Intravenøs og Intra-fostervand In Utero Transplantation i Murine Model

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en protokol til at udføre en i utero transplantation (IUT'EN) gennem intravenøs og intra-fostervand ruter af injektion i murine model. Denne protokol kan bruges til at indføre celler, virale vektorer og andre stoffer i den unikke immun-tolerant føtal miljø.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ahn, N. J., Stratigis, J. D., Coons, B. E., Flake, A. W., Nah-Cederquist, H. D., Peranteau, W. H. Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model. J. Vis. Exp. (140), e58047, doi:10.3791/58047 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In utero transplantation (IUT'EN) er en unik og alsidig tilstand af terapi, der kan bruges til at indføre stamceller, virale vektorer eller andre stoffer i begyndelsen af drægtighedsperioden. Rationalet bag IUT'EN til terapeutiske formål er baseret på den lille størrelse af fosteret, den føtale immunologiske umodenhed, tilgængelighed og proliferativ karakter af de føtale stamceller eller stamfader celler, og potentiale til at behandle en sygdom eller symptomdebut forud for fødslen. At drage fordel af disse normale udviklingsmæssige egenskaber af fosteret, levering af hæmatopoietisk stamceller (HSC) via en IUT'EN har potentiale til behandling af medfødt hæmatologiske lidelser såsom seglcelleanæmi, uden de nødvendige myeloablative eller immunsupprimerende conditioning kræves for postnatal HSC transplantationer. På samme måde, tilgængelighed af stamceller i flere organer under udvikling potentielt giver mulighed for en mere effektiv målretning af stem/stamceller efter en IUT'EN af virale vektorer for genterapi eller genom-redigering. Derudover kan IUT'EN blive brugt til at studere normale udviklingsprocesser, herunder, men ikke begrænset til, udvikling af immunologisk tolerance. Den murine model giver en værdifuld og overkommelige midler til at forstå de muligheder og begrænsninger på IUT'EN før prækliniske store dyreforsøg og en eventuel klinisk anvendelse. Her, beskriver vi en protokol for at udføre en IUT'EN i murine fosteret gennem intravenøs og intra-fostervand ruter. Denne protokol har været anvendt med succes til at belyse de nødvendige betingelser og mekanismer bag i utero hæmatopoietisk stamcelletransplantation, tolerance induktion og i utero genterapi.

Introduction

De seneste fremskridt i prænatal screening og diagnose har kastet lys over muligheden for behandling af fosteret for en række medfødte lidelser, som ikke har tilstrækkelig postnatal behandlingsmuligheder og resultere i betydelig sygelighed og dødelighed. Specifikt, har i utero hæmatopoietisk stamcelletransplantation (IUHCT) og gen terapi/genom-redigering potentiale til at drage fordel af normale udviklingsmæssige egenskaber af fosteret til behandling af medfødt hæmatologiske, immun og genetiske sygdomme mere effektivt end postnatal HSC transplantation og gen terapi/genom-redigering kan gøre1,2. Specifikt, på grund af den lille størrelse af fosteret, kan donor celle eller viral vektor dosis være maksimeret pr. vægten af modtageren. Derudover tillader de immunologiske umodenhed af fosteret donor HSCs sprøjtes uden myeloablative og immunosuppressive konditionering, der kræves i postnatal transplantation protokoller. På samme måde, virale vektorer transporterer en terapeutisk transgen eller genom-redigering teknologi kan sprøjtes uden en begrænsende immunrespons til enten transgen produkt eller den virale vektor. Endelig, tilgængelighed og proliferativ karakter af føtal stem/stamceller råd til muligheden for en mere effektiv transduktion af målcellerne inspirator, samt visse former for genom redigering (homologi-instrueret reparation), som kræver cykling celler at forekomme effektivt. Den murine model fungerer som en indsigtsfuld og overkommelige midler til at tage fat på vigtige spørgsmål i stilken cellebiologi og Immunologi før eksperimenterer i prækliniske store dyremodeller og som sådan har fungeret som den primære model, hvor IUHCT og i livmoderen genterapi har været udforsket1,2,3.

Selv om mange variabler spiller en vigtig rolle for succesen af IUHCT og i utero gen terapi/genom-redigering i murine og store dyremodeller, er en central variabel metode til levering af HSCs eller viral vektor. Levering af store doser af donor HSCs med en first-pass virkning vil indtræffe i føtal leveren, hæmatopoietisk orgel på tidspunktet for IUHCT, har vist sig at være medvirkende til at nå macrochimeric niveauer af engraftment i mus og store dyremodeller4 ,5. Dette blev opnået via en indsprøjtning af donor celler via den vitelline vene i musemodel og via en intra hjerte indsprøjtning i den canine model. Ruten af injektion spiller også en afgørende rolle i at målrette stamceller af forskellige organer under udvikling. For eksempel, en intravenøs injektion via vitelline venen har vist sig at effektivt transduce cardiomyocytes og hepatocytter efter en sen drægtighed injektion6,7. Alternativt, en intra-fostervand indsprøjtning af virale vektorer giver mulighed for målretning af organer, der er fysisk udsat baseret på embryonale foldning/udvikling på tidspunktet for indsprøjtning8. Dette er bedst eksemplificeret ved målretning af respiratoriske epitel via en intra-fostervand indsprøjtning sent i drægtigheden at drage fordel af normale føtal "vejrtrækning" bevægelser, som udsætter luftveje til den virale vektor i den fostervand flydende9. Disse to tilstande på IUT'EN, intravenøs via vitelline venen og intra-fostervand, har været grundlaget for flere tidligere og igangværende forsøg i vores laboratorium. I denne protokol beskriver vi i detaljer metoderne for at udføre intravenøs og intra-fostervand IUT'EN i modellens murine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De eksperimentelle protokoller blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på The children's Hospital of Philadelphia.

1. oprettelse af injektion pipetter

  1. Ved hjælp af en lodret mikropipette puller, trække en 100 µL microcapillary pipette (figur 1A - 1 C). Kalibrere mikropipette puller, således at den tilspidsede ende er > 1 cm lange.
    Bemærk: I første omgang, indstillingerne for puller bør justeres for en optimal længde. En højere varme indstilling spidsen længere, og en højere pull indstilling vil gøre diameteren af spidsen smallere.
  2. Skære den tilspidset ende, så det er ≥ 1 cm lange. Sikre at den indvendige diameter på spidsen af nålen er mellem 70 µm og 100 µm og at det er omvendt proportional med længden af den tilspidsede ende.
    Bemærk: Den indvendige diameter også afhænger af kalibrering af mikropipette puller. Se vejledningen fra producenten af den lodrette mikropipette aftrækker eller foretrukne mikropipette puller type.
  3. Efter at have sikret at nålen har den korrekte indre diameter, oprette facet af 15-20 grader af skarphed spidsen med en mikropipette beveller med en diamant slibning hjulet (figur 2A - 2 C). Sørg for at hvile spidsen forsigtigt på rattet uden for meget pres, for at mindske chancer for at bryde eller knække spidsen.
    Bemærk: En pensel kan bruges til at tørre væk eventuelle rester, der hober sig op på nål-spids.
  4. Evaluere tip under et mikroskop og sikre, at spidsen er runde uden chips eller revner. Revurdere den indre diameter for at sikre det er mellem 70 µm og 100 µm (figur 2D - 2 H).
  5. Tegne streger på resten af nål til at udpege 5 µL af volumen mellem dem (f.eks.nåle med en indre diameter på 1,3 mm bør have linjer trukket på 3,77 mm-trin).
  6. Autoklave nåle forudgående til brug i kirurgi og håndtere dem med sterile handsker.

