Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

Experimentos de fatias cerebrais permitem o interrogatório da função neuronal com alta resolução elétrica e temporal, mas essas fatias normalmente cortam muitas conexões pré-sinápticas. Uma fatia em forma de cunha mantém um circuito pressinápico mais intacto. Esta fatia cerebral modificada mantém um circuito neuronal mais completo em forma de in vivo, proporcionando os benefícios da experimentação in vitro, como gravações de grampos de remendo visualmente guiados, farmacologia e imagem de atividade.

Geometria fatiada precisa pode ser estimada com base nos locais atlas dos neurônios dentro do circuito, mas a integridade das schematas e axônios pré-sinápticas deve ser determinada usando histologia. Comece usando uma lâmina de barbear para cortar a pele na linha média do crânio do nariz para a parte de trás do pescoço. Retire a pele para expor o crânio e começando na base do crânio e continuando em direção ao nariz, use uma pequena tesoura para fazer uma incisão no crânio através da linha média.

Na sutura lambda, faça cortes no crânio a partir da linha média lateralmente em direção à orelha em ambos os lados para descascar o crânio para expor o cérebro. Começando na extremidade rostral, use uma pequena espátula de laboratório para levantar suavemente o cérebro do crânio para permitir que os nervos ópticos sejam cortados. Continue a trabalhar suavemente o cérebro para trás, expondo a superfície ventral e use fórceps finos para beliscar cuidadosamente os nervos trigêmeos perto da superfície ventral do tronco cerebral para cortá-los.

Coloque a preparação em uma placa de vidro Petri cheia de solução de corte frio e coloque a placa sob um microscópio dissecando. Corte os nervos faciais perto do tronco cerebral para expor os nervos vestibulococochlear. Use fórceps finos para empurrar as pontas para a foramina onde o nervo vestibulocochlear sai do crânio o mais longe possível.

Belisque para cortar os nervos de ambos os lados, deixando a raiz nervosa presa ao tronco cerebral. Remova as meninges e vasculatura da superfície ventral do tronco cerebral perto do corpo trapezoide. Em seguida, belisque os nervos cranianos restantes e o tecido conjuntivo para libertar o cérebro completamente do crânio, tomando cuidado para preservar a medula espinhal restante, se possível.

Para preparar a superfície do cérebro para fixação ao palco coloque o lado ventral do cérebro para cima e use uma ferramenta contundente para imobilizar suavemente a medula espinhal para estabilizar o tecido cerebral. Insira fórceps abertos em um ângulo de aproximadamente 20 graus através do cérebro até a parte inferior do prato de modo que as pontas saem da superfície dorsal do cérebro caudal para o quiasmo óptico e usam uma lâmina de barbear para cortar ao longo das fórceps. Em seguida, prepare um bloco de um centímetro cúbico de 4% de ágar e espalhe uma pequena gota de cola em um retângulo no palco.

Use fórceps para levantar cuidadosamente o cérebro e delicadamente dab o excesso de líquido com a borda de uma toalha de papel. Em seguida, coloque a superfície bloqueada sobre a cola para que a superfície ventral esteja voltada para a direção da lâmina durante o corte e empurre o bloco de ágar suavemente contra a superfície dorsal como suporte. Para adquirir fatias de cunha com a raiz nervosa coclear no lado grosso e os neurônios olivococlear medial e o núcleo medial do corpo trapezoide no lado fino, coloque o disco magnético com o cérebro preso no suporte do palco e coloque o suporte na câmara de corte de um vibratome com a superfície ventral do cérebro orientada para a lâmina.

Encha a câmara com solução de corte gelado e baixe a lâmina na solução bolha de carbogen. Corte fatias caudais para a região de interesse para garantir que as fatias sejam simétricas. Em seguida, mude o palco aproximadamente 15 graus para um lado.

Continue cortando cuidadosamente até que a raiz nervosa auditiva esteja perto da superfície de um lado e o nervo facial possa ser visto na superfície do outro lado da fatia. Mude o estágio 15 graus de volta para a posição original e mova a lâmina para longe do tecido. Gire a base do palco 90 graus de modo que a borda lateral do lado fino esteja voltada para a lâmina e baixe a lâmina várias centenas de mícrons antes de lentamente trazer a lâmina perto da borda do tecido.

Com a lâmina retraída ligeiramente abaixe a lâmina para a espessura desejada da borda fina da fatia. Mova a lâmina para trás do tecido e gire a base do palco para trás para que a superfície ventral fique de frente para a base do palco. Faça um corte para designar a superfície rostral da fatia de cunha e transfira a fatia para um pedaço quadrado de papel de interface caudle superfície para baixo.

O nervo facial deve ser visível em ambos os hemisférios da fatia na superfície rostral. Em seguida, mova a fatia para uma câmara de incubação de 35 graus Celsius para se recuperar por 30 minutos. Para configurar a fatia da cunha para análise de eletrofisiologia coloque a amostra em uma câmara de gravação que está sendo continuamente perfundida com 35 graus Celsius ACSF e estabilize a fatia.

Usando óptica DIC, concentre-se na raiz nervosa auditiva no lado grosso da fatia e use um micromanipulador para mover o eletrodo estimulante de tungstênio bipolar para a raiz nervosa auditiva e suavemente para a superfície do tecido. Mova o campo de visão para o núcleo ventral do corpo trapezoide no lado fino e selecione um neurônio olivococlear medial como alvo para eletrofisiologia de grampo de remendo sob epifluorescência usando um filtro de emissão de 561 nanômetros. Preencha uma pipeta de gravação com a solução interna apropriada para o experimento proposto e sob patch de óptica DIC e grave a partir do neurônio olivococlear medial na configuração de células inteiras.

Ajuste a amplitude de estimulação elétrica da raiz nervosa auditiva para obter eventos postsináspticos consistentes no neurônio olivococlear medial. Em seguida, execute protocolos de estimulação apropriados para observar correntes sinápticas evocadas em neurônios olivococleares medial. Esta preparação de fatia de cunha foi projetada para conter a raiz nervosa auditiva e o núcleo coclear contralateral aos neurônios olivococlear medial direcionados para gravações.

Nesta fatia de cunha ressecção ressecada de cresílico, o núcleo coclear está presente em quase sua extensão rostral-caudal completa. E a raiz nervosa auditiva é observada entrando no núcleo coclear. Além disso, a fatia da cunha contém neurônios do núcleo medial do corpo trapezoideal ipsilateral aos neurônios olivococlear medial dos quais as gravações são realizadas.

Para confirmar a conectividade neuronal dentro de uma fatia de cunha, as entradas pré-sinápticas são estimuladas de duas maneiras. Primeiro, a estria acústica ventral na linha média é eletricamente estimulada, ativando axônios T-stellate diretamente e o núcleo medial dos neurônios do corpo trapezoide através da estimulação do axônio da célula espessa globular e resultando em correntes postsintálicas que são medidas no neurônio olivocochle medial. A raiz nervosa auditiva é então estimulada a ativar todo o circuito de tronco cerebral ascendente monaural e a evocar respostas pós-sinápticas.

A comparação das medidas de latência de início da primeira corrente não sináptica evocada com estimulação direta da estria acústica ventral com aquelas evocadas com estimulação nervosa auditiva revela uma latência significativamente maior no evento de estimulação do nervo auditivo, indicativo do atraso sináptico resultante da sinapse adicional do núcleo coclear ativado durante a estimulação do nervo auditivo. O uso de marcos anatômicos e manobras cuidadosas do estágio do disco magnético são fundamentais para a criação de fatias de cunha com circuitos neuronais intactos e respostas pós-sinápticas evocadas confiáveis. Esta técnica de corte fornece uma plataforma para o uso de ferramentas adicionais de eletrofisiologia in vitro, incluindo imagem de cálcio ou tensão, optogenética, neurotransmissor uncaging, e tanto farmacologia intracelular e extracelular.