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シアノ バクテリア阻害のフィコビリタンパク質の吸光光度定量

Biochemistry

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Summary

ここでは、定量的阻害吸光光度法によるシアノ バクテリアのフィコビリタンパク質の内容を決定するためのプロトコルを提案する.抽出手順でした; 他のシアノ バクテリアや藻類の系統に適用も正常にただし、色素の吸収スペクトルの違いは、各緊張に吸光光度式を個別にテストする必要が。

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Zavřel, T., Chmelík, D., Sinetova, M. A., Červený, J. Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis. J. Vis. Exp. (139), e58076, doi:10.3791/58076 (2018).

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Abstract

モデル シアノ バクテリア阻害フィコビリタンパク質含量の定量のための単純なプロトコルです。フィコビリタンパク質は、フィコビリソーム、シアノ バクテリアにおける主要集光性アンテナの最も重要なコンポーネントといくつかの藻類の分類群。阻害のフィコビリソームを含む 2 つのフィコビリタンパク質: フィコシアニン、アロフィコシアニン。このプロトコルでは、シンプルで効率的とフィコシアニン、アロフィコシアニンこのモデル シアノ バクテリアでの定量のための信頼性の高い方法をについて説明します。フィコビリタンパク質抽出吸光光度定量のいくつかの方法を比較しました。このプロトコルに従って抽出プロシージャもに応用したArthrospira sp.CyanotheceSynechococcuselongatusの spスピルリナsp.など他のシアノ バクテリアの系統藍藻sp 紅藻チノリモに関して。様々 な分類から特定のフィコビリタンパク質の消散係数が異なることができ、それは、したがって、すべての単一のひずみの吸光光度定量法を個別に検証にオススメします。プロトコルは、少し時間が必要です、のみ標準装備が必要なので、任意の標準的な生命科学の研究所で実行できます。

Introduction

fPhycobiliproteins は原核生物のシアノ バクテリア (ラン藻) 光捕集アンテナといくつかの真核生物分類群 (Glaucophyta紅藻の主要コンポーネントを表す水溶性色素蛋白複合体、およびCryptophyta)1。超分子複合体フィコビリソームを呼ばれてとして主に発生して、彼らは通常間質側Cryptophytaで、フィコビリタンパク質をローカライズする場所を除いて光合成膜の表面に接続されて、チラコイド ルーメン2。日までフィコビリタンパク質の 4 つのタイプが識別されている: コア アロフィコシアニンと末梢フィコシアニン、フィコエ リスリンと phycoerythrocyanin1。主要集光性複合体としてフィコビリソームは藻類やシアノ バクテリアの大量文化生産性の重要な要因の 1 つを表します。フィコビリソーム切り捨ては強い光3の下でバイオマス蓄積を高めることができることが実証されています。一方、中程度あるいは低照度下でアンテナ切り捨ては成長率とバイオマス蓄積低減3,4で起因しました。フィコビリタンパク質、食品添加物、化粧品業界、医薬品、食品の着色剤と蛍光として商業栽培されているプローブをフローサイトメトリー、蛍光イムノアッセイ蛍光顕微鏡5のアプリケーション。

このプロトコルは、モデル シアノ バクテリア阻害のフィコビリタンパク質の定量分析に焦点を当てください。シアノ バクテリアが、最も早く酸素光合成独立栄養;彼らは 24 億年6以上の地球の生物圏を形成しました。彼らは、窒素、炭素、酸素、およびその他の要素のグローバル物質循環に重要な役割を果たします。シアノ バクテリアの間で単細胞ひずみ阻害全体のゲノムを持つ最初のシアノ バクテリアだったのでユニークなポジションを得たシーケンス78、外因性 DNA9、当然のことながら変形、安定的かつ比較的高速な成長10,11を実行します。阻害アンテナのコアコンポーネントにアロフィコシアニン、不可欠な膜タンパク質に関連付けられてし、添付のフィコシアニンはチラコイド膜周辺に位置します。