2. in utero injektioner

  1. Forberede nødvendige instrumenter ved autoklavering dem god tid. Omfatter væsentlige instrumenter såsom microinjector nål holder, en kirurgisk nål chauffør, et par Adson pincet, et par af buede regelmæssig væv saks, en 1 mL insulin sprøjte, et par af bomuld-tip applikatorer, overførsel pipette, en 50 mL konisk slange, og en pakke med 4-0 polyglactin 910 suturer.
  2. Med en steril teknik, tillægger nål holder nålen og sætter det ind i microinjector.
    Bemærk: Indstillingerne for det komprimerede nitrogen bruges er som følger: injicere 4-6 psi, balance 0 psi. Hvad er at være injiceres, specifikt, viskositet af injectate, samt størrelsen af mikropipette, injektion gange variere mellem 0,3 - 1,5 s.
  3. Rens nål tip på muligt snavs ved udarbejdelse af 5-10 µL sterilt 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og derefter rydde det ud. Gentag dette 2-3 x.
  4. Forberede gravid 2 til 6 måned forhenværende hunmus for kirurgi ved barbering deres underliv med en clipper. Pas på ikke at beskadige brystvorterne. Administrere oral smertestillende medicin (f.eks., 100 µL af 1,5 mg/mL meloxicam oral suspension pr. mus).
  5. Start fylde nålen med det ønskede materiale (celler/vektor/narkotika) med den ønskede lydstyrke. Vær omhyggelig med ikke at bryde nål-spids udfylde nålen.
    Bemærk: Mængden af injektion pr. fosteret varierer afhængigt af den specifikke forsøgsdesign. 20 µL fungerer godt for indsprøjte et stort antal celler (dvs.op til 107 celler i vitelline vene. For eksempel, vi leveret 1 x 107 hele knoglemarv celler isoleret fra C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ["B6 grøn fluorescerende proteiner (NGL)"] mus via den vitelline vene i svangerskabsuge dag-14 Balb/c fostre. For viral vektor injektioner, en enkelt injektion af 10 µL af en 1:1 fortyndede vektor med PBS fungerer godt.
  6. For at kalibrere injektion tid, tage følgende skridt.
    1. Push Mode knap 3 x på microinjector at komme til injektion Kalibrerings-skærmbilledet. Juster tid, injektion ved at tilføje mellemrum af 10 eller 100 ms og push Mode knap 2 x.
    2. Trykke på knappen saldo og tryk på pedalen én gang. Nu skubbe pedalen igen og vurdere, hvor meget volumen er tømt ud af nålen pr push. Hvis ikke kalibreret til den ønskede mængde af 5-20 µL pr. pedal skubbe, Gentag trin 2.6.1 og 2.6.2.
      Bemærk: Generelt, det er godt at kalibrere hvert tryk og levere halvdelen samlede destinationsdiskenheden ad gangen. Mens det er muligt at injicere mere end 30 µL eller endda 40 µL af den samlede mængde, går vi generelt ikke over 20 µL pr. fosteret, intravenøs eller intra-fostervand.
  7. Fylde nål op til det ønskede niveau.
  8. Begynde at levere anæstesi til musen ved at justere ilt flowmåler til 1 L/min og isofluran vaporizer til 3%.
  9. Bekræfte, om musen er bedøvede ved at kontrollere for fravær af den pedal refleks. Overføre musen til en hede afrivningsblok i en liggende stilling.
  10. Anvende smøremiddel eye gel for at undgå hornhinde udtørring. Sikre musen på plads ved at tape de øvre og nedre lemmer til pad.
  11. Prep maven med klorhexidin krat efterfulgt af alkohol og injicere en lokalbedøvelse (fx, 100 µL af 0,25% bupivacaine) subkutant (fig. 3A).
  12. Med en saks, gøre en 1-2 cm hud indsnit, så at den nedre grænse er ikke tættere end 1 cm til introitus; fascia under er meget tynd og gennemsigtig.
  13. Identificere midterlinjen af fascia, som er mere gennemsigtige end det omkringliggende område. Pas på ikke at skade de epigastriske fartøjer, der ligger på hver side af midterlinjen. Bør de epigastriske fartøjer blive skadet, hold presset med bomuld-tip applikatorer at stoppe blødningen.
  14. Ved hjælp af Adson knivspids pincet, fascia uden at snuppe en af de underliggende organer som tarm, blære eller fostre. Åbn fascia med saks, være omhyggelig med ikke at beskadige nogen af organer. Engang sikkert i underlivet, udvide den fascial indsnit. Gør det ikke længere end hud indsnittet.
  15. Brug bomuld-tip applikatorer for at flytte tarmene i den øvre del af maven, dermed udsætte fælderne livmoderen. Levere livmoderen ud af indsnit, nøje identifikation af højre og venstre æggestokkene til at sikre, at alle fostre tælles (fig. 3B).
  16. Placer venstre livmoderen tilbage ind i maven, så kun de rigtige livmoderen er udsat; Dette forhindrer udtørring af livmoderen og holder de ikke-indsprøjtning fostre varm.
  17. Holde mest laterale fosteret/fosterhinden mellem tommel- og indeks fingre af den erhvervsdrivende ikke-dominerende hånd (figur 3C). Altid være blid med hensyn til ikke forårsage nogen skade til fostrene.
