Intravenös och Intra-fostervatten In Utero Transplantation i murina modellen

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver ett protokoll för att utföra en i livmodern transplantation (IUT) genom intravenös och intra-fostervatten vägar av injektion i murina modellen. Detta protokoll kan användas för att införa celler, virala vektorer och andra ämnen i den unika immun-tolerant fostrets miljön.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ahn, N. J., Stratigis, J. D., Coons, B. E., Flake, A. W., Nah-Cederquist, H. D., Peranteau, W. H. Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model. J. Vis. Exp. (140), e58047, doi:10.3791/58047 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In utero transplantation (IUT) är en unik och mångsidig läge av terapi som kan användas för att införa stamceller, virala vektorer eller andra ämnen i början av dräktigheten. Logiken bakom IUT för terapeutiska ändamål är baserad på den lilla storleken på fostret, den fetala immunologisk omognad, tillgänglighet och proliferativ naturen av de fetala stamceller eller stamceller cellerna och potential att behandla en sjukdom eller symtomen före födseln. Dra nytta av dessa normala utvecklingsmässiga egenskaper av fostret, leverans av hematopoetiska stamceller (HSC) via en IUT har potential att behandla medfödda hematologiska störningar såsom sicklecellsjukdom, utan det krävs myeloablativ eller immunsuppressiva luftkonditionering krävs för postnatal HSC transplantationer. Likaså kan tillgängligheten av stamceller i flera organ under utveckling potentiellt för en mer effektiv inriktning av stammen/stamceller efter en IUT av virala vektorer för genterapi eller gen editering. Dessutom kan IUT användas att studera normala utvecklingsprocesser inklusive, men inte begränsat till, utveckling av immunologisk tolerans. Murina modellen ger en värdefull och prisvärd möjlighet att förstå möjligheter och begränsningar av IUT före prekliniska studier på stora djur och en eventuell klinisk tillämpning. Här beskriver vi ett protokoll för att utföra en IUT i murina fostret genom intravenös och intra-fostervatten vägar. Detta protokoll har använts framgångsrikt att klarlägga nödvändiga villkor och mekanismer bakom Utero hematopoetisk stamcellstransplantation, toleransutveckling och Utero genterapi.

Introduction

Senaste framstegen inom prenatal screening och diagnos har visat att möjligheten att behandla fostret för ett antal medfödda störningar som inte har adekvat postnatal behandlingsalternativ och leda till betydande sjuklighet och dödlighet. I synnerhet har i livmodern hematopoetisk stamcellstransplantation (IUHCT) och gene therapy/gen editering potential att dra nytta av normala utvecklingsmässiga egenskaper av fostret att behandla medfödda hematologiska, immun och genetiska sjukdomar mer effektivt än postnatal HSC transplantation och gene therapy/gen editering kan göra1,2. Specifikt på grund av den lilla storleken på fostret, kan givare cellen eller virala vektorn dos maximeras per vikt av mottagaren. Dessutom tillåter den immunologiska omognad av fostret givare Förenta injiceras utan myeloablativ och immunsuppressiva luftkonditionering som krävs i postnatal transplantation protokoll. Likaså kan virala vektorer bära en terapeutisk transgenens eller genomet redigering teknik injiceras utan ett begränsande immunsvar mot antingen transgenens produkt eller virala vektorn. Slutligen, tillgänglighet och proliferativ naturen av fetala stamceller/stamceller ger möjlighet att en effektivare transduktion av målet stamceller, liksom vissa lägen av genomet redigering (homologi-regisserad reparation) som kräver Cykling celler förekommer effektivt. Murina modellen fungerar som ett insiktsfulla och prisvärt sätt att ta itu med viktiga frågor i stamcellsbiologi och immunologi före experimentera i prekliniska stora djurmodeller och, som sådan, har fungerat som den primära modellen där IUHCT och i livmodern genterapi har varit utforskade1,2,3.

Även om många variabler har en viktig roll i framgången för IUHCT och i utero gen terapi/gen editering i murina och stora djurmodeller, är en nyckelvariabel metoden för leverans av Förenta eller virala vektorn. Leverans av stora doser av givare Förenta med en första-passage-effekten uppstår i fetala levern, hematopoetiska orgeln vid tidpunkten för IUHCT, har visat sig vara avgörande för att nå macrochimeric nivåer av engraftment mus och stora djurmodeller4 ,5. Detta var uppnås via en injektion av givare celler via den vitelline ven i musmodell och via en intra cardiac injektion i Hundarnas modellen. Sträckningen av injektion också spelar en grundläggande roll i inriktning stamceller av olika organ under utveckling. Exempelvis en intravenös injektion via den vitelline ven har visat sig effektivt transduce hjärtmuskelceller och hepatocyter efter en sen dräktighet injektion6,7. Alternativt kan en intra-fostervatten injektion av virala vektorer inriktningen av organ som utsätts fysiskt baserat på den fällbara/fosterutvecklingen vid tidpunkten för injektion8. Detta exemplifieras bäst av inriktningen av respiratoriskt epitel via en intra-fostervatten injektion sent i dräktigheten att dra nytta av normala foster ”andas” rörelser, som exponerar luftvägarna till virala vektorn i den fostervatten flytande9. Dessa två lägen av IUT, intravenös via den vitelline ven och intra-fostervatten, har legat till grund för flera tidigare och pågående experiment i vårt laboratorium. I detta protokoll beskriver vi i detalj metoderna för att utföra intravenös och intra-fostervatten IUT i murina modellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De experimentella protokoll godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén på The Children's Hospital i Philadelphia.

1. skapande av injektion pipetter

  1. Med hjälp av vertikala mikropipett avdragare, dra 100 µL microcapillary pipett (figur 1A - 1 C). Kalibrera den mikropipett avdragare så att den spetsiga änden är > 1 cm lång.
    Obs: Initialt, inställningarna för avdragare bör justeras för en optimal längd. En högre värme inställning kommer att göra spetsen längre, och en högre pull inställning gör diametern på spetsen smalare.
  2. Skär den spetsiga änden så att det är ≥ 1 cm långa. Säkerställa att den inre diametern på spetsen av nålen är mellan 70 µm och 100 µm och att det är omvänt proportionell till längden av den spetsiga änden.
    Obs: Innerdiameter beror också på kalibrering av en mikropipett avdragare. Se instruktionerna från tillverkaren av den vertikala mikropipett avdragare eller någon rekommenderad mikropipett avdragare typ.
  3. Efter att se till att nålen har korrekt innerdiameter, skapa avfasningen på 15-20 grader genom att vässa spetsen med hjälp av en mikropipett beveller med diamant slipning hjulet (figur 2A - 2 C). Se till att vila spetsen försiktigt på hjulet utan för mycket tryck, minskar risken att bryta eller sprickbildning spetsen.
    Obs: En pensel kan användas för att torka bort eventuellt skräp som byggs upp på nålens spets.
  4. Utvärdera spetsen under ett mikroskop och se till att spetsen är rund utan marker eller sprickor. Omvärdera inre diameter att se till att det är mellan 70 µm och 100 µm (figur 2D - 2 H).
  5. Rita linjer på resten av nålen att utse 5 µL av volymen mellan dem (t.ex., nålar med en innerdiameter på 1.3 mm bör ha linjer dragna på 3.77 mm-steg).
  6. Autoklav nålar föregående att använda i kirurgi och hantera dem med sterila handskar.

2. in utero injektioner

  1. Förbereda nödvändiga instrument genom autoklavering dem före tid. Innehåller väsentliga instrument såsom microinjector nålförare, en kirurgisk nål-drivrutin, ett par Adson pincett, ett par böjd regelbunden vävnad sax, en 1 mL spruta av insulin, ett par Bomull-Tips applikatorer, överföring pipett, en 50 mL konisk tub, och en förpackning med 4-0 polyglactin 910 suturer.
  2. Med steril teknik, Fäst nålen till innehavaren nål och Anslut den till microinjector.
    Obs: Inställningarna för den komprimerade kväve som används är som följde: injicera 4-6 psi, balansera 0 psi. Beroende på vad som injiceras, specifikt, viskositeten hos injectate, samt storleken på mikropipett, injektion tider varierar mellan 0,3 - 1,5 s.
  3. Rensa ut kanylspetsen all möjligt skräp genom att rita upp 5-10 µL sterilt 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sedan rensa den ut. Upprepa detta 2-3 x.
  4. Inför kirurgi gravid 2 till 6-månader gamla honmöss genom rakning deras abdomens med en clipper. Var noga med att inte skada bröstvårtorna. Administrera perorala smärtstillande (t.ex., 100 µL av 1,5 mg/mL meloxikam oral suspension per mus).
  5. Börja fylla nålen med materialet (celler/vector/läkemedel) på önskad volym. Var noga med att inte bryta kanylspetsen samtidigt fylla nålen.
    Obs: Volymen av injektion per fostret varierar beroende på den specifika experimentell designen. 20 µL fungerar väl för att injicera ett stort antal celler (dvs.upp till 107 celler i vitelline ven. Till exempel har vi levererat 1 x 107 hela benmärgsceller isolerade från C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 [”B6 grönt fluorescerande Protein (GFP)”] möss via den vitelline ven i graviditetsdiabetes dag-14 Balb/c foster. För virala vektorn injektioner, en enda injektion av 10 µL av en 1:1 utspädda vektor med PBS fungerar bra.
  6. För att kalibrera den injektion tid, ta följande steg.
    1. Tryck Mode knappen 3 x på microinjector att komma till skärmen injektion kalibrering. Justera injektion tid genom att lägga till intervaller om 10 eller 100 ms och push Mode knappen 2 x.
    2. Tryck på knappen Saldo och tryck ned fotpedalen en gång. Nu tryck pedalen igen och bedöma hur mycket volym töms ur nålen per push. Om inte kalibrerad till önskad volym på 5-20 µL per pedal push, upprepa steg 2.6.1 och 2.6.2.
      Obs: I allmänhet är det bra att kalibrera varje push att leverera halva totala målvolymen i taget. Det är möjligt att injicera mer än 30 µL eller ens 40 µL av den totala volymen, går vi inte generellt över 20 µL per fostret, intravenös eller intra-fostervatten.
  7. Fyll nålen upp till önskad nivå.
  8. Börja leverera anestesi till musen genom att justera syre flödesmätarens till 1 L/min och den isofluran spridare till 3%.
  9. Bekräfta om musen är bedövas genom att kontrollera avsaknad av pedal reflexen. Flytta musen till en värmedyna i ryggläge.
  10. Applicera smörjmedel eye gel för att undvika korneal uttorkning. Trygga musen på plats genom att tejpa de övre och nedre extremiteterna till pad.
  11. Prep buken med klorhexidin scrub följt av alkohol och injicera lokalbedövning (t.ex., 100 µL av 0,25% bupivakain) subkutant (figur 3A).
  12. Med sax, göra ett snitt med 1-2 cm i huden så att den nedre gränsen är närmare än 1 cm i introitus; fascian under är mycket tunn och genomskinlig.
  13. Identifiera mittlinjen av fascia som är mer öppet än det omgivande området. Var noga med att inte skada de epigastrisk fartyg som ligger på vardera sida om mittlinjen. Bör epigastrisk kärlen skadas, Håll trycket med bomull-Tips applikatorer att stoppa blödningen.
  14. Pincett, använder Adson och nyp fascian utan ta tag i någon av de underliggande organ som tarmar, urinblåsa eller foster. Öppna fascian med sax, vara noga med att inte skada någon av organ. En gång säkert i buken, förlänga fascian snittet. Gör det inte längre än huden snittet.
  15. Använd Bomull-Tips applikatorer för att flytta tarmen in i den övre delen av buken, därmed utsätta den dräktiga livmodern. Leverera livmodern av snittet, noggrant identifiera höger och vänster äggstockarna för att säkerställa att alla foster räknas (figur 3B).
  16. Placera vänster livmodern tillbaka in i buken så att bara rätt livmodern exponeras; Detta förhindrar uttorkning av livmodern och håller icke-injiceras fostren varm.
  17. Håll den laterala fostret/fostersäcken mellan tummen och pekfingret av operatörens icke-dominanta hand (figur 3C). Alltid vara varsam om inte orsakar några skador på fostren.
  18. Placera mikroskopet dissektion (en 10 X förstoring är perfekt) och justera fokus så att fostret är i sikte. Justera belysningen för en bättre visualisering.
  19. Identifiera den del som injiceras (vitelline ven, amnionen). För intravenösa injektioner, visualisera både vitelline venerna och deras anastomos först. För intra-fostervatten injektioner, orient fostret med till höger i vyn.
  20. Nå målet utrymmet med nålen som beskrivs nedan.
    1. För en intravenös injektion, gör följande.
      1. Rotera livmodern så att den vitelline ven som är som injiceras är parallell till spetsen av nålen; Tänk på att injektioner måste göras mot anastomos av två vener.
      2. Lägg nålen på livmodern 5° vinkel och genomborra livmoderväggen. Nu när spetsen är mellan livmoderväggen och fostersäcken, Placera spetsen direkt ovanpå vitelline venen.
      3. I en nästan tangerar vinkel, glida nålen över venen tills avfasningen genomborrar och förskott till fartyget. Detta framgår av en blixt av blodet ses i nålspetsen (figur 3D).
        Obs: Tillgång till venen kan ta några försök eftersom nålen inte kan punkteras venen med det första glidet över venen.
    2. För en intra-fostervatten injektion, gör följande.
      1. Rotera fostersäcken och hitta en plats saknar fartyg att tränga igenom.
      2. Peka vinkelrätt mot livmoderväggen nålen och stick genom livmodern, gulesäcken och sedan fostersäcken. Var noga med att inte pierca igenom någon fostervävnad. Kontrollera att nålen har passerat mellan armar och ben som detta bekräftar att nålen är i fostersäcken. Fortsätt sedan med injektionen.
  21. Injicera lämplig volym av material önskas (vanligtvis 10-20 µL) genom att trycka på fotpedalen.
    Obs: Eftersom injektorn måste upprätthålla visualisering av nålspetsen genom mikroskopet på alla tider, en andra person måste läsa markeringarna på nålen att kvantifiera det injicerade beloppet och informera injektorn hur mycket volym är kvar för att injicera. En diskussion före injektionen mellan spridare och assistent är viktigt att undvika förvirring och försening. Detta är särskilt viktigt för intravenösa injektioner eftersom en fördröjd borttagning av nålen kommer att möjliggöra en återflödet av venöst blod i nål och resultera i en felaktig dosering.
  22. Ta ut nålen från injektionsstället när önskad volym levereras. Eftersom det kan finnas några blödningar från fartyget punktera webbplats med intravenösa injektioner, hålla trycket med sidan av nålen för 10-15 s för att stoppa blödningen.
  23. Gå vidare till nästa fostret. Fortsätt tills alla fostren av just livmoderns horn har injicerats.
  24. Ta den vänstra livmoderns hornen från buken och ersätta höger livmoderns horn tillbaka inne i bukhålan.
    Obs: Ibland nålen behöver fyllas på med injectant.
  25. När alla foster har injicerats, ersätta livmodern i buken (figur 3E). Se till att undvika en livmoder eller tarm volvulus.
  26. Med disponibla överföring pipett, placera ungefär 2 mL 1 x PBS i buken att ersätta förluster okänslig.
  27. Stäng fascia och buken i ett fortlöpande lager med 4-0 polyglactin 910 suturer för att undvika skada underliggande organ under stängningen (figur 3F - 3 G).
  28. Ta bort tejpen och föra musen till en bur under en värmelampa. Var noga med att inte placera värmelampa för nära till musen. Se till att buren har sängkläder, mat och vatten.
    Obs: En termostatstyrd varm kammare kan också användas. Musen är vaken när det är upprätt och promenader.
  29. Observera musen dagligen och ge smärtstillande vid behov.
    Obs: Vi rutinmässigt ge meloxikam postoperativ dag 1 och 2, och ibland på dag 3 om musen visar tecken på smärta.
  30. Om gör en batch operation med samma material som injektion, rensa ut injektionsnålen med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Om injektionen med ett annat material, släng kanylen i en behållare och använda en ny nål.
    Obs: Vi rekommenderar att främja pups med fostermödrarna omedelbart efter födseln om dammen monterar ett immunsvar mot de injectant och överföringar antikropparna mot valpar via bröstmjölk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Överlevnad och engraftment är viktiga mått på framgång för IUHCT experiment. Beroende på specifika ändpunkterna av ett experiment, kan foster som fått ett IUHCT analyseras prenatalt genom ett kejsarsnitt eller postnatalt. Överlevnaden efter intravenösa injektioner alltifrån i genomsnitt 75-100%. Överlevnaden efter intra-fostervatten injektioner tenderar att rättvis bättre än intravenösa injektioner, ca 85-100%.

I vårt laboratorium tar utbildningsprocessen att uppnå kunskaper i dessa tekniker cirka 8-12 månader. För att bedöma de färdigheter som krävs för att utföra dessa injektioner på ett reproducerbart sätt, övervakas praktikanter för fostrets överlevnad och givare cell engraftment på kort tidpunkter efter IUT. Detta framgår av följande kvalitetskontroll experimenten. Specifikt, 1 x 107 hela benmärgsceller isoleras från C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 (”B6 GFP”) möss som tidigare beskrivs5 och är injiceras via den vitelline ven i graviditetsdiabetes dag-14 Balb/c foster. I en grupp, IUT utfördes av en erfaren instruktör och i den andra gruppen av en praktikant som har tränat tekniken för ~ 4 månader. Representativa fluorescerande mikroskopi bilder av skördade fostrets lever 24 h efter IUT visas i figur 4A. Levern hos fostren som fick IUT av praktikanten fluorescerar mindre på grund av en lägre engraftment av de transplanterade cellerna GFP. Dessa lever analyserades sedan för GFP+ donatorcellerna av flödescytometri att kvantifiera engraftment nivåerna. Skillnaden i genomsnittlig engraftment nivåer mellan de två injektorer korrelerar med bilder ses under fluorescerande mikroskopi (figur 4B).

Möjligheten för virala vektorer levererade via intra-fostervatten rutten till transduce celler i kontakt med fostervatten exemplifieras av transduktion av epiteliala celler 48 h efter en intra-fostervatten injektion av Ad-GFP (ett adenovirus-vektor bära god Jordbrukarsed transgenens10) i graviditetsdiabetes dag-12,5 foster (figur 5A och 5B).

Figure 1
Figur 1 . Processen att göra en glas pipett nål med en mikropipett avdragare. (A) montera glas pipetten och säkra den genom att dra åt rattarna på vardera änden av avdragare. (B) när säkrade, dra reglaget aktiverar värmen. Inställningarna som visas är Heat #1: 985 och Pull: 27. Mörka täckglaset bör vara stängd under denna process för säkerhet. Det öppnades för fotograferingen. (C) mikropipett avskiljs. Kassera den nedre delen och ta den övre delen av den separerade mikropipett för nästa steg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Processen för slipning av mikropipett för att forma spetsen på nålen. (A) denna panel visar den allmänna installationen av slipningen. En ljuskälla som behövs för att visualisera spetsen under mikroskopet. (B och C) Montera mikropipett i 15-20 ° vinkel. (D) ett uppbyggd av skräp väntas under hela slipprocessen. Använd en pensel för att rensa tipset att få en bättre visualisering av slipprocessen. (E) A välslipat nålspetsen utan identifierbara chips eller ojämna kanter visas i en 4 X förstoring. (F, Goch H) En förnyad inspektion av marken nålen under en 10 X Förstoring visar en välslipat nål med en vass spets och jämna kanter runt spetsen. Se till att kontrollera nålen i olika vinklar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Laparotomi och Utero transplantation. (A) rakning, söva, och tejpa en gravid dam och prep hennes buk. (B) efter laparotomi, leverera helheten av livmodern utanför buken för en identifiering av alla foster. (C) Position fostret med kirurgens icke-dominanta pekfinger och tumme samtidigt som spänningen med det tredje fingret. Identifiera spetsen på nålen under lupp i förhållande till fostret. (D) ett blixt av blodet tillbaka-flyter in mikropipett nålen måste ses vid kanylering av vitelline ven. (E) efter en avslutning av alla injektioner, placera alla fostren tillbaka in i buken. (F) nära buken med ett lager rakstygn med 4-0 polygalactin 910 suturer. (G) när buken är helt stängd, låt dammen återhämta sig under en värmelampa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Engraftment av givaren hela benmärgen mononukleära celler efter en vitelline ven injektion. (A), skillnaden i graden av engraftment med (praktikant) och utan (instruktör) läckage av celler visas tydligt under fluorescerande mikroskopi. (B) procent chimärism återspeglas också samma konstaterande framgår av flöde flödescytometri analysen. Varje datapunkt representerar levern från en annan injicerade fostret. Experimentet utfördes av en praktikant och en instruktör. Felstaplar representera en standardavvikelse (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Det uttryck pattern av grönt fluorescerande protein i ett foster embryo 48 h efter en intra-fostervatten injektion av Ad-GFP. (A) denna panel visar hornhinnan (röd pil) och huden färgas med GFP på E14.5 efter en intra-fostervatten injektion av Ad-GFP på E12.5 (E12.5/E14.5). (B), en cryosection av baksidan av embryot (indikeras med en ljus blå ruta i panel A) vid en högre förstoring visar att den virala transduktion begränsas till ytliga peridermal celllagrar (röda pilar) och inte epidermis (epi). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In utero transplantation är en potentiell behandling för många medfödda sjukdomar som kan diagnostiseras tidigt i dräktigheten. Murina modellen för IUT tillåter forskare att undersöka fostrets miljön eller för att experimentera med olika terapier. Beroende på vad som injiceras och vad är riktade, kan intravenös eller intra-fostervatten i livmodern transplantation ge en tillförlitlig leverans av en injectant in i önskat utrymme.

När rikta specifika organ, är det viktigt att plocka lämpliga embryologiska ålder fostret samt injektionstekniken. Medan den intravenösa injektionen av celler vid E14 är idealisk för att rikta den hematologiska nischen, och intra-fostervatten injektionen vid E16 är idealisk för lung inriktning, är dessa inte de enda alternativen som är tillgängliga. Exempelvis kan intra-fostervatten injektioner utföras för foster så tidigt som E8 med ultraljud vägledning8. Systemiska leverans går också före E14 med ultraljud-guidad intra cardiac injektioner på E9 - E1011. Möjligheten att utföra injektioner på olika stadier av fostret utveckling erbjuder stora möjligheter för experiment undersöker säkerheten och effektiviteten av genen överföringar och cell organtransplantationer samt undersöka grundläggande ifrågasätter av utvecklingstoxicitet biologi.

Dessutom utöver en intravenös och intra-fostervatten leverans finns andra platser också för inriktning beroende på syftet med terapin eller vetenskapliga frågan som eftersträvas. Den i livmodern intramuskulär tillvägagångssätt har använts för en överföring av gener för muskeldystrofier12, en intraspinala strategi för transduktion i ryggmärgen motoriska nervceller13, och en intrakraniell strategi för genen överförs till målet centrala nervsystemet sjukdomar14. För i livmodern hematopoetisk stamcellstransplantation är intrahepatisk och intraperitoneal rutter ytterligare livskraftiga alternativ som varje väg för leverans i slutändan riktar de hematopoetiska nisch15. Dock möjliggör sträckan intravenös transplantation en effektivare homing hos donatorcellerna in i hematopoetiska nisch och en större dosering hos donatorcellerna, vilket resulterar i totalt sett högre nivåer av stabila långsiktiga givare cell engraftment utan lagt till fetal dödlighet1.

De protokoll som vi har detaljerade ovan för utför IUT är kraftfulla och mångsidiga verktyg som möjliggör en unik i vivo -Metod för att studera stamcellsbiologi, utvecklingsmässiga immunologi och immunologiska toleransutveckling, utvecklingsbiologi, och prenatal gen terapi/gen editering. Dessa leveransmetoder också har relevanta kliniska konsekvenser och har varit grunden för studier av IUHCT och i utero genterapi i prekliniska stora djurmodeller som hund och får model4,16. De kommer att fortsätta att fungera som ett värdefullt verktyg för att testa nya idéer i utvecklingsbiologi och utforska nya terapier för förödande medfödda genetiska, hematologiska, immun och metabola störningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gloves Cardinal Health 2D73DP65
Adson Forceps w/ teeth Fine Science Tools 11027-12
Adson Forceps w/o teeth Fine Science Tools 11006-12
Curved scissors Fine Science Tools 14075-11
Heavy Scissors Fine Science Tools 14002-13
Needle Driver Fine Science Tools 12005-15
Vicryl 2.0 Ethicon JB945
Transfer Pipette Medline GSI135010
Cotton Tipped Applicators Medline MDS202000
50 mL Conical tube Fischer Scientific 14-432-22
Tape 3M 1527-1
Eye lubricant Major LubriFresh 0904-6488
Heating Pad K&H 3060
Stereomicroscope Leica MZ16
Injector Narishige HI01PK01
Glass Capillary tubes Kimble 71900-100
Vertical Micropipette Puller Sutter Instruments P-30
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV-10
IM-300 Pneumatic Microinjector Narishige IM-300
Insulin Syringe  BD  305935
Filter Genesee Scientific 25-244
Compac5 Anesthesia Machine VetEquip Compac5 901812 
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
N2 gas Airgas NI 125
O2 gas Airgas OX 125
Ad-GFP viral vector Penn Vector Core H5'.040.CMV.eGFP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
  2. Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
  3. Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126, (10), 1245-1254 (2015).
  4. Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124, (12), 1987-1995 (2014).
  5. Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108, (13), 4268-4274 (2006).
  6. Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101, (4), 1359-1366 (2003).
  7. Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
  8. Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15, (3), 579-587 (2007).
  9. Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, (6), 991-999 (2016).
  10. Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
  11. Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18, (7), 719-726 (2011).
  12. Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15, (7), 531-536 (2008).
  13. Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
  14. Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
  15. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
  16. Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19, (2), 201-209 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics