メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

Immunology and Infection

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Summary

今回ナイーブ cd4 陽性 T 細胞 (T 細胞) の活性化、増殖、GM-CSF 骨髄 (BM) による th1 細胞分化・生体内で定量のためのプロトコル-由来樹状細胞 (Dc)。さらに、このプロトコルでは、BM と T 細胞の分離、DC 世代と DC および T 細胞の養子移動について説明します。

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Toribio-Fernandez, R., Zorita, V., Herrero-Fernandez, B., Gonzalez-Granado, J. M. An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (138), e58118, doi:10.3791/58118 (2018).

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Abstract

ナイーブな cd4 陽性 T 細胞の活性化・増殖・ T ヘルパー 1 への分化の定量化 (Th1) 細胞は免疫応答における T 細胞の役割を評価するために便利な方法です。このプロトコルでは、顆粒球マクロファージ コロニー刺激因子 (GM-CSF) の由来樹状細胞 (Dc) を取得する (BM) 骨髄前駆細胞の in vitro分化について説明します。プロトコルはまた卵白ペプチド (OVAp) の養子の転送を記述-GM 由来 CSF Dc とナイーブ cd4 陽性 T 細胞を生体内で活性化・増殖・ th1 細胞分化を解析するために OTII トランスジェニック マウスからロード、転送 CD4 T 細胞。このプロトコルは、純粋な生体内での方法の具体的操作または調査のセル人口を選択する無力によって課される制限を回避できます。さらに、このプロトコルは生体外で発生する可能性があります機能の要因など細胞の種類とそのまま臓器でのみ発見その他の要因の影響の変化を避けるため生体内の環境で研究をできます。Dc の変更を生成するための便利なツールであり、T 細胞をプロトコル適応免疫応答、潜在的起源や多数の免疫関連疾患の開発を理解するための重要な結果を提供することを変更します。

Introduction

CD4 T 細胞と抗原提示細胞 (APCs) Dc などは、微生物病原体1,2に免疫の必要なメディエーターです。末梢のリンパ組織における CD4 T 細胞は Apc3,4,5によって提示された特定の抗原の認識に基づいてアクティブ化されます。活性化 cd4 陽性 T 細胞は、増殖し、正しい適応免疫応答67の開発に必要な個別の特定エフェクター Th 細胞に分化します。これらのプロセスの制御は、有害な組織損傷8を生成せず、病原体を殺す十分な適応性の防衛を生産するため重要です。Th 細胞は式または表面分子、転写因子やエフェクター サイトカインの生産によると定義され、病原体1への応答で不可欠な機能を実行します。Th1 細胞サブセットの細胞は、転写因子 t-bet とサイトカイン インターフェロン γ (肝腎) を表現、1細胞内の病原体に対する生体防御に参加します。ナイーブな cd4 陽性 T 細胞の活性化・増殖・ th1 細胞分化の定量化は、免疫応答における役割 T 細胞再生を評価するための有用な手段です。

このプロトコルによりin vivo解析で体外の容量には、活性化・増殖・ ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の th1 細胞の分化を調節するための Dc の BM の派生が生成されます。プロトコルもナイーブ cd4 陽性 T 細胞活性化、増殖誘導の能力を評価して th1 細胞分化 (図 1)。この汎用性の高いプロトコルは、具体的操作またはプロトコル純粋な生体内での研究セル人口を選択できないことを回避できます。多様な分子と Dc の治療の影響は、治療または分離 BM セル9を遺伝子操作、遺伝子改変マウス5から BM を使用して学ぶことができます。同様に、養子の転送のための T 細胞の異なるソースからまたはいくつかの操作3,8,10後取得することによって T 細胞の反応を探索できます。

このプロトコルの主な利点は 2 つあります。T 細胞の活性化・増殖・ th1 細胞分化を流れの cytometry アプローチ; 分析します。これが生体内で研究、体外で発生する変更を回避したがってと細胞のタイプとだけそのまま臓器11に見られるその他の要因などを含むと組み合わされています。

