Biochemistry
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マイクロ Rna による天然リポタンパク質粒子の濃縮とその絶対/相対マイクロ Rna 含量とその細胞移動速度の決定
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Summary May 9th, 2019
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ここでは、定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応ベースのプロトコルが、リポタンパク質粒子の天然マイクロ RNA 含量 (絶対/相対) の決定のために提示される。加えて、マイクロ RNA レベルを増加させるための方法、ならびにリポ蛋白質粒子の細胞取り込み速度を決定するための方法が、実証される。
Transcript
リポタンパク質粒子は、ネイティブ輸送車です。異物の濃縮は、トラックキャリアとしての使用を容易にします。分子または粒子全体の特異的標識は、細胞の取り込み量を測定することが可能になります。
濃縮のための2つの方法は、迅速かつ使いやすく、物質の広い範囲に適合することができます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の2つのポスドクであるマルクス・アクスマンとアンドレアス・カーナーです。ヒュームフードで脱脂を開始するには、5ミリグラムのHDL粒子を含む調製済みHDL溶液の1〜2ミリリットルを、コニカル遠心管にエタノールジエチルエーテルの3対2の混合物をあらかじめ冷却して50ミリリットル混合して混合します。
マイナス20°Cで2時間インキュベートします。2500回gで遠心分離機を10分間マイナス10°Cで。上清を捨て、ペレットをあらかじめ冷却したエタノールジエチルエーテル混合物の50ミリリットルで再懸濁し、渦を短時間で繰り返す。
20°Cを負の20度で2時間インキュベートします。2500回gで再び2500倍の摂氏マイナス10度で10分間遠心分離機。次に、窒素ガス流を供給するチューブを挿入してペレットを乾燥させます。
そして、250マイクロリットルのバッファーAに再懸濁し、ブラッドフォードタンパク質アッセイまたは別の適切なものを使用してタンパク質濃度を決定します。これらの溶媒はアポリポタンパク質の再脂質化を阻害するので、エタノールジエチルエーテル混合物の残骸を除去することが重要です。次に、バッファーAの250マイクロリットル当たり1ミリグラムのタンパク質の最終濃度に希釈し、不活性ガスを供給するチューブをチューブ内の溶液部分に挿入します。
必要に応じて、不活性ガス雰囲気下で摂氏4度で一晩保存します。再構成を開始するには、クリーンガラスチューブで、100マイクロリットルのCO、13.5マイクロリットルのC、500マイクロリットルのPCを混合します。次に、窒素ガスをチューブ内部に流し込みながらガラス管を回転させて、均一な表層を得るために混合物を乾燥させる。0.5ミリリットルの反応チューブで、新鮮な30ミリモルスペルミン溶液を緩衝Aに調製し、10マイクロモル合成マイクロRNAの100マイクロリットルを100マイクロモル合成マイクロRNAと100マイクロリットルのスペルミン溶液を2ミリリットルの反応チューブに混ぜます。
そして摂氏30度で30分間インキュベートします。次に、インキュベートした200マイクロリットルの溶液をガラス管に移し、調製したPC-CO-Cマスターミックス表面層を水分補給する。そして、1ミリリットルのナトリウムデオキシコール酸ナトリウム10ミリグラムの50マイクロリットルを加えます。
摂氏4度で2時間かき混ぜます。その後、250マイクロリットルの脱脂HDL溶液をガラス管に加えます。そして、一晩摂氏4度でかき混ぜます。
透析を開始するには、まず800ミリリットルの二重蒸留水に50グラムの吸着剤ビーズを加えます。そして、1分間かき混ぜるために磁気攪拌機を使用してください。ビーズが落ち着くまで15分待ち、上清をデカントします。
事前に冷却したPBSで手順を繰り返します。PBSのプレウェット透析カセット。シリンジを使用して、メーカーの指示に従って、以前に準備した混合物をカセットに追加します。
