स्थिर जीर्ण मूषक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए सिरिंज इंजेक्शन मेष इलेक्ट्रॉनिक्स

Bioengineering
 

Summary

मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच मूल एकीकृत और मस्तिष्क के भीतर स्थिर, दीर्घकालिक, एकल ंयूरॉन स्तर रिकॉर्डिंग प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल में vivo प्रयोगों के लिए मेष इलेक्ट्रॉनिक्स का उपयोग करता है, जाल इलेक्ट्रॉनिक्स के निर्माण को शामिल, सुई में लोड हो रहा है, stereotaxic इंजेक्शन, इनपुट/आउटपुट का सामना करना पड़, रिकॉर्डिंग प्रयोगों, और जाल युक्त ऊतक के प्रोटोकॉल जांच.

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Schuhmann Jr., T. G., Zhou, T., Hong, G., Lee, J. M., Fu, T. M., Park, H. G., Lieber, C. M. Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology. J. Vis. Exp. (137), e58003, doi:10.3791/58003 (2018).

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Abstract

प्रत्यारोपित मस्तिष्क इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी जांच अपने उथले और गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों से उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ तंत्रिका गतिविधि को रिकॉर्ड करने की क्षमता के कारण तंत्रिका विज्ञान में मूल्यवान उपकरण हैं । उनके उपयोग, हालांकि, यांत्रिक और संरचनात्मक जांच और मस्तिष्क ऊतक है कि आमतौर पर पुरानी रिकॉर्डिंग प्रयोगों में जिसके परिणामस्वरूप संकेत अस्थिरता के साथ micromotion और gliosis के लिए नेतृत्व के बीच बेमेल द्वारा बाधा किया गया है । इसके विपरीत, सिरिंज इंजेक्शन के माध्यम से ultraflexible मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के आरोपण के बाद, मेष जांच एक निर्बाध, gliosis के आसपास मस्तिष्क ऊतक है कि व्यक्तिगत ंयूरॉंस के स्थिर ट्रैकिंग में सक्षम बनाता है के साथ मुक्त इंटरफेस फार्म टाइमस्केल. इस प्रोटोकॉल विवरण एक ठेठ माउस तंत्रिका रिकॉर्डिंग प्रयोग में महत्वपूर्ण कदम सिरिंज इंजेक्शन मेष इलेक्ट्रॉनिक्स का उपयोग कर एक मानक photolithography में जाल इलेक्ट्रॉनिक्स के निर्माण सहित कई विश्वविद्यालयों में संभव प्रक्रिया के आधार पर, लोड हो रहा है मानक केशिका सुई में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स, vivo मेंstereotaxic इंजेक्शन, जाल इनपुट का कनेक्शन/मानक इंस्ट्रूमेंटेशन इंटरफेस करने के लिए, रोका या आज़ादी से चलती रिकॉर्डिंग सत्र, और मस्तिष्क के ऊतकवैज्ञानिक अनुभाग ऊतक मेष इलेक्ट्रॉनिक्स युक्त । प्रतिनिधि तंत्रिका रिकॉर्डिंग और प्रोटोकॉल डेटा प्रस्तुत कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल से परिचित जांचकर्ताओं को अपने स्वयं के प्रयोगों में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स को शामिल करने और अद्वितीय दीर्घकालिक स्थिर तंत्रिका सामना करना पड़ के अवसरों का लाभ लेने के लिए आवश्यक ज्ञान होगा, जैसे उंर बढ़ने के अध्ययन के रूप में प्रक्रियाओं, मस्तिष्क के विकास, और मस्तिष्क की बीमारी के रोगजनन ।

Introduction

एकल ंयूरॉन संकल्प के साथ मस्तिष्क मानचित्रण के लिए सक्षम उपकरणों के विकास तंत्रिका विज्ञान और तंत्रिका विज्ञान के लिए केंद्रीय महत्व का है । electroencephalography (ईईजी), magnetoencephalography (मेग), और कार्यात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (fMRI) के रूप में तंत्रिका अध्ययन के लिए इनवेसिव प्रौद्योगिकियों मानव में व्यवहार के साथ correlating मस्तिष्क गतिविधि के लिए मूल्यवान साबित कर दिया है1, 2, लेकिन वे spatiotemporal संरचना और उनके मौलिक माइक्रोमीटर और मिलीसेकंड तराजू, क्रमशः3,4पर तंत्रिका नेटवर्क की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए आवश्यक संकल्प की कमी है । कुछ electrocorticography (ECoG) जांच और वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों का उपयोग ऑप्टिकल इमेजिंग तरीकों vivo5,6में एकल इकाई spiking गतिविधि रिकॉर्डिंग में सफल रहा है, लेकिन वे आम तौर पर केवल के पास प्रभावी रहे है मस्तिष्क की सतह, उथले मस्तिष्क क्षेत्रों के अध्ययन के लिए प्रयोज्यता सीमित । इसके विपरीत, प्रत्यारोपित विद्युत जांच में एकल ंयूरॉन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपाय कर सकते है आज़ादी से लगभग किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र से फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए आवश्यकता के बिना पशुओं को ले जाने, उंहें सिस्टम के लिए अपरिहार्य स्तर तंत्रिका विज्ञान, विशेष रूप से बना अर्धचालक उद्योग से microfabrication तकनीक के रूप में सैकड़ों और हजारों में चैनल गिनती धकेल दिया है3,7,8,9। इन क्षमताओं के आधार पर, प्रत्यारोपित विद्युत जांच तंत्रिका विज्ञान और तंत्रिका विज्ञान के लिए कई महत्वपूर्ण योगदान दिया है, दृश्य प्रणाली10में सूचना प्रसंस्करण के मौलिक अध्ययन, स्नायविक के उपचार सहित इस तरह के पार्किंसंस रोग11के रूप में विकारों, और मस्तिष्क मशीन इंटरफेस (BMIs) के प्रदर्शन उन्नत कृत्रिमताओं के लिए12,13.

फिर भी, लंबे समय तक अस्थिरता स्पाइक आयाम और14महीने के लिए सप्ताह के timescales पर अस्थिर संकेतों को कम के रूप में प्रकट,15 अपेक्षाकृत अल्पकालिक के अध्ययन के लिए प्रत्यारोपित जांच की प्रयोज्यता सीमित है घटनाएं, जैसे मस्तिष्क उंर बढ़ने और विकास काफी हद तक अनुत्तरित के रूप में सवाल छोड़ । दीर्घकालिक अस्थिरता में सीमाएं पारंपरिक जांच और आकार, यांत्रिकी, और टोपोलॉजी14,15, 16,17,18में मस्तिष्क के ऊतकों के बीच एक बेमेल का परिणाम है । आकार के संदर्भ में, जबकि न्यूरॉन synapses और सोमता nanometers के दसियों व्यास19में micrometers के लगभग दसियों हैं, क्रमशः, पारंपरिक जांच अक्सर काफी बड़ा कर रहे हैं, सिलिकॉन microelectrode arrays के मामले में > 4 बार एक एकल ंयूरॉन कोशिका शरीर के आकार7,8। इन जांचों के अपेक्षाकृत बड़े आकार प्राकृतिक संरचना और घने तंत्रिका ऊतक के संपर्क को बाधित कर सकते हैं, इस प्रकार पुरानी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए योगदान और perturbing तंत्रिका सर्किट का अध्ययन किया जा रहा है । यांत्रिक गुणों के संदर्भ में, पारंपरिक जांच बेहद नरम तंत्रिका ऊतक जिसमें वे प्रत्यारोपित कर रहे है की तुलना में काफी कड़ा कर रहे हैं; यहां तक कि "लचीले" जांच से बना 10-20 polyimide के µm मोटी चादरें कम से १००,००० बार मस्तिष्क ऊतक20,21से कड़ा है । झुकने कठोरता में यह बेमेल जांच और मस्तिष्क ऊतक के बीच रिश्तेदार कतरनी गति का कारण बनता है, विस्तारित रिकॉर्डिंग के दौरान अविश्वसनीय एकल इकाई ट्रैकिंग और आरोपण साइट पर पुरानी gliosis उत्प्रेरण के लिए अग्रणी । अंत में, पारंपरिक मस्तिष्क जांच के टोपोलॉजिकल संरचना जरूरी ऊतक के एक ठोस मात्रा शामिल नहीं है । टोपोलॉजी में ऐसे बेमेल तंत्रिका सर्किट की कनेक्टिविटी बाधित, precludes प्राकृतिक तीन आयामी (3 डी) न्यूरॉन्स, glial कोशिकाओं के प्रवेश वितरण, और मस्तिष्क ऊतक22के भीतर रक्त वाहिकाओं, और के 3 डी परिवहन में बाधा अणुओं23संकेत । एक साथ, पारंपरिक जांच की इन कमियों बना दिया है उंहें दीर्घकालिक संगतता नैदानिक अनुप्रयोगों और अनुदैर्ध्य तंत्रिका विज्ञान अध्ययन के लिए मांग की कम गिरावट के एकल ंयूरॉन स्तर पर ।

