녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지

Biology

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Summary

이 프로토콜 열 스트레스 단백질 핵 전 좌는 녹색 형광 단백질 (GFP) 퓨전 단백질 마커로 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 사용 하 여 추적 하는 방법을 보여 줍니다 얼룩. 프로토콜을 얼룩이 DAPI 빨리 고 GFP 단백질 subcellular 지 방화 신호 유지.

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Liang, J., De Castro, A., Flores, L. Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (137), e57914, doi:10.3791/57914 (2018).

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Abstract

이 프로토콜, 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합 단백질 및 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 단백질 subcellular 지 방화 변화;을 추적 하는 데는 얼룩 특히, 아래는 열 핵 전 스트레스 조건. 단백질 반응 대응에 외부 및 내부 신호. 공통 메커니즘의 subcellular 지 방화를 변경 하는. 이 문서는 항 체, 방사성 라벨 또는 confocal 현미경 요구 하지 않는 단백질 지 방화를 추적 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 문서에서는, GFP 포유류 CLIC4를 포함 하 여 염화 세포내 채널 단백질 (CLICs) 가족의 C. 선 충, 구성원에에서 대상 단백질 EXL-1 태그 데 사용 됩니다. (모터와 전체 유전자 시퀀스) 통합된 변환 exl 1::gfp 유전자 변형 라인 변환 및 γ 방사선에 의해 창조 되 고 안정적으로 유전자와 gfp를 표현 한다. 최근 연구는 열 스트레스, 아니라 산화 스트레스, 따라 EXL 1::GFP 핵에서 축적 했다. 핵 구조와는 DAPI GFP 신호 겹치는 신호 스트레스 EXL 1 subcellular 지 방화 변경 확인 합니다. 이 프로토콜 선물 DAPI 얼룩에 대 한 두 가지 다른 고정 방법: 고정은 에탄올과 아세톤 고정. 이 문서에 제공 된 DAPI 얼룩 프로토콜 신속 하 고 효율적 이며 GFP 신호 및 단백질 subcellular 지 방화 변경. 이 메서드는만 Nomarski, FITC 필터와 DAPI 필터 형광 현미경을 요구 한다. 그것은 작은 실험실 설정, 학부 학생 연구, 고 등 학생 연구 및 생명 공학 교실에 적합 합니다.

Introduction

단백질 subcellular 지 방화의 변화는 열 스트레스, 기아, 산화 스트레스, apoptosis, 단백질 인 산화 등 내부 또는 외부 신호에 응답에서 일반적인 메커니즘입니다. 예를 들어 열 스트레스는 FOXO 회원 DAF 16 핵 전 좌1,2, 및3,4신호 수신 죽음 미토 콘 드리 아에 입찰 translocates 프로 apoptotic BCL-2 단백질을 유도 합니다. 다양 한 기술을 이러한 변화를 감지할 수 있습니다. 서 부 럽 고 화학적 분리 subcellular 구조 (, 미토 콘 드리 아 또는 핵)의 조합을 잘3목표 달성할 수 있었다. 그러나, 그것은 관심사의 단백질에 대하여 특정 항 체를 요구 한다. 따라서, 잘 설립 된 항 체는 성공에 열쇠 된다. 다른 접근은 다른 subcellular 구조 또는 세포 녹색 형광 단백질 (GFP), 빨간 형광 단백질 (RFP), 노란색 형광 단백질 (YFP), mCherry, 등 다양 한 마커 라벨 한편 라벨의 단백질을 다른 표시와 관심입니다. 그런 다음 대상5,6지역화 confocal 현미경 그들을 관찰 합니다. 방사성 동위 원소는 대상 단백질 레이블 및 다음 그들의 subcellular 지 방화7감지 대안 선택 이다. 그러나,이 메서드는 적절 한 교육 및 방사성 폐기물의 처리를 해야합니다. 특정 항 체의 부족, 적절 한 마커의 부재 또는 confocal 현미경 등의 scarceness 상황 대체 접근 고려 될 필요가 있다. 단백질의 핵 전 좌를 식별 하려면 그것만 표시와 함께 대상 단백질을 분류 하 고 얼룩 핵 화학 시 약 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)이만 일반 형광 현미경을 필요로 하기 때문에 함께 매력적입니다.