フィコビリタンパク質抽出と定量化のためのいくつかのメソッドは、このプロトコルで比較されます。Cyanothece sp Synechococcuselongatusスピルリナsp.Arthrospiraを含む他のシアノ バクテリアの系統だけでなく阻害、最終的な抽出プロシージャが正常に適用されましたsp.藍藻の sp は、紅藻チノリモにも正常に適用されました。したがって、このプロトコルで提案する手法は、フィコビリタンパク質抽出のための普遍的な方法として考えることが。ここに抽出手順が説明されている最高のフィコビリタンパク質利回りクロロフィルの残渣の最も低いコンテンツと共に提供されるにもかかわらず、いくつかのテストの抽出方法は、総蛋白収量の結果、フィコビリタンパク質を抽出します。クロロフィルの内容を減らすことは、正しいフィコシアニン、アロフィコシアニン吸光光度定量のために不可欠だった。

フィコビリタンパク質吸収スペクトルが様々 な藻類やシアノ バクテリア種12,13,14,15,16,17の間で大きく異なるし、も単一のシアノ バクテリア属18系統。したがって、特定の波長と吸収係数としてフィコシアニン、アロフィコシアニン阻害での定量は一般的に他の系統に適用されません。また、フィコエ リスリンと他の藻類とシアノ バクテリアで見つけることができる phycoerythrocyanin、阻害は含まれません。阻害以外の系統のフィコビリタンパク質の定量を目的として、各緊張に吸光光度式を個別に評価することをお勧めします。

プロトコルには (細胞ペレットおよび 1 時間蛋白質の抽出の一晩凍結乾燥) 長いの 2 つの手順が含まれています、フィコビリタンパク質定量化のための総労働時間は 2 時間以内。

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Protocol

1 シアノ バクテリア栽培

  1. エルレンマイヤー フラスコまたは < 10 (例えば、17 mM HEPES10を使用して) の pH を維持するためにバッファーに格納された BG11 の中20フォトバイオリアクター10,19 阻害細胞を養います。
    注: 標準的な栽培条件温度制御を必要とする (通常は、30 ° C、最適温度は 35 ° C)21照明 (800 µmol [光] 最大強度の通常、白色光/[m2·s])21、および CO2供給 (400 mL フラット パネル フォトバイオリアクターの CO2濃度を飽和成長は 1,700 ppm)21
  2. 文化の密度を決定する 730 でオンカラム文化の光学密度を測定 nm (外径730) を用いたキュベット光路 1 cm. の代わりに、診断または自動化されたセルを用いた顕微鏡下のセルをカウントカウンター。

2. サンプル準備

  1. フィコビリタンパク質の劣化を防ぐために低照度下で働きます。
  2. 安全ロック チューブに文化を懸濁液の 3 x 1 mL を収穫します。トリプリケート測定の技術的な間違いの推定のために使用します。無菌条件下で文化サンプリングを実行するには、層流フードのセルを収穫し、適切な作業と安全性のプラクティスに従ってください。
  3. 15,000 × g 5 分正しくバランスのとれた遠心ローターに注意を払うの温研究室で細胞を遠心します。遠心分離後、上清を破棄します。ペレットを邪魔しないようにします。
  4. サンプルを冷凍庫に入れてください。長期保存を-80 ° C でサンプルをしてください。これはフィコビリタンパク質の劣化を防ぐために必要です。短期的なストレージ、-20 ° C で十分です。
  5. サンプルを一晩凍結乾燥します。適切な凍結乾燥プロセスの凍結乾燥機コンデンサー-60 ° C 以下の温度を保ち、凍結乾燥機の圧力チャンバー周り 1 hPa。
  6. 凍結乾燥のサイクルを終えた後、空気中の水分の再吸収を防ぐために、できるだけ早くチューブを閉じます。

3. セルの均質化と抽出を顔料

  1. 各サンプル管にガラス ビーズ (直径 2 mm) を 4 枚を追加し、チューブを閉じます。
    注: 均質化用安全ロック チューブのふたが薄すぎる、それ間破るができる均質化;したがって、このプロトコルの強い蓋安全ロック チューブのみお勧めします。
  2. サンプルは 15 のガラスビーズを均質化研究所温ホモジナイザーで s。
    注: 正しく均質化されたサンプルは、安全ロック チューブの全体の内側の表面に広がっています。
  3. 1 mL の PBS バッファー (pH 7.4) のフィコビリタンパク質を抽出するためにサンプルへの 4 ° C に冷却を追加します。
    注: このステップから抽出したタンパク質の劣化を防ぐために氷のサンプルを保持します。これは重要です。
  4. 5 サンプルを PBS でミックス研究所温ホモジナイザーで s。
    注: 混合した後、サンプルは緑がかったです。
  5. 混合した後、顔料の劣化を防ぐためにふた付きの氷浴 60 分カバーのための氷のサンプルを保ちます。
  6. フィコビリタンパク質抽出の 60 分後 15,000 × gで 5 分遠心ローターのバランスをとるために注意を払うのための 4 ° C でサンプルを遠心します。
    注: 遠心分離後上澄みシアン ブルーの色をが。

