В естественных условиях модель мыши для активации Т-клеток CD4 наивно мера, пролиферации и дифференцирования Th1, индуцированных дендритные клетки костного мозга, полученных

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Здесь мы представляем протокол для определения в vivo наивно CD4 T клеток (Т-клеток) активации, пролиферации и дифференцирования Th1, вызванных костного ГМ-КСФ (BM)-дендритные клетки (DCs). Кроме того этот протокол описывает BM и T-cell изоляции, поколения DC и DC и T-cell приемных передачи.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Toribio-Fernandez, R., Zorita, V., Herrero-Fernandez, B., Gonzalez-Granado, J. M. An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (138), e58118, doi:10.3791/58118 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Количественная оценка активации клеток CD4 T наивными, пролиферации и дифференцировки Т-хелперами 1 (Th1) клетки является полезным способом оценить роль, которую играет Т-клеток в иммунной реакции. Этот протокол описывает в vitro дифференциация предшественники костного мозга (БМ) для получения гранулоцитов, макрофагов, колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) производные дендритные клетки (DCs). Протокол также описывает приемных передачи овальбумина пептида (OVAp)-загружен ГМ-КСФ производные DCs и наивно CD4 Т-клеток от OTII трансгенных мышей с целью проанализировать в естественных условиях активации, пролиферации и дифференцирования Th1 из переданные CD4 Т-клеток. Этот протокол позволяет обойти ограничения методов исключительно в естественных условиях введенных неспособность специально манипулировать или выбрать популяции клеток изучены. Кроме того этот протокол позволяет исследования в среде в естественных условиях , таким образом избегая изменения функциональных факторов, которые могут произойти в пробирке и в том числе влияние типов клеток и других факторов, можно найти только в неприкосновенности органов. Протокол является полезным инструментом для создания изменений в DCs и Т-клеток, изменить адаптивного иммунного ответа, предоставляя потенциально важные результаты для понимания происхождения или развитие многочисленных сопутствующих заболеваний иммунной.

Introduction

CD4 Т-клеток и антиген представляющих клеток (БТР), таких как контроллеры домена, требуется посредников иммунитета к патогенных микроорганизмов в1,2. В периферических лимфоидных органов CD4 Т-клеток активируются после признания специфических антигенов, представленный БТР3,4,5. Активированные клетки CD4 T размножаться и дифференцироваться в отдельных конкретных эффекторных клеток Th, которые необходимы для разработки правильной адаптивного иммунного ответа6,7. Контроль этих процессов имеет решающее значение для производства адекватной адаптивной обороны, который убивает возбудителя не производит вредных тканей повреждения8. Й клетки определяются согласно выражение или производства поверхности молекул, факторов транскрипции и эффекторных цитокинов и выполняют функции основных и точные в ответ на патогены1. Клетки подмножества ячеек Th1 Экспресс транскрипционный фактор T-Бет и цитокинов интерферона гамма (IFNγ) и участие в принимающей обороны против внутриклеточных возбудителей1. Количественное определение активации клеток CD4 T наивными, пролиферации и дифференцирования Th1 является полезным средством оценки роли T клетки играют в иммунного ответа.

Этот протокол позволяет в vivo анализ способности in vitro -генерируется BM-производные DCs для модуляции активации, пролиферации и дифференцирования Th1 наивно CD4 Т-клеток. Протокол также служит, чтобы оценить способность клеток CD4 T наивно быть активирована, индуцированной размножаться, и Th1 дифференцированной (рис. 1). Этот универсальный протокол обходит неспособность специально манипулировать или выбрать исследованных клеток населения в чисто в vivo протоколы. Эффекты различных молекул и лечения на контроллерах домена могут быть изучены с помощью BM от генетически измененных мышей5 или лечения или генетически манипулировать изолированных BM клетки9. Аналогичным образом Т-клеток ответов могут быть изучены путем получения Т-клетки для приемных передачи из различных источников или после нескольких манипуляций3,8,10.

Основные преимущества этого протокола являются двоякими. Активация т-клеток, пролиферации и дифференцирования Th1 анализируются с подходом цитометрия потоков; и это в сочетании с в vivo исследований, таким образом предотвращение изменения, которые могут произойти в пробирке и включая типы клеток и другие факторы, которые можно найти только в неприкосновенности органов11.