重要な染料の使用は、放射能の使用を回避しながら増殖を追跡するため広く使用されている手法です。これらの試薬と拡散の測定は、細胞分裂後色素希釈法に基づいています。また、これらの染料は、複数の波長で検出することができます、複数の蛍光抗体またはマーカーと組み合わせてフローサイトメトリーによる分析が簡単に。Th1 細胞分化、増殖、活性化 T 細胞をフローサイトメトリーによる分析する方法を示すことによってこのプロトコルの有用性を強調表示します。

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Protocol

実験手順は、フンダシオン セントロ ナシオナル デによって承認された研究 Cardiovasculares カルロス III (CNIC) とスペインやヨーロッパのガイドラインに従ってコムニダード Autónoma デマドリード。マウスは特定病原体無料 (SPF) 条件で飼育し、二酸化炭素 (CO2) 吸入による安楽死されました。

1 脛骨と大腿骨からマウス骨髄細胞の分離

注: C57BL/6 コンジェニック マウスひずみ差分白血球マーカー Ptprc野生型 C57BL 系統 CD45.2 または Ly5.2 として知られている、 Ptprcbの対立遺伝子を運ぶに対し CD45.1 または Ly5.1、として一般に認識を運ぶ。CD45.1 および CD45.2 バリアントは、抗体を用いたフローサイトメトリーによる区別できます。CD45.1/CD45.2、CD45.2, CD45.1 マウスは、フローサイトメトリーによる細胞集団の追跡を許可する養子の転送のため、細胞ソースまたは宛先として使用できます。年齢を優先的に使用- と 12 週齢以下の性別をマッチさせたのオスかメスのマウス。

  1. 大腿骨と脛骨の準備
    1. 制度上のアニマル ・ ケア委員会で承認プロトコルを使用してマウスを安楽死させます。
    2. 後肢を 70% エタノールで動物の表面を噴霧して消毒します。
    3. 滅菌ハサミ、鉗子やメスを使用します。メス、皮膚のカットを行うし、後の四肢を覆う皮膚を含むマウスの遠位部から皮膚を削除します。下のふくらはぎの筋肉の周りの皮膚の皮をむくし、足から皮膚を完全に削除 (図 2 a、2 b)。
    4. メスを用いた大腿骨から大腿四頭筋を分離します。股関節は、大腿骨頭を壊すことがなく disarticulate します。メス (図 2、2 D) による脛骨から筋肉を削除します。脛骨骨端を壊すことがなく、大腿骨を分離します。
    5. 10% 牛胎児血清 (FBS) と冷たい 1 x ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 中 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むペトリ皿に骨をしてください。
  2. 細胞分離
    メモ: 汚染を避けるため無菌素材と文化フードの下では、これ以降の手順を行う必要があります。
    1. 滅菌シャーレ、メス各骨の近位および遠位端を慎重にカットします。
    2. 温かみのある完全 RPMI 培地 (RPMI + 10 %fbs、2 ミリメートルの EDTA、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、20 mM HEPES、55 μ M 2-メルカプトエタノール、1 mM ピルビン酸ナトリウムと 2 mM L グルタミン) の 10 mL の容量で何度も骨をフラッシュします。1 mL の注射器に接続されている 25 G 針を使用して両端から骨をフラッシュします。
    3. 70 μ m ナイロン web フィルターが装備 50 mL のコニカル チューブ、effluate に転送します。穏やかな攪拌ピペッティングして残骸と細胞集塊を慎重に外します。
    4. 250 × g 10 分間室温 (RT) の細胞懸濁液を遠心します。
    5. 1 mL の冷たい赤血球溶解バッファー (0.15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0.1 ミリメートルの EDTA、0.4 μ m 滅菌、フィルター選択、4 ° C で保存、1 N の HCl で 7.2 調整 pH) で細胞ペレットを再懸濁します。揺れマニュアルと氷上で 5 分間維持します。
    6. 不活性化し、赤い血セル換散バッファーを洗い流すコールド バッファー (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 2 ミリメートルの EDTA + 2% ウシ血清アルブミン (BSA) x 1) 10 mL を追加します。
    7. 4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。
    8. 完全 RPMI 培地 25 mL、250 x gで 4 ° C で 5 分間遠心すると血球を洗浄します。
    9. 完全 RPMI 培地 5 mL に細胞を再懸濁します。細胞懸濁液トリパン ブルーと 1:1 のミックス 50 μ L。顕微鏡下でカウント チャンバーで細胞の数を決定します。数式を使用してセル数を計算する: 細胞/ml = [(非染色細胞数/4) 2 x 10,000 x]12
      注: このメソッドの利回り 40 x 106 60 x 106骨骨髄細胞 12 週齢の c57bl/6 マウスに感染していない 8 あたり。
    10. 4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。