Immunolabeling C. 선 충 항 체와 달걀 껍질 또는 동물을 둘러싼 collagenous 표 피에의 낮은 침투성으로 인해 도전 이다. 한편, 선 충 C. 단백질 그들의 척추 orthologs에서 크게 분기 이기 때문에, 몇몇 상업 회사 특정 제품 C. 선 충 을 제공 합니다. 자신에 대 한 C. 선 충 항 체를 생성 하는 작은 실험실 어렵습니다. 종종 지역 사회에 있는 연구원은 단백질 지역화 또는 유전자 발현을 보여 주기 위해 태그 단백질 마커로 사용 합니다. 이 문서의 예를 들어 EXL 1::GFP를 사용 하 여 열 스트레스8에서 단백질 핵 전 좌를 추적. 동물 게놈에는 통합된 변환 exl 1::gfp 는 안정적으로 gfp 융해 유전자를 표현 하는 데 사용 됩니다. 연구 exl-1 소장, 체 벽 근육, 및 다른 subcellular 구조8에 표현 했다. 이 프로토콜에서는 벌레 애벌레 4 (L4) 단계로 동기화, 열 스트레스 실험, 및 행위 DAPI 얼룩, 에탄올 고정, 아세톤 고정 및 일반 형광 현미경 이미징 수행 하는 방법을 보여 줍니다.

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Protocol

1입니다. 솔루션

  1. NGM 플레이트
    1. 2l 삼각 플라스 크에 NaCl의 3 세대, 한 천의 17 g, 펩의 2.5 g와 dH2오 커버 알루미늄 호 일로 플라스 크의 입의 975 mL를 추가 합니다. 압력솥 50 분에 대 한 플라스 크 20-30 분 동안 그것을 멋진.
    2. 멸 균된 솔루션 추가: 1 mL의 1 M CaCl2, 에탄올에 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL, 1 mL의 1 M MgSO4, 및 1 M KPO4 (pH 6.0) 버퍼의 25 mL. 그들을 잘 혼합 솔루션을 소용돌이 친다.
    3. 액체 디스펜서를 사용 하 여, 60 mm 페 트리 접시에 NGM 솔루션 분배. 한 천의 격판덮개 2/3 전체 채우기. 나중에 사용할 4 ° C에서 밀폐 용기에 그들을 저장 합니다.
  2. 1 M KPO4 버퍼 (pH 6.0)
    1. KH24 10.83 g와 dH2O, K2HPO4 의 3.56 g 녹 이십시오 다음 100 ml 전체 볼륨을 조정 합니다. 압력솥 15 분에 대 한 솔루션입니다.
  3. M9
    1. KH24,2HPO 6 g의 3 세대 분해4및 5 g dH2O, NaCl의 1 mL의 1 M MgSO4, 추가 하 고 1 L. 총 볼륨 조정
  4. 10 µ g/mL DAPI
    1. DAPI dH2오의 999 µ L에 10 mg/mL의 1 µ L을 추가
  5. 95% 알콜 (v/v)
    1. 100% 알코올의 95 mL를 측정 하 고 증류수 100ml에 볼륨 조절 추가.
  6. 30% 아세톤 (v/v)
    1. DH2O 30 mL의 아세톤을 추가 하 고 100 ml 전체 볼륨을 조정 합니다.