Жизненно красители используются широко используемый метод для отслеживания пролиферации клеток, избегая использования радиоактивности. Измерения распространения с этих реагентов на основе красителя разбавления после деления клеток. Кроме того эти красители могут быть обнаружены на нескольких длинах волн и легко анализируются проточной цитометрии в сочетании с несколькими флуоресцентные антитела или маркеров. Мы подчеркнуть полезность настоящего Протокола, показывая, как активация Т-клеток, пролиферации и дифференцирования Th1 могут быть проанализированы по проточной цитометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Экспериментальные процедуры были утверждены Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Карлоса III (CNIC) и Autónoma Comunidad де Мадрид в соответствии с испанскими и европейскими директивами. Мыши были разведены в конкретных патогеном бесплатно (SPF) условиях и были умерщвлены вдыханием двуокиси углерода (CO2).

1. изоляция клетки костного мозга мыши от Tibias и бедра

Примечание: C57BL/6 congenic мыши штамм несет дифференциального лейкоцита маркер Ptprc, обычно признаются CD45.1 или Ly5.1, в то время как одичал тип C57BL штаммы нести аллеля Ptprcb , известный как CD45.2 или Ly5.2. CD45.1 и CD45.2 варианты можно отличить по проточной цитометрии с использованием антител. CD45.1, CD45.2 и CD45.1/CD45.2 мышей может использоваться как мобильные источники или получателей для приемных передачи, позволяя трассировки различных клеточных популяций подачей cytometry. Предпочтительно использовать возраст- и секс согласованной мужского или женского пола мышей ниже 12-недельного возраста.

  1. Подготовка бедра и Tibias
    1. Усыпить мышей с использованием протокола, одобренного Комитетом институционального ухода за животными.
    2. Продезинфицируйте задних конечностей путем опрыскивания поверхности животных с 70% этиловом спирте.
    3. Используйте стерильные ножницы, пинцет и скальпели. С помощью скальпеля сделать разрез в коже и снять кожу от дистальной части мыши, включая кожу, охватывающих задней конечности. Пил кожи вокруг нижней икроножных мышц и полностью удалить кожу с ног (рисунок 2A, 2B).
    4. Отделите четырехглавой мышцы от бедра с помощью скальпеля. Disarticulate тазобедренного сустава не нарушая головку бедренной кости. Снять мышцы голени с помощью скальпеля (рис. 2 c, 2D). Отделите бедренной кости от голени не нарушая концы костей.
    5. Держите кости в чашке Петри, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллина/стрептомицина в ледяной 1 x Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 среде.
  2. Изоляция клетки
    Примечание: Все последующие шаги должны выполняться под капотом культуры и стерильным материалом, чтобы избежать загрязнения.
    1. В стерильные Петри тщательно Отрежьте проксимальном и дистальном концы каждой кости с помощью скальпеля.
    2. Промойте кости неоднократно с общим объемом 10 мл теплой полный RPMI среды (RPMI + 10% FBS, 2 мм ЭДТА, 1% пенициллина/стрептомицина, 20 мм HEPES, 55 мкм 2-меркаптоэтанол, пируват натрия 1 мм и 2 мм L-глютамин). Промойте кости с обоих концов, с помощью иглы 25 G прилагается к 1 мл шприц.
    3. Передача effluate в 50 мл Конические трубки оснащены 70 мкм нейлон веб-фильтр. Осторожно выбить мусора и клеток конгломератов нежное перемешивании и закупорить.
    4. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 10 мин при комнатной температуре (RT).
    5. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл холодного эритроцитов-литического буфера (0,15 М NH4Cl + 1 мм KHCO3 + 0,1 мм ЭДТА, скорректированные pH 7.2 с HCl 1 N, 0,4 мкм стерильным фильтруются и хранить при 4 ° C). Сохранить на льду за 5 мин с руководством встряхивания.
    6. Добавьте 10 мл холодного буфера (1 x-фосфатный буфер (PBS) + ЭДТА 2 мм + 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА)) инактивирует и промывают буфера lysis клеток красной крови.
    7. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при 4 ° C.
    8. Вымыть клетки с 25 мл полного RPMI среднего и центрифуги на 250 x g 5 мин при 4 ° C.
    9. Ресуспензируйте клетки в 5 мл полного RPMI среды. Mix 50 мкл суспензии клеток с Трипановый синий 1:1. Определите номер ячейки в Счетной палате под микроскопом. Расчет количества клеток, используя формулу: клеток/мл = [(не окрашенных клеток фото/4) x 2 x 10000]12.
      Примечание: Этот метод урожайности 40 x 106 -60 x 10-6 костных клеток костного мозга на неинфицированных 8-12 недельных C57BL/6 мыши.
    10. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при 4 ° C.