4. フィコビリタンパク質の定量

  1. 吸光光度測定の前に空白として PBS バッファーを使用して基準に分光光度計を調整します。
  2. 分光光度計を校正すると、いったん 1 つの分光光度計のキュベットから PBS を破棄し、破棄されたバッファーの代わりに抽出されたフィコピリン蛋白質の上澄みをピペットします。
  3. オンカラム、スリット幅は 0.5 を使用してフィコビリタンパク質濃度を定量化 nm。
    1. フィコシアニン、アロフィコシアニン 615 で空白の PBS バッファーに対して phycocyanobilins の吸光度を測定 nm (615) と 652 nm (652)、それぞれ、720 で細胞の残骸の吸光度を測定して nm (720)。
    2. (1) と (2) のベネットと Bogorad12フィコシアニン、アロフィコシアニン方程式に従っての濃度を計算します。
      Equation 1
      Equation 2
      注:615,652, と720は、分光光度計の吸光度の線形範囲に収まるようにします。必要に応じて、PBS バッファーでサンプルを希釈します。
  4. 元のサンプル中の顔料濃度を再計算します。サンプル中の顔料濃度は式 (1) と (2) 文化の 1 mL と 1 mL 抽出バッファーの使用分析の結果と直接対応しています。シアノ バクテリアのサンプルや PBS バッファーの別のボリュームを使用する場合最終的な顔料濃度は式 (3) に従って計算する必要があります。
    Equation 3(3)
    注: セルの乾燥重量あたりの正規化フィコビリタンパク質コンテンツの場合最終的な顔料濃度計算するか式 (4) によるとEquation 4(4)

5. (オプション) 細胞の乾燥重量の測定

  1. 分析的なバランスの 3 つの空の安全ロック チューブの重量を量る。
    注意: 安全なロック チューブ乾燥していることが重要です。チューブを湿潤環境に格納する場合それらを計量する前に乾燥機の凍結で数時間チューブを乾燥します。チューブを優しく操作と材料と研究者の指の間の接触を避けるために手袋をはめた手のパウダー フリーのみ。すべての者を維持し、クリーン チューブへの任意の材料の転送を避けるために遠心分離機します。
  2. 15 mL の円錐管に文化を懸濁液の 1 x 15 mL のサンプルです。
  3. 文化のサスペンション 3 追加 15 mL コニカル チューブ、4,000 x gで 10 分間遠心ローターのバランス研究所温で 15 mL の円錐管の水含む各 15 mL を遠心します。遠心分離の後上澄みの 12 mL を破棄します。
  4. 残りの上清でペレットを再懸濁し、混合物の 3 x 1 mL をピペットで 3 つの 1.5 mL 安全ロック チューブに転送します。ペレットのいくつかの残り物は、15 mL の円錐管に残る場合に円錐管、渦または横に振る残り再懸濁しますチューブ、ペレットし、3 1.5 mL 安全ロック チューブ (すでに containi の混合物の 3 x 0.5 mL に転送する 1.5 mL の脱イオン水を追加します。ng ペレットの 3 x 1 mL) ピペットと。
    注: 3 1.5 mL 安全ロック チューブでペレットを分割乾燥重量測定の技術的なエラーの推定できるようになります。
  5. 1 mL の水を含むその他の 1.5 mL 安全ロック チューブを遠心ローター 5 分バランス研究所温 15,000 × gで 1.5 mL 安全ロック チューブに細胞を遠心分離機します。、遠心分離後、上清を破棄します。
  6. 冷凍庫の中にサンプルを置きます。長期保存のためサンプルを保つ-80 ° c;短期保存、-20 ° C で十分です。
  7. サンプルを一晩凍結乾燥します。適切な凍結乾燥プロセスの凍結乾燥機コンデンサー-90 ° C 以下の温度を保ち、凍結乾燥機の圧力チャンバー周り 1 hPa。
  8. 凍結乾燥後、管を閉じて、分析的なバランスのサンプルの重量を量る。
    注: 細胞の乾燥重量あたりのフィコビリタンパク質コンテンツ正規化の乾物重の値を使用できます。