2. 열 스트레스

  1. Extrachromosomal 배열 라인과 대상 유전자9,10의 변환 구문 생성 합니다. 또는,에서 꼬마 유전학 센터 (CGC), C. 선 충 연구를 위한 공공 자원 인 또는 이전에 게시 연구 실험실에서 같은 라인을 얻을.
  2. Extrachromosomal 라인을 3800 Rad γ 방사선9벌레를 노출 하 여 게놈에 통합할. 그런 다음 선택 안정적으로 표현한 라인 롤러 등 GFP 마커 단백질을 표현 하는 동물.
  3. 방사선 중에 생성 된 돌연변이 제거 하려면 outcross 라인 적어도 2 x. 이 유전자 변형 라인을 사용 하 여 스트레스 단백질 식 패턴 변화 감지.
  4. 1.1 단계에서 설명한 대로 NGM 웜 접시를 준비 합니다. OP50 복제를 행진 하 고 하룻밤 액체 LB 국물에 박테리아 문화. 벌레를 위한 음식 근원으로 박테리아 잔디를 성장 씨앗 NGM 접시 액체 OP50와 문화 고 37 ° C 배양 기에서 번호판을 품 어 하룻밤. 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 식혀.
  5. 열 스트레스 분석 결과 이전에 적어도 2 세대에 대 한 기아 없이 20 ° C에서 유전자 변형 라인을 성장.
  6. 새로운 벌레 플레이트, 그리고 하자 그들에 대 한 3-5 h에 대 한 알을 8-10 젊은 벗 성인 (자 궁 가득 계란)을 선택 하 고 모든 성인 판에서 제거.
  7. 벌레를 동기화 하려면 계란 해치 고 약 48 h에 대 한 애벌레 애벌레 (L4)의 4 단계로 성장 하자. 그들의 외 음부 구조 (반달 구조) L4 단계 (그림 1, 화살표)11를 식별 하기 위해 검사 합니다.
  8. 열 스트레스를 달성 하기 위해 2-5 h 35 ° C 배양 기에서 L4 애벌레와 벌레 접시를 놓습니다. 정확 하 게 온도 측정 하는 인큐베이터에 온도계를 넣습니다.

3. DAPI 얼룩

  1. 에탄올 고정
    1. 유리 슬라이드 중앙에 M9 버퍼의 10 µ L를 추가 합니다.
    2. 단계 2.8에서에서 열 충격 벌레를 선택 하 고 유리 슬라이드에 M9 버퍼에 넣어.
      1. 또는, M9와 접시를 씻어, 실내 온도에서 1 분 동안 1000 x g 에서 원심 고는 상쾌한 삭제 합니다. 유리 슬라이드에 벌레를 추가 합니다.
    3. 부드러운 휴지를 사용 하 여 모든 초과 액체를 배출 하. 조심 해 현미경이 단계.
    4. 벌레에 95% 알코올의 10 µ L을 추가 하 고 그들이 건조 한 공기. 해 현미경 과정을 시청 하 고 너무 건조 얻을 하는 동물을 두지 마세요. 에탄올은 동물에서 증발 하 고, 후에 바로 다음 단계로 진행 합니다.
      참고: 에탄올 매우 빠르게 증발.
    5. 두 번 반복 단계 3.1.4 벌레 고정 되도록.
      참고: 그것은 어두운 하 고 왜곡을 보고 동물에 대 한 정상입니다.
    6. DAPI의 10 µ L 추가 (10 µ g/mL) 벌레를. 즉시는 coverslip로 그들을 커버 하 고 투명 한 매니큐어 젤 슬라이드 인감.
    7. 형광 현미경에서 약 10 분 후 동물을 보기.
  2. 아세톤 고정 (대체 방법)
    1. 단계 2.8 m 9에서에서 열 충격 격판덮개 떨어져 세척 하 고 실내 온도에서 1 분 동안 1000 x g 에서 원심은 상쾌한 삭제. 씻어 dH2O의 1 mL와 펠 릿, 펠 릿, 수집 하 고 삭제는 상쾌한.
    2. 1000 x g 실 온에서 1 분에 15 분 원심 분리기에 대 한 30% 아세톤의 400 µ L을 추가 하 고 삭제는 상쾌한. DH2O의 500 µ L를 사용 하 여 씻어 동물 2 x. 폐기는 상쾌한.
    3. DAPI의 200 µ L 추가 (10 µ g/mL), 또는 15 분 동안 관에서 총 벌레 볼륨의 금액 x 4.
    4. 1 분 동안 1000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. 2 펠 릿을 세척 dH2오 500 µ L x 벌레 유리 슬라이드에, coverslips와 함께 그들을 커버, 투명 매니큐어 젤, 슬라이드 봉인 놓고 형광 현미경 동물을 관찰.

4. 현미경 이미징

  1. UV 광원 및 형광 현미경 켭니다. 현미경에 연결 된 컴퓨터를 켭니다.
  2. 형광 현미경에 슬라이드를 로드 합니다. 낮은 전력 목표 렌즈 (10 배)를 사용 하 여 벌레, 찾아서, 400 X, 확대 힘 증가 표본에 집중.
  3. 현미경으로 제공 하는 소프트웨어를 엽니다. 메뉴;에서 "인수" 클릭 "카메라"에 클릭 하 고 현미경;에 연결 된 카메라를 선택 소프트웨어와 통신 하기 위해 선택 된 카메라 수 있습니다.
    참고: 다른 현미경 작업에서 달라질 수 있습니다.
  4. 같은 "수집", "다차원 수집"에 클릭 합니다. 새로운 "다차원 수집" 탐색 창이 열립니다. "다중 채널" 버튼을 클릭 하 고 모든 사용할 수 있는 채널이 표시 됩니다.
  5. 파랑, 녹색, 및 표본 관찰 하 DIC (미분 간섭 명암)를 선택 합니다. "다차원 수집" 탐색 창에서 두고는 "블루-DAPI", "그린-GFP", 및 "회색-DIC", "Nomarski" 채널 "레드-rhodamine" 및 "백색 밝은 분야", 등의 다른 채널을 마우스 오른쪽 단추로 그들을 닫습니다.
  6. 첫째, 각 채널에 대 한 노출 시간 측정:
    1. "블루-DAPI" 채널을 선택 하 고 다음 자동된 노출 시간 DAPI 채널에서 라이브 이미지 "측정"에 클릭 왼쪽 클릭 하십시오. 라이브 이미지와 함께 새로운 창이 나타납니다.
    2. 라이브 이미지 창의 왼쪽에 원하는 대로 이미지를 만드는 데 필요한 경우 수동으로 노출 시간을 조정 합니다.
    3. 마지막으로, "확인 클릭" 라이브 이미지 창에서. 이 DAPI 채널에서 노출 시간을 설정합니다.
  7. 다른 채널, "그린-GFP" 및 "회색-DIC", "Nomarski", 그 채널에 대 한 노출 시간을 설정 하려면 4.6 단계를 반복 합니다.
  8. "다차원 수집" 탐색 창에서 "시작" 설정으로 특정 노출 시간 순서 (위 참조) 3 다른 채널에서 3 이미지를 자동으로 수집을 클릭 합니다.
  9. 파일을 저장 하려면 주 메뉴에, "파일" 다음 "다른 이름으로 저장"을 클릭 합니다. 파일 이름 및 폴더 이름을 입력 합니다. 나중에 참조할 수에 대 한 상세한 이미지 정보를 유지 하려면 기본 파일 형식으로 파일을 저장 합니다.
  10. 다른 형식으로 파일을 내보내려면:
    1. "파일"에 고 "내보내기"를 클릭 합니다. 이것은 수출 설정 창을 열 것 이다.
    2. 파일 이름 및 폴더를 설정 합니다. 데이터 구성 "프로젝트 폴더 만들기"를 선택 합니다. 소프트웨어는 또한 다른 4 옵션을 지정 하려면 사용자 수 있습니다: "생성 병합 이미지", "이미지에 대 한 색상을 사용", "사용 하 여 채널 이름" 및 "결합 된 이미지에 만".
    3. "TIF", "BMP", "PSD", 또는 "JPG" 및 다른 형식 예: 드롭-다운 메뉴에서 원하는 파일 형식을 선택 합니다. 다음 클릭 하십시오 "시작" 내보낼.

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Representative Results

염화 물 채널 세포내 단백질 (클릭)는 높은 종12에 걸쳐 보존 다기능 단백질. 많은 연구가 보여줍니다 CLICs 세포, autophagy, apoptosis, 발암, 신생, 긴장과는 포유류 시스템13,,1415,16 대 식 세포 타고 난 면역 반응 조절 ,17. C. 선 충에 있는 두 개의 클릭 homologs: exl 1실-4. 우리의 최근 연구가 보여주었다 exl 1 조절 동물 스트레스 관리8. 우리는 변환 exl 1::gfp 구조는 동물 게놈으로 통합 하 고 안정적으로 유전자 exl-1 는 GFP 마커 (그림 2A 2B)로 표현 하는 유전자 변형 라인을 만들었습니다. 열 스트레스, 강한 GFP 신호 (그림 2 C-E) 핵 구조와 겹치는 이후 EXL 1::GFP 장 지역에서 핵에서 축적. 확인 하려면 subcellular 지 방화, DAPI 얼룩 사용 되었다 접근으로는 핵 얼룩. 동물의 시체 (그림 3B)에 DAPI 얼룩 쇼 명확한 핵에 대 한 에탄올 고정을 사용 하 여. 아세톤 기정은 또한 유사한 결과를 (그림 3E)을 달성 한다. 겹치는 GFP와 DAPI 신호 EXL 1::GFP 실제로 장 지역 (그림 3C, F)에 핵에서 축적 된 확인 합니다.

Figure 1
그림 1: 4 (L4) 애벌레의 이미지 다른 확대 능력에서 C. 선 충 무대. (A) 63 X, (B) 115 X, 및 (C) 400 X 배율 파워. 화살표 L4 웜;의 외 음부를 가리킨 참고 반달 구조입니다. 눈금 막대에 모든 이미지 100 µ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 열 스트레스, EXL 1::GFP 내장의 핵에서 축적. (A) 열 충격 전에 장 지역의 Normaski 이미지. (B) 강한 GFP 신호 열 충격 전에 instestinal 지역에서 관찰 되었다. (C) 열 충격 (장 지역의 핵에 화살표 지점) 후 장 지역의 이미지를 Normaski. (D) 열 충격 후 강한 GFP 신호 축적. (E) 겹친 GFP와 Normaski의 이미지. 모든 사진은 400 X 확대 전력으로 찍힌다. 눈금 막대 = 모든 이미지에서 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: EXL 1::GFP 핵 전 확인 DAPI 얼룩으로. (A-C) DAPI 얼룩에 대 한 에탄올 고정을 사용 하 여. (D-F) DAPI 얼룩 아세톤 고정 사용 하. AD, 그린 컬러는 장 지역에 GFP 신호를 보여준다. BE, 파란색 DAPI 얼룩에 의해 핵을 보여줍니다. CF GFP, DAPI, 및 Normaski의 겹치는 이미지를 표시합니다. 눈금 막대 = 모든 이미지에서 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림: 아세톤 고정 표본 유지 하 고 아세톤 고정 후 60 일 이내 GFP와 DAPI 신호는 아직도 관찰. (A) 그린은 GFP. (B) 블루 DAPI 신호입니다. (C) 겹친 GFP, DAPI, 및 DIC의 이미지. 모든 이미지는 아래 400 X 확대 전력을 이동 됩니다. 눈금 막대 = 50 μ m. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 기사는 핵을 세포질 로부터 단백질 subcellular 변경 사항을 확인 하는 신속 하 고 효율적인 방법을 제시. 핵 구조 DAPI 얼룩 (그림 3)에 의해 확인 하는 동안 단백질 식 GFP 융해에 의하여 표시 했다. Immunostaining C. 선 충 단백질 도전 이기 때문에, 대부분 선 충 C. 단백질 subcellular 지 방화 마커 단백질 GFP, 나사로, mCherry, 등 그들을 태그 특징으로하는18,19 , 20 , 21.이 기사에서 gfp 의 단백질 세포질 지 방화를 보여 주기 위해 대상 유전자 exl-1 태그를 사용 되었다. 확인 하려면 핵 지역화, DAPI 얼룩 사용 되었다. 두 가지 대체 방법을 제시 했다 DAPI 얼룩에 대 한. 모두 효율적으로 괜찮은 근무 시간 내 (1 시간 미만) 벌레에 강한 핵을 보여주었다. 에탄올 고정은 (50 미만 웜 수집) 품질 관측 등 작은 샘플 컬렉션에 적합 합니다. 완전히 건조에서 벌레를 방지 키입니다. 일단 95% 알코올 벌레에서 증발, 다음 단계로 바로 진행 합니다. 아세톤 고정 (50 동물 수집) 정량 분석 하는 등 대규모 샘플 컬렉션에 적합 합니다. 그러나, 세척 샘플의 여러 단계 때문에 어떤 견본 손실 됩니다. 따라서, 그것은 신중 하 게 제거 하는 상쾌한 고 가능한 많은 벌레를 유지 높은 것이 좋습니다. 일단 그들이 봉인 된 아세톤 기정에서 유래 하는 슬라이드 4 ° c.에 1 주 동안 저장 될 수 있다

이 프로토콜은 다른 단백질의 subcellular 지 방화의 변경 내용을 추적 하 게 조정할 수 있습니다. 여기에 제시 된 열 스트레스 뿐만 아니라 다른 스트레스 분석 실험 수 부과, 산화 스트레스, 중 금속 스트레스, 식이 제한, 그리고 다른 사람 같은. 단백질 subcellular 지 방화 변화 또한 관심사의 단백질의 유전 배경 변경 하 여 검사 수 있습니다. 예를 들어, 유전자 변형 라인 소설 유전자 상호 작용 수 있습니다 식별할 수 있도록 다른 돌연변이 배경으로 메시지를 넘어 수 있습니다. RNA 간섭 (RNAi) 특정 유전자를 허물고 하 고 조사 결과 단백질 subcellular 지 방화의 변경에도 적용할 수 있습니다. 이러한 응용 프로그램은 새로운 규제 구성 요소를 식별 하 고 관심의. 알 수 없는 단백질에 대 한 다양 한 실험 조건 시험 되어야 한다, 테스트 시 약 농도 등의 스트레스 시간, 기간 및 벌레의 특정 발달 단계. 우리의 연구에서 우리는 5 h, 및 다른 열 스트레스 온도에 30 분에서 다른 기간을 했어요. 3 h 35 ° C에서 열 충격 단백질의 핵 전 좌에 명확 하 게 방법을 보여 줍니다.

DAPI 얼룩의 추가 응용 프로그램 특히 생식 세포22,23,,2425에 벌레와 수 핵의 수에 감수 분열 및 유사 분열 과정의 시험을 포함 한 유전 돌연변이 배경20,,2627.

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Disclosures

저자는 선언할 수 없다.

Acknowledgements

이 연구에 사용 된 선 충 C. 긴장 건강-사무실의 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 국가 학회에 의해 지원 되는 꼬마 유전학 센터에서 얻은 했다. 이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다: 1R03AG048578-01 6 월 회담, 6 월 회담, 및 PSC CUNY CCRG 1501-CUNY 66184 00 44와 67248-00 45 6 월 회담을. 우리는 그녀의 실험실 공간을 공유 하는 친절 하 게 대 한 캐시 야만인-던 감사 합니다. 모든 형광 이미지는 퀸 즈 대학 핵심 시설에서 수집 되었다. 원고에 대 한 그의 의견에 감사 윌리엄 J. 쌀 하 고.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Biotium 40043 both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well
OP50 CGC OP50 https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe Kimberly-Clark Corporation soft tissue
Zeiss  AX10 Zeiss fluorescence microscope
Axiovision Rel 4.8 Zeiss microscope software
AxioCam MR Rev3 Zeiss digital camera
Incubator 
Micro centrifuge
Transparent nail polish gel
60 mm petri dishes
Glass slides
Glass coverslips
1-20 µL pipettor
20-200 µL pipettor
200-1000 µL pipettor
1-200 µL pipet tips
200-1000 µL pipet tips
1.5 mL microcentrifuge tubes
Platinum wire worm pick

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References

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