2. DC дифференциации, созревания и антиген загрузки

  1. BM клеток уборки
    1. Семя полный культуры на поверхности пластины 6-ну ультра-Низкий-насадку на 106 клеток / мл среды, обычно в 5 мл на хорошо. Дифференцированные макрофаги будет приложить к культуре пластины. После 12 h передачи супернатанта, который в основном содержит моноцитов, чтобы очистить пластины 6-Ну, отбрасывая старые 6-ну пластины с придерживался макрофаги.
    2. Для содействия дифференцировки клеток, культура клетки не сторонник на 5 x 105 клеток / мл в обычно 5 мл на хорошо полного среднего RPMI, содержащий 20 нг/мл, коммерчески полученные рекомбинантных мышиных ГМ-КСФ при 37 ° C и 5% двуокиси углерода (CO2) и наблюдать ежедневно.
    3. Каждые 3 дня, спина вниз подвесной клетки и собирать адэрентных клеток с 5 мм ЭДТА в PBS и вращаться вниз. Объединить и Ресуспензируйте на 5 x 105 клеток/мл в свежих носитель, содержащий 20 нг/мл rm-GM-CSF.
    4. На 8 день собирать сторонником и отдельные клетки как выше и Ресуспензируйте 5 x 105 клеток/мл в средних содержащий 20 нг/мл ГМ-КСФ и 20 нг/мл липополисахарида (LPS) за 24 ч в тканевой культуры пропитанная стерильные Петри, чтобы побудить высокой MHC-II , CD80 и CD86 выражения.
    5. Проверка DC дифференциация подачей cytometry, как указано в шаге 2.2.
  2. Потока цитометрии дифференцировки и созревания анализ.
    1. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при 4 ° C. Повторите этот шаг два раза.
    2. Блок Fc рецепторов по инкубации Пелле ресуспензированы клеток в мыши ФК блокатора рецепторов (очищенный анти мыши CD16/CD32 IgG антитела2b ) для 15 мин при температуре 4 ° C согласно инструкциям производителя.
    3. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при 4 ° C.
    4. Для каждого зонда Ресуспензируйте 250.000 клеток в 300 мкл буфера потока цитометрии (1 x PBS + ЭДТА 2 мм + 2% BSA) при 4 ° C.
    5. 30 мкл раствора клеток на хорошо передавать 96-хорошо пластины.
    6. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при 4 ° C.
    7. Отменить супернатант и 30 мкл антител содержащие буфер для каждой хорошо после указания производителя. Инкубировать клетки с антитела для 20 мин при 4 ° C.
      Примечание: Обычно используемых маркеров для DCs, моноциты и макрофаги являются CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 и CD86 (рис. 3).
    8. Центрифугуйте образцы на 250 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте в 200 мкл на хорошо холодного потока цитометрии буфер, содержащий маркер, чтобы исключить мертвые клетки (например, пропидий йодидом, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) или Амин реактивных красителей ) на производителя рекомендуемая концентрация13.
    9. Контролировать дифференцировки клеток путем передачи образцов цитометрии расходомерных трубок и выполнение анализа цитометрии потока, исключая мёртвые клетки на 0, 3, 6 и 9 дней.
  3. Загрузка DC антигена.
    1. На 8 день, Центрифугуйте образцы на 250 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл среднего (RPMI + 10% FBS без антибиотиков). Повторите этот шаг два раза.
    2. Инкубировать DCs с 10 мкг/мл OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) за 1 x 107 DCs в 1 мл среды (RMPI + 1% FBS) в пластиковой трубки для по крайней мере 30 минут при 37 ° C. Используйте не загружен OVAp РС как условие отрицательного контроля.
    3. Центрифугуйте образцы на 250 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл полный RPMI среде. Повторите этот шаг два раза.
    4. Центрифугуйте образцы на 250 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл среднего (RPMI + 10% FBS) на 2 x 106 клеток/мл.

