Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Udvikling af organoider fra musegravyse som in vitro-model til at udforske hypofysestamcellebiologi
Chapters
Summary February 25th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hypofysen er den vigtigste regulator af kroppens endokrine system. Denne artikel beskriver udviklingen af organoider fra musegravfysen som en ny 3D in vitro-model til at studere kirtlens stamcellepopulation, hvis biologi og funktion fortsat er dårligt forstået.
Transcript
Vores organoidmodel er yderst værdifuld til at udforske hypofysestamcellebiologi i homeostatiske såvel som hypofyseombygningsbetingelser, såsom i neonatal modning af kirtlen, aldringsassocieret funktionel tilbagegang og tumorvækst i kirtlen. Til dato er vores hypofyseorganoidteknik det eneste tilgængelige værktøj til pålideligt og robust at dyrke og udvide primære musepifysestamceller. Forevisning af proceduren vil være Emma Laporte og Charlotte Nys, ph.d.-studerende i min forskningsgruppe.
Til at begynde med skal du vaske musehovedet med deioniseret vand for at fjerne blodet. Sprøjt 70% ethanol på hovedet for at generere et sterilt miljø. Fjern derefter huden mellem ørerne ved hjælp af sterile kirurgiske værktøjer.
For at åbne kraniet skal du bryde næsebroen med steril saks. Yderligere åbne kraniet startende fra næsebroen mod ørerne på begge sider. Fjern kraniet og hjernen med steril pincet uden at røre hypofysen.
Fjern membranen sellae med stump pincet. Derefter adskilles den forreste lap under et stereomikroskop fra de bageste og mellemliggende lobes. Isoler forsigtigt den forreste lap med stump pincet og opsaml den i en 10 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende tre ml medium A.Tilsæt to ml forvarmet 2,5% trypsinopløsning.
Inkuber ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Tilsæt to milliliter forvarmet DNAse-opløsning, og hvirvl Erlenmeyer-kolben 10 gange. Lad hypofysen synke til bunden og fjern supernatanten.
Tilsæt to milliliter forvarmet trypsinhæmmeropløsning og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Fjern supernatanten, når hypofysen synker til bunden. Tilsæt to milliliter forvarmet medium B og inkuber i fem minutter.
Tilsæt to milliliter forvarmet medium C til dette og inkuber i 15 minutter. Lad hypofysen synke til bunden og fjern supernatanten. Skyl det derefter tre gange med forvarmet medium C.Tilsæt to milliliter forvarmet medium C.Aspirate og udvis hypofysen med en steril, flammepoleret Pasteur-pipette flere gange, indtil fragmenter ikke længere er synlige.
Overfør suspensionen til et 15 ml rør indeholdende 4,5 ml forvarmet DNAse-opløsning. Kolben skylles tre gange med to ml forvarmet medium C, og suspensionen overføres til røret. Bland den opsamlede cellesuspension og filtrer den gennem en 40 mikron cellesil i et 30 ml rør.
Skyl røret og cellesilen tre gange med to milliliter medium C, og overfør suspensionen til røret. Fyld en pasteur pipette af glas med to milliliter BSA. Placer spidsen af pipetten i bunden af røret, og pipetter forsigtigt ud for at danne et synligt densitetslag.
Centrifuge ved 190 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten, og genophænd cellepillen i en milliliter iskold avanceret DMEM / F-12. Kvantificer derefter cellerne med en celletæller.
Centrifugering af cellesuspensionen ved 190 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. Resuspend cellepillen i avanceret DMEM / F-12 for at nå en celletæthed på 1,1 gange 10 til de 6. celler pr. Milliliter. Tilsæt ECM til det ønskede volumen cellesuspension i et forhold på 30:70 og bland godt.
Deponer en 30-mikroliter dråbe af denne blanding i hver brønd af en forvarmet 48-brønds plade. Vend pladen på hovedet, og lad ECM størkne ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Efter inkubationen tilsættes forsigtigt 250 mikroliter forvarmet hypofyseorganoidmedium suppleret med 10-mikromolær ROCK-hæmmer.
Hver anden til tre dage skal du ændre mediet uden ROCK-hæmmer i 10 til 14 dage, indtil organoiderne er fuldt udvoksede. For at passere organoiderne skal du først aspirere mediet forsigtigt og tilsætte 400 mikroliter iskold avanceret DMEM / F-12 for at opløse ECM. Saml derefter organoiderne i et mikrocentrifugerør.
Vask brønden med 400 mikroliter iskold avanceret DMEM/F-12. Centrifugering af røret ved 200 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten, og tilsæt 400 mikroliter forvarmet TrypLE Express-enzym.
Bland ved at vende røret flere gange og inkuber ved 37 grader Celsius i fem minutter. Tilsæt 400 mikroliter iskold avanceret DMEM/F-12. Centrifugering ved 200 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten.
Genophæng pillen med 100 mikroliter iskold avanceret DMEM/F-12. Smal en P-200-spids og brug spidsen til at adskille organoiderne ved kraftigt pipettering, indtil der opnås organoidfragmenter. Tilføj 800 mikroliter avanceret DMEM/F-12.
Centrifugering ved 190 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. For at passere organoiderne skal pelleten suspenderes igen i et passende volumen avanceret DMEM / F-12 og tilsætte ECM i et forhold på 30:70. Bland godt.
Fortsæt med at frø og dyrke organoiderne som beskrevet i tekstmanuskriptet. Dissocierede enkeltceller fra den forreste lap blev podet i ECM og dyrket i hypofyseorganoidmedium. 14 dage efter såning var organoiderne fuldt udviklede og nåede en diameter på op til 500 mikrometer.
På dette stadium udviste organoiderne cystisk morfologi med et epitellag, der omslutter et lumen. Det anbefales ikke at bruge de brønde, hvor tætte strukturer vises efter vækst. Til passaging blev organoidfragmenter brugt til såning.
Syv dage efter passaging blev gunstig organoid genvækst observeret med cystiske strukturer. Tætte organoider bør kasseres, da de ugunstige organoider kan overtage kulturen. Immunofluorescensfarvningsanalyse for epitelmarkørerne E-cadherin og cytokeratiner 8 og 18 bekræftede organoidernes epitelkarakter.
Ekspression af hypofysestamcellemarkører Sox2 og Trop2 demonstrerede stammen, og hypofysespecifik markør LHX3 viste hypofysefænotype af organoiderne. Ekspression af markøren Ki67 viste, at de organoid-konstituerende celler er i en proliferativ tilstand. RTQ PCR-analyse viste højere ekspression af stammemarkører i organoiderne end i den forreste lap, selv efter flere passager, hvilket validerede berigelsen af stamceller.
Det er vigtigt at plade det passende antal enkeltceller i ECM-kuplen ved den indledende såning, og når man passerer organoiderne, skal man huske at genfrø fragmenter og ikke enkeltceller.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
