Microscopia de reflectométrica espectral em dendritos In Situ

Neuroscience

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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para imagem mielinizados axônios em uma fatia do cérebro fixo usando uma rótulo livre nanoescala imagem técnica baseada na reflectometria espectral.

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Kwon, J., Choi, M. Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ. J. Vis. Exp. (137), e57965, doi:10.3791/57965 (2018).

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Abstract

Em um sistema nervoso de mamíferos, mielina fornece um isolamento eléctrico por enwrapping as fibras de axônio em uma espiral de várias camada. Inspirado por sua arquitetura subcellular altamente organizado, desenvolvemos recentemente uma nova modalidade de imagem, chamada reflectometria espectral (provador), que permite que a imagem latente de nanoescala rótulo livre sem precedentes dos axônios mielinizadas ao vivo em situ. O princípio subjacente é obter informações nanoestrutural, analisando o espectro de refletância da estrutura subcelular várias camada. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado passo a passo para a realização de uma imagem de provador básica dos tecidos nervosos usando um sistema comercial microscópico confocal, equipado com um laser de luz branca e um filtro sintonizável. Cobrimos os procedimentos de preparação da amostra, aquisição de dados espectrais e processamento de imagem para obtenção de informações nanoestrutural.

Introduction

No sistema nervoso dos mamíferos, mielina fornece condução nervosa rápida e integridade axonal por enwrapping as fibras de axônio com bainhas membranosas em várias camadas. É composta por sua estrutura várias camada alternando nanoescala fino-filmes compostas por membranas de plasma (~ 5 nm), citoplasma (~ 3 nm) e espaços extracelulares (~ 7 nm)1,2. Microscopia ótica, incluindo a recente microscopia de super-resolução, não são adequados para observar a dinâmica de mielina nanoescala devido a sua resolução insuficiente devido à difração óptica3,4,5. Apesar de microscopia eletrônica pode fornecer detalhes de nanostructure a mielina, não é compatível com os sistemas biológicos vivos devido a preparações altamente invasivo amostra envolvendo fixação química e,ultrasectioning67 . Até recentemente, não houve nenhuma técnica aplicável para observar a dinâmica de nanoescala de dendritos em situ.

Schain et al relataram anteriormente que dendritos exibem refletância de luz colorido8. Adotando a análise espectroscópica da luz refletida, criámos uma nova modalidade de imagem para a imagem latente de nanoescala de axônios mielinizados, chamado reflectometria espectral (provador)9. Provador baseia-se a interferência de filme fino que ocorrem na estrutura multi-camadas da bainha de mielina (Figura 1). Por simulação óptica em vários axônios, revelamos que o espectro de refletância é uma função periódica do número de onda e sua periodicidade (Equation 1) é inversamente proporcional ao diâmetro do axônio (d). Esta relação simples (Equation 2) oferece fácil quantificação do diâmetro do axônio a partir dos dados do provador. Utilizando este, revelamos o axônio prevalente abaulamento sob leve traumatismo crânio-encefálico em nosso relatório prévio.

O sistema de provador baseia-se na microscopia confocal e consiste de uma fonte de laser especializado e filtros (Figura 2). A fonte de entrada é um laser de luz branca, fornecendo banda larga saída espectral visível para regiões de infravermelhas. Para a varredura espectral, o sistema é equipado com dois dispositivos óptico-acústico: um filtro sintonizável Acusto-óptica (AOTF) para a entrega de um comprimento de onda selecionado de fonte entrada de banda larga e um divisor de feixe óptico-acústico (AOBS) para guiar o selecionado refletido comprimento de onda do detector. O software para a microscopia confocal hiperespectral (ver Tabela de materiais) oferece uma opção de varredura espectral personalizável para adquirir sequencialmente as imagens de reflectância em vários comprimentos de onda de entrada. Além disso, a aberração cromática criticamente pode interferir na medição espectral; Portanto, recomenda-se uso de uma lente objetiva de apochromat.