3. изоляция наивно CD4 Т-клеток от OTII мышей

Примечание: Этот метод дает примерно 100 х 106 spleenocytes на неинфицированных 8 12 недельных C57BL/6 мыши. Может использоваться как мужчин, так и женщин. CD4 Т-клеток могут быть изолированы от селезенки и лимфатических узлов; CD4 Т-клеток приходится приблизительно 25% и 50% клеток в этих органах, соответственно. Выполните следующие действия в стерильных условиях.

  1. Изолировать паховые, подмышечные, плечевого, шейки матки и брыжеечных лимфатических узлах и селезенке от OTII трансгенных мышей (Рисунок 4) и передавать их на пластиковые Петри, содержащие 10 мл полного RPMI среднего.
  2. Промывать ячейки ситечко с 2 мл полного RPMI среды и удалить его из 50 мл трубки. Передачи лимфатических узлов и селезенки стрейнер ячейки 70 мкм помещены в 50 мл трубки. Однородный, используя поршень шприца (рис. 5) и добавить среднего до 15 мл.
  3. Центрифугуйте образцы на 250 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте гранулы в 15 мл полного RPMI среды. Повторите этот шаг два раза.
  4. Суспензию клеток селезенки Ресуспензируйте Пелле клеток и лизируют красные кровяные клетки, как указано в шаге 1.2.5.
  5. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при 4 ° C.
  6. Вымыть клетки с 25 мл полного среднего RPMI и центрифуги на 250 x g 5 мин на RT.
  7. Ресуспензируйте клетки в 5 мл среды. Смешайте 50 мкл суспензии клеток 1:1 с Трипановый синий. Определите номер ячейки, используя Счетной палате под микроскопом. Расчет количества клеток, используя формулу: клеток/мл = [(не окрашенных клеток фото/4) x 2 x 10000]12.
  8. Повторите шаг 2.2.2.
  9. Следуя инструкциям изготовителя инкубации клеток с терапевтами разведений биотинилированным антител к CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 и DX5 30 мин на льду для позднее негативный выбор CD4 Т-клеток.
  10. Следуя инструкциям производителя и основываясь на количество клеток и количество шариков, рассчитать необходимое количество стрептавидина покрытием магнитные микрошарики и изолировать CD4 Т-клеток с помощью разделителя магнитные клеток и соответствующие разделения столбцов.
  11. Ресуспензируйте клетки в 5 мл полного RPMI среды и держать их на льду во время подсчета живые клетки, как описано в пункте 3.7.
  12. Экстракт 2 x 105 клеток и проверьте чистоту собранного клеток с помощью анти-CD3, CD4 и CD8, B220 флуоресцентных антител в проточный цитометр, используя рекомендации производителя разбавления антитела.
  13. Пятно изолированных наивно CD4/OTII Т-клеток, Ресуспензируйте 106 клеток в 500 мкл буфера (1 x PBS + ЭДТА 2 мм + 2% BSA). Подготовка 500 мкл буфера (1 x PBS + ЭДТА 2 мм + 2% BSA) содержащий двойной конечная концентрация рекомендованный изготовителем жизненно важных клеток трассирующими красителя. Смешайте оба решения, медленно добавляя решение трассирующими сотовый к суспензии клеток. Инкубировать клетки для 5 минут при 37 ° C.
  14. Вымыть клетки с 5 мл полного среднего RPMI и центрифуги на 250 x g 5 мин при 4 ° C. Повторите этот шаг два раза. Ресуспензируйте клеток в 1 мл полного RPMI среды в 1 x 10-7кл/мл.

4. в естественных условиях активации, распространением и Th1 дифференциация Assay

Примечание: Жизненно важные ячейки трассирующими красителя Карбоксифлуоресцеина диацетата succinimidyl эфира (CFSE) и другие succinimidyl на основе эфира красители, которые рады и излучают флуоресцирования на разных длинах волн, широко используются для оценки распространения лимфоцитов потока цитометрии из-за их высокой флуоресценции интенсивности, Лонг жизнь, низкой изменчивости и низкой токсичности14.