  18. Placer dissektion mikroskop (10 X forstørrelse er ideel) og justere fokus, således at fosteret er i betragtning. Justere belysning til en bedre visualisering.
  19. Identificere den del, der vil blive injiceret (vitelline vene, dyr). For intravenøse injektioner, visualisere både vitelline venerne og deres anastomose først. For intra-fostervand injektioner, orient fosteret med højre side i betragtning.
  20. Nå målet plads med nålen som beskrevet nedenfor.
    1. For en intravenøs injektion, gøre som følger.
      1. Rotere livmoderen, så den vitelline vene, der er ved at blive sprøjtet er parallel til spidsen af nålen; Husk på, at injektionerne skal træffes mod de to vener anastomose.
      2. Lægge nålen på livmoderen ved en vinkel på 5° og gennembore livmodervæggen. Nu, at spidsen er mellem livmodervæggen og fosterhinden, Placer spidsen direkte på toppen af den vitelline vene.
      3. I en næsten tangerer vinkel, glide nålen over venen indtil facet gennemborer og forskud til fartøjet Det fremgår af en flash af blod set i nål tip (figur 3D).
        Bemærk: Adgang til venen kan tage et par prøver som nålen ikke kan gennembore vene med den første glide over venen.
    2. For en intra-fostervand injektion, gøre som følger.
      1. Rotere fosterhinden og finde et sted fartøjer til at gennembore.
      2. Punkt vinkelret på livmodervæggen nålen og gennembore gennem livmoderen, blommesækken og derefter fosterhinden. Vær omhyggelig med ikke at gennembore gennem enhver føtalt væv. Kontroller, at nålen er gået mellem lemmerne, som bekræfter, at nålen er i fosterhinden. Derefter fortsættes med indsprøjtning.
  21. Injicere den passende mængde af materiale ønskes (normalt 10-20 µL) ved at trykke på pedalen.
    Bemærk: Fordi injektoren skal opretholde visualisering af needle-tip gennem mikroskop på alle tidspunkter, en anden person skal læse markeringer på nål til at kvantificere det indskudte beløb og informere injektoren hvor meget volumen er overladt til at injicere. En diskussion inden injektionen mellem injektor og assistent er vigtigt at undgå enhver forvirring og forsinkelser. Dette er især vigtigt for intravenøse injektioner, fordi en forsinket fjernelse af nålen vil tillade en tilbagestrømning af venøse blod ind i kanylen og resultere i en forkert dosering.
  22. Hæve nålen fra injektionsstedet, når den ønskede mængde er leveret. Da der kan være nogle blødning fra fartøjet punktere site med intravenøse injektioner, hold presset med siden af nålen for 10-15 s for at stoppe blødningen.
  23. Gå videre til det næste fosteret. Fortsæt, indtil alle fostre af den lige uterin horn har været injiceres.
  24. Fjerne den venstre uterin horn fra maven og erstatte den lige uterin horn tilbage inde i bughulen.
    Bemærk: Lejlighedsvis, nålen skal genfyldes med injectant.
  25. Når alle fostre har været injiceres, erstatte livmoderen ind i maven (figur 3E). Sørg for at undgå en livmoder eller tarm Tarmslyng.
  26. Med en engangs overførsel pipette, sted ca 2 mL 1 x PBS i maven til at erstatte tab, følelsesløse.
  27. Luk fascia og maven i én sammenhængende lag ved hjælp af 4-0 polyglactin 910 suturer for at undgå at skade de underliggende organer under lukning (figur 3F - 3 G).
  28. Fjern tapen og overføre musen til et bur nedenunder en varmelampe. Pas på ikke at anbringe varme lampen for tæt til musen. Kontroller, at buret har sengetøj, mad og vand.
    Bemærk: Et Termostatstyret varme kammer kan også bruges. Musen er vågen, når det er oprejst og gå.
  29. Observere musen dagligt og give smertestillende medicin efter behov.
    Bemærk: Vi rutinemæssigt give meloxicam postoperative dage 1 og 2, og nogle gange på dag 3 Hvis musen viser tegn på smerte.
  30. Hvis gør en batch operation med det samme materiale, injektion, rense ud injektion nålen med steril PBS. Hvis indsprøjtning med et andet materiale, bortskaf kanyle i en skarpe container og bruge en ny nål.
    Bemærk: Vi anbefaler fremme unger med rugemødre umiddelbart efter fødslen, i tilfælde af dæmningen monterer en immunrespons på injectant og overførsler antistoffer til unger via modermælk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overlevelse og engraftment er vigtige foranstaltninger af succes for IUHCT eksperimenter. Afhængigt af de specifikke endpoints af et eksperiment, kan fostre, der modtog en IUHCT analyseres prænatalt ved en c-sektion eller efter fødslen. I gennemsnit spænder overlevelsesrate efter intravenøse injektioner fra 75-100%. Overlevelsesraten efter intra-fostervand injektioner tendens til at fair bedre end intravenøse injektioner, på omkring 85-100%.