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Representative Results

BG11 栽培中20 (17 mM HEPES を補充) 25 ° c、50 µmol (光子) の強さの暖かい白色光の下で阻害されたシェーカーのエルレンマイヤー フラスコで培養として栽培初期メソッドのテスト/(m2·s) と養殖の雰囲気の中で 1% CO2 。、栽培期間中文化安全ロック チューブにサンプリングされた (15,000 x gで 5 分間実験室の温度) を遠心、上清が破棄され、サンプルいたどちらか-80 ° C で保存の準備として凍結乾燥、このプロトコルの個々 のステップまたは-20 ° C または比較抽出と数量分析-80 ° C で保存します。

テストの抽出手順は、超音波処理、PBS バッファー、および凍結融解内ジルコニア ビーズを均質化によってセル中断を含まれています。図 1は、異なる抽出方法の結果をまとめたものです。このプロトコルで説明するメソッドは、最高のフィコビリタンパク質利回り、最低クロロフィルの汚染抽出バッファーと共に提供。クロロフィル検出された抽出バッファー内セル中断の超音波を使用した場合。氷上超音波槽のサンプルを凍結融解のサイクルを繰り返し、高い利回りをタンパク質抽出バッファーで起因しました。しかし、同時にクロロフィル抽出バッファー内の濃度増加 (図 1 埋め込み)、適切なフィコビリタンパク質コンテンツ定量化を除いた。

最適な均質化当時の両方の短い s. 均質化 15 (5 s) 長く (20 s) 期間よりも少し下のフィコビリタンパク質利回りを提供は、図 2に示すように。直径 2 mm のガラス玉とセルを均質化は最高の利回りは径 0.5 mm、1 mm や 4 mm のガラス製のビーズ、ジルコニア ビーズ直径 0.5 mm のまたは海砂穀物を比較した場合で起因しました。PBS 抽出バッファーは、フィコビリタンパク質抽出 (図 3) 最適なバッファーとしてテストされました。NaCl 100 mM または 150 mM KCl PBS バッファーするか水の添加は、フィコビリタンパク質抽出効率を増加しなかったし、同じは 20 mM 酢酸緩衝液を用いた抽出 (図 3) に行きました。最適なフィコビリタンパク質抽出時間より多くの時間 (最大 240 分) 後抽出バッファーのフィコビリタンパク質濃度は大幅に変更されないため、60 分であった (図 4)。

またフィコビリタンパク質測定 (図 5) 分光光度計の直線範囲をテストし、フィコシアニン、アロフィコシアニン基準 (図 6) を使用してフィコビリタンパク質定量化のいくつかの方程式を比較します。このプロトコルで使われる分光光度計が 0.1 - 間の線形吸光度範囲を示した 3.0 (図 5)。タンパク質のスペクトルを抽出のでいたその極大吸収約 620 nm (620)、652 nm 吸収 (652)620 (図 7)652 (最大の分光光度計の直線性の 33% であったアロフィコシアニン吸光度) は、1.16 の652までテストされました。式 (1) と (2) のベネットと Bogorad12提供フィコシアニン、アロフィコシアニン基準すべてのテスト済みの方程式 (図 6) の間での最高の再建。ストレプトマイシン硫酸塩、膜の除去の断片含んでいるクロロフィル、いくつかの以前の研究で使用を示した (図 7) を抽出するためには不要。