  1. Восприимчивую (и.в.) 1 x 106 живой клетки жизненно важные трассировочные краситель окрашенных наивно T CD4/OTII клетки в 100 мкл PBS на мышь внутривенно перехода. Обозначение Т-клетки могут передаваться восприимчивую хвост вен или ретро орбиталь инъекций15; в обоих случаях клетки будет домом для лимфоидных органов (рис. 6A).
  2. Вызов получателя мышей один день позже передав восприимчивую 100000 LPS-созрел OVAp загружен DCs подкожно (с.и.) в башмаки (Рисунок 6B).
  3. Урожай подколенной лимфоузлов от получателей мышей и их обработку до получения одного клеточных суспензий после те же шаги, как описано ранее в 3.1 и 3.2. Сделать это на 2 день после иммунизации для измерения активации клеток CD4/OTII Т и день 5 для измерения распространения плюс Th1 дифференциации.
  4. Для анализа активации клеток T на 2 день, запятнать клетки с флуоресцентных антител против CD4, CD69 и CD25 (опционально CD45.1 и CD45.2) и определить процент C69+CD25+ T-клеток CD4 населения. Анализировать проточной цитометрии (рис. 7).
  5. Чтобы проверить пролиферации клеток T на 5 день, пятно клеток с использованием соответствующих флуоресцентных антител против CD4 и, при необходимости, CD45.1 и CD45.2. Проанализируйте разрушение жизненно важные трассировочные краситель сигнала численности CD4 проточной цитометрии (рис. 8). Можно определить несколько параметров в этих исследованиях, таких как количество клеточных делений претерпела клетками, помечены краситель трассирующими жизненно важных клеток, процент деления клеток в каждом пика флуоресценции и процент деления клеток в ячейке населения.
  6. Чтобы определить Th1 дифференциации в день 5, плиты 400 000 ячеек на хорошо 96-луночных плиты в 200 мкл полного среднего RPMI, содержащие 1 мкм ionomycin и 10 нг/мл phorbol 12 миристат 13 ацетат (PMA) за 6 ч при 37 ° C в инкубаторе. За последние 4 часа добавьте 3 – 10 мкг/мл brefeldin A блокировать секрецию цитокинов на носитель.
  7. Центрифуга для пластин для 5 мин на 250 x g при 4 ° C. Отказаться от супернатанта, быстрое инверсии 96-луночных пластины.
  8. Повторите шаг 2.2.2.
  9. Пятно клеточных мембран, инкубации 15 мин при температуре 4 ° C в 30 мкл буфера (1 x PBS + ЭДТА 2 мм + 2% BSA) содержащий антител на CD4 и, при необходимости, CD45.1 и CD45.2 на рекомендованный изготовителем разведениях. Вымыть клетки путем добавления 150 мкл буфера (1 x PBS + ЭДТА 2 мм + 2% BSA) и центрифуги пластины для 5 мин на 250 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
  10. Исправить ячейки, добавив 100 мкл paraformaldehyde/1% 2% сахарозы для 20 мин на RT. центрифуги пластины для 5 мин на 1000 x g и 4 ° C. Выбросите супернатант.
  11. Разрушения клеток, добавляя 50 мкл буфера внутриклеточных permeabilization (1 x PBS + 0.1% BSA, 0,01 М HEPES, 0.3% сапонин) и Инкубируйте 30 мин при 4 ° C.
  12. Добавьте 150 мкл PBS и центрифуги для 5 мин на 1000 x g на RT. удалить супернатант.
  13. Пятно внутриклеточных цитокинов, добавив 30 мкл конъюгированных Флюорофор анти IFNγ антитела в буфере (PBS + 0.1% сапонин) и Инкубируйте 30 мин на RT.
  14. Вымойте клетки путем добавления 150 мкл буфера (PBS + 0.1% сапонин). Центрифуга для пластин для 5 мин на 1000 x g на RT и удалить супернатант. Повторите этот шаг два раза.
  15. Анализ клеточных популяций подачей cytometry (рис. 8).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 1 иллюстрирует шаги, описанные в настоящем Протоколе. Рисунок 2 иллюстрирует изоляции и культуры клеток мыши BM. ГМ-КСФ и LPS этих культур позволяет поколения в пробирке и созревания DCs. рис. 3 показан cytometry анализ потоков дифференцировки и созревания полученные DCs ГМ-КСФ BM-производные DCs. OVAp-загрузить и отдельных жизненно важных клеток трассировки краситель окрашенных CD4/OTII Т-клеток, восприимчивую передаются мышей. На рисунке 4 показано расположение лимфатические узлы, используемые для изоляции клеток CD4/OTII Т. Рисунок 5 показывает 50 мл трубки с 70 мкм фильтром нейлона и поршень шприца, используется для гомогенизации в лимфатических узлах и селезенке. На рисунке 6 показан и.в. инъекции CD4/OTII Т-клеток в ретро орбиталь сплетения и s.c. инъекции DCs ГМ-КСФ BM-производные OVAp загружен в зверолов. CD4/OTII Т-клеток распределить различных лимфоидных органов, тогда как ГМ-КСФ DCs мигрируют в подколенной лимфатические узлы, где ГМ-КСФ DCs активировать наивно CD4/OTII Т-клеток, презентация OVAp. Наивный CD4/OTII Т-клетки затем размножаются и дифференцировать направлении Th1 фенотип. Рисунок 7 иллюстрирует количественная оценка наивно активации клеток CD4/OTII T от анализа мембраны CD69 и CD25 выражение. На рисунке 8 показана количественная оценка пролиферации клеток CD4/OTII Т. Рисунок 9 иллюстрирует количественная оценка дифференцировки клеток CD4/OTII T к Th1 фенотип.

Figure 1
Рисунок 1: Схема протокола. 1) изолируйте BM клетки мыши бедра и tibias. BM 2) культуры клеток с ГМ-КСФ для создания ГМ-КСФ BM полученных-DCs. 3) проверить DC дифференциации и зрелые ГМ-КСФ BM производные РС с ПЛАСТИНОК. 4) Проверьте DC созревания. 5) загрузить РС с OVAp. 6) изолировать CD4/OTII Т-клетки формируют Хандра мыши. 7) пятно CD4/OTII Т-клеток с красителем трассирующими жизненно важных клеток. 8) Проверьте чистоту изоляции и жизненно важных клеток трассирующими краситель окрашивание изолированных клеток CD4/OTII Т. 9) восприимчивую передавать получателей мышей изолированных и.в. клеток CD4/OTII Т. 10). восприимчивую передачи DCs s.c. OVAp нагружено и созрели для получателей мышей. 11) Проверка активации клеток CD4/OTII Т. 12) Проверьте T CD4/OTII пролиферации и дифференцировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: процесс изоляции костного мозга от мыши бедра и tibias. (A) кожи разрез с ножницами. (B) удаление кожи от конечностей. (C) мышечной разрез с ножницами. (D) удаление мышцы конечностей с помощью скальпеля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: cytometry анализ созревания DCs, ГМ-КСФ BM-производный потока. Поверхности выражение MHCII, CD80 и CD86 в LPS активирована (+ LPS) и неактивированные (-ПЛАСТИНОК) ГМ-КСФ BM-производные DCs. цифры показывают интенсивность средняя флуоресценции в произвольных единицах (а.е.). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: расположение паховые, подмышечные, плечевого, шейки матки и брыжеечных лимфатических узлов и селезенки мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: экспериментальная установка для лимфатических узлов и селезенки гомогенизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: приемные передачи CD4/OTII Т-клеток и OVAp загружен GM-CSF BM-производные DCs. (A) внутривенно CD4/OTII Т-клеток в ретро орбиталь сплетения. (B) подкожной инъекции OVAp загружен ГМ-КСФ BM-производные DCs в зверолов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: количественная оценка активация Т-клеток в vivo. Потока цитометрии участков и график анализа и количественной оценки выражения мембраны CD69 в CD4 Т-клеток. CD45.1/CD45.2 мышей были восприимчивую передаваемых и.в. с помощью мыши CD45.1/CD4/OTII и CD45.1/CD4/OTII клетки 24 h перед передачей приемных s.c. OVAp загружен ГМ-КСФ BM-производные-DCs. T активации клеток была измерена на 2 дня пост DC передачи проточной цитометрии после окрашивания с меткой флуоресцентных антител к указанные антигены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: количественная оценка распространения Т-клеток в vivo. Потока цитометрии участков и графики, показывающие анализа и количественной оценки снижение жизненно важных клеток трассирующими краситель пятнать в пролиферирующих клеток CD4 T. CD45.2 мышей были восприимчивую передаваемых и.в. с CD45.1/CD4/OTII клеток мыши 24 h перед передачей приемных s.c. OVAp загружен ГМ-КСФ BM-производные-DCs. T пролиферации была измерена на 5 дней пост DC передачи подачей cytometry после окрашивания с указал флуоресцентных антител. Пролиферация клеток t может определяться путем измерения процент пролиферирующих клеток, процент клеток в каждом отделе пик, или путем подсчета числа разделения пиков, как показано на графиках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9: количественная оценка дифференцировки Т-клеток к Th1 фенотип в vivo. Потока цитометрии участки и графики, показывающие анализа и количественной оценки доли IFNγ-выражая CD4 Т-клеток. CD45.2 мышей были восприимчивую передаваемых и.в. с CD45.1/CD4/OTII клеток мыши 24 h перед передачей приемных s.c. OVAp загружен ГМ-КСФ BM-производные-DCs. T дифференцировки клеток была измерена в дни поста DC передачи подачей cytometry после окрашивания с указал флуоресцентных антител. Т-клеточная дифференцировка к фенотипу Th1 был определен как выражая IFNγ клетки как в процентах от общего числа клеток CD4 T и от только пролиферирующих клеток CD4 T. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол позволяет для характеристики BM-производные DCs способность модулировать активации, пролиферации и дифференцировки клеток CD4 T наивно. Кроме того она может также использоваться для оценки подверженности модуляции CD4 Т-клеток, БМ производные DCs. Этот протокол изменения в этих мероприятиях может быть измеренной в естественных условиях.

В зависимости от гипотезы под следствием может использоваться несколько комбинаций Т-клеток и DCs. Например один можно проанализировать последствия стучать в или выбив конкретные гены или эффективность определенного стимула активации клеток CD4 T, распространения или Th1 дифференциации. Эти процедуры можно выполнять на РС или CD4 T клеток или на обоих типах клеток. Таким образом CD4 Т-клеток от дикого типа или генетически измененных мышей может сочетаться с DCs, производный от мышей одичал тип и наоборот.

Этот протокол может быть адаптирована для различения происхождение различных клеточных популяций с помощью проточной цитометрии и антител против CD45.1 и CD45.2. Действительно CD45.1/CD45.1 и CD45.2/CD45.2 мышей может использоваться как источник любого из типов клеток, используемых или получателей для приемных передачи в любой комбинации. Например CD4 Т-клетки могут быть получены CD45.1/CD45.1/OTII мышей при CD45.2/CD45.2 мышей может быть происхождение BM для поколения DC. В этом эксперименте обоих типов клеток могут передаваться восприимчивую CD45.1/CD45.2 мышей. Кроме того, CD4/OTII Т-клеток от CD45.1/CD45.1 типа мышей и CD45.2/CD45.2 типа две мыши могут быть объединены в одной или разных получателей типа три CD45.1/CD45.2 сравнить поведение типа 1 и типа две популяции клеток CD4 T в конкурирующих и не конкурирующие условия, соответственно.

Этот метод описывает поколения ГМ-КСФ BM-производные DCs. Однако альтернативные протоколы доступны для DC созревания и дифференциации; к примеру папаин может использоваться вместо ПЛАСТИНОК или связанных с fms тирозин киназа 3 лиганда (Flt3-L) вместо ГМ-КСФ, позволяя исследование фенотипически собственный DCs способность активировать CD4 T клетки адаптивного иммунитета. С тем же намерением, DCs для загрузки антигена и презентации может быть непосредственно изолированы от мышей. Сочетание этого протокола с другими9 позволяет манипуляции наивно CD4/OTII Т-клеток вирусной инфекции16 до их приемных перевода получателей мышей. BM может быть также преобразованы с9 ретровирусы для изучения влияния изменения контролируемых клеток на контроллерах домена перед их использованием в протоколе.

Кроме того этот протокол может быть адаптирована для прижизненной микроскопии исследования17 с помощью флуоресцентного белка выражая клетки. Например можно пересечь CD4/OTII мышей с GFP - или вишня выражая мышей для получения GFP или вишня/OTII CD4 мышей. Эти мыши может затем использоваться как источник CD4 Т-клеток и могут быть объединены с DCs BM-производные от мышей, вишня или GFP-выражения, при необходимости, в естественных условиях экспериментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать

Acknowledgments

Мы благодарим д-р Симон Bartlett для английского редактирования. Это исследование было поддержано грантов из Instituto de Salud Карлоса III (ISCIII) (ПЭ14/00526; PI17/01395; ПЦ11/00145; CPII16/00022), Мигель Сервет программа и Фонд Ramón Аресес; При совместном финансировании региональных Europeo Fondo de Desarrollo (ФЕДЕР). CNIC поддерживается Министерством экономики, промышленности и конкурентоспособности (МЭПТ) и Фондом Pro CNIC и является Северо Очоа центр повышения квалификации (SEV-2015-0505). RTF основан Фонд Рамона Аресес и CNIC, VZG, ISCIII, BHF Институто де инвестигасьон обеспечиваются больница 12 де октубре (imas12) и JMG-G ISCIII Мигель Сервет программы и imas12.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol VWR Chemicals 20,824,365 5 L
Scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 14001-12
Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11000-13
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11253-20
Scalpel Fine Science Tools (F.S.T.) 10020-00 Box of 100 blades
Fetal Bovine Serum SIGMA F7524
Penicillin/streptomycin LONZA DE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) GIBCO 21875-034
Sterile Petri dishes Falcon 353003
25-gauge needle BD Microlance 3 300600
1 ml syringe Novico N15663
15 ml conical tubes Falcon 352096
50 ml conical tubes Falcon 352098
70 μm nylon web filter BD Falcon 352350
Red blood lysis buffer SIGMA R7757 100 Ml
EDTA SIGMA ED2SS-250
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906 100 g
Trypan blue SIGMA 302643-25G
Culture-plates Falcon 353003
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Cambrex BE17-737E
Beta-mercaptoethanol Merck 8-05740-0250
Sodium pyruvate LONZA BE13-115E
L-glutamine LONZA BE17-605E
Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Prepotech 315-03
lipopolysaccharide (LPS) SIGMA-ALDRICH L2018
96-well-plate Costar 3799
v450 anti-mouse CD11b antibody BD Biosciences 560455
PE anti-mouse CD64 antibody BioLegend 139303
PE anti-mouse CD115 antibody BioLegend 135505
FITC anti-mouse CD11c antibody BioLegend 117305
FITC anti-mouse MHCII antibody BioLegend 125507
APC anti-mouse CD86 antibody BioLegend 105011
APC anti-mouse CD80 antibody BioLegend 104713
Flow Cytometry tubes Zelian 300800-1 PS 12X75 5mL
OTII Ovoalbumine peptide InvivoGen 323-339
anti-mouse biotinylated CD8α antibody Tonbo Biosciences 30-0081-U500
anti-mouse biotinylated IgM antibody BioLegend 406503
anti-mouse biotinylated B220 antibody Tonbo Biosciences 30-0452-U500
anti-mouse biotinylated CD19 antibody Tonbo Biosciences 30-0193-U500
anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody BioLegend 115302
anti-mouse biotinylated CD11b antibody Tonbo Biosciences 30-0112-U500
anti-mouse biotinylated CD11c antibody BioLegend 117303
anti-mouse biotinylated CD44 antibody BioLegend 103003
anti-mouse biotinylated CD25 antibody Tonbo Biosciences 30-0251-U100
anti-mouse biotinylated DX5 antibody BioLegend 108903
streptavidin-coated magnetic microbeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-101
Magnetic cell separator MACS Miltenyi Biotec 130-090-976 QuadroMACS Separator
Separation columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
PE anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100408
APC anti-mouse CD3 antibody BioLegend 100235
FITC anti-mouse CD8 antibody Tonbo Biosciences 35-0081-U025
Cell Violet Tracer Thermofisher C34557
APC anti-mouse CD25 antibody Tonbo Biosciences 20-0251-U100
Alexa647 anti-mouse CD69 antibody BioLegend 104518
PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 65-0453
APC anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 20-0453
PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 60-0453
FITC anti-mouse CD45.2 antibody Tonbo Biosciences 35-0454
Ionomycin SIGMA-ALDRICH I0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) SIGMA P8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD 555029
Paraformaldehyde Millipore 8-18715-02100
Intracellular permeabilization buffer eBioscience 00-8333
APC anti-mouse IFNg antibody Tonbo Biosciences 20-7311-U100
Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161-U100
B6.SJL CD45.1 mice The Jackson Laboratory 002014
BD LSRFortessa™ Cell Analyzer BD Biosciences 649225
DAPI Solution Thermofisher 62248

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
  2. Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
  3. Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7, (322), ra37 (2014).
  4. Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5, (5), 396-401 (2014).
  5. Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37, (15), (2017).
  6. Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2, (4), 251-262 (2002).
  7. Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
  8. Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9, (1), 9 (2018).
  9. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  10. Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8, (1), 1591 (2017).
  11. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
  12. Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
  13. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47, (10), 1584-1797 (2017).
  14. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379, (1-2), 1-14 (2012).
  15. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40, (5), 155-160 (2011).
  16. Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  17. Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics