due-ingrediente adipogenico cocktail semplifica il protocollo procedurale e lo rende più conveniente.

Un'osservazione importante è che la risposta di adipogenico del CD34 + CD31 + cellule era altamente variabile con il soggetto donatore e deposito adiposo. Mentre le differenze specifiche depot in adipogenico le risposte delle cellule staminali adipose o progenitori vascolari stromali sono state segnalate precedentemente32,34, la variabilità di soggetto di tale risposta è un osservazione novella. Dei 20 campioni umani analizzati, 3 SC e 7 celle OM non hanno risposto all'induzione di adipogenic. Ha mostrato le risposte più robuste > 90% delle cellule del reattive per l'induzione per 4 campioni da SC e per 2 campioni da OM. interessante, abbiamo trovato che la reattività è correlata negativamente con HbA1c e non correla con la risposta ad un in vitro stimolazione dell'insulina in cellule non differenziate. Sosteniamo che la differenza nella risposta non è dovuto alla scarsa riproducibilità della tecnica, ma piuttosto riflette l'impronta individuale delle cellule che simulano le risposte in vivo . La conservazione di questa risposta differenziale richiede ulteriore convalida e possono rappresentano un metodo di screening relativamente facile per la capacità di risposta alle terapie volte a stimolare il adipogenesis in vivo. Per comprendere ulteriormente la fonte di variabilità individuale nel potenziale adipogenico, immunophenotyping aggiuntive è necessario identificare sottopopolazioni delle cellule all'interno del CD34 + CD31 + popolazione che portano una funzione del progenitore del adipocyte specifici.

Alcune delle limitazioni di questo protocollo includono un'incompleta caratterizzazione delle popolazioni di cellule; relativamente lunga espansione e differenziazione volte (2 settimane + 2 settimane); potenziali limitazioni all'accesso ai campioni umani e la necessità per l'elaborazione immediata dei tessuti appena prelevati; e la mancanza attuale di dati funzionali per le cellule differenziate. Ci sono diversi vantaggi di questa metodologia che includono un protocollo riproducibile e non laborioso; cellule che probabilmente conservano l'impronta digitale del loro fenotipo in vivo ; l'espansione delle cellule da piccolissime quantità di tessuti con costi relativamente bassi; la possibilità di crioconservare le cellule e mantenere la loro firma adipogenico seguito ri-cultura; e l'opzione per generare repository di queste cellule in modo che possono essere utilizzati per proiezione futura o per altri scopi.

Questo protocollo e il CD34 + CD31 + cellule ottenute come risultato finale possono essere utilizzate come una piattaforma traslazionale sia per studi meccanicistici ai fini dello screening.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano riconoscere Becky Marquez, il coordinatore clinico presso il centro di Sentara bariatrica, per la sua assistenza con il processo del paziente di screening e consenzienti. Questa ricerca è stata sostenuta da R15HL114062 a Dobrian D. Anca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Large Equipment

Biosafety Cabinet

Nuaire

nu-425-400

Cell Culture Incubator

Thermo-Fisher Scientific

800 DH

Water Bath

Forma Scientific

2568

Reciprocal Shaker

RT-PCR Machine

BIO-RAD

CFX96-C1000

Electrophoresis Box

BIO-RAD

Mini PROTEAN 3 Cell

Transblot Box

BIO-RAD

Mini Trans-Blot Cell

Electrophoresis Power Supply

BIO-RAD

PowerPac Basic

ELISA Reader

Molecular Devices

SpectraMax M5

Blot Reader

LI-COR

Odyssey

Near Infrared

Refrigerated Centrifuge

Eppendorf

5810 R

Tabletop Centrifuge

Eppendorf

MiniSpin Plus

Fluorescent Microscope

Olympus

BX50

Inverted Microscope

Nikon

TMS

KRBSS Buffer

HEPES

Research Products International

H75030

Sodium bicarbonate

Sigma-Aldrich

792519

Calcium chloride dihydrate

Sigma-Aldrich

C7902

Potassium phosphate monobasic

Sigma-Aldrich

P5655

Magnesium sulfate

Sigma-Aldrich

M2643

Sodium chloride

Sigma-Aldrich

746398

Sodium phosphate monobasic monohydrate

Sigma-Aldrich

S9638

Potassium chloride

Sigma-Aldrich

P9333

Glucose

Acros Organics

410950010

Adenosine

Acros Organics

164040250

Bovine Serum Albumin

GE Healthcare Bio-Sciences

SH30574.02

Penicillin/Streptomycin

Thermo-Fisher Scientific

15070063

Tissue Digestion

20 mL Syringe

Global Medical

67-2020

Nylon Mesh, 250 µm

Sefar

03-250/50

Pipetting Needles

Popper

7934

Fine Scissors

Fine Science Tools

14058-11

Tissue Forceps

George Tiemann & Co

160-20

Collagenase, Type I

Worthington Biochemical

LS004196

Petri Dishes, 100 mm

USA Scientific

5666-4160

TC Treated

Eppendorf Tubes, 1.5 mL

USA Scientific

1615-5500

Conical Tubes, 15 mL

Nest Scientific

601052

Conical Tubes, 50 mL

Nalgene

3119-0050

Scintillation Vials

Kimble

74505-20

Tissue Dicing

Cell Isolation

Cellometer

Nexcelom

Auto 2000

Cellometer Slides

Nexcelom

CHT4-SD100-002

Cellometer Viability Stain

Nexcelom

CS2-0106-5mL

Acridine Orange/Propidium Iodine

Anti-CD34 Magnetic Beads

StemCell Technologies

18056

Kit

EasySep Magnet

StemCell Technologies

18000

Anti-CD31 Plastic Beads

pluriSelect USA

19-03100-10

pluriSelect 10x Wash Buffer

pluriSelect USA

60-00080-10

pluriSelect Connector Ring

pluriSelect USA

41-50000-03

pluriSelect Detachment Buffer

pluriSelect USA

60-00046-12

pluriSelect Incubation Buffer

pluriSelect USA

60-00060-12

pluriSelect S Cell Strainer

pluriSelect USA

43-50030-03

Cell Culture

6-well Plates

USA Scientific

CC7682-7506

TC Treated

4-well chambered slides

Corning Life Sciences

354559

Fibronectin coated

4-well chambered slides

Thermo-Fisher Scientific

154526PK

Uncoated glass

Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)

Sciencell Research Laboratories

7200

Primary cell line

Endothelial Cell Media (ECM)

ScienCell Research Laboratories

1001

Complete Kit

DMEM/F12 Basal Media

Thermo-Fisher Scientific

11320082

Fetal Bovine Serum (FBS)

Rocky Mountain Biologicals

FBS-BBT

Insulin

Lilly

U-100

Humalog

Rosiglitazone

Sigma-Aldrich

R2408

Cell Analysis

Oil Red O Dye

Sigma-Aldrich

O0625

Prepared in isopropanol

96 well plates

USA Scientific

1837-9600

96 well PCR plates

Genesee Scientific

24-300

RNA Extraction

Zymo Research

R2072

Kit

cDNA Synthesis

BIO-RAD

1708841

Supermix

JumpStart PCR Polymerase

Sigma-Aldrich

D9307-250UN

Hot start, with PCR Buffer N

Magnesium Chloride Solution

Sigma-Aldrich

M8787-5ML

3 mM final in PCR reaction

dNTPs

Promega

U1515

TaqMan AdipoQ

Thermo-Fisher Scientific

Hs00605917_m1

TaqMan CIDEA

Thermo-Fisher Scientific

Hs00154455_m1

TaqMan RPL27

Thermo-Fisher Scientific

Hs03044961_g1

TaqMan UCP1

Thermo-Fisher Scientific

Hs00222453_m1

BCA Assay

Sigma-Aldrich

QPBCA-1KT

Kit

Bis-acrylamide

BIO-RAD

1610146

40% stock solution

Ammonium Persulfate

BIO-RAD

1610700

TEMED

BIO-RAD

1610800

Tris

Sigma-Aldrich

T1503

Glycine

BIO-RAD

1610718

Sodium Dodecal Sulfate

Sigma-Aldrich

L3771

EDTA

Fisher Scientific

S311-100

Bromophenol Blue

Sigma-Aldrich

B8026

Blot Membrane

EMD Millipore

IPFL00010

Methanol

Fisher Scientific

A452-SK4

Odyssey Blocking Buffer, Tris

LI-COR

927-50000

Anti-AKT antibody

Cell Signaling Technology

2920S

Mouse monoclonal

Anti-pAKT antibody

Cell Signaling Technology

9271S

Rabbit polyclonal

Anti-UCP1 antibody

Abcam

ab10983

Rabbit polyclonal

Anti-Mouse IgG antibody

LI-COR

926-68070

Goat Polyclonal, IRDye 680RD

Anti-Rabbit IgG antibody

LI-COR

926-32211

Goat Polyclonal, IRDye 800CW

Anti-Rabbit IgG antibody

Jackson ImmunoResearch

111-025-003

Goat Polyclonal, TRITC

Phosphate Buffer Saline

Thermo-Fisher Scientific

10010049

37% Formaldehyde Solution

Electron Microscopy Sciences

15686

4% solution for cell fixation

Normal Goat Serum

Vector Laboratories

S-1000

10% blocking solution

Triton X-100

Sigma-Aldrich

X-100

0.1% permeabilization solution

DAPI

Thermo-Fisher Scientific

D1306

Calcein AM

Thermo-Fisher Scientific

65-0853-39

Cell fluorescent visualization

Matrigel Basement Membrane Matrix

Corning Life Sciences

356231

Growth factor reduced

DiI labeled Acetylated LDL

Thermo-Fisher Scientific

L3484

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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