PBS処理した吸着剤ビーズを3リットルのPBSに加え、カセットをPBSに入れ、摂氏4度で透析します。ビーズは透析膜に沿って密度勾配を一定に保ちます。1時間2時間後にバッファとビーズを変更します。
24時間後、シリンジを用いて、カセットから1.5ミリリットルの反応チューブに溶液を抽出し、再構成したHDL粒子溶液を回収する。ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。反応管に不活性ガスを供給し、それを密封し、不活性ガス雰囲気下で再構成したHDL粒子溶液を摂氏4度で貯蔵する。
まず、RNAseフリー水に新鮮な30ミリモルのスペルミン溶液を調製します。合成マイクロRNAの10マイクロモルの100マイクロリットルを、2ミリリットルの反応チューブに100マイクロリットルのスペルミン溶液と混合します。そして摂氏30度で30分間インキュベートします。
次に、DMSOの100マイクロリットルと1X LDLバッファーの1.2ミリリットルを調製したマイクロRNAスペルミン溶液に加えます。PBSで以前に調製したLDL粒子溶液を、1ミリリットル当たり約4ミリグラムの最終濃度に希釈する。その後、希釈した溶液の450マイクロリットルを1.5ミリリットルの反応チューブに引き込み、50マイクロリットルの10X LDLバッファーと混合します。
氷の上で10分間インキュベートします。インキュベーション後、500マイクロリットルLDL粒子溶液と1.5ミリリットルマイクロRNA-スペルミンDMSO溶液を組み合わせ、摂氏40度で2時間インキュベートします。先に述べたような透析を行い、標識されたLDL粒子溶液を不活性ガス雰囲気下で摂氏4度で保存する。
まず、PBSのHDLまたはLDL粒子溶液を1対100と1対1、000の間で希釈します。マイカ基板に粘着テープを押して、テープを引っ張って上のマイカ層を取り除いて、マイカを切断します。ピペットを使用して、切断したばかりのマイカに2マイクロリットルを堆積し、5分間インキュベートします。
リポタンパク質粒子は、表面上の連続的な結合膜を形成する傾向がある。その結果、マイカ表面の粒子濃度を調整して個々のものを得ることが重要です。インキュベーション後、PBSでサンプルをすすいだ。
高速AFM液体セルをPBSで満たし、マイカを搭載したスキャナーを高速AFMステージに取り付けます。制御ソフトウェアでは、マイカ表面へのカンチレバーのアプローチプロセスを開始する。1平方マイクロメートル未満のスキャンサイズを使用し、イメージング力をできるだけ低く保ちます。
タップモードでサンプルを画像化します。Gwyddionにデータをロードし、しきい値関数によってマークグレインを介して粒子を検出します。高さのしきい値を調整して、個々のパーティクルをマスクします。
通常、50%前後のレベルが良い出発点です。多項式背景を削除してイメージを平坦化し、マスク領域を除外オプションをアクティブにします。各種の粒子特性関数の分布を使用して検出されたパーティクルの最大高さの値をエクスポートし、記録されたすべての画像に対してこれらの手順を繰り返します。
本実験では、HDL粒子の再構成をHDL粒子の脱脂を経て、再脂質化および透析を行った。再構成されたHDL粒子の50%の収率を達成することができる。しかしながら、同じマイクロRNAによる標識は、アポリポタンパク質B100タンパク質の疎水性のために、LDL粒子の標識には実現できなかった。
このように、DMSOはLDL粒子の脂質単層の浸透に用いられ、品質管理中に100%近い収率を有し、希釈は分析に重要である。上の画像は、パーティクル密度が高すぎることを示しています。下の画像は解析に適しています。
粒子高さの確率密度関数は、ネイティブ、標識、および標識対照リポタンパク質粒子のサイズ分布の比較のために計算された。ラベル付け処理の前後の相対的な変更は無視できます。RNAオリゴヌクレオチドを取り扱う場合、RNAseフリーで働く。
新鮮な使い捨てのプラスチック消耗品を使用し、常に手袋を着用してください。ヌクレアーゼフリー溶液のみを使用してください。高速AFMは、リポタンパク質の一般的な形状を決定する1つの方法に過ぎません。
別の方法は電子顕微鏡です。適切な個人用保護具を着用し、ジエチルエーテルを扱いながらヒュームフードで作業します。
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