Digno de nota, lasers de luz branca produzir uma saída espectral desigual e componentes ópticos também afetam o perfil espectral. Portanto, os espectros adquiridos precisam ser calibrados para posterior análise quantitativa. Um espelho de prata protegido é geralmente usado como uma referência, que fornece uma reflectância quase constante (> 97%) sobre a região completamente visível. Os espectros adquiridos dividem-se em seguida pelos espectros de referência do espelho.

O tamanho de etapa espectral para a varredura espectral determina a velocidade de aquisição; assim, ele precisa ser otimizado. Como um axónio maior tem um período maior de espectral, requer mais fino amostragem espectral. Por exemplo, um axônio com um diâmetro de 10 µm, dentre os axônios fisiológicos maiores, tem um período espectral de ~ 8 nm. Aplicando os critérios de amostragem de Nyquist, utilizamos o intervalo de amostragem espectral de 4 nm para cobrir todos os axônios fisiológicos nos tecidos nervosos do mouse. Esta abordagem geralmente leva vários segundos para uma varredura espectral completa e, portanto, não é adequada para aplicações na vivo , onde o movimento fisiológico (por exemplo, respiração e batimentos cardíacos) interfere aquisição espectral estável. Anteriormente, resolvemos esse problema por instrumentação um microscópio vertical personalizado, concebido para adquirir todo o espectro para cada ponto usando um espectrômetro de matriz (aquisição velocidade ≈ 30 ms por pixel).

Neste relatório, descrevemos um protocolo detalhado do provador de imagens sobre uma fatia de cérebro fixa, que pode ser executada em um microscópio hiperespectrais comercial (ver Tabela de materiais). Assim, o protocolo pode ser concluído por experimentadores sem especialização em instrumentação óptica. Também abordamos os problemas potenciais e solução de problemas para a aquisição e análise de dados do provador.

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Protocol

Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Sungkyunkwan e institucional Cuidado Animal.

1. preparação da amostra

Nota: Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes de manipulação de animais. Realizar todo o desempenho cirúrgico em uma sala dedicada para procedimentos cirúrgicos. Luvas e batas cirúrgicas estéreis devem ser usadas por todo o pessoal na sala cirúrgica em todos os momentos.

  1. Fixação de tecidos
    1. Prepare duas seringas de 10 mL que cada um preenchido com tampão fosfato salino (PBS) e paraformaldeído 4% (PFA) em PBS.
    2. Anestesiar um rato de 7-12-semanas, (C57BL/6J ou quaisquer linhas de rato com ambos os sexos) através da administração de uma mistura de zoletil e xilazina (1:1, 20 mg/kg cada) ou um regime alternativo de anestesia adequada (por exemplo, mistura de 80 mg/kg de ketamina e 10 mg/kg xilazina) com uma injeção intraperitoneal.
    3. Uma vez que o mouse alcançou um plano cirúrgico da anestesia (use o método de pitada-resposta do dedo do pé), expor o coração cortando a pele e a caixa torácica com uma tesoura.
    4. Cortar o átrio direito com uma tesoura pequena para drenar o sangue e perfundir a solução de PBS e PFA sequencialmente através do ventrículo esquerdo com uma agulha (taxa de perfusão = 4 mL/min, volume = 10 mL de cada solução).
      Nota: O rato torna-se duro, se o procedimento for concluído com êxito. O uso de pomada ou esterilização não é necessário que o procedimento é terminal. O procedimento de fixação pode ser ignorado. No entanto, esta etapa é recomendada para minimizar deformações estruturais, incluindo danos nos tecidos mecânicos e inchaço axonal isquêmico. Para mais detalhes sobre a fixação de tecidos, consulte o artigo de Gage, et al . G. J. 10
  2. Preparação da fatia cerebral
    1. Decapitar o mouse com uma tesoura cirúrgica através da ventral do tórax e abdômen.
    2. Remova o periósteo usando uma tesoura devidamente pequena até expor totalmente o crânio e o couro cabeludo.
    3. Quebrar o osso frontal e cortar o crânio ao longo da sutura sagital do osso occipital usando tesouras pequenas com cuidado para não danificar o cérebro.
    4. Remova cuidadosamente o crânio e a dura-máter sequencialmente utilizando pinça fina.
    5. Extraia o cérebro usando uma colher de plástico macia, tomando cuidado para não danificar o tecido.
    6. Lave e mergulhe o cérebro extraído em uma solução PFA 4% durante 30 min a 4 ° C.
    7. Corte o cérebro fixo em 100-150 µm seções usando um vibratome.
      Nota: Para obter mais detalhes sobre a preparação do tecido, consulte o artigo por Segev et al 11. para os procedimentos subsequentes, o tecido deve ser cortado em seções mais fino que a espessura do espaçador.
  3. Montagem da fatia cerebral
    1. Prepare lâmina de 1 vidro e 2 copos de tampa quadrados (22 × 22 × 0,17 mm) para cada pedaço de tecido.
    2. Cortar um dos copos de tampa quadrados em meia (duas peças retangulares) usando um cortador de vidro.
    3. Anexe os dois dos copos de capa cortados ao meio, usando uma super cola no vidro do slide.
      Nota: O espaço entre os dois copos cortados ao meio deve ser ligeiramente maior que o tamanho da fatia do tecido.
    4. Colher a fatia do cérebro usando um pincel ou uma pipeta e colocar o tecido no vidro entre o espaçador do slide. Tome cuidado para não dobrar o tecido.
    5. Dispense 100 μL de PBS sobre a superfície do tecido.
    6. Coloque o outro vidro tampa quadrado em cima do tecido. Evite a inclusão de bolhas de ar durante esta fase.
    7. Selo em torno do vidro tampa usando um esmalte (ou alternativamente apropriados adesivos) para evitar a evaporação de PBS e contaminação por poeira durante a sessão de imagens subsequente.
      Nota: O experimentador pode fazer uma pausa nesta fase.