2. DC 分化、成熟および抗原読み込み

  1. BM の細胞採取
    1. ウェルあたり 5 mL で通常、中の mL あたり 10 の6セルで 6 も超低付着表面板の完全な文化をシードします。分化したマクロファージは、培養皿にアタッチされます。12 h 後 6 ウェル プレート、付着のマクロファージで古い 6 ウェル プレートを破棄することをきれいにする、単球は主に培養上清を転送します。
    2. 20 ng/mL 37 ° C、5% 二酸化炭素 (CO2) で遺伝子組換えマウス GM-CSF を商業的取得を含む完全 RPMI 培地の井戸あたり通常 5 mL の mL あたり 5 x 10 の5セルで非付着細胞の培養細胞の分化を促進して毎日を観察します。
    3. 3 日ごと浮遊細胞スピンダウンし 5 mM PBS で EDTA と付着性のセルを収集し、スピン ・ ダウン。組み合わせるし、5 x 105セル/20 ng/mL rm-GM-CSF を含む新鮮な培地で mL で再懸濁します。
    4. 8 日上記と付着性と戸建の細胞を収集し、非培養処理滅菌シャーレ、高 MHC-II を誘導するために 24 時間を 5 × 105セル/mL 中含む 20 ng/mL に GM-CSF と 20 ng/mL リポ多糖 (LPS) で再懸濁します、CD80 および CD86 の発現。
    5. 2.2 の手順で示されているようにフローサイトメトリーによるチェック DC 分化。
  2. 流れの Cytometry の分化と成熟分析。
    1. 4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。この手順を 2 回繰り返します。
    2. マウス Fc 受容体拮抗薬 (抗マウス IgG CD16/CD322b抗体精製) 製造元の指示に従って 4 ° C で 15 分間で再懸濁細胞ペレットの孵化によってブロック Fc 受容体。
    3. 4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。
    4. 各プローブの 4 ° C で流れ cytometry バッファー (1 × PBS + 2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa) の 300 μ L で 250,000 の細胞を再懸濁します。
    5. 96 ウェル プレートに 30 μ L/ウェルの細胞液を転送します。
    6. 4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。
    7. 上澄みを廃棄し、抗体を含む 30 μ L を追加各メーカーの指示を次もバッファー。4 ° C で 20 分のための抗体を持つ細胞をインキュベートします。
      注: は、Dc、単球、マクロファージ、CD11b、CD64、CD115、CD11c、動的、CD80、CD86 通常マーカーを採用 (図 3)。
    8. 250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、死んだ細胞 (propidium ヨウ化など, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) またはアミン反応性色素を除外するマーカーを含む冷たい流れ cytometry バッファーの井戸あたり 200 μ L で再懸濁します) 製造元の推奨濃度13
    9. 0、3、6、9 の日に死んだ細胞を除く流動フローサイトメトリー解析を行うことで、流れの cytometry のチューブにサンプルを転送する細胞分化を監視します。
  3. DC 抗原負荷。
    1. 8 日に 250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、200 μ L 中でペレットを再懸濁します (RPMI + 10 %fbs 抗生物質なし)。この手順を 2 回繰り返します。
    2. 10 μ G/ml OVAp (323-339; と Dc を孵化させなさいISQAVHAAHAEINEAGR) 1 x 107 1 mL 中の Dc あたり (RMPI + 1 %fbs) 37 ° C で少なくとも 30 分のプラスチック製のチューブで陰性対照条件として Dc の非 OVAp ロードを使用します。
    3. 250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、200 μ L 完全 RPMI 培地でペレットを再懸濁します。この手順を 2 回繰り返します。
    4. 250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、200 μ L 中でペレットを再懸濁します (RPMI + 10 %fbs) 2 x 106セル/mL で。