I vores laboratorium tager uddannelse proces at opnå færdigheder i disse teknikker ca 8-12 måneder. For at vurdere erhvervelse af de færdigheder, der kræves for at udføre disse injektioner på en reproducerbar måde, overvåges praktikanter for fosterets overlevelse og donor celle engraftment på kort tid point efter IUT'EN. Det fremgår af de følgende kvalitetskontrol eksperimenter. Specifikt, 1 x 107 hele knoglemarv celler er isoleret fra C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ("B6 NGL") mus som tidligere beskrevet5 og er injiceres via den vitelline vene i svangerskabsuge dag-14 Balb/c fostre. I én gruppe, IUT'EN blev udført af en erfaren instruktør, og i anden gruppen af en praktikant, der har været praktiserende teknik for ~ 4 måneder. Repræsentative fluorescerende mikroskopi billeder af de høstede føtal lever 24 h efter IUT'EN er vist i figur 4A. Lever af fostre, der modtog IUT'EN af praktikanten fluorescerer mindre på grund af en lavere engraftment de transplanterede celler, normal god landbrugspraksis. Disse lever blev derefter analyseret for normal god landbrugspraksis+ donor celler ved flowcytometri at kvantificere engraftment niveauer. Forskellen i gennemsnitlig engraftment niveauer mellem de to injektorer korrelerer med billeder ses under fluorescerende mikroskopi (fig. 4B).

Mulighed for virale vektorer leveret via intra-fostervand rute til transduce celler i kontakt med fostervandet er eksemplificeret ved transduktion af epitel celler 48 h efter en intra-fostervand indsprøjtning af annonce-normal god landbrugspraksis (en adenovirus vektor transporterer normal god landbrugspraksis transgen10) i svangerskabsuge dag-12,5 fostre (figur 5A og 5B).