2. calibração

  1. Ligue o microscópio pelo menos 1h antes da imagem latente para permitir a estabilização térmica do laser de origem (ver Tabela de materiais). Em seguida, ativar o software para fazer a varredura espectral (ver Tabela de materiais) e clique no botão adquirir no topo do GUI (Figura 3a).
  2. Ative o obturador de software para o laser de luz branca (WLL) e tubo fotomultiplicador (PMT) (Figura 3a).
  3. Selecione o modo de xyΛ na lista drop-down no Modo de aquisição, em seguida, o modo de entrada de laser é automaticamente alterado de % constante para Poder constante. Desmarque a caixa de seleção do Movimento automático SP. E em seguida, defina a janela espectral do laser entrada para 470 – 670 nm e o tamanho de etapa espectral a 4 nm na Λ-excitação Lambda Scan configurações (Figura 3b).
  4. Defina o intervalo espectral de PGTO para 450-690 clicando duas vezes ou movendo a barra de ajuste para a faixa espectral (Figura 3C).
    Nota: Esta faixa espectral deve incluir a largura de banda completa da fonte de entrada.
  5. Seleccione uma lente objetiva de imersão de água, devidamente com uma abertura numérica elevada (at > 0,7) e dar qualquer valor ao poder de PGTO e laser para ativar o botão configuração AOBS e Live Scan . Mude o caminho óptico, verificando o reflexo na Configuração AOBS (Figura 3d).
  6. Montar um espelho de referência (ver Tabela de materiais) na fase de microscópio. A superfície do espelho deve ser enfrentada contra a lente objetiva. Se não é fácil de colocar o espelho no palco microscópio, vínculo um espelho na chapa plana (por exemplo, vidro de slide).
  7. Controle a fase de microscópio para alinhar o plano focal para a superfície do espelho.
  8. Ajustar o ganho de PGTO e a potência do laser, tendo em conta a gama dinâmica do detector e altere o modo de entrada de laser de constante por cento para Poder constante.
    Nota: Como é típico, um PGTO ganho de 500 (V) e um poder relativo do laser de 0.1% são utilizados em 570 nm.
  9. Confirme em um modo de cor pseudo para verificar que não há nenhuma saturação em toda a gama de comprimento de onda. Se for observada a saturação, reduzir a potência do laser (Figura 3a).
  10. Execute a aquisição de Lambda Scan .
  11. Retire o espelho do palco e repetir a mesma aquisição sem uma amostra para obter a referência escura (ou seja, deslocamento escuro).
  12. Salve os dados em um formato TIF Multistacked .