代表的な実験の阻害は光密度の定義された範囲内で急激な成長段階でセルを行ったタービドスタット政権のフォトバイオリアクター25で培われた (680 で測定した OD nm680) 新鮮な栽培中 (17 mm HEPES バッファー BG11 中)11,26によって制御された希釈による。文化は 32 ° C で栽培され、入力空気に 0.5% の CO2が含まれています。文化は赤い光で照らされた (λmax: 633 nm、λ1/2: 20 nm) 25-1100 µmol (光子) の強さの/(m2·s)、一緒に青色光 (λmax: 445 nm、λ1/2: 20 nm) 25 µmol (強度の光子)/(m2·s)。フォトバイオリアクター ベースによる文化サスペンションの光学密度を測定し、0.52 - に設定された範囲の外径680 0.58 (2 x 107 4 x 107セル/ml)。文化は、順化に十分な時間を提供するために、少なくとも 24 時間ごとの特定の光の強度の下で栽培しました。成長安定を達した後文化は乾燥重量 (このプロトコルの手順 2.1 2.8) によると、細胞数、フィコシアニン、アロフィコシアニン コンテンツにサンプリングされました。光強度の増加の下でフィコビリタンパク質評価の結果は、図 8のとおりです。阻害最高照度下で細胞の乾燥重量 (280 fg/セル) の 3% に低照度下で細胞の乾燥重量 (505 fg/セル) の 12% からフィコビリタンパク質量の低下。

Figure 1
図 1: いくつかの参照方法をこのプロトコルで説明されているメソッドの抽出効率の比較。(黒いバー) フィコシアニン、アロフィコシアニン (白棒) 粗蛋白質抽出液中の濃度は、60 min メソッド A PBS バッファーで抽出はこのプロトコルで記述されている後に測定しました。メソッド B は次のように変更されました: 収穫後セルがあった (15,000 x gで 5 分間実験室の温度) を遠心分離して一晩-20 ° C で保存されています。凍結試料が 120 超音波 4 ° c、s と、フィコビリタンパク質 60 分メソッド C は-80 ° c 30 分、細胞ペレットを凍結乾燥で収穫された細胞のペレットを格納することによってメソッド B から変更されたため PBS バッファーで抽出しました。、と乾燥ペレットに追加の PBS バッファー。方法 D は、チョンから変更されました。16: 凍結乾燥後 (メソッド C と同じ)、1% ストレプトマイシン硫酸塩バッファー (pH 5.5) と酢酸 Na の 0.25 mL に追加されました (0.5 mm 径) とジルコニウム ビーズの 0.25 mL と共に、乾燥細胞ペレットとサンプルで 2 回ホモゲナイズ60、ホモジナイザーで s。均質化後、Na 酢酸 1% ストレプトマイシン硫酸塩バッファー (pH 5.5) と別の 0.5 mL のサンプルに追加された、チューブ、vortexed、および 30 分法 E から成っていた PBS バッファー内の単一凍結融解サイクルのため氷の上タンパク質抽出と4 ° C で 24 時間のための蛋白質の抽出メソッド F (はめ込み図) は、氷上 sonication によって続いて、液体窒素凍結細胞 (当初は、凍結乾燥し、PBS バッファーで再停止される) の 1 つと六つのサイクルから成っていた。重要なクロロフィル粗蛋白質抽出物の存在、ため、フィコビリタンパク質の方法 F 内定量化されていません描かれている値は、標準偏差を表す誤差範囲で 3 つの技術的な複製から平均を表します。(1) と (2) この議定書の方程式によると色素濃度を算出しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: フィコビリタンパク質抽出効率に及ぼす均質化時間。(このプロトコルの手順 3.1 3.5) によると阻害細胞の凍結乾燥ペレットは 5 のホモジナイザーのガラスビーズと乱れた s、15 s、20 s。描かれている値は、標準偏差を表す誤差範囲で 3 つの技術的な複製から平均を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 様々 な抽出バッファーのフィコビリタンパク質抽出効率。PBS バッファー、NaCl 100 mM または 150 mM KCl の添加 PBS バッファー、100 mM の NaCl や KCl Hemlata Fareha22, によると 150 mM 脱イオン水、鄭によると酢酸ナトリウム 20 mM で、フィコビリタンパク質抽出ら 。16します。 このプロトコルの手順 4.1 4.3 に従って 4 ° C で抽出を行った。描かれている値は、標準偏差を表す誤差範囲で 3 つの技術的な複製から平均を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 時間で抽出バッファーのフィコビリタンパク質安定。このプロトコルの手順 4.1 4.3 に従ってを実行抽出手順の後 PBS バッファー (pH 7.4) のフィコビリタンパク質抽出物ないの (円) 重要なフィコシアニン、アロフィコシアニン (正方形) の劣化とは、最大で 4 時間の 4 ° C で保存されていました。破線は、最小二乗法による計算時間のポイントの線形フィットを表します。描かれている値は、標準偏差を表す誤差範囲で 3 つの技術的な複製から平均を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: フィコシアニン、アロフィコシアニン濃度の代表的な測定阻害します。懸濁液を高密度培養 (フィコシアニン: 456 μ G/ml、アロフィコシアニン: 106 μ G/ml) フィコシアニン、アロフィコシアニン 19 μ g/mL の濃度まで希釈し徐々 に。描かれている値は、標準偏差を表す誤差範囲で 3 つの技術的な複製から平均を表します。点線は、最小二乗法によって計算される濃度ポイントの線形フィットを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 顔料基準におけるフィコシアニン、アロフィコシアニン濃度推定します。フィコシアニン、アロフィコシアニン顔料基準の内容は、ベネットと Bogorad の12の方程式によるとオンカラム測定した Lüder13、サンパス ワイリーと Neefus15、エヴァンス14チョン16. 蛋白質含量 (フィコビリタンパク質を決定するために必要な) 基準で (最終の pH の 11.25)、ビシンコニン酸、炭酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム 0.1 N NaOH 溶液を用いて定量化4% (w/v) 銅 (ii) との反応では、五水和物27、標準蛋白質としてウシ血清アルブミンを使用して硫酸塩します。ベネット ・ Bogorad の式を提供両方の顔料の最高の復興: フィコシアニン標準の 96% と標準アロフィコシアニンの 99%。描かれている値は、標準偏差を表す誤差範囲で 3 つの技術的な複製から平均を表します。破線は、100% ポイントを強調表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: 粗蛋白質の吸収スペクトルに及ぼすストレプトマイシン硫酸抽出 PBS バッファーにします。(A) 抽出プロシージャ PBS バッファー (円) と 1% を添加した PBS バッファー メソッド F を行ったため図 1の凡例で説明するように超音波を使用してこのプロトコルまたは (B) の手順 4.1 4.3 に示すようストレプトマイシン硫酸塩 (正方形)。このプロトコルの手順 5.1 5.4 に従ってフィコビリタンパク質の定量を行った.描かれている値は、標準偏差を表す誤差範囲で 3 つの技術的な複製から平均を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 8
図 8: (円) フィコシアニン、アロフィコシアニン (正方形) での濃度阻害25-1100 µmol(photons)/(m2·s) の強度の赤オレンジ色の光の下で栽培されています阻害文化は入力の空気、Zavrelによるとタービドスタット政権で 17 mM HEPES BG11 栽培培で 0.5% CO2で 32 ° c、フォトバイオリアクターで栽培しました。11します。 このプロトコルによるとフィコビリタンパク質濃度を測定し、このプロトコルのセクション 2 の説明に従って細胞の乾燥重量ごと最終フィコビリタンパク質コンテンツの正規化されました。破線は、最小二乗法で計算、計測ポイントの累乗フィットを表します。描かれている値は、標準偏差を表す誤差範囲で 3 つの技術的な複製から平均を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