3. OTII マウスからナイーブ cd4 陽性 T 細胞の分離

注: このメソッドは、12 週齢の c57bl/6 マウスに感染していない 8 あたり約 100 × 106脾臓細胞を生成します。男性と女性の両方を使用できます。CD4 T 細胞は脾臓やリンパ節から分離することができます。CD4 T 細胞はそれぞれ約 25% とこれらの器官の細胞の 50% を占めています。無菌状態で次の手順を実行します。

  1. 鼠径部、腋窩、上腕、頚部、および腸間膜のリンパ節および脾臓 OTII トランスジェニック マウス (図 4) から分離し、プラスチック シャーレ完全 RPMI 培地 10 ml に転送。
  2. 完全 RPMI 培地 2 mL でセル ストレーナーを洗浄、50 mL のチューブから取り外します。転送リンパ節および脾臓に 70 μ m の細胞ストレーナーは、50 mL のチューブに配置。シリンジのプランジャー (図 5) を使用して均質化し、媒体を追加 15 mL まで。
  3. 250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、完全 RPMI 培地 15 mL にペレットを再懸濁します。この手順を 2 回繰り返します。
  4. 脾臓細胞懸濁液、細胞ペレットを再懸濁します、1.2.5 の手順で示されているように、赤の血液細胞を溶解します。
  5. 4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。
  6. 完全 RPMI 培地 25 mL、250 x gで室温 5 分間遠心すると血球を洗浄します。
  7. 5 mL の培地で細胞を再懸濁します。トリパン ブルーと 1:1 の細胞懸濁液を 50 μ l 添加をミックスします。顕微鏡下でカウント チャンバーを用いた細胞の数を決定します。数式を使用してセル数を計算する: 細胞/ml = [(非染色細胞数/4) 2 x 10,000 x]12
  8. 2.2.2 手順を繰り返します。
  9. 製造元の指示に従って、1:800 CD8α、IgM、B220、CD19、MHCII (私 Ab)、CD11b、CD11c、CD44、CD25、DX5 CD4 T 細胞の後で否定的な選択のための氷の上で 30 分間ビオチン化抗体の希釈でセルをインキュベートします。
  10. 製造元の指示に従って、セルの数と、ビーズの容量に基づいて、マイクロ磁気ビーズのストレプトアビジン コーティングの必要量を計算磁気セル区切り記号および適切な cd4 陽性 T 細胞を分離分離カラム。
  11. 完全 RPMI 培地 5 mL に細胞を再懸濁します、3.7 の手順で説明されているように生きているセルをカウントしながら氷の上にそれらを保ちます。
  12. 2 x 10 の5セルを抽出し、メーカー推奨の抗体希釈液を使用して流れの cytometer で蛍光抗体を使用して抗 CD8 B220、CD3、CD4 収集した細胞の純度を確認してください。
  13. 分離ナイーブ CD4/OTII T 細胞を染色するには、500 μ L バッファー (1 × PBS + 2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa) の 10 の6セルを再懸濁します。500 を準備重要な細胞トレーサー染料の最終的なメーカー推奨濃度をダブル μ L バッファー (PBS、2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa × 1) を含みます。ゆっくりと細胞懸濁液に細胞トレーサーのソリューションを追加することによって、両方のソリューションをミックスします。37 ° C で 5 分間細胞をインキュベートします。
  14. 完全 RPMI 培地 5 mL、250 x g で 4 ° C で 5 分間遠心するとセルを洗浄してこの手順を 2 回繰り返します。1 x 107セル/mL で完全 RPMI 培地 1 mL の細胞を再懸濁します。

4.生体内で活性化、増殖と th1 細胞分化アッセイ

注: 重要な細胞トレーサー染料 carboxyfluorescein ジアセテート サクシニミジルエステル (CFSE) ・その他染色エステル ベースの染料、興奮している、異なる波長の蛍光を発する活躍してリンパ球増殖を評価する流れで高い蛍光強度、長寿命、変動の少ない、低毒性14などフローサイトメトリー。