3. aquisição de imagens provador

  1. Coloque o tecido montado no palco do microscópio. Para aproximadamente alinhar o tecido para o plano focal da lente da objetiva, use o modo de fluorescência de campo amplo através de uma parte do olho.
  2. Com a Varredura de viver lá, controle a fase de microscópio para alinhar o plano focal para a região de interesse no tecido. Para evitar o ruído de fundo da lamínula, selecione a região alvo de pelo menos 15 μm de profundidade a partir da interface de vidro-tecido.
  3. Adquira a pilha de imagem espectral para a região de destino usando o mesmo procedimento como descrito nos passos 2.1 – 2.10.
  4. Salve os dados para o tecido e o deslocamento escuro em formato TIF Multistacked .
    Nota: O experimentador pode fazer uma pausa nesta fase.

4. processamento e análise de imagem

  1. Abra os dados espectrais (multistacked TIF) para o espelho de referência e o tecido cerebral no ImageJ.
  2. Selecione o ROIs (regiões de interesse) para as pilhas de imagem aberto — a área central para o segmento de uma fibra do axônio para o tecido cerebral e o espelho de referência.
  3. Adquirir os espectros brutos para o ROIs selecionado pela execução imagempilhaseixo z traçar perfil no menu ImageJ.
  4. Abra os dados de deslocamento escuros, uma tomada para o espelho de referência e os outros que eram levados para o tecido cerebral.
  5. Adquirir os espectros para os deslocamentos escuros por execução imagempilhaseixo z traçar perfil no menu ImageJ.
  6. Salve todos os espectros adquiridos usando as opções copiar e colar .
    Nota: Para a imagem latente do provador, uso do campo de imagem central para minimizar as aberrações ópticas fora do eixo é recomendado. As fibras de axônio podem ser estruturalmente heterogêneas ao longo de seu comprimento. Daí, selecionando o ROI em um segmento do axônio pequenos, tipicamente < 5 µm, para minimizar o volume parcial artefato é recomendado.

5. linha de base correção e análise de sinal de provador

  1. Subtrai os deslocamento espectros dos espectros do espelho de referência e os tecidos do cérebro.
  2. Normalize cada espectro dividindo-se a intensidade máxima do espectro.
  3. Dividir o espectro normalizado do axônio pelo espectro normalizado do espelho de referência e subtrair deslocamento DC do espectro normalizado.
  4. Medir a frequência de wavenumber encaixando o espectro adquirido para um sinusoidal curva (ver Tabela de materiais) e em seguida, converter o wavenumber adquirida a periodicidade por tomar recíproca.
  5. Converta a periodicidade wavenumber ao diâmetro do axônio, usando a equação na Figura 4C.

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Representative Results

De acordo com o protocolo, uma fatia do cérebro fixa foi preparada com coloração exógenos, um fluoróforo mielina-direcionamento (ver Tabela de materiais). Imagem de provador foi realizada na fatia cérebro usando um microscópio confocal hiperespectrais comercial em conjunto com fluorescência confocal de imagem (figura 4a). Para provador, entrada intensidade óptica foi definida como 5 µW/µm2 com um tempo de interrupção de pixel ~ 1 µs. Esta dose de luz é sobre uma ordem de magnitude inferior a microscopia confocal de fluorescência convencional12. Demora ~ 17 s para varredura espectral mais de 470-670 nm, com um intervalo de 4 nm (51 imagens).

O sinal de provador era localizado ao longo do centro dos axônios mielinizados como esperado pela geometria da reflexão ótica. Do espectro de refletância de um segmento do axônio, obteve-se a periodicidade do wavenumber, que posteriormente se converteu ao diâmetro do axônio (figura 4b, c). O diâmetro medido pelo provador foi encontrado para ser bom de acordo com a medição baseada em fluorescência (Figura 4D). O erro residual menor poderia ter se originado ou na resolução de difração limitada do método baseado em fluorescência ou o incompleto geométricas modelo para o provador.