इन कमियों को दूर करने के लिए, हम तंत्रिका और इलेक्ट्रॉनिक प्रणालियों के बीच की रेखा को धुंधला "ऊतक की तरह" तंत्रिका जांच के एक नए प्रतिमान के विकास के द्वारा की मांग मेष इलेक्ट्रॉनिक्स16,21,24। मेष इलेक्ट्रॉनिक्स पते आकार, यांत्रिकी में ऊपर मिलान मुद्दों, और टोपोलॉजी शामिल करके (1) एक ही नैनोमीटर के संरचनात्मक सुविधाओं के माइक्रोमीटर आकार पैमाने पर तंत्रिका ऊतक, (2) यांत्रिक मस्तिष्क ऊतक के उन लोगों के लिए इसी तरह के गुण, और (3) एक 3 डी macroporous टोपोलॉजी है कि > 90% खुली जगह है और इस प्रकार extracellular पर्यावरण के माध्यम से ंयूरॉंस और अणुओं के प्रसार द्वारा पैठ को समायोजित । मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच ठीक एक सिरिंज और एक सुई के माध्यम से विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों को दिया जा सकता है, जबकि गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों में भी प्रत्यारोपन21,25न्यूनतम तीव्र क्षति के कारण. न्यूरॉन्स और axons के लिए खुला 3 डी मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच संरचना घुसना करने के लिए दिखाया गया है सप्ताह के बाद इंजेक्शन, जिससे रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रॉनिक्स और आसपास मस्तिष्क ऊतक के बीच एक निर्बाध, gliosis-मुक्त इंटरफेस बनाने21 , 26 , 27. इन अनूठी विशेषताओं के जाल इलेक्ट्रॉनिक्स जांच सक्षम है छुरा से एक ही व्यक्ति ंयूरॉंस से spiking गतिविधि पर ट्रैक करने के लिए कम से एक साल टाइमस्केल27। इसके अलावा, photolithography के आधार पर मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के निर्माण (PL) इलेक्ट्रोड है कि शामिल किया जा सकता की संख्या के उच्च दरिद्रता प्रदान करता है, प्रदर्शन चैनल के साथ गिनती सरल संपर्क मुखौटा का उपयोग कर जांच प्रति १२८ इलेक्ट्रोड के लिए लिथोग्राफी 28 और एक प्लग और प्ले इनपुट/आउटपुट (I/O) डिजाइन कि परिधीय इलेक्ट्रॉनिक्स के लिए रैपिड विद्युत कनेक्शन के लिए विशेष उपकरण के बिना अनुमति देता है29

अध्ययन की एक विस्तृत रेंज माप प्रोटोकॉल में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स को शामिल करने से लाभ हो सकता है । अधिकांश intracortical रिकॉर्डिंग प्रयोगों सिरिंज इंजेक्शन, काफी कम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के माध्यम से मेष इलेक्ट्रॉनिक्स ' न्यूनतम इनवेसिव आरोपण प्रक्रिया से लाभ हो सकता है प्रत्यारोपण के बाद, और में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स छोड़ने की क्षमता एक रिकॉर्डिंग साइट के आसपास के जैविक पर्यावरण के सटीक विश्लेषण के लिए बाद प्रोटोकॉल और immunostaining के दौरान ऊतक । विशेष रूप से पुरानी रिकॉर्डिंग प्रयोगों मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की अद्वितीय क्षमता से मूल्य प्राप्त करने के लिए वर्ष के लिए महीने के लिए व्यक्तिगत ंयूरॉंस की बड़ी संख्या में ट्रैक होगा । इस क्षमता के साथ अध्ययन के लिए अवसर बनाता है एकल ंयूरॉन संकल्प है कि पहले अव्यावहारिक थे, जैसे तंत्रिका सर्किट के अनुदैर्ध्य एजिंग अध्ययन, विकासशील मस्तिष्क की जांच, और पूछताछ के रोगजनन में encephalopathies16.

इस प्रोटोकॉल में, हम एक ठेठ माउस में सभी महत्वपूर्ण कदम का वर्णन तंत्रिका रिकॉर्डिंग प्रयोग सिरिंज इंजेक्शन मेष इलेक्ट्रॉनिक्स का उपयोग कर ( 1 चित्रादेखें) । वर्णित कदम कई विश्वविद्यालयों में एक मानक PL-आधारित प्रक्रिया में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के निर्माण शामिल हैं, मानक केशिका सुई में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स लदान, vivo मेंमेष इलेक्ट्रॉनिक्स के stereotaxic इंजेक्शन, के संबंध मानक इंस्ट्रूमेंटेशन इंटरफेस करने के लिए, रोका या आज़ादी से रिकॉर्डिंग सत्र चलती है, और मेष इलेक्ट्रॉनिक्स युक्त मस्तिष्क ऊतक के ऊतकवैज्ञानिक अनुभाग । कुछ शोधकर्ताओं ने केवल प्रोटोकॉल अध्ययन के लिए मेष इलेक्ट्रॉनिक्स का उपयोग कर बिजली का सामना करना पड़ सकता है और रिकॉर्डिंग की आवश्यकता नहीं है, जो मामले में वे उन कदमों को छोड़ सकते हैं । इस प्रोटोकॉल के साथ खुद को परिचित करने के बाद, जांचकर्ताओं को अपने स्वयं के प्रयोगों में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स का उपयोग करने के लिए आवश्यक सभी ज्ञान होना चाहिए ।

Protocol

हड्डीवाला पशु विषयों पर निष्पादित सभी प्रक्रियाओं को हार्वर्ड विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. मेष इलेक्ट्रॉनिक्स का निर्माण

नोट: इस खंड में वर्णित प्रक्रिया हार्वर्ड विश्वविद्यालय में सेंटर फॉर नेनो सिस्टम्स (सीएनएस) जैसी एक मानक विश्वविद्यालय क्लीन रूम सुविधा के अंदर उपयोग के लिए अभिप्रेत है. इस सुविधा के रूप में अच्छी तरह के रूप में समान सुविधाओं संयुक्त राज्य अमेरिका के आसपास के बाहर उपयोगकर्ताओं के लिए सुलभ हैं, उदाहरण के लिए, राष्ट्रीय नैनो इंफ्रास्ट्रक्चर नेटवर्क (NNIN) राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) द्वारा समर्थित के भाग के रूप में । इन सुविधाओं में, उपकरण, उपकरण, और इस खंड में वर्णित सामग्री के कई स्वच्छ कमरे की सुविधा के लिए उपयोग के साथ प्रदान की जाती है और अलग से खरीद की आवश्यकता नहीं होगी ।

चेतावनी: जाल इलेक्ट्रॉनिक्स के निर्माण में इस्तेमाल रसायनों के कई विरोध, सीडी 26, हटानेवाला स्नातकोत्तर, एसयू 8 डेवलपर, और एनआई नक़्क़ाशी समाधान सहित खतरनाक हैं । उपयोग और लागू करने और हर समय उपयुक्त सुरक्षा उपायों का पालन करने से पहले इन रसायनों के लिए सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (MSDS) से परामर्श करें ।

  1. थर्मल एक साफ एसआई वेफर पर नी के १०० एनएम लुप्त हो जाना ।
    नोट: ठेठ जमाव मानकों के आधार पर दबाव है 5 x 10-7 T और 1 की दर – 2 Å/ नी की पतली परत एक बलि परत है कि बाद में वेफर से मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जारी भंग हो जाएगा के रूप में कार्य करता है ।
  2. एसयू-8 नेगेटिव photoresist (फिगर 2a) के साथ मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के बॉटम passivating लेयर को परिभाषित करने के लिए फर्स्ट पीएल मास्क (पीएल मास्क-1) का प्रयोग करें ।
    नोट: PL एक मानक microfabrication तकनीक है जिसमें पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश एक सहज सब्सट्रेट पर आयोजित एक मुखौटा पर चमकता है । प्रकाश या तो अघुलनशील बनाता है (नकारात्मक विरोध) या घुलनशील (सकारात्मक विरोध) सब्सट्रेट पर उजागर क्षेत्रों. मास्क कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर में तैयार कर रहे है और फिर आम तौर पर एक विक्रेता से आदेश दिया । एक मुखौटा संरेखण एक सब्सट्रेट पर मौजूदा पैटर्न के लिए मास्क संरेखित और उन्हें यूवी प्रकाश को बेनकाब करने के लिए प्रयोग किया जाता है । जाल इलेक्ट्रॉनिक्स के निर्माण चार अलग मास्क (pl मास्क-1 के माध्यम से पीएल मास्क-4) की आवश्यकता है । हमारे मुखौटा डिजाइन अनुरोध द्वारा या संसाधन साइट, meshelectronics.org से उपलब्ध हैं ।
    1. स्पिन-कोट एसयू-8 २०००.५ ४,००० rpm पर वेफर पर एक अनुमानित सु-400 की मोटाई-500 एनएम के लिए नकारात्मक photoresist ।
    2. मुलायम 1 मिनट के लिए एक चूल्हा पर वेफर सेंकना ६५ ° c पर 1 मिनट के बाद डिग्री सेल्सियस ।
    3. एक मुखौटा संरेखण में वेफर लोड करने के लिए PL मुखौटा के साथ एसयू-8 नीचे मेष एसयू-8 परत करने के लिए इसी का पर्दाफाश । एक मैं लाइन पर बेनकाब (३६५ एनएम तरंग दैर्ध्य) १०० माइकल एम/
    4. पोस्ट 1 मिनट के लिए एक चूल्हा पर वेफर ६५ ° c में 1 मिनट के बाद ९५ डिग्री सेल्सियस पर सेंकना ।
    5. सु-8 डेवलपर की एक ट्रे में वेफर विसर्जित कर दिया । धीरे से 2 मिनट के लिए समाधान आंदोलन SU-8 में मेष पैटर्न तक पूरी तरह से विकसित किया गया है । 1 मिनट और झटका सूखी के लिए isopropyl शराब की एक ट्रे में कुल्ला ।
    6. मुश्किल 1 एच के लिए १८० डिग्री सेल्सियस पर एक चूल्हा पर वेफर सेंकना ।
      नोट: SU-8 सामान्य रूप से १५० डिग्री सेल्सियस और २५० डिग्री सेल्सियस के बीच विकास के बाद हार्ड बेक्ड है । हार्ड सेंकना किसी भी सतह दरारें कि विकास के दौरान फार्म और आगे सु-8 crosslinks यांत्रिक स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए कर सकते है anneals । हार्ड पकाना पर १८० ° c के लिए नीचे सु-8 परत और १९० ° c के लिए शीर्ष सु-8 परत पैदावार मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के लिए अच्छा परिणाम है ।
  3. का प्रयोग करें PL मास्क-2 धातु को परिभाषित करने के लिए जोड़ता है और मैं/
    1. स्पिन-कोट ३०० एनएम के एक अनुमानित मोटाई के लिए ४००० rpm पर वेफर पर LOR3A ।
      नोट: LOR3A एक polydimethylglutarimide आधारित प्रतिरोध जो बाद धातुरूप प्रक्रिया के दौरान काटने की गति है ।
    2. 5 मिनट के लिए १८० ° c पर एक चूल्हा पर वेफर सेंकना ।
    3. स्पिन-कोट S1805 ४००० rpm पर ५०० एनएम की अनुमानित मोटाई के लिए सकारात्मक photoresist ।
    4. 1 मिनट के लिए ११५ डिग्री सेल्सियस पर एक चूल्हा पर वेफर सेंकना ।
    5. एक मुखौटा संरेखण में वेफर लोड करने के लिए पी एल मास्क के साथ S1805-2 इसी धातु परस्पर और मैं/ एक एच लाइन पर बेनकाब (४०५ एनएम तरंग दैर्ध्य) ४० माइकल एम की खुराक/
    6. सीडी की एक ट्रे में वेफर विसर्जित-26 photoresist डेवलपर । धीरे से 1 मिनट के लिए समाधान आंदोलन जब तक धातु परस्पर पैटर्न पूरी तरह से विकसित किया गया है । 1 मिनट और झटका सूखी के लिए जल (DI) की एक ट्रे में कुल्ला ।
    7. थर्मल Au के ८० एनएम के बाद सीआर के 3 एनएम लुप्त हो जाना ।
      नोट: के आधार पर दबाव सबसे 5 x 10-7 टी और 1 Å की जमाव दर आम तौर पर सबसे अच्छी फिल्म की गुणवत्ता उपज ।
    8. लगभग 3 जब तक धातु पूरी तरह से काटकर, केवल वांछित आपस में धातु जा रहा है और मैं/O मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के पैड क्षेत्रों को पदच्युत स्नातकोत्तर के एक फ्लैट चोंच में वेफर विसर्जित कर दिया । isopropyl शराब और झटका सूखी में कुल्ला ।
  4. पीटी इलेक्ट्रोड (चित्रा 2c) को परिभाषित करने के लिए PL मास्क-3 का उपयोग करें ।
    1. 1.3.4 के माध्यम से 1.3.1 चरण दोहराएँ ।
    2. पीटी इलेक्ट्रोड के लिए इसी पीएल मास्क-3 के साथ S1805 बेनकाब करने के लिए मुखौटा संरेखण में वेफर लोड. ४० ए. एम. की एक एच लाइन खुराक पर बेनकाब/
    3. सीडी की एक ट्रे में वेफर विसर्जित-26 photoresist डेवलपर । धीरे 1 मिनट के लिए समाधान आंदोलन जब तक पीटी इलेक्ट्रोड पैटर्न पूरी तरह से विकसित किया गया है. 1 मिनट और झटका सूखी के लिए DI की एक ट्रे में कुल्ला ।
    4. पीटी के ५० एनएम के बाद सीआर के 3 एनएम जमा करने के लिए एक इलेक्ट्रॉन बीम वाष्पक का प्रयोग करें ।
      नोट: ठेठ जमाव मानकों के एक आधार दबाव है 5 x 10-7 टी और दर की 2 Å/
    5. लगभग 3 एच के लिए पदच्युत स्नातकोत्तर के एक फ्लैट चोंच में वेफर विसर्जित जब तक धातु पूरी तरह से कम है, केवल वांछित इलेक्ट्रोड मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की साइटों पर पीटी छोड़ने । isopropyl शराब और झटका सूखी में कुल्ला ।
  5. एसयू-8 नेगेटिव photoresist (फिगर 2d) के साथ मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की टॉप passivating लेयर को परिभाषित करने के लिए पीएल मास्क-4 का प्रयोग करें ।
    1. 1.2.5 के माध्यम से 1.2.1 चरणों को दोहराएँ, को छोड़कर पीएल मास्क-4 एसयू-8 के शीर्ष passivating मेष परत करने के लिए इसी के साथ.
    2. मुश्किल 1 एच के लिए १९० डिग्री सेल्सियस पर एक चूल्हा पर वेफर सेंकना ।
      नोट: यह तापमान 10 डिग्री सेल्सियस से अधिक है कि नीचे एसयू-8 (कदम 1.2.6) की हार्ड सेंकना के लिए । यह ऊंचा तापमान थोड़ा नीचे एसयू-8 reflow, जिससे यह शीर्ष एसयू-8 परत के साथ विलय करने के लिए और इस तरह एक एकल, निरंतर एसयू-8 संरचना के रूप में ।
  6. मेष इलेक्ट्रॉनिक्स अब पूरा कर रहे है (चित्रा 2E और चित्रा 3); नी बलि परत भंग करके उन्हें एसआई वेफर से रिहा करो.
    1. 1 मिनट के लिए ५० डब्ल्यू में ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ वेफर समझो । यह हाइड्रोफिलिक और जाल को आसानी से जलीय समाधान में निलंबित होने की अनुमति दे रही है, एसयू-8 सतह ऑक्सीकरण ।
    2. एक फ्लैट चोंच में, हाइड्रोक्लोरिक एसिड, घाट क्लोराइड, और DI 1:1:20 के एक volumetric अनुपात में, क्रमशः, एनआई खोदना का एक समाधान बनाने के लिए गठबंधन ।
    3. मेष इलेक्ट्रॉनिक्स पूरी तरह से एसआई वेफर से जारी किया गया है जब तक लगभग 3 एच के लिए नी नक़्क़ाशी समाधान के एक फ्लैट चोंच में वेफर विसर्जित कर दिया ।
    4. एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें नी खोदना से जारी मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच स्थानांतरण DI के एक १०० मिलीलीटर चोंच के लिए । जाल इलेक्ट्रॉनिक्स के लिए एक ताजा चोंच DI के कम से कम 3 बार धोने सुनिश्चित करने के लिए स्थानांतरण ।
    5. एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के लिए एक 70%/30% इथेनॉल/जल समाधान के लिए स्थानांतरण संक्रमण के लिए, तो पिपेट का उपयोग करने के लिए जाल इलेक्ट्रॉनिक्स धोने के लिए पानी बाँझ हस्तांतरण ।
      नोट: नसबंदी के बाद, मेष इलेक्ट्रॉनिक्स functionalization के लिए अंय समाधान के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, सेलुलर आसंजन को बढ़ावा देने के लिए, मेष इलेक्ट्रॉनिक्स पाली के एक जलीय समाधान के लिए स्थानांतरित किया जा सकता डी-lysine (1 मिलीग्राम/एमएल) 24 एच के लिए ।
    6. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए जाल इलेक्ट्रॉनिक्स जांच बाँझ 1x फास्फेट का एक १०० मिलीलीटर चोंच में स्थानांतरित करने के लिए (पंजाब) vivo मेंइंजेक्शन से पहले ।

2. सुई में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की लोडिंग

  1. पिपेट धारक के रूप में खरीद के लिए दोनों सिरों पर प्रवाह खुला है । epoxy के साथ परिपत्र पेंच बांधनेवाला पदार्थ के विपरीत अंत सील, तो वहां इंजेक्शन के दौरान कोई रिसाव (चित्र 4a) है । आगे बढ़ने से पहले epoxy सख्त चलो ।
  2. पिपेट धारक में एक गिलास केशिका सुई डालें । परिपत्र कस पेंच और शंकु वॉशर (चित्रा 4B) का उपयोग कर जगह में जकड़ना. एक ४०० µm भीतरी व्यास (६५० µm बाहरी व्यास) कांच केशिका सुई इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया गया था । अन्य केशिका सुई सामग्री (जैसे, धातु) और व्यास इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन इंजेक्शन को सुनिश्चित करने के लिए मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के डिजाइन करने के लिए परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है ।
    नोट: केशिका सुई से लेकर १५० µm तक १.१७ मिमी भीतरी व्यास (२५० µm से १.५ मिमी बाहरी व्यास) का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में किया गया है. छोटे सुइयों के माध्यम से इंजेक्शन अनुप्रस्थ और अनुदैर्ध्य एसयू-8 मेष तत्वों और अधिक तीव्र के बीच चौराहे के कोण बनाने के द्वारा पदोंनत किया जा सकता है, एसयू-8 मेष तत्वों की चौड़ाई कम, पतले एसयू-8 का उपयोग कर, और एक मोटे का उपयोग कर (यानी, बड़ा इकाई सेल) मेष संरचना । छोटे केशिका सुई के लिए डिजाइन जाल के लिए Photomasks अनुरोध द्वारा या संसाधन साइट, meshelectronics.org से उपलब्ध हैं । ४०० µm और ५५० µm के बाहरी व्यास के एक भीतरी व्यास के साथ ग्लास केशिका सुई भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । ये तीव्र ऊतक इंजेक्शन की वजह से नुकसान को कम करते हुए एक ४००-µm भीतरी व्यास की आवश्यकता जाल के साथ संगतता बनाए रखने, लेकिन वे यहां वर्णित अध्ययन के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया ।
  3. पिपेट धारक की ओर आउटलेट के लिए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज एक 2-केशिका टयूबिंग के 4 सेमी लंबाई का उपयोग कर देते हैं ।
  4. मेष इलेक्ट्रॉनिक्स युक्त पंजाबियों के १००-एमएल चोंच में ग्लास केशिका सुई डालें । एक मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की जांच के I/O पैड के पास सुई के अंत स्थिति और मैंयुअल रूप से सुई (चित्रा 5 और अनुपूरक वीडियो 1) में एक मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच आकर्षित करने के लिए सिरिंज वापस लेना ।
    नोट: मैं/O पैड, स्टेम क्षेत्र आपस में, और मेष उपकरण क्षेत्र आसानी से नग्न आंखों से पहचाने जाने योग्य है जब मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच समाधान में निलंबित कर रहे हैं । यह सही अभिविन्यास के साथ सुइयों में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के अस्पष्ट लदान में सक्षम बनाता है.
  5. पुश/सिरिंज गोताख़ोर खींच जबकि अभी भी खारा में डूबे सुई के भीतर मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की स्थिति को समायोजित करने के लिए ।
    नोट: आदर्श स्थिति संभव के रूप में सुई के अंत करने के लिए निकट के रूप में ultraflexible मेष डिवाइस क्षेत्र के साथ है । इस विंयास तरल पदार्थ की मात्रा है कि मस्तिष्क में इंजेक्ट किया जाएगा, जबकि डिवाइस क्षेत्र की गारंटी है पहले इंजेक्शन और I/हे पैड पिछले ।
  6. ध्यान से पिपेट धारक की ओर आउटलेट से केशिका टयूबिंग अलग । यह धीरे अलग सुई के भीतर मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की स्थिति को बदल सकता है कि एक चूषण बल बनाने से बचने के लिए ।

3. लाइव माउस मस्तिष्क में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के Stereotaxic इंजेक्शन

नोट: चूहों intraperitoneal इंजेक्शन के मिश्रण के साथ द्वारा anesthetized थे ७५ मिलीग्राम/kg ketamine और 1 मिलीग्राम/kg dexdomitor. संज्ञाहरण की डिग्री पैर की अंगुली चुटकी विधि सर्जरी शुरू करने से पहले के साथ सत्यापित किया गया था । शरीर का तापमान एक ३७ डिग्री सेल्सियस homeothermic कंबल पर जबकि संज्ञाहरण के तहत माउस रखकर बनाए रखा गया था । उचित बाँझ तकनीक सहित सर्जरी के लिए लागू किया गया था, लेकिन उपयोग करने से पहले 1 ज के लिए सभी धातु शल्य चिकित्सा उपकरणों autoclaving करने के लिए सीमित नहीं, निष्फल दस्ताने का उपयोग, सर्जरी भर में एक गर्म मनका नसबंदी का उपयोग कर, एक बाँझ क्षेत्र के रखरखाव सर्जिकल साइट के आसपास, ७०% इथेनॉल के साथ प्लास्टिक उपकरणों के संक्रमण, और depilated खोपड़ी त्वचा iodophor के साथ prepped से पहले चीरा था । अस्तित्व सर्जरी के लिए, सर्जरी के समापन के बाद, antiobiotic मरहम घाव के आसपास लागू किया गया था, और माउस एक ३७ डिग्री सेल्सियस हीटिंग पैड के साथ सुसज्जित पिंजरे में लौट रहा था । चूहों उपेक्षित छोड़ दिया जब तक वे पर्याप्त चेतना को पाने के लिए स्टर्नल recumbency बनाए रखने था नहीं थे । चूहों की एक खुराक पर intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से दिया गया buprenorphine analgesia ०.०५ मिलीग्राम/kg शरीर का वजन हर 12 एच तक के लिए ७२ h सर्जरी के बाद. चूहे सर्जरी के बाद अंय जानवरों से अलग थे । चूहों की एक खुराक पर या तो intraperitoneal इंजेक्शन pentobarbital के माध्यम से euthanized थे २७० मिलीग्राम/kg शरीर का वजन या via transcardial छिड़काव (चरण ६.१ देखें) । जांचकर्ताओं Geiger करने के लिए उल्लेख कर सकते हैं, एट अल. 30, किर्बी, एट अल । ३१, आणि पण, एट अल. ३२ कुतर stereotaxic सर्जरी पर विवरण के लिए ।

  1. माउस को Anesthetize और इसे एक stereotaxic फ्रेम में ठीक करें ।
  2. है माउस आंखों के लिए नेत्र स्नेहक लागू सूखापन को रोकने के लिए जबकि संज्ञाहरण के तहत ।
  3. खोपड़ी पर वांछित निर्देशांक पर एक craniotomy खोलने के लिए एक दंत ड्रिल और stereotaxic फ्रेम का प्रयोग करें । एक दूसरे craniotomy दूर एक स्टेनलेस स्टील के संमिलन के लिए इंजेक्शन साइट से खुला पेंच या तार ।
  4. दंत सीमेंट के साथ खोपड़ी के लिए एक clamping सब्सट्रेट ठीक करें । एक लगभग 1 मिमी चौड़ी खाई सब्सट्रेट में कटौती करने के लिए तह कदम की विश्वसनीयता प्रक्रिया में बाद में सुधार.
    नोट: एक फ्लैट लचीला केबल (FFC) एक "एल" आकार में कटौती अच्छी तरह से (चित्रा 7A) काम करता है, हालांकि कई सामग्री के रूप में वे ३२ चैनल शूंय प्रविष्टि बल (ZIF) संबंधक (०.१८ ± ०.०५ mm मोटी केबल के लिए डिजाइन) के लिए सही मोटाई के है लंबे समय के रूप में काम करेंगे ।
  5. एक सही कोण अंत दबाना (चित्रा 4c और चित्रा 6A) का उपयोग कर stereotaxic फ्रेम पर जाल इलेक्ट्रॉनिक्स युक्त सुई के साथ पिपेट धारक माउंट ।
  6. एक 5 मिलीलीटर एक सिरिंज पंप में बांधा सिरिंज के लिए पिपेट धारक की ओर आउटलेट संलग्न (चित्रा 6D) केशिका टयूबिंग की एक लगभग 0.5-1 मीटर लंबाई का उपयोग कर ।
    नोट: यह पिपेट धारक को जोड़ने से पहले केशिका टयूबिंग में कोई बुलबुले हैं सुनिश्चित करें. बुलबुले इंजेक्शन के दौरान प्रवाह में बाधा और मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के एक चिकनी, नियंत्रित वितरण को रोकने कर सकते हैं ।
  7. मस्तिष्क के भीतर वांछित प्रारंभिक स्थान पर सुई की नोक स्थिति के लिए stereotaxic फ्रेम का प्रयोग करें ।
    नोट: मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच यहां इस्तेमाल किया इलेक्ट्रोड ca .2 मिमी की लंबाई पर फैले और पहले इलेक्ट्रोड के साथ तैयार कर रहे हैं. ०.५ मिमी मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के शुरू किनारे से (बाएं-सबसे बढ़त चित्रा 3ए में) स्थित. इस कारण से, stereotaxic निर्देशांक इस तरह का चयन किया जाना चाहिए कि प्रारंभिक स्थान ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र से ०.५ mm गहरा है. प्रसार और मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के भीतर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के स्थान मुखौटा डिजाइन की प्रक्रिया के दौरान स्वतंत्र रूप से चयनित किया जा सकता है और इसलिए वे अपने stereotaxic साथ इंजेक्शन कर रहे हैं के रूप में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र (ओं) अवधि का चयन किया जाना चाहिए पथ.
  8. कैमरा (चित्रा घमण्ड) की स्थिति कांच सुई के भीतर मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच के शीर्ष प्रदर्शित करने के लिए । कुछ सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता के लिए स्क्रीन पर एक लाइन आकर्षित करने के लिए मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की मूल स्थिति को चिह्नित करने की अनुमति देता है ।
  9. एक कम गति के लिए सिरिंज पंप की स्थापना और दबाने शुरू द्वारा प्रवाह आरंभ करें । 10 मिलीलीटर/एच एक ४०० µm भीतरी व्यास केशिका सुई के लिए एक ठेठ शुरू प्रवाह की दर है । धीरे प्रवाह की दर में वृद्धि अगर मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच सुई के भीतर कदम नहीं है ।
    नोट: यह इंजेक्शन साइट के आसपास के ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में मस्तिष्क में इंजेक्शन द्रव की मात्रा को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. सबसे अच्छा परिणाम इंजेक्शन के साथ प्राप्त कर रहे हैं मात्रा से कम 25 µ एल इंजेक्शन मेष लंबाई के 1 मिमी प्रति. आदर्श मान इस खंड के आधे से कम हैं; हमारी प्रयोगशाला में, हम आम तौर पर एक 4 मिमी प्रति 10-50 µ एल सुई जाल लंबाई इंजेक्शन.
  10. जाल इलेक्ट्रॉनिक्स जांच सुई के भीतर स्थानांतरित करने के लिए शुरू होता है के रूप में, एक गाइड के रूप में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की चिह्नित मूल स्थिति का उपयोग कर, जिसके साथ जाल इलेक्ट्रॉनिक्स जांच इंजेक्ट किया जा रहा है एक ही दर पर सुई वापस करने के लिए stereotaxic फ्रेम का उपयोग करें ।
    नोट: इस प्रक्रिया, दृश्य (FoV) इंजेक्शन विधि25के क्षेत्र में, crumpling या अव्यवस्था के बिना एक लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र के लिए मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के सटीक वितरण के लिए अनुमति देता है । अक्सर प्रवाह की दर कम किया जा सकता है एक बार मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच सुई के भीतर चलती शुरू होता है । हमारी प्रयोगशाला में, 20-30 मिलीलीटर/एच के प्रवाह की दर अक्सर मेष और केशिका सुई दीवारों के बीच स्थिर घर्षण को दूर करने के लिए आवश्यक हैं, लेकिन इंजेक्शन प्रक्रिया शुरू की गई है एक बार दर फिर 10 मिलीलीटर/एच करने के लिए कम किया जा सकता है । प्रवाह दरों और इंजेक्शन मात्रा आमतौर पर छोटे व्यास केशिका सुई के लिए छोटे हैं ।
  11. खारा बहने जारी रखें और सुई वापस लेने तक सुई खोपड़ी से बाहर निकल गया है । सिरिंज पंप से प्रवाह बंद करो ।

4. इनपुट/

नोट: इस बिंदु पर, मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच चुना पथ के साथ मस्तिष्क के भीतर वांछित प्रारंभिक बिंदु से इंजेक्ट किया गया है । सुई मुकर गया है और अभी भी सुई (चित्रा 7B) के अंदर सुई और मैं/हे पैड के लिए मस्तिष्क से फैले जाल इलेक्ट्रॉनिक्स के साथ craniotomy से ऊपर है... इस अनुभाग का उपयोग करता है एक मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी; चित्रा 7, चित्रा 8) मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच करने के लिए इंटरफेस करने के लिए । पीसीबी एक ३२-एक अछूता सब्सट्रेट कि तंत्रिका रिकॉर्डिंग प्रयोगों के लिए सिर चरण बन जाता है के माध्यम से चैनल मानक एम्पलीफायर कनेक्टर के लिए एक ZIF कनेक्टर जोड़ता है. पीसीबी विभिन्न सिर चरण विन्यास को समायोजित करने के लिए अनुकूलन योग्य है. हमारे डिजाइन फ़ाइलें अनुरोध या संसाधन वेबसाइट, meshelectronics.org से उपलब्ध हैं, और पीसीबी निर्माण और विधानसभा सेवाओं के विक्रेताओं से पीसीबी सस्ते में खरीद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. stereotaxic फ्रेम का प्रयोग ध्यान से FFC को सुई clamping सब्सट्रेट करने के लिए और अंतराल के पार, के लिए जाल इलेक्ट्रॉनिक्स संयोजी (चित्रा 7C) में सुस्त उत्पंन सिरिंज पंप के साथ समाधान बह ।
  2. एक बार सुई clamping सब्सट्रेट ऊपर है और अंतराल के पार, एक तेज दर पर प्रवाह को फिर से शुरू करने के लिए जाल इलेक्ट्रॉनिक्स बाहर clamping सब्सट्रेट (आंकड़ा 7d) पर/
  3. चिमटी और एक पिपेट DI का उपयोग कर, i/o पैड ca करने के लिए बेंड. ९० ° कोण संभव के रूप में पहले i/ओ पैड के करीब के रूप में ।
    नोट: झुकने पैड एक बाद में एक कदम में पीसीबी पर ZIF कनेक्टर में सम्मिलित किया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है । ZIF कनेक्टर बिल्कुल एक ही चौड़ाई के रूप में है ३२ मैं/O मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच के पैड, तो एक अपूर्ण ९० ° मोड़, या एक मोड़ सही पहले मैं/o पैड से पहले होने वाली नहीं है, के लिए रवाना हो कटौती करने में परिणाम होगा मैं/o पैड ( चित्रा 7Eमें छोड़ दिया सबसे पैड) ।
  4. एक बार मैं/O पैड गठबंधन कर रहे हैं, सामने आया, और एक ९० ° कोण पर मेष स्टेम करने के लिए, उंहें धीरे से संकुचित हवा बह के साथ जगह में शुष्क ।
    नोट: मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच से कम ३२ चैनलों के साथ एक ही ३२ चैनल अंतरफलक बोर्ड के साथ इंटरफेस किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला सामांयतः ३२ चैनल पीसीबी के साथ 16 चैनल मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच का उपयोग करता है । इस ZIF कनेक्टर के भीतर अतिरिक्त स्थान प्रदान करता है, का सामना करना पड़ आसान है, और अतिरिक्त संपर्क चैनल आसानी से रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान प्रतिबाधा परीक्षण के माध्यम से खुले सर्किट के रूप में पहचान कर रहे हैं.
  5. एक सीधे किनारे पर clamping सब्सट्रेट कट लगभग 0.5-1 मिमी के किनारे से I/O पैड । इसके अलावा बंद clamping सब्सट्रेट है कि पीसीबी में सम्मिलन बाधा होगी के बाहरी भागों में कटौती-३२ चैनल ZIF कनेक्टर (चित्रा 7F) ।
  6. ZIF कनेक्टर में पीसीबी पर मैं/O पैड डालें और कुंड (चित्रा 7G) को बंद करें । चैनलों और जमीन पेंच सफल सामना की पुष्टि करने के लिए के बीच प्रतिबाधा को मापने के लिए माप इलेक्ट्रॉनिक्स का उपयोग करें. प्रतिबाधा मान बहुत अधिक हैं, तो ZIF कनेक्टर unlatch, सम्मिलन समायोजित करें, और सफल कनेक्शन की पुष्टि की है जब तक पुनर्परीक्षण ।
  7. कवर ZIF कनेक्टर और उजागर मेष इलेक्ट्रॉनिक्स सुरक्षा के लिए दंत सीमेंट के साथ परस्पर जोड़ता है । सब्सट्रेट में अंतर में पीसीबी फ्लिप, और माउस खोपड़ी पर सीमेंट के साथ पीसीबी तय (चित्रा 7H).
    नोट: इस अंतर पर FFC झुकने यांत्रिक तनाव है कि कभी कभार मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जोड़ता है तोड़ सकते है कम कर देता है ।
  8. सीमेंट को सख्त करने की अनुमति दें, बाद में रिकॉर्डिंग सत्रों (चित्रा 7I) के दौरान सामना करने के लिए एक मजबूत, कॉम्पैक्ट सिर चरण में पीसीबी बदल ।

5. तंत्रिका रिकॉर्डिंग प्रयोगों

  1. माउस को किसी tailveiner या अंय निरोधी३३में रखें । प्रमुख चरण पीसीबी पर मानक एंपलीफायर संबंधक में एम्पलीफायर पीसीबी डालें... संदर्भ पेंच जमीन के लिए एक अलग केबल का उपयोग करें ।
  2. नियंत्रित रिकॉर्डिंग के लिए, छलनी में माउस छोड़ दें । डेटा प्राप्ति प्रणाली का उपयोग कर डेटा को वांछित समयावधि के लिए रिकॉर्ड (figure 8A).
  3. आज़ादी से चलती रिकॉर्डिंग के लिए, निरोधक पीसीबी और संदर्भ पेंच ग्राउंडिंग डालने के बाद छलनी से माउस को रिहा. समय की वांछित लंबाई के लिए रिकॉर्ड डेटा अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग करते हुए माउस स्वतंत्र रूप से व्यवहार करता है (चित्रा 8B) ।
  4. रिकॉर्डिंग सत्र के अंत में, माउस वापस निरोधक में डाल दिया, यदि आवश्यक हो । जमीनी तार और एम्पलीफायर निकालें, तो वापस अपने पिंजरे के लिए माउस जारी है और यह अगले रिकॉर्डिंग सत्र तक पशु सुविधा के लिए वापस ।

6. ऊतकवैज्ञानिक अनुभाग, धुंधला, और इमेजिंग

  1. इच्छित समय तक प्रतीक्षा करें इंजेक्शन के बाद, फिर माउस anesthetize और transcardially perfuse के साथ formaldehyde. निकालें, फ्रीज, और 10-µm मोटी स्लाइस में मस्तिष्क cryosection । immunohistochemistry और मूषक मस्तिष्क ऊतक के cryosectioning पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल Evilsizor, एट अलमें पाया जा सकता है । ३४.
    नोट: जाल इलेक्ट्रॉनिक्स युक्त मस्तिष्क ऊतक तय किया जा सकता है और सामान्य रूप से खोदी, भले ही निगरानी इलेक्ट्रॉनिक्स के अंदर छोड़ दिया जाता है. यह एक अद्वितीय पारंपरिक तंत्रिका जांच की तुलना में क्षमता है, जो अनुभाग से पहले हटा दिया जाना चाहिए और इसलिए ऊतक को संशोधित करने या यह मुश्किल जांच ऊतक इंटरफेस का विश्लेषण कर सकते हैं ।
  2. 1x पंजाब में जमे हुए मस्तिष्क ऊतक वर्गों 3 बार कुल्ला ।
  3. 1x पंजाब में ०.३% ट्राइटन X-१०० और 5% बकरी सीरम के समाधान में अनुभागों को ब्लॉक करें । 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं ।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी के समाधान के साथ वर्गों मशीन । यहां इस्तेमाल प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान खरगोश विरोधी NeuN (1:200 कमजोर पड़ने), माउस विरोधी Neurofilament (1:400 कमजोर पड़ने), और चूहे विरोधी GFAP (1:500 कमजोर पड़ने) ०.३% ट्राइटन एक्स-१०० और 3% बकरी सीरम के साथ थे । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  5. 1x पंजाबियों के साथ ४० मिनट की कुल के लिए 9 बार वर्गों कुल्ला ।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी के समाधान के साथ मस्तिष्क वर्गों की मशीन । माध्यमिक एंटीबॉडी यहां इस्तेमाल किया समाधान alexa Fluor ४८८ बकरी विरोधी खरगोश (1:200 कमजोर पड़ने) थे, alexa Fluor ५६८ बकरी विरोधी माउस (1:200 कमजोर पड़ने), और alexa Fluor ६४७ बकरी विरोधी चूहा (1:200 कमजोर पड़ने) । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए वर्गों की मशीन ।
  7. 1x पंजाबियों के साथ 30 मिनट की कुल के लिए वर्गों 9 बार कुल्ला ।
  8. antifade mounter का उपयोग coverslips के साथ कांच स्लाइड पर वर्गों माउंट । इमेजिंग से पहले कम से 24 ज के लिए अंधेरे में स्लाइड छोड़ दें ।
  9. छवि ४८८ एनएम, ५६१ एनएम का उपयोग कर एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड, और alexa Fluor ४८८, alexa Fluor ५६८, और alexa Fluor ६४७, क्रमशः के लिए उत्तेजना सूत्रों के रूप में ६३३ एनएम पराबैंगनीकिरण । छवि और विश्लेषण के बाद ओवरले के लिए एक ही माइक्रोस्कोप पर जाल इलेक्ट्रॉनिक्स के लिए अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) का प्रयोग करें ।

Representative Results

परिणाम अध्ययन में पशु प्रजातियों के आधार पर भिंन होगा, लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र, इंजेक्शन के बाद से गुजरा समय, तीव्र नुकसान की मात्रा इंजेक्शन के दौरान दण्डित, और मैं/O के सामने की प्रक्रिया की सफलता, अंय कारकों के बीच । एकल इकाई spiking गतिविधि 1 दिन (१५० µm भीतरी व्यास सुइयों के मामले में) 1 सप्ताह तक इंजेक्शन और स्पाइक आयाम के लिए 4-6 सप्ताह के लिए भिंन हो सकते है जब तक प्रकट नहीं हो सकता है । 9 चित्रा एक ३२ चैनल मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच से प्रतिनिधि electrophysiological डेटा से पता चलता है हिप्पोकैम्पस और एक वयस्क पुरुष C57BL के प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था में इंजेक्शन/6J माउस । लगभग ३००-µV आयाम स्थानीय क्षेत्र क्षमता (LFPs) सभी ३२ चैनलों पर दर्ज किया गया और एकल इकाई spiking गतिविधि 26 चैनलों पर दर्ज किया गया था । LFPs और पृथक spikes के बीच इसी तरह बनी रही 2 और 4 महीने, इस विस्तारित समय अवधि में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रॉनिक्स और न्यूरॉन्स के बीच एक अत्यधिक स्थिर इंटरफेस का सुझाव. चित्रा 10 ऊतकवैज्ञानिक अनुभाग के प्रतिनिधि परिणाम और इंजेक्शन के बाद 1 वर्ष मेष इलेक्ट्रॉनिक्स युक्त मस्तिष्क ऊतक के immunostaining से पता चलता है. NeuN के लिए धुंधलाना, तंत्रिका सोमता के लिए एक मार्कर, और neurofilament, तंत्रिका axons के लिए एक मार्कर, इंजेक्शन साइट पर ऊतक घनत्व का कोई नुकसान करने के लिए थोड़ा पता चलता है, सहज मेष इलेक्ट्रॉनिक्स और मस्तिष्क ऊतक के बीच का सामना करना पड़ मतलब. GFAP के लिए दाग (astrocytes के लिए एक मार्कर) आगे मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के आसपास astrocytes की पृष्ठभूमि के स्तर का पता चलता है, यह दर्शाता है कि अपनी उपस्थिति थोड़ा पुरानी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बटोरता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एक सिरिंज इंजेक्शन मेष इलेक्ट्रॉनिक्स प्रयोग में कदम । इस प्रोटोकॉल मेष इलेक्ट्रॉनिक्स का उपयोग कर एक ठेठ कुतर तंत्रिका रिकॉर्डिंग प्रयोग में सभी महत्वपूर्ण कदम का वर्णन । प्रयोगों आमतौर पर, लागू करने के क्रम में, (1) जाल इलेक्ट्रॉनिक्स के निर्माण, (2) केशिका सुई में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के लोड हो रहा है, (3) मस्तिष्क में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के stereotaxic इंजेक्शन, (4) विद्युत मैं/ इलेक्ट्रॉनिक्स, (5) रोका या स्वतंत्र रूप से चलती रिकॉर्डिंग, और (6) मेष/ऊतक अनुभाग और प्रोटोकॉल के लिए धुंधला । कुछ अध्ययनों में, केवल प्रोटोकॉल डेटा वांछित हो सकता है, जो मामले में कदम (4) और (5) छोड़ दिया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: योजनाबद्ध ultraflexible डिवाइस क्षेत्र (शीर्ष पंक्ति) में प्लग और प्ले मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के लिए निर्माण प्रक्रिया का चित्रण, स्टेम क्षेत्र (मध्य पंक्ति), और I/O क्षेत्र (नीचे पंक्ति) जोड़ता है । (A) SU-8 नकारात्मक photoresist (लाल) PL मास्क के साथ patterned है-1 प्रत्येक प्लग और प्ले मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच के नीचे passivating परत को परिभाषित करने के लिए । () PL मास्क के साथ patterning-2, थर्मल वाष्पीकरण, और धातु लिफ्ट बंद परिभाषित Au परस्पर और I/ओ पैड (सोना) । () PL मास्क के साथ पैटर्न-3, इलेक्ट्रॉन बीम वाष्पीकरण, और धातु लिफ्ट से परिभाषित पीटी इलेक्ट्रोड (नीला) । (D) SU-8 निगेटिव photoresist (red) को पीएल मास्क-4 के साथ पैटर्न लगाया जाता है जो टॉप passivating लेयर को परिभाषित करते हैं । एसयू-8 में उद्घाटन प्रत्येक पीटी इलेक्ट्रोड पर छोड़ दिया और मैं/ () ऊपर, मध्य, और नीचे पंक्तियों में बढ़े स्थानों का संकेत धराशायी बक्से के साथ एक पूरा जाल इलेक्ट्रॉनिक्स जांच । Photomask डिज़ाइन फ़ाइलें लेखकों या संसाधन साइट, meshelectronics.org से अनुरोध द्वारा उपलब्ध हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: फोटो और प्लग और खेल मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवियों । (एक) प्लग के साथ एक सिरिंज इंजेक्शन मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की जांच की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवियों टाइल और खेलने मैं/ जांच चित्रा 2 में निर्माण कदम के पूरा होने के बाद छवि थी, लेकिन नी लेपित सब्सट्रेट से रिहाई के लिए पहले । डैश्ड बॉक्स बाएं से दाएं ultraflexible डिवाइस क्षेत्र, स्टेम, और I/O क्षेत्र के अनुभागों के लिए क्रमशः C, D, और E, में बढ़ाया के अनुरूप है । स्केल बार = 1 मिमी. () एक 3 इंच Si 20 पूरा जाल इलेक्ट्रॉनिक्स की जांच युक्त वेफर की तस्वीर । स्केल बार = 20 मिमी. () ultraflexible डिवाइस क्षेत्र में 20 µm व्यास पीटी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि. स्केल बार = १०० µm. () उच्च घनत्व Au की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि स्टेम क्षेत्र में परस्पर जोड़ता है । प्रत्येक Au आपस में अलग है और एक एकल पीटी इलेक्ट्रोड जोड़ता है एक एकल मैं/ स्केल बार = १०० µm. () मैं/ओ पैड की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि । प्रत्येक पैड एक सिमटने मेष क्षेत्र और एक निरंतर पतली फिल्म स्टेम पर स्थित क्षेत्र के होते हैं । गैर किा SU-8 रिबन पैड के जाल भागों को एक साथ कनेक्ट करने में मदद संरेखण बनाए रखने के लिए । स्केल बार = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 4
चित्रा 4: इंजेक्शन के दौरान केशिका सुई पकड़ के लिए उपकरण के विधानसभा । () तंत्र के घटकों की तस्वीर । घटकों में शामिल है (1) एक गिलास केशिका सुई, (2) एक पिपेट धारक, (3) पिपेट धारक के लिए एक परिपत्र पेंच बांधनेवाला पदार्थ, और (4) पिपेट धारक के लिए एक शंकु वॉशर । आइटम (2) के माध्यम से (4) एक पिपेट धारक की खरीद के साथ शामिल हैं । तीर पिपेट धारक जो epoxy के साथ बंद चिपके रहने की जरूरत के आउटलेट के निशान । () विधानसभा और एक गिलास केशिका सुई की प्रविष्टि के बाद पिपेट धारक की तस्वीर । जोड़ा epoxy पिपेट धारक के शीर्ष आउटलेट पर दिखाई दे रहा है (तीर से चिह्नित) और केशिका ट्यूबिंग एक सिरिंज को पिपेट धारक जोड़ता है (नहीं दिखाया गया है) । () एक सही कोण अंत दबाना के साथ stereotaxic फ्रेम करने के लिए लगाव के बाद पिपेट धारक और केशिका सुई की तस्वीर । स्केल पट्टियां 1 सेमी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए

Figure 5
चित्रा 5: ग्लास सुई में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की लोडिंग । (A) प्लग के लिए लोडिंग प्रक्रिया के योजनाबद्ध चित्रण और खेल मेष इलेक्ट्रॉनिक्स । यह समाधान में निलंबित कर दिया है, जबकि एक गिलास सुई एक मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच के I/O अंत के पास तैनात है । सिरिंज गोताख़ोर तो मैन्युअल रूप से मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच में आकर्षित करने के लिए मुकर जाता है. आदर्श स्थिति बस सुई के अंत के अंदर ultraflexible डिवाइस क्षेत्र के साथ है । () एक जाल इलेक्ट्रॉनिक्स जांच की इसी (एक) के लिए एक गिलास सुई में लोड किया जा रहा तस्वीरें । स्केल पट्टियां = 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 6
चित्रा 6: stereotaxic सर्जरी स्टेशन के योजनाबद्ध । एक मोटर चालित stereotaxic फ्रेम (एक) संलग्न पिपेट धारक के साथ वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में सुई की स्थिति के लिए प्रयोग किया जाता है । सुई और भरी हुई मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की स्थिति एक उद्देश्य लेंस और संलग्न कैमरा () के साथ नजर रखी है और एक कंप्यूटर (सी) पर प्रदर्शित कर रहे हैं । एक सिरिंज पंप (डी) सुई के माध्यम से खारा की सटीक मात्रा में बहती है, वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में सटीक, मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की नियंत्रित इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: प्लग और प्ले I/ओ का सामना करना पड़ प्रक्रिया । () एक FFC clamping सब्सट्रेट दंत craniotomy से सटे सीमेंट के साथ सुरक्षित है । () प्लग और खेल मेष इलेक्ट्रॉनिक्स stereotaxically FoV विधि का उपयोग कर वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में इंजेक्ट कर रहे हैं । () सुई, जाल इलेक्ट्रॉनिक्स जांच के I/ओ पैड के साथ अभी भी अंदर, FFC clamping सब्सट्रेट पर स्थिति है । () प्रवाह सुई के माध्यम से फिर से शुरू होता है FFC clamping सब्सट्रेट पर I/ओ पैड बेदखल । () I/O पैड स्टेम के सापेक्ष ९० ° तुला रहे हैं, का सामना करना पड़ पक्ष के साथ सामने आया, और जगह में सूख गया । () FFC सब्सट्रेट कैंची के साथ एक सीधी लाइन सीए के लिए छंटनी की है. I/O पैड के किनारे से ०.५ मिमी. अतिरिक्त सब्सट्रेट एक ३२-चैनल ZIF कनेक्टर में प्रविष्टि की अनुमति देने के लिए दूर कट जाता है. (G) I/O पैड एक ३२-चैनल ZIF कनेक्टर एक कस्टम पीसीबी पर घुड़सवार में सम्मिलित किए गए हैं । ZIF कनेक्टर मैं/O पैड के साथ संपर्क बनाने के लिए बंद कुंडी है । () कुंडी बंद सीमेंटेड है, पीसीबी खोपड़ी पर पलटे है, और पीसीबी जगह में दंत सीमेंट के साथ तय की है । (I) पीसीबी रूपों रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान आसान सामना के लिए एक मानक एम्पलीफायर संबंधक के साथ एक कॉम्पैक्ट headstage. स्केल बार्स = 1 सेमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Figure 8
चित्रा 8: रोका और स्वतंत्र रूप से चलती रिकॉर्डिंग । () एक रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान एक निरोधक में एक पुरुष C57BL/6J माउस की तस्वीर । एक ३२ चैनल एम्पलीफायर पीसीबी मानक एम्पलीफायर संबंधक में डाला गया है. () एक स्वतंत्र रूप से चलती रिकॉर्डिंग प्रयोग के दौरान ३२ चैनल एम्पलीफायर पीसीबी के साथ एक ही माउस की तस्वीर. स्केल बार्स = 1 सेमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Figure 9
चित्र 9: प्रतिनिधि तंत्रिका रिकॉर्डिंग परिणाम । () प्रतिनिधि LFP हीट मैप्स से ३२-चैनल मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच माउस हिप्पोकैम्पस और somatosensory प्रांतस्था में इंजेक्शन । डेटा रिकॉर्ड किया गया जबकि माउस स्वतंत्र रूप से 2 महीने (ऊपर) और 4 महीने (नीचे) पोस्ट इंजेक्शन में अपने पिंजरे का पता लगाया । LFP आयाम रंग है-सही पर रंग पट्टी के अनुसार कोडित । spiking गतिविधि दिखा उच्च-पास फ़िल्टर किए गए निशान (काला) ३२ चैनलों में से प्रत्येक के लिए spectrogram पर मढ़ा जाता है । () में प्लॉट किए गए डेटा को सॉर्ट करने के बाद अलग spikes (A) । एकल-इकाई spiking गतिविधि का पता लगाया गया 26 पर ३२ चैनलों दोनों 2 महीने के बाद इंजेक्शन (ऊपर) और 4 महीने के बाद इंजेक्शन (नीचे) । spikes के प्रत्येक क्लस्टर के ऊपर की संख्या (A) में चैनल संख्या के अनुरूप हैं । यह आंकड़ा फू, एट अल से संशोधित किया गया है । 28. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 10
चित्र १०: प्रतिनिधि प्रोटोकॉल परिणाम. (A) क्षैतिज (मध्य पैनल) और sagittal (नीचे पैनल) मस्तिष्क स्लाइस के भीतर मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के उंमुखीकरण illustrating योजनाबद्ध । () एक 10 µm मोटी cortical मस्तिष्क के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप छवि एक साल के इंजेक्शन के बाद एक 16 चैनल मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच टुकड़ा । स्लाइस को NeuN (green) के लिए immunostained गया है । () neurofilament (लाल) के लिए एक ही ब्रेन स्लाइस immunostained. () GFAP (सियान) के लिए एक ही ब्रेन स्लाइस immunostained. () (ख) के माध्यम से (घ) के एक समग्र छवि NeuN लेबल (हरा), neurofilament (लाल), GFAP (सियान), और मेष इलेक्ट्रॉनिक्स (नीला) के साथ मेष इलेक्ट्रॉनिक्स/ स्केल बार्स = १०० µm । यह आंकड़ा फू एट अल से संशोधित किया गया है । 27. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

अनुपूरक वीडियो 1: दोहराया लोड हो रहा है और समाधान में मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के इंजेक्शनकृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Discussion

निर्माण और मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के उपयोग में सभी कदम महत्वपूर्ण हैं, लेकिन कुछ विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं । उनके वेफर से मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जारी करने से पहले, यह सतह ऑक्सीकरण करने के लिए आसानी से जलीय समाधान (step 1.6.1) में निलंबित जाल बनाने के लिए आवश्यक है । यदि यह चरण छोड़ दिया है, मेष आमतौर पर पानी की सतह पर नाव, उंहें सुई में लोड करने के लिए मुश्किल बना रही है, और यदि वे लोड किया जा सकता है, वे अक्सर कांच सुई के पक्षों के लिए छड़ी, बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है (> 100 µ एल) इंजेक्शन के लिए । रिहाई से पहले सतह ऑक्सीकरण करने के लिए विफलता, इसलिए, आम तौर पर इसका मतलब है कि मेष और इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है निर्माण फिर से शुरू से प्रदर्शन किया जाना चाहिए । एक और महत्वपूर्ण कदम मेष इलेक्ट्रॉनिक्स झुका है "स्टेम" ~ ९० ° के दौरान I/O सामना करना पड़ रहा है (४.३ कदम) । कोण ९० ° से कम है, तो सभी ३२ मैं/O पैड ZIF कनेक्टर में फिट नहीं होगा; कुछ को अंत में कटौती करने के लिए प्रविष्टि की अनुमति होगी, जुड़े इलेक्ट्रोड की संख्या को कम करने । प्रक्रिया भी धीरे से स्टेम को तोड़ने से रोकने के लिए किया जाना चाहिए ।

मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के डिजाइन photomasks को संशोधित करने और एक ही निर्माण 2 चित्रामें उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग करके विभिंन अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, जबकि मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच चित्रा 9 में डेटा रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया ३२ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड है डिजाइन किए गए थे माउस हिप्पोकैम्पस और प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था, इलेक्ट्रोड स्थान ultraflexible मेष के भीतर हो सकता है वस्तुतः किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र (ओं) को लक्षित करने के लिए चयनित, या उत्तेजना के लिए बड़ा इलेक्ट्रोड27शामिल किया जा सकता है । एक ही मूल जाल संरचना और निर्माण की प्रक्रिया को बनाए रखा है, लेकिन इलेक्ट्रोड स्थान और डिजाइन अध्ययन की जरूरतों को पूरा करने के लिए समायोजित कर रहे हैं. जांचकर्ताओं सावधानी का उपयोग करना चाहिए, तथापि, और हमेशा परीक्षण है कि संशोधित डिजाइन इरादा सुई के माध्यम से आसानी से इंजेक्ट किया जा सकता है । मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के झुकने यांत्रिकी के लिए छोटे परिवर्तन इंजेक्शन पर पर्याप्त प्रभाव हो सकता है । ऐसा ही एक उदाहरण है कि एक ४५ ° कोण अनुप्रस्थ और अनुदैर्ध्य SU-8 रिबन के बीच एक मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच है कि facilely इंजेक्ट किया जा सकता है, लेकिन एक ९० डिग्री कोण परिणाम में एक है कि निचोडकर और सुइयों21सुई रोकना पैदावार ।

की प्रतिबाधा को मापने रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड समस्या निवारण के लिए उपयोगी है । एक 20-µm व्यास परिपत्र पीटी इलेक्ट्रोड एक प्रतिबाधा परिमाण के पास होना चाहिए 1 MΩ जब vivo में एक आवृत्ति 1 kHz या 1x में मापा29. यह मतलब है कि इलेक्ट्रोड उजागर नहीं है से काफी बड़ा प्रतिबाधा, के रूप में अगर यह photoresist अवशेषों के साथ दूषित है, या बिजली से जुड़ा नहीं हो सकता है. उत्तरार्द्ध हो सकता है यदि, उदाहरण के लिए, वहां धूल है कि PL में एक डिस्कनेक्ट में परिणाम के दौरान फोटो मास्क पर है, या एक जाल मैं/o पैड से संपर्क नहीं है ZIF कनेक्टर पिन के दौरान i/o सामना करना पड़ रहा है । एक प्रतिबाधा परिमाण मोटे तौर पर आधा अपेक्षित मूल्य पता चलता है कि चैनल आसंन एक करने के लिए कम हो सकता है, एक दूसरे के समानांतर में दो इलेक्ट्रोड impedances के एक सर्किट बनाने. मापा प्रतिबाधा मान समस्या निवारण के दौरान एक मार्गदर्शिका के रूप में कार्य; मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की जांच की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त, समस्या का स्रोत आमतौर पर पहचाना जा सकता है और अगले निर्माण चलाने या मैं में तदनुसार सही/

तीव्र अध्ययन के लिए सिरिंज इंजेक्शन मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के उपयोग में सीमित है कि एक इकाई spiking गतिविधि आमतौर पर 1 सप्ताह पोस्ट इंजेक्शन27तक नहीं मनाया जाता है, हालांकि हाल ही में काम (अप्रकाशित) से पता चलता है कि इस मुद्दे को आसानी से दूर है । spiking गतिविधि को देखने के लिए आवश्यक समय के प्रमुख निर्धारकों जाल डिजाइन कर रहे हैं, तरल पदार्थ की मात्रा मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के साथ मस्तिष्क में इंजेक्शन, और इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल सुई के व्यास, इन के दौरान ऊतक क्षति की डिग्री को प्रभावित के रूप में इंजेक्शन और उपचार की दर । बड़े इंजेक्शन मात्रा की आवश्यकता हो सकती है अगर मेष इलेक्ट्रॉनिक्स ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ एनआई नक़्क़ाशी में रिलीज करने से पहले इलाज नहीं कर रहे हैं; यही नहीं, अगर मेष हाइड्रोफिलिक नहीं है तो यह शीशे की सुई का पालन कर सकता है । कभी कभार, जाल दोष है कि झुकने यांत्रिकी जो उन्हें इंजेक्षन करने के लिए मुश्किल बनाने के लिए नेतृत्व किया है. मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की लोडिंग के दौरान, यह है कि जाल आसानी से और सुचारू रूप से सुई के भीतर बढ़ रहे है की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है (के रूप में अनुपूरक वीडियो 1में दिखाया गया है) । यदि नहीं, तो एक अलग जाल इलेक्ट्रॉनिक जांच का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । निर्बाध तंत्रिका सामना के लिए सबसे अच्छा परिणाम 10 के आदर्श इंजेक्शन संस्करणों के साथ प्राप्त किया जाएगा-50 µ एल इंजेक्शन मेष लंबाई के 4 मिमी प्रति । महीन मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच के साथ और अधिक हाल के परिणामों के इंजेक्शन और/या छोटे व्यास केशिका सुई (के रूप में छोटे रूप में १५० µm भीतरी व्यास, २५० µm बाहरी व्यास) एक इकाई spiking इंजेक्शन (तीव्र माप) के बाद शीघ्र ही से मनाया जा सकता है कि दिखा लंबे समय के माध्यम से । मुखौटा डिजाइन फ़ाइलें इन महीन मेष संरचनाओं के लिए अनुरोध या संसाधन वेबसाइट, meshelectronics.org से उपलब्ध हैं । हम ४०० µm भीतरी व्यास (६५० µm बाहरी व्यास) सुइयों का उपयोग कर vivo मेष इंजेक्शन प्रक्रियाओं में हमारे समग्र उपज का अनुमान ७०% के आसपास हो, हालांकि उपज 80 के करीब है-१५० µm भीतरी व्यास के साथ हमारे और अधिक हाल के काम के लिए 90% (२५० µm बाहरी व्यास सुई. विफलता के लिए सबसे आम कारण हैं (1) कि मेष सुचारू रूप से सुई नहीं करता है, मस्तिष्क में अप्रत्याशित रूप से बड़े इंजेक्शन संस्करणों से मस्तिष्क शोफ में जिसके परिणामस्वरूप, मैनुअल हेरफेर के दौरान (2) जाल टूटना मैं/ओ के सामने आवश्यक प्रक्रिया, और (3) इंजेक्शन के दौरान एक रक्त वाहिका हानिकारक से खून बह रहा. इंजेक्शन के दौरान एक रक्त वाहिका हानिकारक दुर्लभ है (विफलताओं के 10% से कम के कारण) और छवि निर्देशित सर्जरी का उपयोग करके आगे कम किया जा सकता है. हम यह भी ध्यान दें कि रक्त वाहिकाओं की क्षति अभिकर्मक के लिए वायरल कणों के इंजेक्शन सहित मस्तिष्क के ऊतकों, के प्रवेश को शामिल प्रक्रियाओं की एक आम सीमा है, कठोर मस्तिष्क जांच के आरोपण, और मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के इंजेक्शन ।

मेष इलेक्ट्रॉनिक्स जांच से छुरा रिकॉर्ड कर रहे है और एक ही व्यक्ति ंयूरॉंस ट्रैक करने के लिए कम से timescales वर्ष के लिए महीने और लगभग कोई पुरानी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आह्वान, के रूप में चित्र 9 और 10 चित्रा, क्रमशः में प्रदर्शन किया । यह एक महत्वपूर्ण लाभ का प्रतिनिधित्व करता है कन्वेंशन गहराई इलेक्ट्रोड, जो सामान्यतः कम स्पाइक आयाम, अस्थिर संकेतों, और लंबी अवधि रिकॉर्डिंग प्रयोगों14के पाठ्यक्रम पर जीर्ण सूजन से पीड़ित की तुलना में, 15. इसके अतिरिक्त, मेष इलेक्ट्रॉनिक्स लाभ है कि वे ऊतकवैज्ञानिक के दौरान ऊतक में छोड़ दिया जा सकता है, धुंधला, और इमेजिंग, पारंपरिक जांच के विपरीत, जो बहुत कठोर है और इसलिए प्रोटोकॉल से पहले हटा दिया जाना चाहिए विश्लेषण. इसलिए, मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के लिए अद्वितीय immunohistochemical विश्लेषण का उपयोग करने के लिए ठीक सेलुलर प्रत्येक रिकॉर्डिंग साइट आसपास के वातावरण का अध्ययन करने की क्षमता के लिए अनुमति देते हैं ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल तंत्रिका विज्ञान में रोमांचक नए अवसरों को खोलता है । न्यूनतम इनवेसिव वितरण विधि और मस्तिष्क ऊतक के साथ मेष इलेक्ट्रॉनिक्स के निर्बाध एकीकरण तंत्रिका सर्किट करने के लिए विघटन को कम करता है और पुरानी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, जो पुराने तंत्रिका रिकॉर्डिंग प्रयोगों के सबसे प्रकार के लाभ सकता है बचा जाता है । मेष इलेक्ट्रॉनिक्स की क्षमता रिकॉर्ड करने के लिए और समय की लंबी अवधि के लिए एक ही ंयूरॉंस ट्रैक विशेष रूप से मिलीसेकंड-स्केल spiking गतिविधि को महीने के साथ सहसंबंधी बनाने की मांग के लिए ब्याज की होगी साल के लिए लंबी प्रक्रियाओं उंर बढ़ने के रूप में, मस्तिष्क रोग, या मस्तिष्क के विकास के रोगजनन16,18। इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल को बढ़ाने और अनुकूलित करने के लिए पर्याप्त अवसर मौजूद हैं, जैसे कि डिजिटल division8,३५, वायरलेस जैसी कार्यात्मकता को कार्यांवित करने के लिए पीसीबी प्रमुख-चरण में सक्रिय इलेक्ट्रॉनिक्स जोड़ना संचार३५,३६,३७, और सिग्नल प्रोसेसिंग३५, सह इंजेक्शन स्टेम सेल या बहुलक के साथ जाल इलेक्ट्रॉनिक्स में सहायता करने के लिए ऊतक पुनर्जनन18,३८, ३९, और उच्च स्थानीयकृत और बहुआयामी मस्तिष्क जांच के लिए जाल इलेक्ट्रॉनिक्स में nanowire क्षेत्र प्रभाव ट्रांजिस्टर (एफईटी) को शामिल24,29,४०,४१ ,४२.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

C.M.L. वैज्ञानिक अनुसंधान के वायु सेना कार्यालय (FA9550-14-1-0136), एक हार्वर्ड विश्वविद्यालय भौतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग त्वरक पुरस्कार, और स्वास्थ्य निदेशक पायनियर पुरस्कार के एक राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा इस काम का समर्थन स्वीकार करता है ( 1DP1EB025835-01). T.G.S. राष्ट्रीय रक्षा विज्ञान और इंजीनियरिंग स्नातक फैलोशिप (NDSEG) कार्यक्रम के माध्यम से रक्षा विभाग (DoD) द्वारा समर्थन स्वीकार करता है । G.H. अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (16POST27250219) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की उंर बढ़ने पर नेशनल इंस्टीट्यूट से स्वतंत्रता पुरस्कार (जनक K99/R00) के मार्ग से फैलोशिप समर्थन स्वीकार करता है । इस काम के हिस्से में हार्वर्ड यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर नेनो सिस्टम्स (सीएनएस), नेशनल नैनो समंवित इंफ्रास्ट्रक्चर नेटवर्क (NNCI) के सदस्य, जो नेशनल साइंस फाउंडेशन द्वारा NSF ECCS अवार्ड सं के अंतर्गत समर्थित है, में प्रदर्शन किया गया । १५४१९५९.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motorized stereotaxic frame World Precision Instruments MTM-3 For mouse stereotaxic surgery
512-channel recording controller Intan Technologies C3004 A component of the neural recording system
RHD2132 amplifier board Intan Technologies C3314 A component of the neural recording system
RHD2000 3 feet ultra thin SPI interface cable Intan Technologies C3213 A component of the neural recording system
Mouse restrainer Braintree Scientific TV-150 STD Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions.
Si wafers Nova Electronic Materials 3" P <100> .001-.005 ohm-cm 356-406 μm Thick
Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats &
6,000 A°±5% Wet Thermal Oxide on both sides.
Photomasks (chrome on soda lime glass) Advance Reproductions Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site.
AutoCAD software Autodesk Inc. Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org.
Thermal evaporator Sharon Vacuum Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 2000.5 negative photoresist MicroChem Corp. Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics.
MA6 mask aligner Karl Suss Microtec AG Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 developer MicroChem Corp. Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light.
LOR3A lift-off resist MicroChem Corp. Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes
Shipley 1805 positive photoresist Microposit, The Dow Chemical Company Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics
MF-CD-26 positive photoresist developer Microposit, The Dow Chemical Company To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical.
Spin coater Reynolds Tech For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters.
PJ plasma surface treatment system AST Products, Inc. Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Electron beam evaporator Denton Vacuum For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool.
Remover PG MicroChem Corp. Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off
Ferric chloride solution MG Chemicals 415-1L A component of Ni etching solution
36% hydrochloric acid solution Kanto Corp. A component of Ni etching solution
Glass capillary needles Drummond Scientific Co. Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available.
Micropipette holder U-type Molecular Devices, LLC 1-HL-U Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection
1 mL syringe NORM-JECT®, Henke Sass Wolf Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles
Polyethylene intrademic catheter tubing Becton Dickinson and Company Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm
5 mL syringe Becton Dickinson and Company Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo
Eyepiece camera Thorlabs Inc. DCC1240C Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras Thorlabs Inc. Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics
EXL-M40 dental drill Osada 3144-830 For drilling the craniotomy
0.9 mm drill burr Fine Science Tools 19007-09 For drilling the craniotomy
Hot bead sterilizer 14 cm Fine Science Tools 18000-50 Used to sterlize surgical instruments
CM1950 cryosectioning instrument Leica Microsystems Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility.
0.3% Triton x-100 Life Technologies Used for histology
5% goat serum Life Technologies Used for histology
3% goat serum Life Technologies Used for histology
Rabbit anti-NeuN Abcam ab177487 Used for histology
Mouse anti-Neurofilament Abcam ab8135 Used for histology
Rat anti-GFAP Thermo Fisher Scientific Inc. PA516291 Used for histology
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific Inc. P36930 Used for histology
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich Corp. P6407-5MG Molecular weight = 70-150 kDA
Right-angle end clamp Thorlabs Inc. RA180/M Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame
Printed circuit board (PCB) Advanced Circuits Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org
32-channel standard amplifier connector Omnetics Connector Corp. A79024-001 Component assembled onto the PCB
32-channel flat flexible cable (FFC) Molex, LLC 152660339 Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector
32-channel zero insertion force (ZIF) connector Hirose Electric Co., LTD FH12A-32S-0.5SH(55) Component assembled onto the PCB

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