  1. 本静脈内 (静注) 1 x 106ライブの重要な細胞トレーサー染料染色ナイーブ CD4/OTII T 細胞マウスあたり 100 μ L の PBS を転送します。尾静脈またはレトロ軌道注入15; によってラベル付けされた T 細胞、に対して転送できます。両方のケースでの家では、細胞、リンパ器官 (図 6 a)。
  2. 受信者のマウス 1 日後によって挑戦に対して皮下注射 (点火) (図 6 b) で 100,000 LPS 成熟 OVAp ロード DCs を転送します。
  3. 受信者マウス膝窩リンパ節の収穫、3.1 と 3.2 で前述したように同じ手順に従って単一細胞懸濁液の入手まで処理します。予防接種 2 日後 CD4/OTII T 細胞の活性化を測定して増殖と th1 細胞分化を測定する 5 日目には、これを行います。
  4. 2 日目の T 細胞活性化を分析する CD69 CD4, CD25 蛍光抗体と細胞を染色 (必要に応じて CD45.1 および CD45.2) C69 の割合を決定して+CD25+ T 細胞の CD4 人口。フローサイトメトリー (図 7) を分析します。
  5. 5 日目に T 細胞の増殖を確認するには、CD4 と必要に応じて CD45.1 および CD45.2 に対する適切な蛍光抗体を用いて細胞を染色します。フローサイトメトリー (図 8) による CD4 人口の重要な細胞トレーサー染料信号の減衰を分析します。これらの研究は、重要な細胞トレーサー染料、各蛍光ピークの分裂細胞の割合、総細胞の分裂細胞の割合で標識細胞が細胞分裂の数などのいくつかのパラメーターを確認できます。人口。
  6. /1 μ M イオノマイシンと 10 ng/mL 12 13 フォルボールエステル (PMA) のインキュベーター内の 37 ° C で 6 時間を含む完全 RPMI 培地を 200 μ l 添加の 96 ウェル プレートのウェル プレート 400,000 セル、5 日目で th1 細胞分化を決定します。最後の 4 h 3-10 μ G/ml ブレフェルジン A 媒体にサイトカイン分泌をブロックするを追加します。
  7. 遠心分離機の 4 ° C で 250 x gで 5 分間プレート96 ウェル プレートの急速な反転で上澄みを廃棄します。
  8. 2.2.2 手順を繰り返します。
  9. メーカー推奨希釈液に含まれている抗体 CD4、必要に応じて CD45.1 および CD45.2 をバッファー (1 × PBS + 2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa) の 30 μ L で 4 ° C で 15 分間インキュベートし、細胞膜を染色します。バッファー (1 × PBS + 2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa) の 150 μ L を追加することによって、細胞を洗浄し、遠心分離機の 4 ° C で 250 x gで 5 分間プレート上澄みを廃棄します。
  10. 1,000 x gで 5 分間、4 ° C の板した遠心分離機で 20 分間 2 %paraformaldehyde/1% ショ糖の 100 μ L を追加することでセルを修復します。上清を捨てます。
  11. 細胞内透過バッファー (1 × PBS + 0.01 M HEPES、0.3% サポニン 0.1 %bsa) の 50 μ L を追加することによって、セルを permeabilize し、4 ° C で 30 分間インキュベート
  12. 破棄した上清に 1,000 x gで 150 μ L の PBS と 5 分間遠心を追加します。
  13. バッファー (PBS + 0.1% サポニン) で抗肝腎抗体蛍光体共役の 30 μ L を追加することによって細胞内サイトカインを汚し、室温 30 分間インキュベート
  14. バッファー (PBS + 0.1% サポニン) の 150 μ L を追加することによって、細胞を洗浄します。RT で 1,000 x gで 5 分間プレートを遠心し、上澄みを廃棄します。この手順を 2 回繰り返します。
  15. (図 8) フローサイトメトリーによる細胞集団を分析します。

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Representative Results

図 1は、このプロトコルで説明されている手順を示しています。図 2は、マウスの骨髄細胞の培養と分離を示しています。これらの文化に GM-CSF と LP の追加により、体外生成と dc図 3の成熟分化の流れのフローサイトメトリー解析と取得した dc OVAp ロード GM-CSF BM から派生した Dc の成熟を示しています分離された重要なトレース染色 CD4/OTII T 細胞に対してマウスに転送されます。図 4は、CD4/OTII T 細胞の分離に使用されるリンパ節の場所を示しています。50 mL チューブ 70 μ m ナイロン フィルターが装備とリンパ節および脾臓を均質化するために使用するシリンジのプランジャーを図 5に示します。図 6は、レトロな軌道神経叢に CD4/OTII T 細胞の注射液と足蹠に OVAp ロード GM-CSF BM から派生した Dc の皮下注射を示します。GM-CSF Dc 移行 GM-CSF Dc が OVAp のプレゼンテーションでナイーブ CD4/OTII T 細胞をアクティブに膝窩リンパ節に対し、CD4/OTII T 細胞は異なるリンパ器官に配布します。ナイーブ CD4/OTII T 細胞は増殖し、th1 細胞表現型の方を区別します。図 7は、素朴な膜 CD69 の分析から CD4/OTII T 細胞の活性化の定量化および CD25 式を示します。CD4/OTII T 細胞増殖の定量化を図 8に示します。図 9は、th1 細胞表現型に向かって CD4/OTII T 細胞分化の定量化を示しています。

Figure 1
図 1: プロトコル スキーム。1) マウスの大腿骨および脛骨から BM 細胞を分離します。2) 文化 BM gm-csf GM-CSF BM を生成する細胞由来-DCs。 3) チェック DC 分化と成熟の GM-CSF BM 派生-Dc lps。4) DC の成熟を確認します。5) OVAp の Dc をロードします。6) CD4/OTII T 細胞フォーム マウス脾臓を分離します。7) 重要な細胞トレーサー染料と CD4/OTII T 細胞を染色します。8) 分離純度と重要な細胞トレーサー染料染色孤立 CD4/OTII T 細胞を確認します。9) に対して受信者マウスに孤立した CD4/OTII T 細胞の静脈を転送します。10). 本 Dc sc の OVAp ロードと成熟を受信者のマウスに転送します。11) CD4/OTII T 細胞の活性化を確認します。12) CD4/OTII T 細胞の増殖と分化を確認します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: マウス大腿骨脛骨から骨髄分離プロセス。(A) 皮膚切開をハサミで。手足から皮膚の (B) の除去。(C) ハサミで切開を筋肉します。メスと下肢から筋肉の (D) の除去。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: GM-CSF BM から派生した Dc の成熟のフローサイトメトリー解析します。MHCII、CD80、CD86 LPS 活性化 (+ LP) の式を表面し、非活性化 (-LP) GM-CSF BM 派生 dc 番号は、任意の単位 (a.u.) で平均蛍光強度を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 鼠径部、腋窩、上腕、頚部、および腸間膜リンパ節およびマウスの脾臓の位置この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: リンパ節および脾臓の均質化の実験設定しますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: CD4/OTII T 細胞と OVAp ロードの GM の養子の転送-CSF BM-派生-DCsレトロ軌道神経叢に CD4/OTII T 細胞 (A) 静脈注射。(B) 足蹠に GM-CSF BM から派生した Dc の OVAp ロードの皮下注射。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: T 細胞活性化に生体内の定量化します。流れの cytometry プロットと CD4 T 細胞の解析および CD69 の膜式の定量化を示すグラフ。CD45.1/CD45.2 マウスがマウス CD45.1/CD4/OTII と CD45.1/CD4/OTII 細胞 OVAp ロード GM-CSF BM のサウスカロライナ養子転送する前に 24 時間転送に対して静脈-派生-2 デイズのポスト-DC に dc T 細胞の活性化を測定したフローサイトメトリーによる転送示された抗原蛍光タグ抗体で染色。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 8
図 8: T 細胞増殖の vivoの定量化します。流れの cytometry プロットと分析と増殖する cd4 陽性 T 細胞における染色減少重要な細胞トレーサー染料の定量化を示すグラフ。CD45.2 マウスがマウス CD45.1/CD4/OTII 細胞 OVAp ロード GM-CSF BM のサウスカロライナ養子転送する前に 24 時間転送に対して静脈-派生-5 日ポスト DC に dc T 細胞増殖を測定した染色後フローサイトメトリーによる転送、蛍光抗体を示されました。増殖細胞の割合、各部門ピークのセルの割合を測定することによって、または部門ピークのグラフに示すように、数を数えることによって、t 細胞の増殖を確認できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 9
図 9: th1 細胞表現型体内に向かって T 細胞分化の定量化します。流れの cytometry プロットと分析と定量化肝腎表現する cd4 陽性 T 細胞の割合を示すグラフ。CD45.2 マウスがマウス CD45.1/CD4/OTII 細胞 OVAp ロード GM-CSF BM のサウスカロライナ養子転送する前に 24 時間転送に対して静脈-派生-デイズ ポスト DC に dc T 細胞分化を測定した染色後フローサイトメトリーによる転送、蛍光抗体を示されました。Th1 細胞表現型への t 細胞の分化は、パーセンテージ合計 CD4 T 細胞の CD4 T 細胞増殖のみから肝腎発現細胞として決定されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

このプロトコルは、BM から派生した Dc の活性化・増殖・ ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の分化を調節する能力の評価を使用できます。また、BM から派生した Dc によって変調する CD4 T 細胞の感受性を評価するために使用もできます。このプロトコルで測定された生体内でこれらのイベントの変更ができます。

調査中の仮説によって T 細胞と DCs のいくつかの組み合わせを使用できます。たとえば、1 つはまたは特定の遺伝子や CD4 T 細胞の活性化や th1 細胞の分化、増殖、特定の刺激の効率をノックのノックの結果を分析できます。Dc や CD4 にこれらの手順を実行することができます細胞または両方のセルのタイプ。したがって、野生型や遺伝子組み換えマウスから cd4 陽性 T 細胞は、野生型マウスから派生した Dc と結合できます。

このプロトコルは、フローサイトメトリーと CD45.1 および CD45.2 に対する抗体を使用して異なるセル人口の起源を区別するために合わせることができます。確かに、CD45.1/CD45.1 と CD45.2/CD45.2 のマウスでは、任意の組み合わせで養子の転送の使用する携帯型のいずれかのソースまたは宛先として使用できます。たとえば、CD45.2/CD45.2 マウスは DC 世代の BM の起源をすることができますは、cd4 陽性 T 細胞を CD45.1/CD45.1/OTII マウスから入手できます。この実験では、両方の細胞の種類は、CD45.1/CD45.2 マウスに対して転送できます。さらに、CD45.1/CD45.1 から OTII/CD4 T 細胞はいずれかにマウスを入力し、CD45.2/CD45.2 型の 2 つのマウスの 1 つの種類の動作を比較し競争で 2 つの CD4 T 細胞集団を入力 CD45.1/CD45.2 タイプ 3 受信者の同じまたは異なる組み合わせと非競合条件、それぞれ。

このメソッドでは、DCs の GM-CSF BM 由来の生成について説明します。ただし、代替プロトコルは、利用可能な DC の成熟と分化たとえば、パパインは、LPS や GM-CSF、cd4 陽性 T 細胞免疫をアクティブに異なる表現型 Dc の容量の検討を許可するのではなく fms 関連チロシン キナーゼ 3 リガンド (Flt3-L) の代わりに使用できます。同じ目的で抗原の読み込みとプレゼンテーションの Dc をすることができます直接マウスから分離しました。組み合わせ他このプロトコルの9により世間知らずの操作 CD4/OTII T 細胞ウイルス感染16受信者マウスへの養子の移転前に。BM は、プロトコルでは、使用前に DCs の制御セル修正の効果を研究するレトロ ウイルス9も導入することができます。

さらに、このプロトコルは、蛍光タンパク質を発現細胞を用いた生体顕微鏡研究17の適応になります。たとえば、CD4/OTII マウスは GFP またはチェリー/OTII CD4 マウスを取得する GFP またはチェリー発現マウスと交配することができます。これらのマウスは CD4 T 細胞のソースとして使用することができますおよび生体内の実験、必要に応じてのチェリーまたは gfp 発現するマウスから骨髄由来 Dc と併用できます。

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Disclosures

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Acknowledgments

英語の編集を博士サイモン バートレットを感謝いたします。この調査・ デ ・ セルバンテス協会からの補助金によってサポートされたサラッド カルロス III (ISCIII) (PI14/00526;PI17/01395;CP11/00145;CPII16/00022)、ミゲル サーブレット プログラム、フンダシオン Areces;共同フォンド エウロペオ ・ デ ・開発地域 (フェダー) から資金調達。CNIC は経済省、業界競争力 (MEIC) とプロの CNIC 財団によってサポートされて、セヴェーロ オチョア Center of Excellence (SEV-2015-0505) です。RTF は、フンダシオン Areces と CNIC、ISCIII、セルバンテス de BHF で VZG によって設立された危惧地方病院 12 デ Octubre (imas12) と JMG-G ISCIII ミゲル サーブレット プログラムと imas12。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol VWR Chemicals 20,824,365 5 L
Scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 14001-12
Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11000-13
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11253-20
Scalpel Fine Science Tools (F.S.T.) 10020-00 Box of 100 blades
Fetal Bovine Serum SIGMA F7524
Penicillin/streptomycin LONZA DE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) GIBCO 21875-034
Sterile Petri dishes Falcon 353003
25-gauge needle BD Microlance 3 300600
1 ml syringe Novico N15663
15 ml conical tubes Falcon 352096
50 ml conical tubes Falcon 352098
70 μm nylon web filter BD Falcon 352350
Red blood lysis buffer SIGMA R7757 100 Ml
EDTA SIGMA ED2SS-250
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906 100 g
Trypan blue SIGMA 302643-25G
Culture-plates Falcon 353003
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Cambrex BE17-737E
Beta-mercaptoethanol Merck 8-05740-0250
Sodium pyruvate LONZA BE13-115E
L-glutamine LONZA BE17-605E
Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Prepotech 315-03
lipopolysaccharide (LPS) SIGMA-ALDRICH L2018
96-well-plate Costar 3799
v450 anti-mouse CD11b antibody BD Biosciences 560455
PE anti-mouse CD64 antibody BioLegend 139303
PE anti-mouse CD115 antibody BioLegend 135505
FITC anti-mouse CD11c antibody BioLegend 117305
FITC anti-mouse MHCII antibody BioLegend 125507
APC anti-mouse CD86 antibody BioLegend 105011
APC anti-mouse CD80 antibody BioLegend 104713
Flow Cytometry tubes Zelian 300800-1 PS 12X75 5mL
OTII Ovoalbumine peptide InvivoGen 323-339
anti-mouse biotinylated CD8α antibody Tonbo Biosciences 30-0081-U500
anti-mouse biotinylated IgM antibody BioLegend 406503
anti-mouse biotinylated B220 antibody Tonbo Biosciences 30-0452-U500
anti-mouse biotinylated CD19 antibody Tonbo Biosciences 30-0193-U500
anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody BioLegend 115302
anti-mouse biotinylated CD11b antibody Tonbo Biosciences 30-0112-U500
anti-mouse biotinylated CD11c antibody BioLegend 117303
anti-mouse biotinylated CD44 antibody BioLegend 103003
anti-mouse biotinylated CD25 antibody Tonbo Biosciences 30-0251-U100
anti-mouse biotinylated DX5 antibody BioLegend 108903
streptavidin-coated magnetic microbeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-101
Magnetic cell separator MACS Miltenyi Biotec 130-090-976 QuadroMACS Separator
Separation columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
PE anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100408
APC anti-mouse CD3 antibody BioLegend 100235
FITC anti-mouse CD8 antibody Tonbo Biosciences 35-0081-U025
Cell Violet Tracer Thermofisher C34557
APC anti-mouse CD25 antibody Tonbo Biosciences 20-0251-U100
Alexa647 anti-mouse CD69 antibody BioLegend 104518
PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 65-0453
APC anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 20-0453
PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 60-0453
FITC anti-mouse CD45.2 antibody Tonbo Biosciences 35-0454
Ionomycin SIGMA-ALDRICH I0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) SIGMA P8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD 555029
Paraformaldehyde Millipore 8-18715-02100
Intracellular permeabilization buffer eBioscience 00-8333
APC anti-mouse IFNg antibody Tonbo Biosciences 20-7311-U100
Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161-U100
B6.SJL CD45.1 mice The Jackson Laboratory 002014
BD LSRFortessa™ Cell Analyzer BD Biosciences 649225
DAPI Solution Thermofisher 62248

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References

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