A imagem do provador baseia-se na reflexão óptica, assim, uma lamela com base em sílica pode introduzir um ruído de fundo significativo. Em nossa configuração óptica, o ruído de fundo era considerável quando a profundidade da imagem latente da lamela é inferior a 5 µm, mas foi evitada quando a profundidade de imagem é maior que 15 µm (Figura 5).

Figure 1
Figura 1 : Princípio de provador. Mielinizadas axônio tem uma estrutura multicamada de película fina. A luz incidente é parcialmente refletida nas interfaces, conforme descrito pela lei de Fresnel. Estas refletidas as ondas de luz interferem uns com os outros; Portanto, a luz refletida resultante codifica as informações nanoestrutural. Reflectometria espectral (provador) Obtém as informações de nanoestrutural pela luz refletida do axônio mielinizada de decodificação. Esta figura foi reimpresso de Kwon, J. et al. 9 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Layout do sistema de provador. O sistema de provador é baseado em um microscópio confocal de reflectância. Para fazer a varredura espectral, três componentes adicionais são necessários ao longo do caminho de excitação: (1) um laser supercontinuum, (2) óptico-acústico sintonizável filtro (AOTF) e (3) Acusto-óptica feixe divisor (AOBS). A fonte de laser banda larga espectralmente é filtrada pelo AOTF para transmitir um comprimento de onda selecionado com uma largura de banda estreita. AOBS funciona como um divisor de feixe para o comprimento de onda selecionado guiar a luz de excitação para a amostra. A luz é então incidente sobre a amostra através de um scanner reológicas e uma lente objetiva. A luz refletida da amostra é descanned, filtrada espacialmente por uma pinhole confocal e coletada pelo tubo fotomultiplicador (PMT). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Instalação de software. (uma) interface de usuário gráfica (GUI). Na janela principal, há principalmente cinco sub-painéis: imagem de instalação, instalação do laser, óptica instalação, instalação do detector e visualizador de imagens. (b) o menu drop-down para selecionar o modo de imagem. Para provador, xyλ está selecionada. (c) o painel para ajustar a janela espectral para o detector. (d) o painel de configuração do divisor de feixe óptico-acústico (AOBS). 'Reflexão' é selecionado para orientar a luz refletida para o detector. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Provador em um tecido de cérebro. (um) provador A imagem de um tecido de cérebro murino manchada com um counterstaining fluorescente da mielina (fluoromyelin). (b) um espectro de refletância representante obtidos a partir da caixa branca tracejada na alínea a. (c) uma curva de referência simulado para estimar o diâmetro do axónio de periodicidade espectral. Asterisco azul é o ponto de dados obtido de (b). (d), o perfil Transversal da intensidade de fluorescência da região Box na alínea a. O diâmetro externo de mielina, estimado por meio do sinal de fluorescência é ~ 760 nm, que concorda com a medição do provador. O erro residual é concebível de erro de difração da medição baseada em fluorescência. Scalebar, 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Efeito de uma lamela. (a, b) Imagens de reflectância de um tecido cerebral na mesma posição lateral são adquiridas em diferentes profundidades da interface tecido-Lamela: 3 µm (um) e 15 µm (b). Scalebar, 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Provador é uma nova modalidade de imagem livre de rótulo baseada na interferometria espectral, que pela primeira vez, oferece a informação de nanoescala em axônios mielinizadas ao vivo. No actual protocolo de aquisição, a resolução espacial para o diâmetro do axônio é da ordem de 10 nm. Além disso, o provador utiliza ordens de magnitude menor dose leve em comparação com outros microscopies de super-resolução; assim, é livre de fototoxicidade e fotobranqueamento. Provador forneceria uma nova avenida para estudar a dinâmica de nanoescala de axônios mielinizadas.

O protocolo descrito neste documento baseia-se na varredura espectral mediada pelo óptico e um detector de ponto (ou seja, pgto). Esta abordagem é vantajosa para aquisição de imagens espectrais do campo de visão total. No entanto, o tempo de resolução é limitado pela varredura espectral, que é tipicamente > 15 s em nossa configuração atual. Como alternativa, um espectroscópio de alta velocidade pode ser incorporado para permitir a observação em tempo real de um pequeno campo de visão de9. Este sistema pode ser construído simplesmente de um sistema convencional confocal comutando o pgto em um espectroscópio e adicionando um laser de luz branca. Para software de aquisição, a posição do galvanômetro precisa ser sincronizado com a execução do espectroscópio. No caso de uma único ponto de medição, a resolução temporal é determinada pela taxa de quadros do espectroscópio, que pode ser > 10 kHz para recentes espectroscópios ultra rápidos. Esta resolução temporal de milissegundo sub deve ser suficiente para a observação da dinâmica fisiológica os dendritos vivo namaioria. Provador baseia-se na reflexão da luz; Portanto, a luz detectada tem o mesmo comprimento de onda, como a luz de entrada. Pelo contrário, fluorescência envolve deslocamento espectral (ou seja, deslocamento de Stokes); assim, a luz detectada é espectralmente separável da luz de entrada. Esse recurso é útil para aquisição simultânea do provador e fluorescência na mesma amostra (como demonstrado na Figura 4). Absorção da luz entrada por um fluoróforo pode afetar a medição do provador, mas a absorção de coloração fluorescente típica é insignificante baixa (< 1%).

Digno de nota, provador tem uma limitada detecção angular gama-somente que os axônios quase paralelos ao plano de imagem podem ser detectados. Este limite angular do provador é em torno de 13,5 ° ± 9. Para adquirir a orientação específica de interesse, a amostra pode ser inclinada. No caso de espécimes transparentes como o embrião de zebrafish, a aquisição completa volumétrica pode ser possível, girando o espécime. Uma limitação prática adicional é que uma lamela montada numa amostra produz forte reflexão volta levando para a geração do sinal de fundo elevado, como mostrado na Figura 5; recomenda-se que esta região superficial deve ser evitada. Provador com base na luz visível tem comprimento de atenuação a 1/e de ~ 20 µm nos tecidos cerebrais. A profundidade de penetração de tecido típico para adquirir informações fiáveis espectrais é limitado a ~ 100 µm. mais profunda de imagem pode ser possível se for utilizada uma fonte de entrada mais. No final, a validação do provador é mostrada, comparando-o com microscopia de fluorescência de difração limitada. Aparentemente, isto tem sido insuficiente para avaliar a precisão de escala nanométrica (Figura 4). Técnicas recentes, como correlativa microscopia de luz e microscopia de expansão, que oferecem uma forma de validar o provador em nanoescala regime13,14.

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Disclosures

Os autores declaram interesses financeiros concorrentes: J. Kwon e M. Choi são inventores da patente pendente tecnologia descrito neste artigo.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Instituto de ciência básica (IBS-R015-D1) e pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da educação (2017R1A6A1A03015642).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass cutter - - Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Nail polish - - Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Apochromat objective 40×, NA 1.1 Leica Microsystems 15506357 Water-immersion type
Fluoromyelin Green Thermo Fisher F34651 Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.
Leica SP8 TCS microscope Leica Microsystems SP8 Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details.
Imaging software Leica Microsystems LAS-X -
Matlab MathWorks - -
Mirror Thorlabs PF10-03-P01 Coated with protected silver.
Phosphate-buffered saline (PBS) Life technologies 14190-136 -
Paraformaldehyde Biosolution BP031a 4% v/v in PBS
Cover slip Thermo Fisher 3306 Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)
Slide glass Muto Pure Chemicals 5116-20F Thickness: ~1 mm
Super glue Henkel Loctite 406 Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.
Syringe pump Brainetree Scientific BS-8000 DUAL -
Vibratome Leica Biosystems VT1200S -
White-light laser NKT photonics EXB-6 EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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