このプロトコルでは、単純な高速で、再現性のあるモデル シアノ バクテリア阻害フィコビリタンパク質含量の定量法について説明します。セルの均質化、蛋白質の抽出、フィコシアニン、アロフィコシアニン定量化のいくつかの方法が比較され、最終的なプロトコルは、すべて単一の最適な手順の組み合わせを表します。代表的なデータとして光強度の増加の下で阻害細胞のフィコビリタンパク質の内容の定量化を行った。このプロトコルの利点は、にもかかわらず、分析は、同様の時間といくつかの以前に発行された方法12,13,14,15,16実験装置を必要とします。クロロフィルはリリースしない抽出バッファーと、したがって、フィコビリタンパク質測定を高精度で推定できます。

フィコビリタンパク質分析に必要な細胞懸濁液の量は、文化の密度によって異なります。1.5、2 x 107セル/mL、約の細胞密度の OD730とカルチャまたは約 20 mg/L のフィコビリタンパク質コンテンツ文化の 1 mL の試料体積を最適化します。希薄化後の文化の場合文化の大量を収穫します。その一方で、高密度培養の場合収穫高密度培養をボリュームの低い文化、フィコビリタンパク質部分的抽出後にセルに残っている危険性があります。同様に、細胞懸濁液乾物定量に必要な量の文化の密度によって異なります。15 mL の採取量は、1.5 OD730または約 2 × 107細胞/ml の密度の細胞培養に最適です。低密度文化または下位のボリュームに、測定誤差が増やすことができます。それどころか、大きな文化ボリュームや密度の高い文化より良い方法の解像度を提供します。

プロトコルの重要なステップは、高収率と高い特異性の両方を提供する必要がありますセルの均質化とフィコビリタンパク質抽出です。最高の利回りと同時最大タンパク質の保全とエキスの純度はサンプルを凍結乾燥、ガラスビーズ、によって乾燥細胞ペレットを均質化、PBS バッファー (のフィコビリタンパク質の抽出を実行することによって達成されました。図 1)。クロロフィルによって粗蛋白質抽出物の小さな汚染もフィコビリタンパク質コンテンツ過大評価につながることができます、ので、PBS バッファーを追加して、クロロフィル抽出を避けるために必要です。クロロフィル検出された粗野なエキスのセル中断の超音波を使用した場合。示すように図 1の示されて定期的な超音波処理サイクル、クロロフィル増加抽出液中の量。量がタンパク質を抽出する一方、(280 吸光度によって検出された nm) 超音波処理サイクルを繰り返し後も増加しました。したがって、超音波処理と組み合わせることで液体窒素中で凍結融解サイクル) の使用は総蛋白質の抽出に適した方法として表示されます (無料と膜結合タンパク質は細胞から解放される);ただし、フィコビリタンパク質吸光光度定量を目的としてそれはお勧めできません。チョンクロロフィル16.の膜片を除去するために 1% ストレプトマイシン硫酸塩の使用をお勧めしますここでは、ストレプトマイシン硫酸塩の使用は、以来、クロロフィルタンパク質抽出物 (図 7) での削減には至りませんでしたが必要になること登場。にもかかわらず、単一の超音波サイクル 120 の細胞を効率的に中断しなかった (メソッド B および C、図 1)、他の方法 (例えばメソッド F図 1または図 7 bに示される方法に記載されている) を確認効率的なセル中断法22,28をされている超音波照射の前の調査結果。フィコビリタンパク質抽出22,28、効率的な方法として報告も以前簡単な凍結融解のサイクルがここで説明するテスト (法 E、図 1 の最低利回りを提供する一方で、).セルの均質化 (2 x 60 抽出バッファー内 s) ジルコニウムによるビーズ凍結乾燥した細胞ペレット (方法 D,図 1) の 15 s 均質化よりも効率としてテストされました。抽出バッファー内の均質化のプロシージャは長く均質化時間 (10 分)29と以前述べた。各均質化サイクル中に大幅熱さサンプルから 2 分より長いための均質化はテストしませんでした。文献で他のセル中断の方法が述べたように、フランス語を押す16または研削13,15,30; の活用を含むもしかし、このような方法は、この研究ではテストしませんでした。

15 の蛋白質の抽出を行った PBS バッファーで s (図 2)。バッファーの pH は 7.4 フィコビリタンパク質抽出22最適として以前報告しました。NaCl や KCl の追加が矛盾する前の観察22フィコビリタンパク質抽出効率 (図 3) は改善されませんでした。ただし、図 3で示したように、リン酸緩衝生理食塩水液このプロトコルにおいて含まれている 154 ミリメートルを確立する許可しない (に加えて 5.6 mM ナ2HPO4と 1 mM KH2PO4)、塩化ナトリウム、塩化ナトリウム無料 PBS 抽出バッファー コントロールとして。また、PBS バッファーとナトリウム酢酸バッファー16抽出効率を比較しました。リン酸ナトリウムとカリウム リン酸 PBS バッファー内の組み合わせより高いフィコビリタンパク質が得られます (図 3) を提供されています。この発見は、Hemlataの前の所見と一致しました。22

フィコビリタンパク質抽出時間は 1 h. 長く抽出は重要なフィコビリタンパク質劣化や抽出の改善 (図 4) ・ ローレンツの前の仕事に相当するには至らなかったために最適化されました。28します。 抽出時間より 1 時間はテストされていません。同様に、4 時間以上のための抽出が以前発見されたリン酸バッファーで抽出されたフィコビリタンパク質が少なくとも 48 h28安定しているテストされませんでした。

フィコシアニン、アロフィコシアニンの吸光光度定量のいくつかの方程式を比較した文献で知られていた蛋白質の商業基準で両方のフィコビリタンパク質のコンテンツを再計算して前述のよう濃度 (図 6)。両方の顔料の最高の再建は、ベネットと Bogorad12の方程式で達成されました。この結果はリン酸塩に固有ではなかった以前にこのようなバッファーが以来抽出バッファー使用12,13,15。どちらも615618620 (以前の作品のフィコシアニン推定波長) の違いから顔料基準に特定標準フィコシアニンは 1% と、の違い650652 (波長アロフィコシアニン推定12,13,14,16以前用) 標準アロフィコシアニン 3% であった。同様に、阻害タンパク質抽出物の615620の違いはわずか 2% だった。吸収スペクトルのような小さな違いが 36% (図 6) の最終的な色素変化で発生します。したがって、個々 の方程式の違いは、むしろ、特定の生物12,13,14,のフィコビリタンパク質吸光係数の変化に接続されていた15,16,17. 興味深いことに、チョンの方程式。作者はまた、実験16阻害を使いましたが、最低フィコシアニン復興 (図 6) を提供しました。

単一波長の測定ではなく、280 720 nm、クロロフィル両方と干渉する抽出液中の存在を推定する間フィコビリタンパク質抽出物の連続スペクトルを測定をお勧めしますアロフィコシアニンとフィコシアニン吸収。280 で吸光度を測定することによってさらに、nm (280)、フィコシアニン (615/A280または620/A280)21,22アロフィコシアニン (652/A280) の純度エキス内24を推定できる (0.7: 食品グレード、3.9: 反応性グレード、> 4.0: 分析グレード)21

代表的なデータとしてフィコシアニン、アロフィコシアニン阻害での濃度は光強度の増加の下で測定しました。タービドスタット栽培体制11内で一定レベルの文化の密度を維持する,21直接比較実験に不可欠であった。フィコシアニン、アロフィコシアニン濃度の 2.4% から 10.2% と 0.6% - それぞれ、既報値11,31,32同様された細胞の乾燥重量の 1.7%。また、フィコビリタンパク質コンテンツごとセル単位だった11,33は既報と同様。増加の光では、フィコビリタンパク質含量が減少しました。興味深いことに、1100 µmol (光子) の最高照度下でも (m2·s)、フィコビリタンパク質ではなかった/完全に漂白します。

プロトコルのみ標準装備が必要ですが比較的高速なので、フィコビリタンパク質を定期的に分析研究室では、簡単に採用されることができます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

プロトコルは、以前出版11から採用されました。T. Z.、d. ch. と j. Č. 教育省、青年および国家の持続可能性プログラムの中でチェコ共和国のスポーツによって支えられた私 (当社私)、許可番号 LO1415。J. Č。 また GA CR、許可番号 18-24397S によって支えられました。楽器やその他の施設へのアクセスは、システム生物学 (プロジェクトなし LM2015055) C4SYS チェコ研究基盤によって支えられました。M. A. s. はロシアの科学財団 [第 14-14-00904] からの助成金によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synechocystis sp. PCC 6803 Institut Pasteur, Paris, France 6803 Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 9143.1 Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes  Eppendorf, Hamburk, Germany 30120086 Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA 30128-282 Holder for safe-lock tubes 
RAININ 100 µl -1000 µl  Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA 17014382 Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA 30389272 Pipette tips
Rotina 420R Hettich, Kirchlengern, Germany 4701 Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010 Liebherr, Bulle, Switzerland 9005382197172 Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA EXF24086V  Freezer -80 °C
CoolSafe LaboGene, Lillerød, Denmark 7.001.000.615 Freeze dryer 
UV-2600 Shimadzu, Kyoto, Japan UV-2600 Spectrophotometer 
Hellma absorption cuvettes, semi Micro Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA Z600288  VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm 
Silamat S6 Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein 602286WU Homogenizer 
Solid-glass beads Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA Z273627 Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE Sartorius AG, Göttingen, Germany SECURA225D-1OBR Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P2172 Phycocyanin standard
Allophycocyanin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA A7472 Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA BCA1, B9643 Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron  Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic AG 130-ECO  Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic FMT-150 Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer  Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA Auto M10 Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS430791  15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 51024579 Laminar flow hood

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