Figure 1
Figur 1 . Processen med at gøre et glas pipette nål med mikropipette puller. (A) Mount glas pipette og Fastgør det ved at stramme ringer på begge ender af puller. (B) når sikret, trække kontakten aktiveres varmen. Indstillinger vist er varme #1: 985 og Pull: 27. Den mørke cover glas skal være lukket under denne proces for sikkerhed. Det blev åbnet for fotosession formål. (C) mikropipette er adskilt. Kassér den nederste del og tage den øverste del af den adskilte mikropipette til de næste trin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Processen med slibning mikropipette til at forme spidsen af nålen. (A) dette panel viser den generelle opsætning af slibning. En lyskilde er nødvendig for at visualisere tip under mikroskop. (B og C) Mount mikropipette på en 15-20 ° vinkel. (D) A oprustning af vragrester forventes i hele slibeprocessen. Bruge en pensel til at klare tip til at få en bedre visualisering af slibeprocessen. (E) A godt jorden nål tip uden identificerbare chips eller takkede kanter er vist under en 4 X forstørrelse. (F, Gog H) En fornyet inspektion af jorden nål under en 10 X forstørrelse viser et godt jorden nål med en skarp spids og glatte kanter omkring spidsen. Sørg for at tjekke nålen i forskellige vinkler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Laparotomi og i utero transplantation. (A) barbering, bedøver, og tape en gravid dam og prep hendes underliv. (B) efter laparotomi, levere helhed af livmoderen uden for maven for en identifikation af alle fostre. (C) Position fosteret med kirurgens ikke-dominerende pegefinger og tommelfinger samtidig opretholde spænding med den tredje finger. Identificere spidsen af nålen under mikroskop i forhold til fosteret. (D) A flash af blodet tilbage-flyder ind i mikropipette nålen skal ses ved cannulation af den vitelline vene. (E) efter en afslutning af alle injektioner, placere alle fostrene tilbage ind i maven. (F) Luk i maven med et enkelt lag kører søm ved hjælp af 4-0 polygalactin 910 suturer. (G) når maven er helt lukket, lad dæmningen inddrive under en varmelampe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Engraftment donor hele knoglemarv mononukleære celler efter et vitelline vene injektion. (A) forskellen i graden af engraftment med (praktikant) og uden (instruktør) udsivning af celler er vist klart under fluorescerende mikroskopi. (B) procent kimærisme afspejler også den samme konstatering flow flowcytometri analyse. Hvert datapunkt repræsenterer leveren fra en anden injiceres fosteret. Eksperimentet blev udført af en elev og en instruktør. Fejllinjer udgør en standardafvigelse (SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Udtryk mønster af grøn fluorescerende proteiner i en føtal embryo 48 h efter en intra-fostervand indsprøjtning af annonce-NGL. (A) dette panel viser hornhinden (rød pil) og huden farves med normal god landbrugspraksis på E14.5 efter en intra-fostervand indsprøjtning af annonce-normal god landbrugspraksis på E12.5 (E12.5/E14.5). (B) en cryosection af bagsiden af embryo (angivet med en lys blå boks i panelet A) ved en højere forstørrelse viser, at den virale transduktion er begrænset til den overfladiske peridermal cellelag (røde pile) og ikke epidermis (epi). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In utero transplantation er en potentiel terapi for mange medfødte lidelser, der kan blive diagnosticeret tidligt i drægtigheden. Den murine model for IUT'EN giver forskere til at udforske den føtale miljø eller at eksperimentere med forskellige behandlingsformer. Afhængigt af hvad sprøjtes og hvad er at være målrettet, kan intravenøs eller intra-fostervand i utero transplantation give en pålidelig levering af en injectant til den ønskede plads.

Når du målretter specifikke organer, er det vigtigt at vælge en passende embryologiske alder af fosteret samt injektionsteknik. Mens intravenøs injektion af celler på E14 er ideel til at målrette den hæmatologiske niche, og den intra-fostervand injektion på E16 er ideel til lunge målretning, er disse ikke de eneste muligheder. For eksempel, kan intra-fostervand injektioner udføres for fostre så tidligt som E8 med ultralyd vejledning8. Systemisk levering er også muligt før E14 med ultralydsvejledt intra hjerte injektioner på E9 - E1011. Muligheden for at udføre injektioner på forskellige stadier af fetus' udvikling tilbyder store muligheder for forsøg at undersøge sikkerheden og effektiviteten af genet overførsler og celle transplantationer samt undersøger basale spørgsmål om udviklingsmæssige biologi.

Desuden, foruden en intravenøs og intra-fostervand levering andre steder er også tilgængelige for målretning afhængigt af formålet med terapien eller den videnskabelige spørgsmål bliver forfulgt. Den i utero intramuskulær tilgang har været brugt i en genoverførsel til muskuløse dystrophies12, en intraspinal tilgang til transduktion af rygmarven motoriske neuroner13, og en intrakranielle tilgang til genterapi overfører til målet centrale nervesystem sygdomme14. For i utero hæmatopoietisk celle transplantation er intrahepatisk og intraperitoneal ruter ekstra levedygtige muligheder som hver rute levering mål i sidste ende hæmatopoietisk niche15. Men ruten intravenøs transplantation giver mulighed for en mere effektiv homing af donor celler i hæmatopoietisk niche og en større dosering af donor celler, hvilket resulterer i generelt højere niveauer af stabil langsigtet donor celle engraftment uden tilføjet føtal dødelighed1.

De protokoller, vi har beskrevet ovenfor for udfører IUT'EN er kraftfulde og alsidige værktøjer, der giver mulighed for en unik i vivo tilgang til at studere stamcelle biologi, udviklingsmæssige immunologi og immunologiske tolerance induktion, udviklingsmæssige biologi, og Prænatal gen terapi/genom-redigering. Disse leveringsmetoder også har relevante kliniske implikationer og har været grundlag for undersøgelser af IUHCT og i utero genterapi i prækliniske store dyremodeller såsom hunde og får model4,16. De vil fortsætte med at fungere som et værdifuldt værktøj til at teste nye ideer i udviklingsmæssige biologi og udforske nye behandlingsformer for ødelæggende medfødt genetisk, hæmatologiske, immun og metaboliske forstyrrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gloves Cardinal Health 2D73DP65
Adson Forceps w/ teeth Fine Science Tools 11027-12
Adson Forceps w/o teeth Fine Science Tools 11006-12
Curved scissors Fine Science Tools 14075-11
Heavy Scissors Fine Science Tools 14002-13
Needle Driver Fine Science Tools 12005-15
Vicryl 2.0 Ethicon JB945
Transfer Pipette Medline GSI135010
Cotton Tipped Applicators Medline MDS202000
50 mL Conical tube Fischer Scientific 14-432-22
Tape 3M 1527-1
Eye lubricant Major LubriFresh 0904-6488
Heating Pad K&H 3060
Stereomicroscope Leica MZ16
Injector Narishige HI01PK01
Glass Capillary tubes Kimble 71900-100
Vertical Micropipette Puller Sutter Instruments P-30
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV-10
IM-300 Pneumatic Microinjector Narishige IM-300
Insulin Syringe  BD  305935
Filter Genesee Scientific 25-244
Compac5 Anesthesia Machine VetEquip Compac5 901812 
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
N2 gas Airgas NI 125
O2 gas Airgas OX 125
Ad-GFP viral vector Penn Vector Core H5'.040.CMV.eGFP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
  2. Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
  3. Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126, (10), 1245-1254 (2015).
  4. Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124, (12), 1987-1995 (2014).
  5. Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108, (13), 4268-4274 (2006).
  6. Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101, (4), 1359-1366 (2003).
  7. Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
  8. Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15, (3), 579-587 (2007).
  9. Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, (6), 991-999 (2016).
  10. Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
  11. Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18, (7), 719-726 (2011).
  12. Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15, (7), 531-536 (2008).
  13. Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
  14. Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
  15. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
  16. Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19, (2), 201-209 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics